INSTITUTO FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CURSO BACHARELADO EM BIOMEDICINA
LETÍCIA MONTANHA DE ASSIS PRISCILA ALVES NERES PEREIRA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DO EXTRATO DE Myrsine rubra EM CÉLULAS DE CÂNCER DE MAMA (MCF-7)
VILA VELHA 2022
LETÍCIA MONTANHA DE ASSIS PRISCILA NERES ALVES PEREIRA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DO EXTRATO DE Myrsine rubra EM CÉLULAS DE CÂNCER DE MAMA (MCF-7)
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenadoria do Curso de Bacharelado em Biomedicina do Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Vila Velha, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Biomedicina.
Orientadora: Prof.ª Drª. Marcella Porto Tavares
VILA VELHA-ES 2022
FICHA CATALOGRÁFICA
DECLARAÇÃO DAS AUTORAS
Declaramos, para fins de pesquisa acadêmica, didática e técnico-científica, que este Trabalho de Conclusão de Curso pode ser parcialmente utilizado, desde que se faça
referência à fonte e à autoria.
Vila Velha, 19 de Dezembro de 2022 Letícia Montanha de Assis Priscila Alves Neres Pereira
AGRADECIMENTOS
Á nossa querida orientadora Marcella Porto, um exemplo de pesquisadora que doa sempre seu tempo e dedicação. Obrigada por depositar sua confiança em nós.
Admiramos e nos inspiramos em você. Agradecemos, em especial, aos professores que nos apoiaram para que nosso trabalho desse certo: professor Hildegardo França pelo apoio com o fornecimento dos extratos utilizados na pesquisa. Assim como Priscila Meier, mestranda da professora Renata Daltoe, que gentilmente forneceram a linhagem tumoral utilizada nesta pesquisa. Professora Silvana Meyrelles, obrigada pelo carinho e por permitir que fizéssemos análises em seu Laboratório de Fisiologia Translacional. Sem vocês esse trabalho não seria possível. Muito obrigada a todos!
Eu, Letícia, agradeço ao meu pai, Josimar, e minha mãe, Sueli, por lutarem para que eu fosse a minha melhor versão. Sem vocês eu não seria nada. Agradeço ao meu irmão Vinícius por acreditar mais em mim do que eu mesma. Saiba que o orgulho é recíproco. E por fim, agradeço ao meu avô e minha avó, Claudemiro e Lourdes, por todo apoio ao longo dos anos. Amo todos vocês.
Eu, Priscila, agradeço à minha mãe, Vanuza, por me permitir estudar apesar de todas as dificuldades. À minha família por todo o incentivo e por sempre acreditarem no meu potencial. Aos meus amigos por me instigarem a ir além. Não me construí sozinha e sem vocês eu não seria ninguém. Amo muito vocês.
RESUMO
INTRODUÇÃO: O câncer de mama é o tipo mais comumente diagnosticado e a principal causa de morte por câncer em mulheres no Brasil. Apesar do avanço no tratamento da doença, os tratamentos ainda apresentam efeitos colaterais prejudiciais aos pacientes. Dessa forma, novas potenciais drogas devem ser investigadas, a fim de analisar possíveis terapias coadjuvantes que minimizem efeitos colaterais e sejam mais eficientes. Neste estudo, avaliou-se a potencial ação citotóxica do extrato bruto hidroetanólico de Myrsine rubra em células de câncer de mama (MCF-7).
METODOLOGIAS: O extrato bruto hidroetanólico foi obtido por meio do professor Hildegardo França. As soluções de tratamento foram de 1, 5, 10, 25, 50 e 100μg/mL, solubilizadas em PBS. A avaliação da viabilidade celular por azul de tripan e reconfirmado pelo ensaio de morte celular por iodeto de propídio, medido por citometria de fluxo. As análises a fim de verificar os possíveis mecanismos de ação foram a análise do ciclo celular e verificação dos níveis de espécie reativa de oxigênio (EROs), ambos quantificados por citometria de fluxo.
RESULTADOS: No ensaio de azul de tripan, em todos os tempos houve uma redução da viabilidade celular, apresentando-se maior no tempo de 72h. Nos demais ensaios no tempo de 72h, foi verificado o aumento de maneira dose dependente da morte celular por iodeto de propídio, com valores significativos a partir da concentração de 5μg/mL. As alterações no ciclo celular foram visualizadas com paradas na fase G2/M com consequente diminuição de células na fase G1/G0 e aumento da fragmentação do DNA (fase subG0), sustentando os demais resultados do aumento de células não viáveis, potencializadas pela maior concentração do extrato. Na avaliação de níveis citoplasmáticos de EROS houve um aumento do estresse oxidativo na maior concentração, o que pode ser um indicativo que os efeitos citotóxicos estão relacionados a um efeito pró-oxidante do extrato.
CONCLUSÃO: Esses achados indicam o efeito citotóxico do extrato bruto hidroetanólico de Myrsine rubra na linhagem de câncer de mama MCF-7, entretanto, mais estudos devem ser realizados a fim colaborar com nossos achados.
Palavras-chave: Adenocarcinoma. Viabilidade. Primulaceae. Citômetro. Antitumoral.
ABSTRACT
INTRODUCTION: Breast cancer is the most commonly diagnosed type of cancer and the main cause of death from cancer in women in Brazil. Despite advances in the treatment of the disease, treatments still have harmful side effects for patients. Thus, new potential drugs should be investigated in order to analyze possible adjuvant therapies that minimize side effects and are more efficient. In this study, we evaluated the potential cytotoxic action of the crude hydroethanolic extract of Myrsine rubra in breast cancer cells (MCF-7).
METHODS: The crude hydroethanolic extract was obtained through Professor Hildegardo França. The treatment solutions were 1, 5, 10, 25, 50 and 100μg/mL, solubilized in PBS. The evaluation of cell viability by trypan blue and reconfirmed by propidium iodide cell death assay, measured by flow cytometry. The analyses to verify the possible mechanisms of action were the cell cycle analysis and verification of the levels of reactive oxygen species (ROS), both quantified by flow cytometry.
RESULTS: In the trypan blue assay, at all times there was a reduction in cell viability, which was greater at 72h. In the other assays at 72h, a dose-dependent increase in cell death by propidium iodide was observed, with significant values starting at a concentration of 5μg/mL. The alterations in the cell cycle were visualized with stops in the G2/M phase with consequent decrease of cells in the G1/G0 phase and increase of DNA fragmentation (subG0 phase), supporting the other results of the increase of non-viable cells, potentiated by the higher concentration of the extract. In the evaluation of cytoplasmic EROS levels there was an increase in oxidative stress at the highest concentration, which may be an indication that the cytotoxic effects are related to a pro-oxidant effect of the extract.
CONCLUSION: These findings indicate the cytotoxic effect of the crude hydroethanolic extract of Myrsine rubra on MCF-7 breast cancer lineage, however, further studies should be conducted in order to collaborate with our findings.
Keywords: Adenocarcinoma. Viability. Primulaceae. Cytometer. Antitumor.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- O processo da carcinogênese...11 Figura 2- Myrsine rubra M. F. Freitas & L. S. Kinoshita...15 Figura 3- Fluxograma do protocolo completo de obtenção do extrato bruto hidroetanólico das folhas de Myrsine rubra...17 Figura 4- Concentrações do extrato bruto hidroetanólico das folhas de Myrsine rubra...18 Figura 5- Linhagem MCF-7 observada no microscópio invertido. Aumento de 10x (A).
Aumento de 40x (B)...19 Figura 6- Câmara de Neubauer...20 Figura 7- Células viáveis identificadas (setas brancas) e células mortas não viáveis (setas azuis) em câmara de Neubauer...22 Figura 8- Citômetro de Fluxo FACSCanto II (BD)...23 Figura 9- Placas de 12 poços utilizada nos ensaios...24 Figura 10- Análise do conteúdo de DNA pela marcação com iodeto de propídeo.
