Felipe Augusto Gorlaa*; Jéssica Gubany Sanchesa; Ana Lúcia de Souza Madureira Felíciob; Suzana Lucy Nixdorfa
Avaliação do Emprego da Técnica NIRS para a Determinação de Cafeína em Café Solúvel
Use of NIRS Technique for Caffeine Determination in Instant Coffee
aUniversidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Exatas, Departamento de Química, PR, Brasil
bUniversidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Ciência de Alimentos, Londrina, PR, Brasil *E-mail: felipeagorla@hotmail.com
Resumo
A cafeína é um alcaloide presente no café que apresenta efeitos benéficos à saúde. Sua determinação em café solúvel pelo método normalizado (ISO 10.095) emprega a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou do inglês HPLC), técnica amplamente utilizada por ser precisa e exata. Entretanto, sua aplicação exige preparo da amostra, analista treinado, equipamento sofisticado, e implica no uso contínuo da fase móvel, o que a torna dispendiosa e gera grandes volumes de resíduos. Em contrapartida, a espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS) surge como uma alternativa interessante para o controle de qualidade. É rápida - não demanda basicamente preparo das amostras – é simples, barata e não destrói a amostra. Como um método secundário, pode ser utilizada, desde que estabelecido o modelo de calibração para o equipamento. No presente estudo foi estabelecido um modelo de calibração para o NIRS, tendo sido aplicadas as técnicas de HPLC e NIRS na determinação do teor de cafeína de cafés solúveis. Através da utilização do teste t de student pareado, foi comprovado que não há diferenças significativas entre as técnicas, em nível de 95% de confiança. Desta forma, verificou-se a potencialidade do uso da técnica NIRS em análises de rotina, onde critérios como: agilidade; redução de custos com reagentes, mão de obra e perda de produto; minimização de retrabalho e geração de resíduos são primordiais, em complementação à técnica de HPLC, utilizada na confirmação dos teores de cafeína como método primário.
Palavras-chave: Cafeína. Café. HPLC. NIR.
Abstract
Caffeine is an alkaloid present in coffee that has beneficial health effects. Its determination in soluble coffee by normalized method (ISO 10.095) employs high performance liquid chromatography (HPLC), a widely used technique due to its precision and accuracy. However its application requires criteria for sample preparation; trained analyst; sophisticated equipment; and continuous use of mobile phase, which make it expensive and generates large volume of waste. In contrast, near infrared spectroscopy (NIRS) emerges as an interesting alternative for quality control. It is fast, simple, non-expensive, and harmless for the sample. It could be used as a secondary method, provided that the calibration model is established for the device. In present study a calibration model for NIRS was established by NIRS and HPLC techniques for determination of caffeine contents in soluble coffee. The Student t test showed that there are no significant differences at 95% of confidence level between the techniques. Therefore, the potentiality of NIRS uses in routine analysis was verified, where features such as agility; reagent cost, manpower and product loss reduction; and minimal rework and waste generation are fundamental, in complement to HPLC technique used as the primary method in the confirmation of caffeine.
Keywords: Caffeine. Coffee. HPLC. NIRS.
1 Introdução
O café é um dos produtos básicos mais valiosos, sendo a segunda bebida mais popular do mundo e a segunda
commodity geradora de riquezas, permanecendo atrás somente
do petróleo (DIAS, 2009). O Brasil é o maior produtor e exportador mundial, ocupando o segundo maior mercado consumidor (ABIC, 2012).No País, o café é a segunda bebida mais consumida do mercado interno, ficando atrás apenas da água, seguida de refrigerantes e leite (NAKAMURA, 2009).
É uma bebida bastante apreciada tanto por seu sabor, quanto por seus efeitos estimulantes. Neste quesito, a cafeína, quimicamente conhecida por 1,3,7-trimetilxantina, é o ingrediente mais ativo do café. Essa substância pertence ao grupo de compostos das metilxantinas, como a teobromina e a teofilina. As xantinas são substâncias capazes de estimular
o sistema nervoso, produzindo certo estado de alerta de curta duração (ALVES; BRAGAGNOLO, 2002).
A cafeína é também encontrada em alguns remédios, como analgésicos, termogênicos, antigripais, em chás e em outras bebidas compostas por cola, cacau e chocolate. Por estar presente em diversos produtos e em mais de 60 espécies de plantas, pode-se dizer que a cafeína é, seguramente, a substância psicoativa mais popular do mundo (RICHARDS, GLASS, 1994; BALLONE, MOURA, 2008).
