UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
ANTONIO PEDRO FRÓES DE FARIAS
ISOLAMENTO, SELEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS
PRODUTORAS DE BIOATIVOS COM POTENCIAL PARA
APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA DO PETRÓLEO
Salvador - BA
Fevereiro, 2016
ANTONIO PEDRO FRÓES DE FARIAS
ISOLAMENTO, SELEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS
PRODUTORAS DE BIOATIVOS COM POTENCIAL PARA
APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA DO PETRÓLEO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia como requisito para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Dr. Paulo Fernando de Almeida Coorientadora: Dr.ª Josilene Borges Torres Lima Matos
Salvador - BA
Fevereiro, 2016
FICHA CATALOGRÁFICA
F224 Farias, Antonio Pedro Fróes de.
Isolamento, seleção e identificação de bactérias produtoras de bioativos com potencial para aplicação na indústria do petróleo / Antonio Pedro Fróes de Farias. - Salvador, 2016.
92 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Fernando de Almeida.
Coorientadora: Profa. Dra. Josilene Borges Torres Lima Matos. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Instituto de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, 2016.
1. Petróleo - Bactérias. 2. Tensoativos. 3. Microbiologia industrial. I. Almeida, Paulo Fernando de. II. Matos, Josilene Borges Torres Lima. III. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. IV. Título.
Dedicado a ela, que sempre acreditou no menino da Zona Rural, estudante de Colégio Público, o filho de Dona Flor e Dema do Leite. E disse que ele chegaria lá...
...ela sabia!!
Maria das Mercês de Farias Souza – Tia Cecê (in memoriam)
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo que me foi concedido. Saúde, força, coragem e sabedoria para superar os obstáculos e realizar esta conquista. A Bom Jesus da Lapa, por sua companhia constante, todas as bênçãos alcançadas e por ter colocado tantas pessoas boas em meu caminho.
A minha família, em especial aos meus pais Valdemar Barreto (Dema do Leite) e Florisbela Fróes (Flor) por todo o amor, carinho, dedicação e incentivo durante esse período longe de casa. Aos meus irmãos Jorge, Renato (Bá) e Marquinhos pelo amor e companheirismo que existe entre nós. As minhas cunhadas, Thalita e Joseane. E a princesa Jujú, que fez minha caminhada mais feliz!
A minha namorada Lais Reis, pela compreensão e paciência nessa jornada. Pela ajuda constante nas inúmeras correções, mas, principalmente, pelo amor, carinho e confiança que me fizeram continuar. Te amo!
A todos os meus tios (as) e primos (as), em especial a Gilberto Tibério, meu amigo, pelos conselhos e apoio que nortearam minha caminhada.
Aos meus sogros, Dona Leide e Antônio (Tó) por me acolherem em sua casa e fazerem de mim, seu filho. A toda família Reis, da qual tenho orgulho de dizer que faço parte.
A UFBA - Universidade Federal da Bahia, que abriu novas portas para minha formação, contribuindo com toda a estrutura física e de pessoal, em especial ao ICS. Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo Almeida por ter me acolhido, pela paciência, apoio e confiança, fundamental no desenvolvimento desse trabalho. É uma honra fazer parte do grupo LABEM.
A Prof.ª Josilene Matos, pelo apoio e confiança sem igual, pelo auxílio no desenvolvimento da pesquisa e pelas correções. Muito obrigado!
Aos colegas do LABEM: Diego Montes, Tatiane, Igor, Marcela, Nai, Roseane, João, Daniel, Leila, Joalene, Jackson, Lais, Débora, Bethânia, pelo auxílio nas dúvidas, e por estarem sempre dispostos a ajudar. Em especial ao pessoal do BIOMOL, Luciana e Mariane, fundamentais para o desenvolvimento da parte molecular.
Aos meus amigos Sueli, Luiz e Fúlvia, por terem me acompanhado durante essa caminhada, dando apoio, incentivo e ajudando sempre, obrigado!!
Aos alunos de Iniciação científica, Flávia Marília e Mariana Cozza, que fizeram parte diretamente da pesquisa, muito obrigado!
A todo o pessoal do Moura Costa, na pessoa do Prof. Fábio Chinália, que sempre manteve as portas abertas, colaborando com o desenvolvimento do trabalho.
Ao Prof. Adailson Feitosa, pelo auxílio constante e por ser uma fonte de inspiração, para continuar melhorando cada dia mais. Obrigado!
Ao meu amigo José Brito, que apesar da distância, sempre se manteve presente, apoiando e dando força!
A Ivonilton Junior, parte da minha família, que ao longo desses dois anos foi uma parceria sem igual para todos os momentos.
A meu amigo/irmão Jorge Alberto, que apesar de todas as dificuldades, sempre me ajuda e da força para continuar.
A FAPESB e ao CNPQ pela concessão da bolsa e pelo incentivo financeiro e científico apostado em nossos projetos.
A PETROBRÁS/UN-BA pelo fornecimento das amostras de água produzida. Ao programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal da Bahia, pela oportunidade concedida.
Ao Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Ferramentas para a Saúde – PDTIS-FIOCRUZ pelo uso de suas instalações.
A todos os professores do Programa de Mestrado em Biotecnologia.
Aos membros da banca, por aceitarem o convite e pelas valiosas sugestões. A todos que direta ou indiretamente fizeram parte desse processo, deixo os meus sinceros agradecimentos.
Farias, Antonio Pedro Fróes. Isolamento, seleção e identificação de bactérias produtoras de bioativos com potencial para aplicação na indústria do petróleo. 92f.: il. 2016. Dissertação (Mestrado). Instituto de Ciências da Saúde. Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2016.