Histograma típico representativo do ciclo celular avaliado por citometria de fluxo com o uso de PI. ...25 Figura 11- Viabilidade das células MCF-7 após tratamento em diferentes concentrações do extrato de Myrsine rubra por 72h...30 Figura 12 Resumo dos resultados encontrados e possíveis mecanismos associados ...37
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 e 2- Viabilidade das células MCF-7 após tratamento em diferentes concentrações do extrato de Myrsine rubra nos tempos de 24h e 48h, respectivamente...28 Gráfico 3- Viabilidade das células MCF-7 após tratamento em diferentes concentrações do extrato de Myrsine rubra por 72h...29 Gráfico 4- Porcentagem de células mortas após as diferentes concentrações de tratamento no tempo de 72h...31 Gráfico 5- Dosagem dos níveis citoplasmáticos de EROs durante o tratamento das células MCF-7 em diferentes concentrações do extrato no tempo de 72h...32
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Classificação molecular por imuno-histoquímica dos carcinomas da mama...13 Tabela 2- Perfil do ciclo celular durante o tratamento das células MCF-7 em diferentes concentrações do extrato para o tempo de 72h...32
LISTA DE ABREVIATURAS ADP-ribose Adenosine difosfato ribose
ANOVA Análise de Variância CHK1 Checkpoint quinase 1 CO2 Dióxido de carbono Cu Cobre
DCF Diclorofluoresceína
DCFH-DA 2’,7’-diacetato de diclorofluoresceína DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
ECACC European Collection of Authenticated Cell Cultures EROs Espécies Reativas de Oxigênio
HER-2 Receptor do fator de crescimento epidérmico humano IC50 Índice de concentração inibitória
MCF-7 Linhagem de células de adenocarcinoma de mama MIF Medianas de intensidade de fluorescência
NaCl Cloreto de sódio
NAD+ Dinucleótido de nicotinamida e adenina PARP-1 Poli (ADP-ribose) polimerase-1
PBS Phosphate Buffer Solution PES Polietersulfona
PI Iodeto de propídio RE Receptor de estrógeno RNAase Ribonuclease
RP Receptor de progesterona Rpm Rotação por minuto
RPMI-1640 Meio Roswell Park Memorial Institute SFB Soro fetal bovino
TrisCl Solução salina com Tris U.A. Unidades Arbitrárias
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 09
1.1 OBJETIVOS ... 16
1.1.1 OBJETIVO GERAL ... 16
1.1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 16
2 METODOLOGIA... 17
2.1 Preparação do extrato de Myrsine rubra M.F. Freitas & Kinoshita ... 17
2.2 Técnica do cultivo celular ... 18
2.3 Avaliação da viabilidade celular com azul de tripan ... 19
2.3.1 Câmara de Neubauer... 19
2.3.2 A viabilidade celular ... 21
2.4 Ensaios por citometria de fluxo ... 22
2.4.1 Citometria de fluxo ... 22
2.4.2 Preparação das amostras para realização dos ensaios ... 23
2.4.3 Ensaio de morte celular por iodeto de propídio (PI) ... 24
2.4.4 Ensaio de análise do ciclo celular por iodeto de propídio (PI) ... 24
2.4.5 Estresse oxidativo ... 26
2.4.6 Determinação de níveis citoplasmáticos de EROS ... 26
2.5 Análise estatística ... 27
3 RESULTADOS ... 28
3.1 Avaliação da viabilidade celular com azul de tripan ... 28
3.2 Ensaio de morte celular por iodeto de propídio (PI) ... 30
3.3 Ensaio de análise do ciclo celular por iodeto de propídio (PI) ... 31
3.4 Determinação de níveis citoplasmáticos de EROS ... 32
4 DISCUSSÃO... 33
5 CONCLUSÃO ... 38
REFERÊNCIAS ... 39
1 INTRODUÇÃO
Estima-se que o Brasil apresentará 625 mil novos casos de câncer a cada ano, progredindo esse valor de 2020 até 2022. O pressuposto está diretamente relacionado com comportamentos e hábitos frequentes da sociedade moderna, desde o aumento do índice da obesidade populacional assim como o sedentarismo (INCA, 2020).
Todavia, ainda que a incidência dessa doença continue aumentando, essa não é uma patologia nova. Desde da antiguidade o termo genérico câncer tem sido associado a uma doença incompreendida. A etimologia da palavra surgiu quando Hipócrates (400 a.C) visualizou em um tumor e seus vasos sanguíneos a imagem de um caranguejo e suas patas, por isso do grego estabeleceu-se a nomenclatura “Karkinos”, na língua portuguesa: câncer (MUKHERJEE, 2012). Atualmente, sabe-se que a definição da palavra câncer consiste em uma variedade de mais de 100 doenças, as quais compartilham de uma característica em comum: o crescimento desordenado de células, as quais tendem a invadir outros tecidos e danificar órgãos (INCA, 2011).
De maneira genérica nossas células estão programadas a crescerem, multiplicam-se e morrerem. Este processo é chamado de ciclo celular, este envolve numerosos processos vitais e está intimamente relacionado ao crescimento e proliferação de células eucarióticas, desenvolvimento de organismos, regulação do reparo de danos no DNA e ocorrência de doenças. O ciclo celular consiste nas fases G1, S, G2 e M. Na fase G1, a célula cresce e se torna maior. A célula entra na fase S quando atinge um determinado tamanho. A fase S é o período para a síntese de DNA, durante o qual a célula duplica seu DNA. Na fase G2 seguinte, a célula monitora a conclusão da replicação do DNA e se prepara para a mitose. A segregação cromossômica e a divisão celular são concluídas na fase M. (WANG, 2021)
A progressão do ciclo celular é principalmente impulsionada e regulada por duas classes de proteínas, ciclinas e quinases dependentes de ciclina (CDKs), tais proteínas garantem a progressão adequada do ciclo celular para que cada uma das duas células-filhas receba cromossomos idênticos aos da célula-mãe. Para garantir a duplicação completa e correta do material genético existem pontos de verificação, conhecidos como “checkpoints”, que detectam DNA danificado e geram paradas em uma das fases G1, S e G2 do ciclo celular. (WANG, 2021)
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O controle do ciclo celular é garantido por complexos que atuam em diferentes pontos do ciclo. O complexos CDK4/ciclina D e CDK6/ciclina D desempenham papéis fundamentais no início e meio de G1, enquanto CDK2/ciclina E e possivelmente CDK2/ciclina A funcionam no estágio final. A fase S é marcada por uma baixa atividade de expressão gênica e síntese proteica, com exceção da síntese proteínas histonas. Todavia, sugere-se que exista um ponto de verificação S regulado por Cdk2. Para a fase G2/M os complexos de proteína quinase de ATR para Chk1 é ativada quando há estímulos genotóxicos. Checkpoint quinases CHK1 atuam como reguladores negativos do ciclo celular impedindo a progressão do ciclo, são ativadas em resposta a diversos insultos genotóxico. A Chk1 fosforila e inibe as fosfatases da família Cdc25, bloqueando assim a ativação de Cdk1 (cinase dependente de ciclina 1; também chamada de Cdc2) e impedindo a entrada mitótica prematura. (ENOMOTO et al. 2009)
Cada fase do ciclo emprega mecanismos moleculares únicos para impor o ponto de verificação. A parada em uma das fases do ciclo tem o objetivo de corrigir eventuais problemas na replicação e quando a correção não é possível há a indução da apoptose. Entretanto, sabe-se atualmente que as disfunções de checkpoint têm sido relacionadas ao câncer. (ZOU e LIN Z. 2021)
O câncer é uma patologia complexa com origem multifatorial sofrendo influência ambiental, genética, dos hábitos de vida e no caso do câncer de mama pela idade avançada (OLIVEIRA, 2019). Entretanto, esse progresso automatizado pode sofrer por interferentes internos ou externos e gerarem células-filhas com malformações genéticas não percebidas pelo sistema imunológico, esse processo é denominado carcinogênese. E a partir desse momento essas continuaram a multiplicar-se com a mutação vigente, desenvolvendo a patologia (INCA, 2011).