Seus efeitos fisiológicos na saúde humana incluem estimulação do sistema nervoso central, dos músculos cardíacos, do sistema respiratório e da secreção de ácido gástrico. Também é considerada como um diurético fraco e relaxante muscular (JAMES, 1991). A teobromina (3,7-dimetilxantina) é encontrada, sobretudo, em produtos de cacau, e tem ação diurética, enquanto a teofilina
(1,3-dimetilxantina), encontrada em algumas variedades de chás, tem predominantemente efeito broncodilatador (HARKINS et al., 1998). Tamanha importância justifica o interesse em métodos analíticos eficazes.
Numerosos métodos tais como espectrofotometria, titulometria e cromatografia gasosa (CG) ou líquida de alta eficiência (CLAE ou do inglês HPLC) são usados para a determinação destes alcalóides (ALVES; BRAGAGNOLO, 2002).
A desvantagem da espectrofotometria e titulometria é que não apresentam seletividade (RIBEIRO, VOLPATO, 2005), importante para matrizes complexas como o café, enquanto a CG exige derivatização (De MARIA, MOREIRA, 2007).
A vantagem do sistema de HPLC na análise destes compostos inclui eficiência, sensibilidade e especificidade (NAIK, 2001). Além disso, a técnica HPLC permite a quantificação de cada composto em uma única corrida cromatográfica (ALVES; BRAGAGNOLO, 2002). A cromatografia líquida de alta eficiência é a técnica normalizada pela ISO, considerada eficiente como técnica primária na quantificação destes alcalóides, utilizando coluna C-18 e detecção UV-VIS em 272 nm com eluição isocrática (ISO 10.095, 1992).
No entanto, o HPLC apresenta desvantagens devido a diversos fatores, tains como: custo elevado, emprego de reagentes de alta pureza (grau HPLC); geração de grandes quantidades de resíduos líquidos orgânicos pela vazão contínua de eluentes; preparo minucioso das amostras; analista especializado, além de demandar tempo analítico e ser considerada uma técnica destrutiva, uma vez que não há possibilidade de reaproveitamento das amostras (De MARIA, MOREIRA, 2007; CAMARGO, TOLEDO, 1998).
Em contrapartida, a espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS), um tipo de espectroscopia vibracional que emprega fótons com energia entre 2,65 x 10-19 a 7,96 x 10 -20 J – o suficiente para intensificar a vibração das ligações
entre os átomos – vem ganhando espaço entre as técnicas mais utilizadas, especialmente quando aliada a tratamentos matemáticos (PIZARRO et al., 2007).
A técnica NIRS apresenta como vantagens ser rápida (cerca de um minuto ou menos para a leitura de cada amostra), não destrutiva, não invasiva, ter grande poder de penetração do feixe de radiação, ser quase universal (detecta qualquer molécula que contenha ligações O-H, C-H, N-H ou S-H) e exigir um mínimo preparo de amostras (PASQUINI, 2003).
Como desvantagem, é importante ressaltar que a NIRS é uma técnica secundária, e, portanto, faz-se necessária a calibração do equipamento através de um modelo de calibração, construído à partir de dados obtidos por uma técnica primária. Uma vez estruturado o modelo, é possível a análise simultânea de vários parâmetros pela comparação entre os espectros (PASQUINI, 2003).
Além disso, para se aplicar a técnica NIRS, é necessário um conhecimento de quimiometria, uma vez que utiliza
métodos matemáticos e estatísticos para definir ou selecionar as condições ótimas de medidas e experiências, visando a obtenção do máximo de informações com um número reduzido de experimentos, a partir da análise de dados químicos (BRUNS, FLAIGE, 1985).
2 Material e Métodos 2.1 Materiais
Foram utilizados para a as análises um padrão de cafeína (Merck, Darmstadt, Alemanha), óxido de magnésio pesado (Merck, Darmstadt, Alemanha), metanol grau HPLC (J. T. Baker, Xalostoc, México) e água ultrapura obtida através de um sistema Milli-Q®(Millipore, MA, EUA). As 26 amostras
de café solúvel spray-dried utilizadas neste estudo foram fornecidas por uma indústria produtora de café solúvel da região de Londrina, Paraná, Brasil.