RESUMO
A corrosão microbiologicamente influenciada é constituída pelo consórcio de diversos micro-organismos, destacando-se as bactérias redutoras de sulfato (BRS) dado sua relevância na constituição do biofilme promotor dos problemas associados à biocorrosão. Além das BRS, os campos de petróleo abrigam comunidades microbianas do subsolo que contêm uma rica diversidade de bactérias. Dentre elas estão as petrobióticas: micro-organismos que apresentam atividade benéfica, produzindo compostos úteis durante o seu crescimento que melhoram a recuperação de petróleo. Essas bactérias estão associadas com o controle de BRS, através da produção de substâncias antimicrobianas e/ou com a produção de bioativos (biopolímeros e biossurfactantes) que auxiliam na recuperação de óleo em campos maduros. O presente trabalho teve como objetivo isolar, selecionar e identificar bactérias produtoras de bioativos para aplicação na indústria do petróleo. No total, 26 bactérias foram isoladas de amostras de água produzida, sendo 13 bactérias do poço A e 13 do poço B. Todas as bactérias apresentaram capacidade de desnitrificação heterotrófica e/ou autotrófica, isso pode estar relacionado aos níveis de nitrato encontrados para as amostras de água produzida, 360 mg.L-1 no poço A e 907 mg.L -1 no poço B. O perfil metabólico para a redução do molibdato a azul de molibdênio foi apresentado por 23 cepas, sendo que 10 mostraram os maiores níveis de redução. Os resultados dos testes de inibição mostraram que 10 linhagens apresentaram atividade inibitória frente às BRS, pela produção de substâncias antimicrobianas, destacando-se as cepas AMD (10 mm), AT6 (11 mm) e AT11-2 (13 mm). Os maiores valores obtidos para a produção de biopolímeros com base no diâmetro da camada de muco foram observadas para as cepas JV4, JV4-1, AMD e AT11-2 (40 mm). As cepas JV1, JV4, AMD, AT6 e AT11-2 apresentaram os melhores resultados para a produção de biossurfactante. Além disso, essas amostras mantiveram emulsão estável por mais de 90 dias. No presente trabalho foi possível selecionar diversas bactérias produtoras de bioativos de interesse para aplicação na indústria do petróleo. Estas, foram identificadas como Bacillus sp. (3), Bacillus subtilis (1), Bacillus
thurigiensis (1), Bacillus pumilus (1), Bacillus cereus (1) e Staphylococcus sp. (1). Esta
pesquisa serve como base para o desenvolvimento de diversos trabalhos com potencial aplicação na indústria do petróleo, tais como: inibição de BRS por produção de substâncias antimicrobianas, utilização das bactérias em processos de biorremediação e a constituição de consórcios microbianos que podem ser utilizados para a tecnologia MEOR.
Farias, Antonio Pedro Fróes. Isolation, selection and identification of bacteria producing bioactive with potential for application in the oil industry. 92f.: il. 2016. Dissertation (Master). Institute of Health Sciences. Federal University of Bahia, Salvador, 2016.
ABSTRACT
The microbiologically influenced corrosion is made by a consortium of several micro-organisms, especially the sulfate reducing bacteria (BRS) given its importance in the constitution of biofilm promoter of the problems associated with biocorrosion. Besides the BRS, oilfield harbor microbial communities subsoil that contain a rich variety of bacteria. Among them are petrobiotics: microorganisms that have beneficial activity, producing useful compounds during their growth to enhance oil recovery. These bacteria are associated with the BRS control by the production of antimicrobial substances and/or the production of bioactive (biopolymers and biosurfactants) that aid in oil recovery in mature fields. This study aimed to isolate, select and identify bioactive producing bacteria for application in the oil industry. A total of 26 bacteria were isolated from produced water samples, 13 bacteria of the pit A and 13 pit B. All bacteria have denitrification capacity (heterotrophic and/or autotrophic), this may be related to nitrate levels found for samples of produced water, 360 mg.L-1 to pit A and 907 mg.L-1 to pit B. The metabolic profile for reduction of the molybdate to molybdenum blue was shown by 23 strains and 10 showed the greatest levels of reduction. The results of the inhibition tests showed that the strains inhibited 10 BRS, production of antimicrobial substances, especially AMD strains (10 mm), AT6 (11 mm) and AT11-2 (13 mm). The highest values obtained for the production of biopolymers based on the diameter of the mucus layer were observed for strains JV4, JV4-1, AMD and AT11-2 (40 mm). The strains JV1, JV4, AMD, AT6 and AT11-2 presented the best results for biosurfactant production. In addition, these samples remained stable emulsion for more than 90 days. In the present study it was possible to select several bioactive producing bacteria of interest for application in the oil industry. These were identified as Bacillus sp. (3) Bacillus subtilis (1), Bacillus thuringiensis (1), Bacillus pumilus (1),
Bacillus cereus (1) and Staphylococcus sp. (1). This study serves as a basis for the
development of various studies with potential application in the oil industry, such as: inhibition BRS by production of antimicrobial substances, use of bacteria in bioremediation processes and the constitution of microbial consortia that can be used for MEOR technology.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fluxograma da recuperação secundária de petróleo através da injeção de
água produzida. ... 19
Figura 2. Ilustração do ciclo microbiano do enxofre. ... 23
Figura 3. Desenvolvimento de biofilme microbiano. ... 31
Figura 4. Ilustração esquemática da interação dos ciclos enxofre/nitrogênio que podem ocorrer em reservatórios de petróleo... 37
Figura 5. Fluxograma do isolamento de bactérias com o meio MBT. ... 45
Figura 6. Fluxograma do isolamento de bactérias com o meio AAC. ... 46
Figura 7. Fluxograma do teste de inibição em placas. ... 50
Figura 8. Placas com meio MBT após o inóculo da água produzida. ... 59
Figura 9. Resultado do teste para bactérias redutoras de nitrato. ... 63
Figura 10. Resultado do teste para bactérias redutoras de nitrato sulfeto-oxidantes. ... 65
Figura 11. Teste de redução do molibdato. ... 67
Figura 12. Atividade antimicrobiana das cepas isoladas da água produzida contra a Desulfovibrio spp. ... 69
Figura 13. Teste de antagonismo em placas por sobrecamada das cepas isoladas da água produzida contra a cepa Desulfovibrio spp. ... 70
Figura 14. Produção de EPS pelas bactérias isoladas da água produzida. ... 71