Portanto, as células cancerosas malignas diferem das normais pois apresentam a característica de multiplicação descontrolada, adiando também a sua morte celular programada, a apoptose (INCA, 2011). Ainda é incerto o processo de evolução dessa doença, mas de acordo com Hanahan e Weinberg (2011) o câncer possui marcas registradas as quais consistem em seis capacidades biológicas adquiridas, conferindo-lhe a habilidade de progredir como doença. São elas: a sustentação de sinais proliferativos, evitar os supressores de crescimento, resistir à morte celular,
permitir a imortalidade replicadora, induzir a angiogênese, ativar a capacidade de invasão e metástase (HANAHAN e WEINBERG, 2011).
Figura 1- O processo da carcinogênese
Fonte: INCA (2011).
Nos tecidos mamários o desenvolvimento dessa doença é uma problemática bastante frequente. O câncer de mama não é apenas o subtipo mais incidente em mulheres no mundo (exceto o de pele), mas o com maior mortalidade dessas (INCA, 2022). Dados de 2020 estimaram 2,3 milhões (24,5%) de novos casos neste ano, enquanto o número de óbitos contabilizou cerca de 684.996 óbitos, ou seja, 15,5% do total dos óbitos por câncer em mulheres (IARC, 2020). No Brasil, a situação é igualmente preocupante, visto que exceto o câncer de pele, o carcinoma de mama também é o tipo mais incidente em mulheres, com estimativa de 66.280 novos casos da doença em 2022 (INCA, 2022).
O adenocarcinoma mamário, por ser um carcinoma, é classificado como um tumor de origem de células epiteliais, diferindo-se dos demais carcinomas por ser gerado em um tecido que contém glândulas (INCA, 2011). Na mama, pode-se desenvolver a doença nos tecidos epiteliais de revestimento dos ductos mamários ou das glândulas produtoras de leite (FILHO et al., 2020). Em relação a sua área de progressão, pode ser classificado em in situ e invasivo, por meio da avaliação microscópica patológica.
(VIEIRA, 2017; BADVE, 2019; RODRIGUEZ, 2012). Em cada caso, há uma denominação adequada. Essa classificação está relacionada às células lesionadas e a característica de desenvolver metástase. Assim, o tipo carcinoma in situ abrange
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cerca de 15 a 20% dos casos, e seus subtipos são: ductal (80%) ou lobular (20%).
Esse afeta, caso seja tratado, apenas o seu local de origem. Em comparação com o tipo capaz de propagar-se em outros tecidos: o carcinoma de mama invasivo, o qual é mais comum e representa de 80-85% dos casos. Apresenta, entretanto, diversos subtipos heterogêneos, sendo o ductal invasivo o mais frequente em 70-80% das lesões (OTTINI et al., 2012; RODRIGUEZ, 2012).
A classificação anatómica patológica utiliza técnicas da imuno-histoquímica a fim de identificar os subtipos moleculares de carcinomas mamários in situ e fornecer informações sobre o seu prognóstico (GOBBI, 2012). A amostra pode ser adquirida por biópsia de agulha fina ou fixada em parafina, a fim de que seja possível avaliar a expressão de proteínas compostas na morfologia do tumor (CIRQUEIRA et al., 2011).
O procedimento é realizado através da incubação de anticorpos específicos para os receptores proteicos marcados com corantes, receptores do fator de crescimento epidérmico humano, estrógeno e progesterona (HER-2, RE e RP), possibilitando a visualização do resultado mediante a intensidade da coloração (SERRA et al., 2014).
Por meio desse método define-se quatro grupos de acordo com a expressão proteica observada: luminal A, luminal B, HER2 + e triplo negativo (DUTRA, 2019).
Outro parâmetro analisado é o índice de proliferação tumoral, conhecido como proteína Ki-67 (ZHANG et al, 2021). Esse é o parâmetro utilizado para avaliar a progressão do câncer de mama, apresentando o valor de corte de 20%, entretanto ainda não há consenso sobre esse valor pela comunidade acadêmica (HASHMI et al., 2019; DUTRA, 2019). Assim como as demais técnicas, essa também se utiliza anticorpos corados, entretanto com a finalidade de avaliar a expressão nuclear (DOWSET et al., 2011).
Os resultados na imuno-histoquímica são definidos como indeterminados em análise com coloração moderada em >30% ou forte em <30% das células, recomendando-se nestes casos a reavaliação por métodos mais específicos (GOBBI, 2012). Atualmente, outras metodologias de investigação são utilizadas para diagnóstico dos carcinomas mamários. Isso porque sabe-se que mesmo a neoplasia apresentando igual tipo patológico entre si, essas são capazes de possuírem expressões gênicas desiguais, gerando diferentes manifestações fisiológicas (VIEIRA et al., 2008). Os testes genéticos são um exemplo, posto que 5% a 10% são de origem
hereditária e geram mutações em 50% dos casos nos genes BRCA1 e BRCA2, além de HER2, CHEK2 e P53 (VIEIRA, 2017; FILHO et al., 2020).
Tabela 1- Classificação molecular por imuno-histoquímica dos carcinomas da mama
Fonte: Adaptado de Peruzzi (2016).
Um modelo valioso para estudos pré-clínicos sobre carcinoma mamário é a linhagem celular MCF-7. Essa é uma das mais utilizadas em pesquisa de câncer de mama, principalmente para testes de terapias antiestrogênicas e identificação de mecanismos de resistência a drogas (KAMATH et al., 2001). De acordo com a European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) a MCF-7 são células epiteliais isoladas de da mama de uma paciente de 69 anos com o diagnóstico de adenocarcinoma metastático. Em 1973, o cultivo celular dessa foi bem-sucedido apenas na sétima tentativa em Michigan Cancer Foundation, por isso denominou-se a sigla MCF-7 ao referir-se a ela. Apesar de sua origem a partir de metástases de um adenocarcinoma avançado, a linhagem celular não é invasiva e representa um modelo de doença em estágio inicial devido a presença de receptor de estrogênio RE funcional e dependência de estrogênio para crescimento (SCHMIDT, 2013).
Em relação ao tratamento de tumores mamários, no estado inicial geralmente inclui terapias sistêmicas adjuvantes. Quimioterapia, terapia endócrina e terapias direcionadas ao tecido melhoram a terapia local definitiva (cirurgia, radioterapia ou ambas), diminuindo substancialmente a recorrência do câncer e a morte específica da doença. Estabelece-se como tratamento padrão para mulheres com câncer linfonodal positivo ou com tumor maior que 1 cm a quimioterapia (MAUGHAN et al., 2010). A quimioterapia, todavia, não é uma terapia bem direcionada e afeta além das células
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tumorais, gerando danos fisiológicos e emocionais (MATOSO et al., 2015). Portanto, as dificuldades enfrentadas por pacientes oncológicos que fazem uso dessa terapia lidam com efeitos colaterais como náuseas, vômitos, diarreias, fadiga, alopecia, mucosite, alterações na pele e complicações como infecções e neuropatia (FERREIRA e FRANCO, 2017; ALMEIDA et al. 2004). Dessa forma, há a urgência de desenvolver potenciais novas drogas que sejam efetivas para tratamento dessas neoplasias, a fim de proporcionar alternativas coadjuvantes efetivas de tratamento.