2.2 Determinação por HPLC
Os teores de cafeína foram determinados empregando o método normatizado ISO 10.095, utilizando o HPLC como método primário. Pesou-se 1,0000 ± 0,0001 g da amostra de café solúvel e 4,00 g de óxido de magnésio pesado. Posteriormente, ambos foram adicionados a um erlenmeyer de 500 mL, previamente tarado. Ao erlenmeyer, adicionou-se 100 mL de água ultrapura Milli-Q®(Millipore, MA, EUA),
e levou-se à fervura em chapa aquecedora (Cientec, Brasil) por 15 minutos. Após o resfriamento, a tara inicial evaporada foi reconstituída com adição da água ultrapura. O conteúdo foi então, passado em papel filtro faixa branca (Whatman™ Springfield Mill, UK) pregueado, e o filtrado por membrana 0,22 µm de nylon (GVWP 02500, Millipore, MA, EUA).
A análise foi feita em um sistema de cromatografia líquida Waters®, empregando fase móvel água: metanol (70:30, v/v)
com vazão 0,7 mL min-1, impulsionada por uma bomba Waters
515; a injeção de 20,0 µL foi realizada pelo auto-amostrador Waters 717 Plus. Foi utilizada uma coluna de fase reversa Nova-Pak C18 (60Å, 4,0 µm, 4,6 mm X 150 mm, Waters, EUA). A temperatura da coluna foi mantida a 28 ºC. O detector UV-VIS Waters 2487 foi ajustado para o comprimento de onda 272 nm. Os cromatogramas foram adquiridos e integrados pelo software Empower 1.0, interfaceado via Waters bus SAT/ IN Module.
2.3 Determinação por NIRS
Para a análise no infravermelho próximo, pesou-se 2,50 ± 0,1 g de cada amostra, que foram acondicionadas em celas de quartzo comerciais denominadas células spinning. Vale ressaltar que as amostras não foram pré-processadas, nem sofreram algum tipo de abertura ou preparo. Os espectros foram obtidos através do posicionamento da cela no caminho óptico, fechando-se da íris e efetuando-se a varredura espectral na faixa de 1000 a 2400 nm. O equipamento utilizado foi um Near-infrared XM 1100 series da FOSS com módulo de
detecção por reflectância difusa XDS Rapid Content Analyzer. O tempo total por análise foi de 60 segundos.
2.4 Análise dos dados
O software utilizado para o registro dos espectros do infravermelho próximo foi o ISIScan (FOSS, Hilleroed, Dinamarca). Para a análise multivariada dos espectros, foi utilizado o software WinISI II V 1.05 (FOSS, Hilleroed, Dinamarca). A correção da interferência do tamanho das partículas no espectro foi realizada através da derivação de segunda ordem. Uma comparação entre as técnicas pode ser realizada por vários tratamentos estatísticos, como o
teste “t” de student pareado, que permite avaliar se há ou não diferenças significativas entre os valores obtidos pelas técnicas (SKOOG, 2006). Desta forma, este teste foi aplicado para avaliar a ocorrência de diferenças significativas entre os teores de cafeína obtidos por HPLC e NIRS.
3 Resultados e Discussão
A determinação do teor de cafeína para as amostras de café solúvel foi inicialmente efetuada por HPLC/UV-VIS (cromatograma ilustrado na Figura 1) empregando o método primário ISO 10.095 normalizado, considerando-se o valor médio de 3 determinações.
Figura 1: Cromatograma típico de amostra de café solúvel utilizado na quantificação da cafeína (2,81 minutos). AUFS Tempo (min) 350 000 300 000 250 000 200 000 150 000 100 000 50 000 0 0 1 2 3 4 5
Para a quantificação dos teores por esta técnica, utilizou-se uma curva de calibração construída a partir de padrões, na faixa dinâmica de trabalho de 0,05 a 5,00 gcafeína 100 gcafé-1,
representada na Equação 1. 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
Log (
1/R
)
λ/nm Log (1/R) (1) Posteriormente, as mesmas amostras foram analisadas no NIRS, gerando os espectros apresentados na Figura 2.Figura 2: Sobreposição dos espectros NIR para as 26 amostras de café solúvel, com a varredura de 1000 a 2400 nm
Com o objetivo de atenuar os efeitos da granulometria
sobre a reflectância difusa e, em concomitância, ajustar a linha de base, foi efetuada a derivada segunda nos espectros, resultando no gráfico apresentado na Figura 3. y = 2,33x106 – 3,53x104, r = 0,99987
Figura 3: Derivada segunda dos espectros NIR das 26 amostras de café solúvel 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 -0,00020 -0,00015 -0,00010 -0,00005 0,00000 0,00005 0,00010 0,00015 0,00020
Der
ivada S
egunda
λ/nm Derivada SegundaA partir da análise multivariada da derivada segunda dos espectros NIR, os teores de cafeína foram determinados, através da Equação 2, correspondente ao modelo de calibração para predição de cafeína.