Figura 15. Confirmação da produção de EPS pelas bactérias isoladas da água produzida... 72
Figura 16. Quantificação em porcentagem da produção de biossurfactante através do método de índice de emulsificação. ... 74
Figura 17. Análise da redução da tensão superficial para as bactérias isoladas da água produzida. ... 75
Figura 18. Análise comparativa do índice de emulsificação (%) e tensão superficial (mN/m) para as cepas selecionadas como produtoras de biossurfactante. ... 76
Figura 19. Análise filogenética das sequências parciais do gene rRNA 16S (~700 pb) obtidas a partir das cepas produtoras de bioativos. ... 78
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição do meio CSB modificado. ... 48
Tabela 2. Caracterização físico-química da água produzida coletada nos poços A e B. ... 56 Tabela 3. Bactérias isoladas da água produzida - poço A. ... 59
Tabela 4. Bactérias isoladas da água produzida - poço B. ... 60
Tabela 5. Teste metabólico para bactérias redutoras de nitrato (BRN) e bactérias redutoras de nitrato/oxidantes de sulfeto (BRN-OS). ... 62 Tabela 6. Teste para avaliar a capacidade das bactérias isoladas da água produzida de reduzir o molibdato (VI) a azul de molibdênio (V). ... 66 Tabela 7. Bactérias produtoras de bioativos selecionadas para identificação a nível molecular. ... 77
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAC Ágar Amido Caseína
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AP Água Produzida
APS Adenosina Fosfosulfato
atm. Atmosfera
BOD Estufa Bacteriológica
BRN Bactéria Redutora de Nitrato
BRN-OS Bactéria Redutora de Nitrato Oxidante de Sulfeto BRS Bactéria Redutora de Sulfato
CSB Coleville Synthetic Brine
CMI Corrosão Microbiologicamente Influenciada CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente DNA Ácido Desoxirribonucleico
Eh Potencial Redox
EOR Recuperação Avançada do Petróleo
EPS Exopolissacarídeo
E24 Índice de Emulsificação FIOCRUZ Fundação Osvaldo Cruz
g Grama
g.L-1 Grama por Litro
h Hora
ICS Instituto de Ciências da Saúde
ISP-2 Ágar Extrato de Malte Extrato de Levedura
LABEM Laboratório de Biotecnologia e Ecologia de Micro-organismos
L Litro
M Molar
MBT Meio a Base de Glicerina Bruta e Borra de Petróleo
MEOR Recuperação Avançada do Petróleo com Micro-organismos mg.L-1 Miligrama por Litro
min. Minuto
mm Milímetro
mN/m MiliNewtons por Metro
mV Milivolt
nº. Número
ND Não Detectado
PCR Reação em Cadeia da Polimerase pH Potencial Hidrogeniônico
rRNA Ácido Ribonucleico Ribossômico
rpm Rotação Por Minuto
SAM Substância Antimicrobiana
THPS Tetrakis (Hidroximetil) Fosfônio Sulfato TSA Ágar Triptona de Soja
TSB Caldo Triptona de Soja
UFBA Universidade Federal da Bahia UFC Unidade Formadora de Colônia
μL Microlitro
μm Micrometro
µHg Micrometro de Mercúrio
% Porcentagem
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 15 2. OBJETIVOS ... 17 2.1. Geral ... 17 2.2. Específicos ... 17 3. REVISÃO DE LITERATURA ... 18
3.1. Água produzida e recuperação secundária do petróleo ... 18
3.2. Caracterização da água produzida ... 20
3.2.1. pH ... 20
3.2.2. Potencial redox (Eh) ... 21
3.2.3. Composição ... 21
3.3. Microbiologia do petróleo ... 22
3.3.1. Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS)... 22
3.3.1.1. BRS mesófilos Gram-negativos ... 25
3.3.1.2. BRS Gram-positivos formadores de esporos ... 26
3.3.1.3. BRS termófilas Gram-negativas ... 26
3.3.1.4. Arqueobactérias termófilas Gram-negativas ... 27
3.3.2. Outros micro-organismos do petróleo ... 28
3.4. Acidificação biogênica dos reservatórios (souring) ... 30
3.5. Corrosão Microbiologicamente Influenciada (CMI) ... 30
3.6. Métodos de prevenção e controle do souring e CMI ... 33
3.6.1. Limpeza mecânica ... 33
3.6.2. Proteção catódica ... 33
3.6.3. Biocidas ... 34
3.6.4. Uso de molibdato ... 34
3.6.5. Inibição microbiana da corrosão ... 35
3.7. Antagonismo microbiano ... 36
3.7.1. Exclusão biocompetitiva ... 36
3.7.2. Biofilmes protetores e agentes antimicrobianos ... 38
3.7.3. Inibição por bacteriófagos ... 39
3.8. Bioativos para aplicação na indústria do petróleo ... 39
3.8.1. Biopolímeros ... 40
3.8.2. Biossurfactantes ... 41
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 43
4.1. Água produzida de campos de petróleo ... 43
4.2.1. Determinação de íons ... 43
4.2.2. Determinação de parâmetros físico-químicos (Eh/pH) ... 44
4.3. Isolamento e caracterização de micro-organismos de amostras de água produzida. ... 44
4.3.1. Isolamento de bactérias da água produzida ... 44
4.3.2. Caracterização - teste de redução do nitrato ... 47
4.3.3. Caracterização - teste para bactérias sulfeto-oxidantes ... 47
4.3.4. Caracterização - teste de redução do molibdato ... 49
4.4. Estudos laboratoriais de antagonismo ... 50
4.5. Produção de biopolímeros ... 51
4.6. Produção de biossurfactantes ... 52
4.6.1. Índice de emulsificação ... 52
4.6.2. Tensão superficial ... 53
4.7. Identificação dos micro-organismos selecionados ... 53
4.7.1. Extração de DNA ... 53
4.7.2. Reação de PCR ... 54
4.7.3. Reação de sequenciamento ... 55
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 56
5.1. Caracterização físico-química das amostras de água produzida da indústria do petróleo ... 56
5.2. Isolamento de bactérias a partir de amostras de água produzida ... 58
5.2.1. Bactérias isoladas do poço A ... 58
5.2.2. Bactérias isoladas do poço B ... 60
5.3. Caracterização dos micro-organismos isolados das amostras de água produzida. ... 61
5.3.1. Bactérias Redutoras de Nitrato (BRN) ... 61
5.3.2. Bactérias Redutoras de Nitrato Oxidantes de Sulfeto (BRN-OS) ... 64
5.3.3. Redução do molibdato ... 66
5.4. Testes laboratoriais de antagonismo ... 68
5.5. Produção de biopolímeros ... 71
5.6. Produção de biossurfactante ... 73
5.6.1. Índice de emulsificação ... 73
5.6.2. Análise da tensão superficial ... 74
5.7 Identificação molecular das cepas selecionadas como produtoras de bioativos... 77
6. CONCLUSÕES ... 80
7. REFERÊNCIAS ... 82
1. INTRODUÇÃO
A produção de petróleo é seguida de uma significante produção de água, conhecida como água de produção, constituindo a maior parte do rejeito da indústria petrolífera (ALMEIDA et al., 2009). Quando há uma queda na pressão natural do reservatório, essa água é reinjetada nos poços a fim de deslocar o óleo existente no poço de injeção em direção aos poços produtores (recuperação secundária do petróleo) (BACHMANN et al., 2014; EKINS et al., 2007). Métodos terciários, ou recuperação avançada do petróleo (EOR), incluem processos térmicos e químicos para produzir uma extração de petróleo adicional (SANDREA; SANDREA, 2007).