O avanço tecnológico proporcionou o aumento do desenvolvimento de estudos para novas formas de tratamento do câncer. De maneira interessante, há um interesse em produtos naturais que perpetua na nossa sociedade, comprovada por meio de pesquisas as crenças antigas da medicina popular. Atualmente, é inquestionável o uso de certas plantas medicinais para fins curativos. Segundo Estáquio (2017) essa relação é quase a mesma, posto que no mercado encontra-se 49,6% de compostos sintéticos e 50,4% fármacos de origem natural ou derivado (moléculas produzidas por plantas ou microrganismos ou artificialmente modificadas a partir dessas precursoras) (ARANTES, 2017). Na área da terapia anticâncer, constatou-se eficácia de uma ampla variedade de substâncias isoladas de produtos orgânicos, de modo que atualmente cerca de 60% dos fármacos utilizados para tratamento dessa doença têm origem natural (ALVES, 2013; COSTA-LOTUFO et al., 2010). Destaca-se nesse contexto os medicamentos: paclitacel, docetaxel, vimblastina e etoposídeo, utilizados na quimioterapia (VIEIRA et al., 2020). Dessa forma, estudos que sugerem o potencial antitumoral de um extrato de planta vegetal pode tanto se tornar uma alternativa de tratamento adjuvante como posteriormente ser pesquisadas substâncias isoladas desses compostos responsáveis pela propriedade e supostamente desenvolver uma nova droga para uso. Para isso, investigações iniciais simples com plantas pouco conhecidas devem ser realizadas, como pretende o presente estudo, a fim de explorar a flora biodiversa como a do Brasil e prosseguir a busca para potenciais tratamentos alternativos para o câncer de mama.
Nesse contexto, pode-se destacar a Myrsine rubra M.F. Freitas & Kinoshita, um exemplo de espécie pouco estudada, mas com composição química promissora.
Descoberta e descrita em 2005 na literatura, esse arbusto apresenta uma localização restrita: é retratado que essa é nativa do Brasil e se apresenta disposta na Costa da
Mata Atlântica, entre os estados do Espírito Santo até o Paraná (FRANÇA et al., 2011;
FREITAS E KINOSHITA, 2005). Essa árvore pertence à família Primulaceae, subfamília Myrsinaceae e é uma das 300 espécies encontradas em diversas regiões tropicais (FREITAS E KINOSHITA, 2005). No Brasil, muitas espécies como a Myrsine rubra, são conhecidas popularmente como “capororoca”. Ao descrever suas características Freitas e Kinoshita (2005) mencionam a presença de folhas menores quando comparada com outra espécie, menos flores e a presença de frutos com formato de elipse.
Figura 2- Myrsine Rubra M. F. Freitas & L. S. Kinoshita
Fonte: foto cedida pelo professor Hildegardo França.
Em relação a composição química da Myrsine rubra, sabe-se que apresenta um conjunto de metabólitos flavonoides (FRANÇA et al., 2011). Esses compostos apresentam caráter citotóxico em células de câncer (MACHADO et al., 2008;
RADHIKA et al., 2012), assim como efeito antitumoral em diferentes espécies do gênero Myrsine (TOMIO, 2011; MEDEIROS et al., 2013). Portanto, faz-se necessário a investigação do potencial citotóxico do extrato de Myrsine rubra em células de adenocarcinoma de mama, a fim de aumentar pesquisas que são escassas sobre essa árvore nativa brasileira e empenhar-se em futuramente desenvolver novas alternativas tanto efetivas quanto coadjuvantes de tratamento do câncer de mama.
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1.1 OBJETIVOS
1.1.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o potencial antitumoral citotóxico do extrato hidroetanólico das folhas de Myrsine rubra por meio de ensaios citotóxicos em células de câncer de mama (Linhagem MCF-7).
1.1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Desenvolver as técnicas de cultivo celular;
• Testar diferentes concentrações do extrato de Myrsine rubra M.F. Freitas &
Kinoshita;
• Realizar o ensaio de viabilidade celular por meio do corante azul de tripan;
• Avaliar os níveis citoplasmáticos de espécies reativas de oxigênio por citometria de fluxo;
• Analisar o ciclo celular e determinar a possível fragmentação de DNA;
• Identificar possíveis mecanismos de ação do extrato sobre a linhagem tumoral.
2 METODOLOGIA
2.1 Preparação do extrato de Myrsine rubra M.F. Freitas & Kinoshita
O procedimento de obtenção do extrato das folhas de Myrsine rubra foi realizado pelos alunos do professor Dr. Hildegardo Seibert França no Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Vila Velha. Seguiu-se o protocolo em que as folhas foram submetidas à secagem em estufa com ventilação forçada de ar, com temperatura de 40ºC por 48 horas, após secagem a folhas foram moídas em moinho de facas e em seguida submetidas a extração por maceração em etanol 96% (v/v) até esgotamento.
Por fim, o extrato obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório até completa remoção do solvente. O extrato foi então acondicionado em eppendorf e mantido sob refrigeração (4 ºC) até o uso.
Figura 3- Fluxograma do protocolo completo de obtenção do extrato bruto hidroetanólico das folhas de Myrsine rubra
A preparação das concentrações foi realizada um dia antes do tratamento dos ensaios. Para isso, cálculos foram realizados a fim de estabelecer as concentrações ideais para tratar as células, assim o extrato bruto das folhas de Myrsine rubra foi pesado em balança analítica obtendo-se 62,5 mg. Logo após foi realizada a
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dissolução desse em 1000 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) filtrado a 99,9%.
Posteriormente, essa solução foi novamente filtrada utilizando um filtro com membrana PES 0,22μm para seringa, removendo partículas de sua amostra. Essa solução foi então utilizada para a preparação da solução mãe a 10mg/mL (160 μL do extrato diluído com 840 μL de DMSO). Por fim, a partir da solução mãe foi realizado as diluições em PBS para obtenção das concentrações de estudo 1μg/mL, 5μg/mL, 10 μg/mL, 25μg/mL, 50μg/mL e 100μg/mL. A solução utilizada no controle positivo foi preparada com 900μL de PBS e 100μL de DMSO, de modo a simular a condição de maior concentração de tratamento de DMSO a 1%.
Figura 4- Concentrações do extrato bruto hidroetanólico das folhas de Myrsine rubra
2.2 Técnica do cultivo celular
A linhagem celular MCF-7 foi obtida do Laboratório de Biologia Celular e Molecular do Câncer Humano, coordenado pela professora Dra. Leticia Batista de Azevedo Rangel da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES). A escolha do modelo celular foi feita em virtude de sua origem e características, posto que essa é um tipo celular originário de câncer do tecido epitelial\glandular mamário (ECACC, 2022). Durante dois meses, as células foram mantidas em garrafas de 75cm2, proporcionando a aderência e interação célula-célula necessária para esse tipo celular. No recipiente foi adicionado 15 mL de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB, 1% de solução estabilizada de penicilina/estreptomicina (103 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina por mL).
Figura 5- Linhagem MCF-7 observada no microscópio invertido. Aumento de 10x (A).
Aumento de 40x (B)
O meio de cultivo era substituído por um novo, três vezes na semana, a fim de assegurar nutrientes para o desenvolvimento dessa linhagem. Os recipientes eram armazenados em incubadora a 37°C e atmosfera de 5% de CO2, simulando o ambiente ideal de crescimento. A confluência, ou seja, a concentração de células viáveis no meio, eram analisadas diariamente em microscópio óptico de luz invertida.
A partir do momento em que a confluência se encontrava a 90%, realizava-se o repique celular, expandindo as garrafas e assim o espaço de crescimento dessas células. No momento em que a taxa de multiplicação estava crescente e estável, iniciou os ensaios de citotoxicidade.