(2)
onde, A corresponde ao valor de , e B é o coeficiente para comprimentos de onda específicos, respectivamente. Os valores B, juntamente com os comprimentos de onda correspondentes são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1: Valores do parâmetro B da Equação 2 utilizada na predição dos teores de cafeína por NIRS
Parâmetro B Comprimento de onda (nm) Vibracional*Modo
-1,2339 1188 2º OT νCH3 6,2438 1196 1,6580 1204 -11,5290 1356 CB CH3 -7,1810 1364 4,6503 1436 CB CH2 + Ar -4,1463 1444 -6,4398 1468 1º OT νNH 4,3717 1476 3,5059 1484 -0,0077 1492 -1,1731 1500 -0,0938 1508 -14,7107 1916 2º OT νC=O 1,2619 1924
* OT: Overtone; CB: Combinação de bandas; Ar: Aromático; ν: estiramento axial
Após a determinação do teor de cafeína pelas duas técnicas, calculou-se a diferença entre os valores obtidos, apresentados na Tabela 2.
Tabela 2: Teores de cafeína médios obtidos por HPLC e NIRS (N = 3) e desvio entre as técnicas
Amostra (%) (m/m)HPLC (%) (m/m)NIRS d(HPLC-NIR)
1 3,57 3,43 0,14 2 2,98 3,23 - 0,25 3 3,21 3,28 - 0,07 4 3,31 3,26 0,05 5 3,29 3,50 - 0,21 6 3,31 3,36 - 0,05 7 3,27 3,20 0,07 8 3,31 3,39 - 0,08 9 3,48 3,38 0,10 10 3,23 3,32 - 0,09 11 3,04 3,19 - 0,15 12 3,40 3,45 - 0,05 13 3,37 3,53 - 0,16 14 3,45 3,50 - 0,05 15 3,27 3,50 - 0,23 16 3,3 3,41 - 0,11 17 3,35 3,53 - 0,18 18 3,27 3,31 - 0,04 19 3,18 3,03 0,15 20 3,45 3,45 0,00 21 3,60 3,40 0,20 22 3,55 3,53 0,02 23 3,39 3,57 - 0,18 24 2,75 2,60 0,15 25 3,42 3,27 0,15 26 3,01 3,08 - 0,07
Para a aplicação do teste t de student pareado, efetuou-se a média e o desvio padrão das diferenças entre as medidas, empregando as Equações 3 e 4. (3) (4) y =
Σ
i 1 Bi .A log 1 Ronde di é o valor de desvio da amostra, dmédio é o valor médio
dos desvios, sd é o desvio padrão dos desvios amostrais e N é
o número de amostras.
Foi formulada a hipótese de que, não há diferença significativa entre as técnicas, denominada hipótese nula (H0).
Comparou-se o t tabelado em nível de 95 % de confiança com 25 graus de liberdade (ttab = 2,160) com o t calculado
(tcalc) através da Equação 5.
(5) Uma vez que -ttab<tcalc<+ttab, se aceita H0, demonstrando
que não houve diferenças significativas entre as técnicas. A técnica de espectroscopia no infravermelho próximo apresenta vantagens em relação à cromatografia líquida de alta eficiência, tais como: redução significativa no tempo de análise (5 minutos para 40 segundos, desconsiderando o tempo de preparo de amostra de 20 segundos); no custo, por não utilizar reagentes de alta pureza e não exigir analista especializado. Além disso, a determinação pode ser feita em equipamento mais simples e robusto e, por ser uma análise não destrutiva, permite o uso na linha de produção, em análise de rotina.
4 Conclusão
Pelo teste t de student, pode-se concluir que entre as técnicas testadas na quantificação de cafeína em café solúvel, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), método padrão normalizado, e a espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS), mesmo com princípios de medidas diferentes, não apresentam diferenças significativas a 95 % de confiança. Portanto, a técnica NIRS pode ser empregada em análises de controle de qualidade, com agilidade no processo, sem destruição da amostra, com mínima geração de resíduos e redução de custos.
Agradecimentos
Ao CNPq, a FINEP, a CAPES e a Fundação Araucária pelo auxílio financeiro.
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