Os métodos terciários incluem também a utilização de micro-organismos e/ou seus produtos metabólicos na recuperação do óleo residual (BANAT, 1995; JACK, 1991). Este tipo de recuperação envolve a estimulação de micróbios nativos ou a injeção, no reservatório, de consórcios bacterianos com o objetivo de produzir mecanismos e produtos metabólicos específicos que levem à melhoria da recuperação do óleo (ALMEIDA; RAMOS-DE-SOUZA, 2010).
Os maiores problemas associados à reinjeção de água para recuperação secundária de petróleo são o controle da corrosão e a minimização da injeção de sólidos no reservatório. Esses processos corrosivos em sistemas de injeção de água podem ser tanto de natureza química (presença de oxigênio e produtos corrosivos) quanto induzida por micro-organismos (PENNA et al., 2002).
A corrosão microbiologicamente influenciada (CMI) é constituída pelo consórcio de diversos micro-organismos, destacando-se as bactérias redutoras de sulfato (BRS) dado sua relevância na constituição do biofilme promotor dos problemas associados à biocorrosão (NEUMANN, 2012). As BRS têm como importante característica a capacidade de degradação anaeróbia da matéria orgânica, promovendo a redução do sulfato a sulfeto, provocando a acidificação dos reservatórios (souring) e o desenvolvimento da biocorrosão. Essas bactérias são apontadas como as principais responsáveis pela biocorrosão de materiais de ferro e aço na indústria de petróleo, gerando um custo elevado na manutenção de equipamentos e metais usados (CORTEZ, 2009).
Além das BRS, campos de petróleo abrigam comunidades microbianas do subsolo que contêm uma rica diversidade de bactérias (VOORDOUW, 2001). Uma
grande variedade de micro-organismos já foi isolada ou tem sido detectada na água produzida de campos de petróleo, a partir de técnicas de biologia molecular, como por exemplo: bactérias aeróbias, anaeróbias facultativas e micro-organismos microaerófilos (MAGOT et al., 2000). Dentre estas bactérias, estão as petrobióticas: micro-organismos que apresentam atividade benéfica, produzindo compostos úteis durante o seu crescimento que melhoram a recuperação de petróleo (ALMEIDA et al., 2004). Essas bactérias estão associadas com o controle de BRS e/ou com a produção de compostos bioativos (biopolímeros e surfactantes) que auxiliam na recuperação de petróleo em campos maduros (ALMEIDA; RAMOS-DE-SOUZA, 2010).
Para combater os problemas de acidificação e biocorrosão causados pelas BRS, a indústria petroquímica tem investido em produtos químicos como biocidas ou inibidores da formação de biofilmes. Porém, o uso frequente de biocidas para inibir o crescimento microbiano apresenta elevado nível de toxidade (GARDNER; STEWART, 2002). Além disso, as BRS possuem uma grande capacidade adaptativa, reduzindo a eficiência do uso de biocidas através de biofilmes de proteção e pelo surgimento de cepas resistentes (TANG et al., 2009).
A injeção de nitrato através da estratégia de exclusão biocompetitiva, ou a combinação de tratamentos, tais como, injeção de nitrito com molibdato e/ou biocidas, são alternativas cada vez mais estudadas (GIEG et al., 2011). Entretanto, a eficiência do nitrato em campos de petróleo nem sempre é previsível e o tratamento está condicionado ao custo, disponibilidade e, em especial, ao modo de aplicação, uma vez que dependendo do sistema a ser tratado poderá ser necessária a adição de outros sais e/ou biomassa exógena a fim de garantir a eficácia do processo biológico (SEGUI, 2009; SOUSA, 2009).
A dificuldade na eliminação das BRS aderidas às estruturas metálicas na forma de biofilmes e a crescente taxa de resistência dos micro-organismos às estratégias classicamente usadas tem impulsionado pesquisas que visam o desenvolvimento de estratégias alternativas para o controle da biocorrosão. Uma delas é a utilização de micróbios antagonistas ou o produto de seu metabolismo para eliminar micro-organismos causadores da corrosão (ALBUQUERQUE et al., 2014; ZARASVAND; RAI, 2014). Sendo assim, a utilização de substâncias antimicrobianas (SAM) pode ser a chave para o controle dos efeitos nocivos causados por essas bactérias (ALBUQUERQUE et al., 2014; ROSA et al., 2013).
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Isolar, selecionar e identificar bactérias produtoras de bioativos com potencial para aplicação na indústria do petróleo.