2.3 Avaliação da viabilidade celular com azul de tripan 2.3.1 Câmara de Neubauer
Para a realização da contagem é obtido uma alíquota da amostra contendo as células já desprendidas da garrafa de cultura e ressuspensa em um determinado volume de meio conhecido. À alíquota é adicionado o corante azul de tripan e têm se o fator de diluição. Utilizamos para a contagem na rotina do nosso laboratório 10μL de amostra e 10 uL de azul de tripan, obtendo-se o fato de diluição 2. Retira-se então 10μL dessa solução e prossegue-se para a contagem.
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A contagem de células da linhagem MCF-7 é feita utilizando a Câmara de Neubauer, também conhecido como hemocitômetro, esse dispositivo permite a contagem de células em um volume específico de solução. A Câmara de Neubauer consiste em uma lâmina grossa de vidro medindo 30 X 70 mm e 4 mm de espessura, contém duas câmaras para contagem independentes, uma superior e uma inferior. (CÂMARA, 2015)
Cada câmara contém uma grade de contagem 3 mm x 3 mm, que é subdividida em nove quadrantes de 1 mm x 1 mm. A lamínula é colocada sobre a câmara o volume obtido desse espaço é de 0,1 mm³. A contagem é realizada nos quatro quadrantes externos, e o resultado real da contagem é obtido após a conversão pela fórmula de contagem. (SPLABOR,2021)
Figura 6- Câmara de Neubauer
Fonte: Adaptado de centerlab (2022).
Para obter o número de células por mL, conta-se os 4 quadrantes das extremidades da câmara de Neubauer, dividindo-se por 4 para obtenção de uma média. Multiplica-se então esse valor pelo fator de diluição realizado anteriormente entre as células e a solução de azul de tripan e por fim multiplica-se por 10.000 que é o fator de correção da câmara de Neubauer, este valor considera o espaço entre a câmara e a lamínula com volume de 0,1 mm3 ou 1x104 mL. (SPLABOR,2021)
Assim, tem-se o cálculo para contagem de células:
2.3.2 A viabilidade celular
A contagem para determinar a viabilidade celular foi realizada utilizando a câmara de Neubauer e feita por meio do ensaio de exclusão de azul de tripan. Este é um ensaio simples e importante para a determinação rápida da viabilidade celular em cultura e para quantificar a morte celular após o tratamento com qualquer estímulo citotóxico (CROWLEY et al., 2016). O azul de tripan é um corante colorimétrico que cora as células mortas com uma cor azul e as células viáveis não irão permanecer coradas. Este teste avalia a integridade da membrana celular, se baseia no princípio de que as células vivas possuem membranas celulares intactas que excluem certos corantes, como azul de tripan, eosina ou propídio, enquanto as células mortas não (STROBER, 2015).
Para o ensaio de viabilidade, foi adicionado 3 mL de tripsina em uma garrafa de 75cm2 contendo, a linhagem tumoral estudada. A tripsina é uma enzima proteolítica responsável pela remoção das células aderentes de uma superfície de cultura (HUAN et al., 2010) Após o desprendimento as células foram transferidas para um Tubo Falcon, uma alíquota foi coletada e contada com azul de tripan a fim de obter o número de células necessárias para o experimento.
Foram então semeadas 7,7 x 104 células/poço em 2 placas estéreis de 12 poços e incubadas durante a noite para adesão das células. No dia seguinte, as células foram tratadas adicionando 900μL de meio RPMI suplementado mais 100μL do extrato bruto de Myrsine rubra. As concentrações do extrato analisadas foram 1μg/mL, 5μg/mL, 10 μg/mL, 25μg/mL, 50μg/mL e 100μg/mL e os tempos de incubação foram 24, 48 e 72h. Aos controles negativos foram adicionados 1000μL de RPMI completo e os controles positivos 900μL com 100μL de solução com 10% DMSO diluído em PBS.
Após os períodos de tratamento com os extratos, retirou-se o meio contendo a solução com o extrato, as células foram lavadas duas vezes com PBS e adicionou-se
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100 μL de tripsina em cada poço. Após o desprendimento das células, elas foram transferidas para um microtubo e centrifugadas a 1200 rpm por 10 minutos e ressuspendidas novamente em 1 mL de PBS. A contagem, enfim, foi realizada utilizando 10μL das células e 10 μL de azul de tripan. O mesmo procedimento foi realizado para todos os tempos e o ensaio foi feito em triplicata para cada concentração.
Por fim, a viabilidade então foi quantificada pelo número de células viáveis e vivas dividido pela quantidade total de células contadas (células vivas e células não viáveis e mortas), como exemplifica a fórmula:
Figura 7 - Células viáveis identificadas (setas brancas) e células mortas não viáveis (setas azuis) em câmara de Neubauer
2.4 Ensaios por citometria de fluxo 2.4.1 Citometria de fluxo
O citômetro de fluxo é um equipamento usado para análise de diversos parâmetros celulares. Entre esses, os mais simples são a avaliação do tamanho e complexidade (granulosidade) de cada evento de modo singular. Isso é feito por meio do método em que se utiliza um fluxo de lasers incidente sobre esses corpos celulares, os quais os sinais de luz e fluorescência emitidos serão lidos por detectores e através de softwares de análises são representados em gráficos. O gráfico habitual para a
visualização desses eventos é o histograma de dois parâmetros, o qual correlaciona em um eixo a medida da dispersão da luz na direção direta (Forward Scatter ou FSC) e no outro na direção lateral de 90º (Side Scatter ou SSC). Essas técnicas são associadas ao tamanho relativo da célula assim como a sua complexidade ou granularidade, respectivamente (MCKINNON, 2018; SHEHAT e JUSTINE, 2019).
Figura 8 - Citômetro de Fluxo FACSCanto II (BD)
2.4.2 Preparação das amostras para realização dos ensaios
Garrafas com confluência maior que 90% foram tripsinizadas com 3mL e a contagem foi realizada. As células foram plaqueadas em placas de 12 poços com concentração de 7,7x104 células/poço, após o tempo de 24 horas para aderirem, foram tratadas com 100μL das concentrações 1μg/mL, 5μg/mL, 10 μg/mL, 25μg/mL, 50μg/mL e 100μg/mL do extrato, juntamente com 900μL de meio RPMI completo. Aos controles negativos foram adicionados 1000μL de RPMI completo e os controles positivos 900μL de RPMI com 100μL de solução DMSO/PBS.
Em cada grupo o ensaio foi realizado em triplicata. Seguindo o protocolo anteriormente estabelecido por Porto et al., (2015), foram desagregadas as células da linhagem MCF-7 de cada poço após 72 horas de tratamento de cada grupo. Essas
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células foram centrifugadas a 1200 rpm por 10 minutos e lavadas duas vezes com PBS e ao final foram ressuspendidas em 300μL de PBS em microtubos identificados para cada grupo, a fim de gerar uma concentração conhecida de cerca de 1x106 células/mL.
Figura 9- Placas de 12 poços utilizada nos ensaios
2.4.3 Ensaio de morte celular por iodeto de propídio (PI)
Dentre os diversos parâmetros analisados por citometria de fluxo, por meio do uso do corante fluorocromo iodeto de propídio (PI) é possível analisar as células viáveis e não viáveis. O PI é um corante vital e impermeável à membrana plasmática íntegra, assim células negativas para a marcação com PI estão viáveis enquanto células coradas estão mortas (RIEGER et al., 2011).
As amostras anteriormente preparadas foram transportadas à Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), onde no laboratório de Fisiologia Translacional foram realizados os ensaios no citômetro de fluxo modelo FACSCanto II (BD). Às amostras de células anteriormente preparadas foram adicionadas 2µL de uma solução de iodeto de propídio (50 µg/mL). Essas foram incubadas durante 30 minutos e centrifugadas a 1200 rpm por 10 minutos, lavadas e ressuspendidas em 200 µL de
PBS. Durante o procedimento as amostras foram protegidas da luz. A fluorescência emitida pelo PI foi medida no citômetro de fluxo.
2.4.4 Ensaio de análise do ciclo celular por iodeto de propídio (PI)
O corante iodeto de propídio possui a capacidade de intercalar ao DNA celular.
Desse modo, após um processo de sensibilização das membranas das células, este associa-se ao material genético. Assim, com a quantificação do corante é possível mensurar o DNA. A análise por citometria fornece histogramas da fluorescência emitidas pelo PI, capazes de quantificar a presença de DNA fragmentado (classificado como a região sub-G0/G1), DNA normal (diploide – região G0/G1, antes da síntese de DNA), DNA em processo de duplicação (região S) e DNA duplicado (poliploide – região G2/M) (CAMPAGNARO et al., 2013).
O protocolo utilizado foi anteriormente estabelecido por Porto et al., (2015). As células foram ressuspensas 50µL em 500µL da solução de permeabilização (Tris-Cl a 3,4mM, NaCl a 10mM, 50µL de RNAse A, 750µg de PI, 15µL de Triton X-100).
Incubadas durante 15 minutos e centrifugadas a 1200 rpm por 10 minutos, lavadas e ressuspendidas em 500 µL de PBS. Durante o procedimento as amostras foram protegidas da luz. A fluorescência emitida pelo PI foi medida no citômetro de fluxo. A taxa de aquisição foi de 200 células/segundos para que fosse possível diferenciar singlets e doublets. Além disso, foi feito um citograma da fluorescência de PI versus FSC (FSC vs. PI) para excluir debris. A análise dos dados foi realizada utilizando o software FACSDiva.
Figura 10- Análise do conteúdo de DNA pela marcação com iodeto de propídeo.
Histograma típico representativo do ciclo celular avaliado por citometria de fluxo com o uso de PI
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Fonte: PORTO (2015).
2.4.5 Estresse oxidativo
A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) é natural do organismo, isso porque esses são considerados subprodutos gerados em virtude da redução parcial do oxigênio consumido no metabolismo celular (BARBOSA, 2010). A problemática ocorre a partir do momento em que esses níveis são produzidos em excesso e as substâncias antioxidantes não são suficientes para reagir com essas moléculas. Esse desequilíbrio gera o estresse oxidativo e é capaz de produzir alterações prejudiciais ao sistema fisiológico. O câncer é uma entre outras doenças que o seu desenvolvimento também pode estar relacionado a esses radicais livres, posto que esses são capazes de causar danos ao DNA característico da doença (LIMA, 2012).
Em contrapartida, sabe-se que o aumento da produção das EROs pelas células gera interações de dano com o DNA e RNA e em casos mais graves promovem a morte celular dessas (LIU et al., 2021). Assim, pensando-se em células neoplásicas, esse efeito pode ser induzido a fim de gerar um ambiente citotóxico com potencial antitumoral. Dessa forma, analisou-se esse parâmetro a fim de investigar se o efeito citotóxico do extrato de Myrsine rubra poderia ocorrer em virtude de alterações nos níveis citoplasmáticos de EROs.
2.4.6 Determinação de níveis citoplasmáticos de EROS
O ensaio capaz de avaliar os níveis citoplasmáticos de EROS é medido por meio da intensidade de fluorescência emitida pelo marcador o 2’,7’-diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA). O composto 2’,7’-diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) é um éster não fluorescente, mas que é apto a adentrar nas células. No interior do citoplasma é encontrado especialmente em regiões hidrofóbicas na sua forma DCFH, produtos de reações por esterases do citoplasma. Assim, o DCFH é oxidado por EROS formando a substância apolar passível de ser quantificado de maneira diretamente proporcional pela sua fluorescência: o diclorofluoresceína (DCF).
A quantificação de EROS no interior das células foi contabilizada por meio da fluorescência emitida pela diclorofluoresceína (DCF). (PORTO, 2015; SPRADA, 2014).
As amostras de células preparadas foram incubadas com DCF-DA (20 mM), por 30 minutos à 37°C no escuro. Após a incubação, as células foram lavadas e ressuspendidas com PBS, os cuidados de manter essas amostras refrigeradas e protegidas da luz foram feitos. No equipamento, as amostras foram excitadas a 488 nm e para cada grupo foram gravados, para posterior verificação, dez mil eventos. A fluorescência de DCF foi medida utilizando filtro 530/30 nm. A análise de dados foi realizada posteriormente pelos softwares FACSDiva e FCS Express 8 Plus. (PORTO et al., 2015; GUERRA et al.,2022).
2.5 Análise estatística
Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão de três determinações independentes. A análise estatística dos dados de ensaio por azul de tripan foi feita pelo método ANOVA 1 via post hoc Dunnett’s test multiple comparisons test. no GraphPad Prism versão 8.0 (GraphPad Software). A diferença foi considerada estatisticamente significante quando p < 0 .05 (*).
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3 RESULTADOS
3.1 Avaliação da viabilidade celular com azul de tripan
O efeito do extrato hidroetanólico de Myrsine rubra na viabilidade da linha celular MCF-7 do adenocarcinoma mamário foi analisada pelo teste de exclusão de azul de tripan. Este teste avalia a integridade da membrana celular, se baseia no princípio de que as células vivas possuem membranas celulares intactas que excluem certos corantes, como azul de tripan, eosina ou propídio, enquanto as células mortas não (STROBER, 2015). O efeito citotóxico em termos de morte celular foi determinado pelo tratamento da linhagem celular MCF-7 com as diluições de extrato 1μg/mL, 5μg/mL, 10 μg/mL, 25μg/mL, 50μg/mL e 100μg/mL nos tempos de 24, 48 e 72h.
No menor tempo de exposição das células ao extrato de Myrsine rubra houve uma redução significativa na viabilidade celular nas concentrações de 50μg/mL e 100μg/mL (gráfico 1). No tempo de 48h houve um decréscimo significativo da viabilidade nas concentrações de 10μg/mL, 25μg/mL, 50μg/mL e 100μg/mL, de maneira independente do aumento da concentração do extrato (gráfico 2).
Gráfico 1 e 2- Viabilidade das células MCF-7 após tratamento em diferentes concentrações do extrato de Myrsine rubra nos tempos de 24h e 48h, respectivamente
Os valores estão expressos como média± desvio padrão, *p<0.05 vs. veículo.
No tempo de 72h de tratamento é possível visualizar uma diminuição significativa da viabilidade em padrão proporcional ao aumento da dose (gráfico 3).
Nesse tempo, os resultados demonstraram uma diminuição das células viáveis à medida que há um aumento das células não viáveis, dependentes da dose do extrato.
Em todas as concentrações houve uma diminuição significativa da viabilidade celular.
O índice de concentração inibitória (IC50) é um indicador que retrata, por meio de cálculos, a concentração mínima de um fármaco ou droga capaz de inibir em 50%
alguma ação biológica, neste caso estabelecido como a viabilidade (MINHO et al., 2016). Assim, tem-se que o IC50 no tempo de 72h é estimado na concentração de 8,957 μg/mL para as células MCF-7, no experimento realizado.
Gráfico 3- Viabilidade das células MCF-7 após tratamento em diferentes concentrações do extrato de Myrsine rubra por 72h
Os valores estão expressos como média± desvio padrão, *p<0.05 vs. veículo.
Com base nos ensaios de toxicidade de azul de tripan, foi determinado os ensaios subsequentes. Definiu-se que seria avaliado por meio do citômetro de fluxo:
o ciclo celular por corante iodeto de propídio e os níveis de espécies reativas de oxigênio. O tempo que apresentou melhor resultado foi o de 72h, portanto, as análises
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de investigações foram realizadas apenas para esse tempo em todas as concentrações dos extratos.