2.2. Específicos
Caracterizar físico-quimicamente amostras de água produzida oriundas de campos de petróleo com problemas de souring e corrosão microbiologicamente influenciada (CMI);
Isolar micro-organismos antagonistas às BRS a partir de amostras de água produzida;
Avaliar atividade metabólica dos micro-organismos, quanto à redução de nitrato, molibdato e sulfeto-oxidantes;
Caracterizar os micro-organismos quanto à produção de biopolímeros e biossurfactantes;
Identificar as cepas selecionadas como produtoras de bioativos, através de técnicas moleculares.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Água produzida e recuperação secundária do petróleo
A produção de petróleo gera grandes volumes de resíduos líquidos em todo o mundo. A água produzida (AP) é um subproduto da extração de petróleo e gás natural e representa o principal resíduo gerado durante o processo de separação, para que esses fluidos possam se transformar em produtos comerciais (MOTTA et al., 2013, TELLEZ et al., 2002).
O termo “água produzida” é utilizado para descrever a mistura de água de formação (naturalmente encontrada em reservatórios de petróleo e gás) e hidrocarbonetos que, mesmo após tratamento, contém uma pequena quantidade de óleo (EKINS et al., 2007). A água produzida é formada a partir de diferentes compostos (orgânicos e inorgânicos) e tem como principais constituintes: óleo, minerais dissolvidos da formação, compostos químicos residuais da produção, sólidos da produção, gases dissolvidos e micro-organismos (FAKHRU’L-RAZI et al., 2009).
Segundo Fakhru’l-Razi et al. (2009), a quantidade de AP gerada é dependente do método de recuperação e a natureza da formação, ocorrendo um aumento gradual durante o processo de produção. No início, um campo produz pouca água, em torno de 5 a 15% da corrente produzida. Entretanto, à medida que a vida econômica dos poços vai se esgotando, o volume de água pode aumentar significativamente, correspondendo a uma faixa de 75 a 90% (THOMAS, 2004).
Para maximizar os níveis de recuperação do petróleo, a água produzida é reinjetada nos reservatórios para aumentar a pressão interna e deslocar o óleo existente no poço de injeção em direção a superfície - recuperação secundária do petróleo (Figura 1) (VOORDOUW, 2011).
Antes de ser reinjetada nos poços, a água de produção deve ser submetida a um tratamento de modo a torna-la mais adequada ao reservatório e aos fluidos neles existentes. Convencionalmente, ela pode ser tratada por diferentes métodos: físicos, químicos e biológicos (FAKHRU’L-RAZI et al., 2009).
Figura 1. Fluxograma da recuperação secundária de petróleo através da injeção de água
produzida.
Fonte: Voordouw, p. 403 (2011).
A recuperação primária (extração do petróleo pela pressão natural do poço) é responsável pela extração de até 20% do petróleo. Já a recuperação secundária (usada quando há uma queda na pressão natural do reservatório) é um método que permite obter uma recuperação de 45-50% do petróleo. Métodos terciários, ou recuperação avançada do petróleo (EOR – Enhanced Oil Recovery), incluem processos térmicos e químicos para produzir uma extração de petróleo adicional de 7-15% (GOA et al., 2009; SANDREA; SANDREA, 2007).
Os métodos terciários incluem também a utilização de micro-organismos e/ou seus produtos metabólicos na recuperação do óleo residual (MEOR – Microbial
Enhanced Oil Recovery). Este tipo de recuperação envolve a estimulação dos
micro-organismos naturais do reservatório ou injeção de consórcios microbianos, especialmente selecionadas, para produzir eventos metabólicos específicos que levam à melhoria da recuperação de petróleo (BANAT, 1995; JACK, 1991).
Os micro-organismos podem sintetizar compostos análogos aos utilizados em processos EOR a partir da fermentação de substratos ou matérias-primas de baixo custo, para aumentar a recuperação de óleo de reservatórios marginais. Portanto,
MEOR apresenta grande potencial para substituir a EOR, que é uma tecnologia muito cara (SHIBULAL et al., 2014).
O processo de recuperação de petróleo pela injeção de AP promove a redução da salinidade e da temperatura da água de formação e, consequentemente, estimula o crescimento microbiano ao tornar as condições do meio favorável à sua proliferação (NEUMANN, 2012). Isso pode representar um sério risco às atividades operacionais de recuperação do petróleo, uma vez que, aumenta a fonte de nutrientes disponíveis e estimula a atividade de bactérias redutoras de sulfato que provocam a acidificação dos reservatórios (souring) e o desenvolvimento da biocorrosão (SOUSA, 2009).
3.2. Caracterização da água produzida
As propriedades físicas e químicas da água produzida variam consideravelmente, dependendo da localização geográfica do campo, da formação geológica e dos tipos de hidrocarbonetos que estão sendo produzidos (VEIL et al., 2004). As propriedades e o volume da água produzida podem variar ao longo do tempo de vida de um reservatório. Além disso, as condições operacionais e produtos químicos utilizados em instalações de processamento também interferem na sua composição (FAKHRU’L-RAZI et al., 2009).
3.2.1. pH
Realizar a análise do potencial hidrogeniônico (pH) da água produzida é necessário para o monitoramento do seu poder de corrosão, do crescimento de micro-organismos e, com o intuito de verificar se tal AP se enquadra dentro das legislações pertinentes para o controle de efluentes industriais (RIBEIRO, 2013). O pH ótimo para o crescimento das BRS em poços geralmente é entre 5 e 8. No entanto, a avaliação do pH mensurado à pressão atmosférica pode não refletir necessariamente o pH real
in situ, uma vez que o pH é influenciado por dissolução de gases sob alta pressão.
Esta característica tem que ser levada em consideração na interpretação da natureza indígena das bactérias recuperadas a partir de amostras do subsolo (MAGOT et al., 2000).
3.2.2. Potencial redox (Eh)
O potencial de oxirredução, determina as características do ambiente quanto a fugacidade de oxigênio (ambiente redutor ou oxidante). É sabido que bactérias redutoras de sulfato requerem um Eh negativo para seu crescimento inicial. Sendo assim, o Eh encontrado na AP é um registro metabólico da possível presença de BRS nos poços de petróleo (POSTGATE, 1979).