Figura 11 - Viabilidade das células MCF-7 após tratamento em diferentes concentrações do extrato de Myrsine rubra por 72h
Diminuição da viabilidade das células MCF-7 após tratamento com o extrato de Myrsine rubra em diferentes concentrações por 72h. A – Controle do veículo com DMSO 1%. B – Tratamento com Myrsine rubra 25μg/mL. C– Tratamento com Myrsine rubra 50μg/mL. D – Tratamento com Myrsine rubra 100μg/mL.
3.2 Ensaio de morte celular por iodeto de propídio (PI)
Os resultados do ensaio que avalia o número de células mortas por meio do corante iodeto de propídio apresentou conformidade com o ensaio de exclusão do corante azul de tripan, anteriormente realizado. Comparados com o veículo, todas as concentrações, exceto a de 1μg/mL, apresentaram aumentos significativos de células não viáveis. A maior atividade antitumoral para células MCF-7 no tempo de 72h foi visualizada no tratamento mais concentrado de 100μg/mL. Em relação ao veículo, a quantidade de células mortas aumentou cerca de 10%. Na concentração de 50μg/mL a diferença é menor, demonstrando um valor aproximadamente 6% acima do veículo.
As demais concentrações de 5μg/mL, 10μg/mL e 25μg/mL, apresentaram pouca
variação entre seus resultados, mas os valores mesmo assim ainda foram significativos.
Gráfico 4- Porcentagem de células mortas após as diferentes concentrações de tratamento no tempo de 72h
Os valores estão expressos como média± desvio padrão, *p<0.05 vs. veículo.
3.3 Ensaio de análise do ciclo celular por Iodeto de Propídio (PI)
O extrato de Myrsine rubra alterou significativamente o ciclo celular das células MCF-7 na concentração de 100 μg/mL para o tempo de 72h. Os resultados relatados na tabela 2 demonstraram que a porcentagem de células na fase G2/M e Sub G0 aumentaram (14,66±0,30 e 2,58± 0,22, respectivamente) em comparação ao controle (7,71±1,04 e 1,15±0,05, respectivamente). Enquanto isso, as proporções de células na fase G0/G1 foram diminuídas, sugerindo que a atividade citotóxica de extrato pode estar associada à parada da fase G2/M e apoptose de células MCF-7.
O efeito na fase Sub G0 já era evidente em concentrações de 1μg/mL e aumentou consideravelmente significativas para as concentrações de 25μg/mL, 50μg/mL e 100μg/mL (1,76±0,05; 1,90 ± 0,16 e 2,58±0,22; respectivamente) em relação ao veículo (1,15±0,05). Embora tenha havido uma tendência de diminuição de células MCF-7 na fase de duplicação celular (fase S), essas alterações não foram significativas em nenhuma das concentrações testadas.
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Tabela 2- Perfil do ciclo celular durante o tratamento das células MCF-7 em diferentes concentrações do extrato para o tempo de 72h
Os valores estão expressos como média± desvio padrão, *p<0.05 vs. veículo.
3.4 Determinação de níveis citoplasmáticos de EROS
A dosagem de diclorofluoresceína (DCF) é uma forma de avaliar as espécies reativas de oxigênio (EROs) a nível celular. No presente estudo essa foi quantificada a fim de investigar a ação citotóxica por meio do aumento de EROS, gerando um estresse oxidativo possivelmente capaz de induzir as células à apoptose. Os resultados exibiram uma diferença significativa apenas na maior concentração de 100μg/mL. Nas demais concentrações de tratamento houve mínima variação no resultado, gerando medidas sem significância.
Gráfico 5- Dosagem dos níveis citoplasmáticos de EROs durante o tratamento das células MCF-7 em diferentes concentrações do extrato no tempo de 72h
Os valores estão expressos como média± desvio padrão, *p<0.05 vs. veículo
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4 DISCUSSÃO
No presente trabalho, investigou-se a atividade citotóxica do extrato hidroetanólico bruto de Myrsine rubra na viabilidade celular da linhagem tumoral de câncer de mama MCF-7. Até o presente momento, nosso estudo é o primeiro a avaliar a atividade citotóxica extrato de Myrsine rubra na literatura. Nossos resultados demonstram que houve uma redução significativa da viabilidade, com interferência no ciclo celular e aumento do estresse oxidativo, principalmente no tempo de 72h para a concentração de 100μg/mL, demonstrando um potencial citotóxico da Myrsine rubra.
O pouco que se sabe sobre a composição do extrato de Myrsine rubra foi demonstrado por França (2011), através de estudos fitoquímicos. O estudo identificou a presença de flavonoides, uma classe de compostos polifenólicos, no extrato etanólico de Myrsine rubra. Os flavonoides, entre as drogas anticancerígenas e preventivas do câncer, são os mais estudados (HASHEMZAEI, et al. 2017;
SELVAKUMAR, 2020).
Embora uma comparação direta não possa ser realizada, estudos anteriores de Laraib (2021), Medeiros et al., (2013) e Girardi et al., (2012) avaliaram por meio de diferentes metodologias o potencial de inibição celular que podem estar associados a plantas pertencentes ao mesmo gênero Myrsine. Estes estudos demonstraram que M. africana, Myrsine coriacea e Myrsinaceae peruanas apresentam potencial de inibição da proliferação celular em linhagens tumorais, incluindo MCF-7. Um estudo anterior de Cabanillas et al., (2016) avaliou a atividade citotóxica do resorcinol, composto isolado de plantas pertencentes à mesma família Primulaceae, contra linhagens tumorais 3T3, H460, DU145 e MCF-7. O estudo demonstrou que o resorcinol demonstrou forte atividade citotóxica com valores de IC50 variando entre 22 e 100μM para todas as linhagens celulares testadas. Na linhagem MCF-7 o IC 50 ficou 76μM. Tais estudos fortalecem nossos resultados sobre o potencial anticancerígeno que plantas do mesmo gênero e família que a Myrsine rubra.
Nossos resultados, conforme expostos no gráfico 3, demonstraram por meio do teste de exclusão do azul de tripan que o extrato de Myrsine rubra expressou uma tendência de diminuir a viabilidade MCF-7 de modo dependente da dose e do tempo em todos os tempos estudados, principalmente para o tempo de 72h. Sugere-se que a exposição prolongada ao tratamento pode ter um efeito potencializador do seu efeito. O ensaio com azul de tripan, embora seja amplamente utilizado, apresenta
limitações, estando sujeito a maiores variáveis na contagem (AVELAR et al., 2014).
Portanto, para confirmar o aumento da mortalidade das células MCF-7, foi realizado um ensaio com maior precisão ainda para o tempo de 72h: o teste de morte celular por iodeto de propídio com leitura pelo citômetro de fluxo.
Os resultados relatados no gráfico 4 mostraram que o tratamento com extrato trouxe um aumento significativo na porcentagem do número de células mortas dependente da concentração do extrato, corroborando com nosso achado de diminuição da viabilidade no teste com azul de tripan. O que está de acordo com estudos precedentes que analisaram o efeito do tratamento de diferentes flavonoides e demonstraram como resultado a diminuição da viabilidade de células tumorais, incluindo a MCF-7 (RADHIKA, 2012; KONG,2019). Em ambos por meio de outras análises o evento foi atribuído à proteólise de Poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP- 1). Alguns quimioterápicos utilizam essa via a fim de induzir a apoptose celular. Visto que ao ocorrer a quebra do DNA essa enzima é ativada e catalisa, por meio da utilização de NAD+, há transferência de ADP-ribose às proteínas-alvo. A partir do momento que há um uso das NAD+ para essa função, a sua atribuição de reação de elétrons na mitocôndria é prejudicada, ameaçando a sobrevida das células (DAMIANI, 2016).
A quebra de caspases e PARP, além do aumento dos níveis de expressão de p53 são mecanismos discutidos por ocorrerem em concomitância. Diversos estudos demonstram esses resultados quando visualizados os efeitos citotóxicos de polifenóis (D’ANGELO et al., 2017; FINI et al., 2007; PLAUMANN et al., 1996). Esses são um conjunto de mecanismo envolvidos no processo de indução da apoptose. As caspases são proteases que ao sofrerem clivagem geram uma cascata proteolítica. Enquanto o p53 é o gene mais associado quando se fala de câncer, pelo fato de que esse é ativado em resposta a dano celular (CONTE et al., 2012). Em sua funcionalidade normal é um gene supressor de tumor. A junção desses fatores, portanto, podem ser possíveis vias de atuação de citotoxicidade do extrato de Myrsine rubra. Entretanto, estudos direcionados devem ser feitos para confirmar essa suposição.
As moléculas encontradas no extrato de Myrsine rubra por França (2011) foram a miricetina-3-O-α-Lramnopiranosideo, a quercetina-3-O-α-L-ramno- piranosideo (quercitrina), kaempferol-3-O-β-D-(6''-galoil)-glicopiranosideo, luteolina-3'-α-L- ramnopiranosideo e epicatequina. Tais compostos têm sido associados à supressão
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da viabilidade celular e indução da apoptose de células MCF-7 conforme demonstrado por Sajedi et al., (2020), Kabała-Dzik et al., (2018), Yi et al., (2016) e Wang et al., (2012) e confirmam os nossos achados apresentados nos gráficos 1, 2, 3 e 4.
O aumento de células mortas foi um resultado que se confirmou nos três experimentos realizados neste estudo. Além dos ensaios de viabilidade por azul de tripan e mortalidade por PI, esse achado também está evidente por meio dos resultados da análise do ciclo celular.
A citotoxicidade induzida pelo extrato de Myrsine rubra foi confirmada com a análise do ciclo celular conforme ilustrado na tabela 2. O ciclo celular é um processo responsável pela duplicação da estrutura do DNA e consequente divisão da célula, é regulada por uma rede complexa de interações entre proteínas, enzimas, citocinas e vias de sinalização. Danos à estrutura do DNA podem provocar uma parada do ciclo celular para ativar vias de reparo, o que é caracterizado pelo aumento da porcentagem de DNA em uma das fases do ciclo, porém danos excessivos e/ou falhas nos mecanismos de reparo ativam mecanismos de morte celular (BARNUM e O'CONNELL, 2014; SUN et al., 2021) Portanto, a indução de apoptose em células tumorais é altamente desejável durante a quimioterapia do câncer e se tornou um novo alvo na busca por drogas antitumorais (CHEN 2016).
Os dados apresentados na tabela 2 demonstram que a concentração de 100ug/mL do extrato Myrsine rubra alterou o ciclo celular com parada na fase G2/M com consequente diminuição de células na fase G1/G0. Estudos anteriores relataram propriedades citotóxicas de constituintes ativos de plantas através da parada G2/M, assim como muitos fármacos utilizados na clínica atuam nessa fase, como doxorrubicina, irinotecano, etoposídeo e paclitaxe (ARMANIA et al., 2013; LEE et al., 2019; ANDROUTSOPOULOS e SPANDIDOS, 2018)
Além disso, foi possível a detecção de danos ao DNA (fase subG0) observado pelo aumento de DNA fragmentado. Esse acúmulo de células em subG0 é um importante marcador de indução de morte celular por apoptose (SHUJAA et al., 2021).
Dessa forma, nossos dados corroboram a outros estudos que associam a morte celular aos mecanismos de parada do ciclo celular na fase G2/M. (CHEN, 2016;
ARMANIA et al., 2013; ANDROUTSOPOULOS, e SPANDIDOS, 2018)
Espécies reativas de oxigênio podem promover ações diretas na ativação da proteína quinase CHK1 (Checkpoint quinase 1) ou afetar diretamente a família da
proteína fosfatase Cdc25. A inibição de Cdc25 previne a de-fosforilação de Cdc2 (quinase dependente de ciclina) e ativação da mesma, impedindo o ciclo de continuar (ARMANIA et al., 2013; SUN et al., 2021; SRINIVAS et al. 2019.)
Nesse contexto, suspeitou-se que o extrato gerou estresse oxidativo prejudicial às células, posto que o acúmulo de espécies reativas do oxigênio pode induzir lesões no DNA nuclear, quebras de fitas e degradação do DNA mitocondrial. (SRINIVAS et al, 2019). Em resumo, esse processo pode induzir o processo apoptótico (JONES et al., 2008). No tratamento de 100ug/mL, como demonstrado no gráfico 5, houve um aumento significativo do estresse oxidativo mediada por EROS dosado pelo ensaio de DCF.
Os flavonoides possuem propriedades antioxidantes bem estabelecidas, principalmente devido a sua capacidade facilitada de doar elétrons ou hidrogênio (HU et al., 2021; ZHANG et al., 2016; SOUSA, 2012). Entretanto, apesar de serem antioxidantes em condições normais e demonstrarem tendência de diminuir o estresse oxidativo, novos estudos evidenciaram que os polifenóis são capazes de gerar um ambiente pró-oxidante (DHANYA et al., 2021; FENG et al., 2019). Assim, em células neoplásicas os flavonoides podem atuar induzindo a apoptose por meio do aumento pró-oxidativo, confirmando não apenas nossa teoria como o dado obtido na concentração de 100μg/mL (HADI et al., 2000; KOPUSTINSKIENE et al., 2020).
A ação pró-oxidante dos polifenóis é atribuída a mobilização da reação redox do cobre endógeno, principalmente reduzindo o Cu3+ ligado a cromatina em Cu2+, cuja tentativa de reoxidação gera uma quantidade de EROs que promove um ambiente instável para moléculas como o DNA (HADI et al., 2007; HADI et al., 2000). Um ensaio específico elucidou a habilidade do flavonoide miricetina em ser tanto antioxidante como pró-oxidante, dependendo das moléculas que interagem no local (CHOBOT &
HADACEK., 2012). Esses achados podem explicar o resultado obtido pelo nosso estudo e justificar a capacidade pró-oxidativa dos compostos polifenóis do extrato.
Em resumo, podemos associar nossos dados a mecanismos de parada do ciclo celular já bem estabelecidos. Observamos que o extrato de Myrsine rubra diminuiu a viabilidade celular dependente do tempo e da dose. Tais efeitos podem estar associados a um aumento de EROS, observadas pelo ensaio de DCF, ao qual podemos sugerir como possível geradora a via de redução do cobre. Espécies
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reativas de oxigênio em excesso podem causar danos ao DNA, o que pode estar associado ao aumento de DNA fragmentado (fase sub-g0) encontrado no ensaio de ciclo celular. Tais estímulos genotóxicos costumam ativar pontos de verificação importantes que atuam na parada do ciclo celular na fase G2/M (CHK1 e fosfatase Cdc25). Quando a correção desses danos não é possível a célula é encaminhada para o processo de apoptose e com isso há uma diminuição do número de células vivas.
Figura 12 – Resumo dos resultados encontrados e possíveis mecanismos associados.
5 CONCLUSÃO
O presente estudo permitiu verificar, pela primeira vez, as atividades biológicas do extrato bruto hidroetanólico das folhas de Myrsine rubra. Nossos estudos comprovaram que o extrato bruto reduziu eficientemente a viabilidade da linhagem celular MCF-7, adenocarcinoma mamário, de maneira dependente da dose e do tempo. Foram estimados valores de IC50 de 8,957μg/mL para o tempo de 72h. Por meio de citometria de fluxo verificou-se um aumento do estresse oxidativo que pode estar associado à parada do ciclo na fase de G2/M e ao aumento de DNA fragmentado, sendo um forte indício que o extrato de Myrsine rubra induz a apoptose celular. No entanto, mais estudos são necessários para compreender quais componentes do extrato de Myrsine rubra estão envolvidos na toxicidade celular e sobre quais mecanismos podem estar atuando.
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