3.2.3. Composição
A água produzida é uma mistura de materiais orgânicos e inorgânicos. Os compostos orgânicos naturais podem ser divididos em quatro grupos principais: alifáticos (incluindo os naftênicos), aromáticos, polares e ácidos graxos. A quantidade relativa e a distribuição de peso molecular destes compostos variam de poço para poço. Os compostos aromáticos juntamente com os alifáticos, constituem os chamados hidrocarbonetos da água produzida e o material orgânico está presente tanto nas formas dispersa, como dissolvida (OLIVEIRA; OLIVEIRA, 2000).
A água produzida apresenta em sua composição, diferentes compostos inorgânicos. Dentre eles, cátions (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Ba2+, Sr2+, Fe2+) e ânions (Cl-, SO42-, CO32-, HCO3-), responsáveis pelo potencial de incrustação dessas águas (VEIL, et al., 2004). A determinação da concentração destes elementos é importante para o monitoramento da água onde se encontra a estrutura metálica, já que essas variáveis influenciam diretamente o processo corrosivo e o metabolismo dos micro-organismos (GALVÃO, 2008).
É importante lembrar que o conhecimento sobre as características físicas, químicas e a composição da água produzida são indispensáveis para avaliar a possibilidade de seu uso nos processos de reinjeção, assim como prever as condições existentes para o crescimento de BRS e os possíveis problemas decorrentes do
3.3. Microbiologia do petróleo
Uma grande diversidade taxonômica e funcional de micro-organismos tem sido recuperada de reservatórios de extração de petróleo: desde anaeróbios estritos, termófilos e hipertermófilos, até anaeróbios facultativos e termotolerantes. Aeróbios também foram isolados ou tem sido detectados por técnicas moleculares (LOPES, 2010; MAGOT et al., 2000; ORPHAN et al., 2000).
Dentre os micro-organismos anaeróbios estritos presentes nos reservatórios de petróleo, as BRS são o grupo bacteriano mais bem estudado devido ao seu papel central nos processos de biocorrosão.
3.3.1. Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS)
O ciclo do enxofre é complexo, pois o enxofre pode existir em diversos estados de oxidação na natureza. Em ambientes onde há a presença de oxigênio o sulfato é termodinamicamente estável e em ambientes anaeróbios o sulfeto é mais constante (ALMEIDA, 2005). Além disso, o ciclo do enxofre está intimamente ligado a outros ciclos de elementos, tais como os ciclos do carbono e do nitrogênio (MUYZER; STAMS, 2008).
O sulfato é utilizado por muitos micro-organismos como fonte de enxofre para as suas necessidades biossintéticas. A capacidade de utilizar essa substância como aceptor de elétrons nos processos geradores de energia, no entanto, envolve a redução de uma grande quantidade de SO4-2, processo restrito às BRS (MADIGAN et al., 2010).
A redução de sulfato a sulfeto não ocorre espontaneamente nas condições físicas da atmosfera, e requer uma mediação catalítica por atividade biológica (ALMEIDA, 2005). A redução do sulfato pode ocorrer de duas formas: 1) redução assimilatória - o H2S formado é imediatamente convertido a enxofre orgânico, sob a forma de aminoácidos e outros compostos sulfurados orgânicos; 2) redução desassimilatória - uma pequena quantidade de enxofre reduzido é assimilada pelo organismo, mas praticamente todo o H2S formado é excretado no ambiente externo (MADIGAN et al., 2010).
As BRS têm um papel chave no ciclo do enxofre (Figura 2). Eles são micro-organismos ubíquos de habitats anaeróbios que utilizam o sulfato como aceptor terminal de elétrons para a degradação de compostos orgânicos, formando sulfeto, sem a assimilação significativa de enxofre em biomassa celular. O processo de redução global do sulfato pode ser representado pela equação:
2CH2O + SO4-2 + 2H+ ⇔ H2S + CO2 + H2O (1)
onde CH2O representa um composto orgânico. Subsequentemente, o sulfeto pode ser oxidado sob condições aeróbias por bactérias sulfurosas quimiolitotróficas ou em condições anóxicas por bactérias sulfurosas fototróficas (GILBERT et al., 2002; MUYZER; STAMS, 2008).
Figura 2. Ilustração do ciclo microbiano do enxofre.
Algumas BRS podem realizar a desproporcionação do enxofre: processo de geração de energia no qual o enxofre elementar ou o tiossulfato atuam como doador e aceptor de elétrons, resultando na formação simultânea de sulfato e sulfeto. Em adição aos compostos inorgânicos de enxofre, uma grande variedade de compostos orgânicos de enxofre (isto é, proteínas contendo enxofre) são sintetizados por micro-organismos e considerados parte do ciclo microbiano do enxofre (TANG et al., 2009).
As BRS são capazes de reduzir o sulfato (SO42-) e por vezes outros compostos de enxofre, como o sulfito (SO32-) e o tiossulfato (S2O32-), a sulfeto, isto é, realizam a redução desassimilativa do íon sulfato, onde este íon atua como agente oxidante para metabolizar a matéria orgânica (MADIGAN et al., 2010). A produção de H2S pelas BRS podem causar sérios problemas para as indústrias de petróleo, já que esse composto é altamente reativo, corrosivo e tóxico (MUYZER; STAMS, 2008).
As BRS apresentam crescimento em ampla faixa de pH (entre 5,0 e 9,0), grandes variações de temperatura, além de uma ampla faixa de condições osmóticas e um baixo potencial redox (TANG et al., 2009). São micro-organismos anaeróbios estritos que estão distribuídas em ambientes terrestres e aquáticos. No entanto, alguns gêneros de BRS conseguem sobreviver a longos períodos de exposição ao oxigênio na natureza pela presença das enzimas superóxido dismutase e superóxido redutase (VOORDOUW, 2001).
Atualmente, as BRS podem ser divididas em dois grupos metabólicos principais: aqueles que degradam compostos orgânicos incompletamente ao acetato; e aqueles que degradam compostos orgânicos completamente em dióxido de carbono (MUYZER; STAMS, 2008). Existem também as bactérias redutoras de sulfato que não necessitam de compostos orgânicos como fonte de energia ou doadores de elétrons. Nesse caso, o crescimento bacteriano não ocorre através de um processo heterotrófico, mas sim, autotrófico e geralmente com a produção de enxofre elementar como produto inorgânico final (MADIGAN et al., 2010). Os dois primeiros grupos de micro-organismos são os que mais contribuem para que ocorra o processo no qual o H2S é produzido e assim afeta diretamente as superfícies metálicas que conduzem a corrosão eletroquímica e anaeróbia (MAGALHÃES, 2014).
A redução desassimilatória do SO42- a H2S requer oito elétrons e ocorre por meio de vários estágios intermediários. Primeiramente, o sulfato é ativado por uma enzima ATP sulfurilase, resultando na formação de adenosina fosfosulfato (APS). A enzima APS redutase reduz o sulfato ativado em sulfito (SO32-) com liberação de
adenosina monofosfato (AMP). Por fim, a enzima sulfito redutase converte o sulfito a H2S. As taxas de crescimento das BRS sugerem que há formação de um ATP para cada sulfato reduzido a sulfeto quando o H2 é utilizado como doador de elétrons. Quando o lactato ou o piruvato são os doadores de elétrons, ocorre a formação adicional de ATP a nível de substrato, durante a oxidação do piruvato a acetato e CO2, via acetil-COA e acetil fosfato (MADIGAN et al., 2010; MUYZER; STAMS, 2008).
Com base em análises da sequência de rRNA 16S, as BRS podem ser divididas em quatro grupos principais: mesófilos Gram-negativos; Gram-positivos formadores de esporos; eubactérias termófilas Gram-negativas e arqueobactérias termófilas Gram-negativas. Todos esses grupos são caracterizados pelo uso do sulfato como aceptor final de elétrons durante a respiração anaeróbia (CASTRO et al., 2000; POSTGATE, 1979).
3.3.1.1. BRS mesófilos Gram-negativos
Este grupo de BRS está localizado dentro da subdivisão delta Proteobacteria. Em algum ponto da evolução microbiana, a subdivisão delta divergiu de outros membros do grupo Proteobacteria a partir de um ancestral comum fotoautotrófico, perdendo sua capacidade fotossintética e sendo convertido para heterotrofia (WOESE, 1987).
Segundo Castro et al., (2000) duas famílias de BRS foram propostas para delta Proteobacteria:
1) Desulfovibrionaceae - inclui os gêneros Desulfovibrio e Desulfomicrobium;
2) Desulfobacteriaceae - inclui os gêneros Desulfobulbus, Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfomonile, Desulfonema, Desulfobotulus e Desulfoarculus.
O gênero de BRS mais frequentemente estudado é a Desulfovibrio, comum em habitats aquáticos ou solos encharcados, contendo matéria orgânica em abundância e concentrações suficientes de sulfato. Esse gênero possui grande importância na
indústria do petróleo, pois está associada a CMI de tubulações metálicas de campos de petróleo (MADIGAN et al., 2010; MAGOT et al., 2000; TORTORA et al., 2012).
Além de bactérias redutoras de sulfato, a subdivisão delta inclui bactérias redutoras de enxofre (ordem Desulfovibrionales), Myxobacteria, Bdellovibrio,
Pelobacter e Geobacter (LONERGAN et al., 1996). As bactérias redutoras de enxofre
são organismos anaeróbios obrigatórios que utilizam formas oxidadas de enxofre, como sulfato e enxofre elementar (S0), em vez do oxigênio como aceptor de elétrons tendo como produto dessa redução o sulfeto de hidrogênio (TORTORA et al., 2012).
3.3.1.2. BRS Gram-positivos formadores de esporos
Este grupo é dominado pelo gêneroDesulfotomaculum e é colocado dentro do
grupo de bactérias Gram-positivas com baixa quantidade de GC.Este gênero inclui as únicas BRS conhecidas capazes de formar endosporos resistentes ao calor, uma característica partilhada com diversas espécies de Bacillus e Clostridium.Em contraste com as BRS mesófilas, algumas espécies de Desulfotomaculum são termófilas moderadas, com temperatura ótima de crescimento entre 54 e 65º C (CASTRO et al., 2000; LEÃO, 2009).
As espécies desse gênero exibem grande diversidade na obtenção de nutrientes, oxidando incompletamente uma ampla gama de substratos incluindo lactato, etanol, butanol e ácidos carboxílicos na presença de sulfato. Dependendo da espécie, substratos orgânicos são oxidados incompletamente a acetato ou completamente a CO2 (CASTRO et al., 2000; MAGOT et al., 2000).
Embora a maioria das BRS formadoras de esporos gram-positivas sejam encontradas em ambientes similares aos das BRS mesófilas gram-negativas, a formação de esporos permite a esse grupo sobreviver por longos períodos (meses ou anos) em condições óxicas e de dissecação (STUBNER; MEUSER, 2000).
3.3.1.3. BRS termófilas Gram-negativas
As duas espécies mais bem caracterizados neste grupo de BRS são
a partir de fontes de águas hidrotermais).Embora estes dois gêneros tenham características fisiológicas e fenotípicas semelhantes, eles diferem na forma (vibrião e bacilo) e teor de GC (CASTRO et al., 2000).
As Termodesulfobacteria são um pequeno grupo de bactérias termófilas primitivas que habitam as águas quentes em volta de chaminés vulcânicas submarinas, nascentes hidrotermais e lençóis profundos de petróleo. São organismos estritamente anaeróbios que utilizam o sulfato para oxidar compostos orgânicos ou inorgânicos disponíveis no ambiente, produzindo energia e liberando sulfeto (JEANTHON et al., 2002).
Thermodesulfobacterium é uma bactéria termofílica (temperatura ótima de
crescimento é de 70º C), incapaz de utilizar o acetato como doador de elétrons em seu metabolismo energético. Em vez disso, ela utiliza compostos como lactato, piruvato e etanol como doadores de elétrons, reduzindo o sulfato a sulfeto (MADIGAN et al., 2010).
3.3.1.4. Arqueobactérias termófilas Gram-negativas
No domínio Archaea, as bactérias redutoras de sulfato são representadas por membros do gênero Archaeoglobus. Esse gênero de BRS hipertermófila, com temperatura ótima de crescimento de 83º C, possui algumas coenzimas únicas de bactérias metanogênicas, que permitem produzir pequenas quantidades de metano durante o crescimento. Utilizam H2, formato, glicose, lactato e piruvato como fonte de energia e podem reduzir o SO42-, S2O32- ou SO32- a sulfeto (MADIGAN et al., 2010; MAGOT et al., 2000). Apenas duas espécies foram descritas até hoje, as quais foram isoladas a partir de sistemas hidrotermais marinhos: Archaeoglobus fulgidus e A. profundus. As principais diferenças entre as duas espécies são que A. fulgidus possuem flagelos, são quimiolitotróficos facultativos e produzem pequenas quantidades de metano, enquanto A. profundus não possuem flagelos, são quimiolitotróficos obrigatórios e não produzem metano (CASTRO et al., 2000).
3.3.2. Outros micro-organismos do petróleo
Outras importantes comunidades microbianas destes ambientes são representadas pelas arqueas metanogênicas (principalmente as mesófilas), bactérias (mesófilas e termófilas) e arqueas fermentativas, além de bactérias redutoras de ferro e manganês (MAGOT et al., 2000).
O Isolamento de micro-organismos metanogênicos tem sido bem sucedido a partir de águas de poços de petróleo com temperaturas mesófilas e alta salinidade. Já bactérias termófilas foram isoladas a partir de reservatórios que apresentam altas temperaturas. A combinação de alta temperatura e salinidade, em campos de petróleo, geralmente reduz drasticamente as populações microbianas, incluindo as metanogênicas (MAGOT et al., 2000).
Bactérias fermentadoras mesófilas, termófilas e hipertermófilas constituem uma importante comunidade microbiana do ambiente de campos de petróleo. As bactérias fermentadoras termófilas têm sido isoladas com uma frequência muito maior que as mesófilas, devido as altas temperaturas encontradas na maioria dos campos de petróleo. Termófilos anaeróbios, em geral, também têm sido estudados, principalmente devido ao potencial industrial das suas enzimas termoestáveis (MAGOT et al., 2000).
Bactérias redutoras de ferro mesófilas têm sido detectadas em fluidos de campos de petróleo e identificadas como Shewanella putrefaciens. Esta bactéria pode reduzir o enxofre elementar, sulfito e tiossulfato em sulfeto e usar H2 ou formato como doador de elétrons (MAGOT et al., 2000). Bactérias termófilas redutoras de ferro e manganês, Deferribacter thermophilus, foram isoladas a partir de águas de produção no Mar do Norte (GREENE et al., 1997).
No grupo das espécies anaeróbias facultativas encontradas em poços de petróleo estão as BRN, que incluem bactérias autotróficas e heterotróficas. Os principais gêneros heterotróficos desses organismos são: Achomobacter, Aerobacter,
Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Flavobaterium, Lactobacillus, Micrococcus, Proteus, Pseudomonas e Spirrillum (SEGUI, 2009). As BRN quimiolitotróficas são
representadas por Thiobacillus denitrificans, Sulfurimonas denitrificans (antigamente conhecido como Thiomicrospira denitrificans) e a espécie autotrófica facultativa
Vários trabalhos relatam a recuperação de bactérias aeróbias de reservatórios de petróleo. Sette et al. (2007) analisando a composição das comunidades microbianas em reservatórios de petróleo, utilizando métodos dependentes e independentes de cultivo, identificaram 9 diferentes grupos taxonômicos. Estes micro-organismos mostram-se relacionados à Acidithiobacillus, Arcobacter, Alicyclobacillus,
Bacillus, Acinetobacter, Halanaerobium, Leuconostoc, Marinobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Propionibacterium e Streptococcus.
Bactérias aeróbias também foram relatadas por Lopes (2010) estudando a diversidade taxonômica de bactérias isoladas da água de formação de reservatórios de petróleo da Bacia de Campos. Os principais gêneros isolados foram: Marinobacter,
Halomonas, várias espécies de Bacillus, Citreicella, Stenotrophomonas,
Achromotobacter, Micrococcus, Kocuria, algumas espécies de Streptomyces, e Staphylococcus.
Representantes de bactérias do gênero Streptomyces spp. já foram caracterizadosem vários estudos de diversidade bacteriana em campos de petróleo (LOPES, 2010; OLIVEIRA et al., 2008; SETTE et al., 2007; SILVA et al., 2013).Este grupo tem uma ampla distribuição em diferentes reservatórios de petróleo em todo o mundo e tem sido descrito como degradadores de hidrocarbonetos (SETTE et al., 2007). A recuperação de bactérias do gênero Streptomyces em campos de extração de petróleo pode revelar uma nova abordagem no desenvolvimento de substâncias antimicrobianas para a redução dos problemas causados pelas BRS, uma vez que, esse grupo de micro-organismos é conhecido como potenciais produtores de uma variedade de metabólitos secundários com atividades biológicas distintas (BÉRDY, 2005).
Uma avaliação abrangente da diversidade, processos metabólicos e condições de habitat para os micro-organismos do petróleo é de importância prática para avaliar as potencialidades econômicas dos campos de petróleo. Ela também ajuda na compreensão de como os fatores bióticos in situ podem afetar as operações de produção de petróleo (OKORO et al., 2016). Essas informações podem ajudar na elaboração de medidas de prevenção de problemas associados com a biocorrosão de equipamentos, a biotransformação e a biodeterioração do petróleo (LOPES, 2010).
3.4. Acidificação biogênica dos reservatórios (souring)
A acidificação de reservatórios de petróleo pode ser atribuída a vários mecanismos, bióticos e abióticos, sendo a geração microbiológica de sulfeto o que melhor explica o fenômeno. Este mecanismo baseia-se no consumo anaeróbio da matéria orgânica por micro-organismos através da utilização de íons sulfato como aceptor final de elétrons (metabolismo desassimilativo do sulfato). O sulfeto gerado no metabolismo das BRS é um gás altamente tóxico, corrosivo e inflamável, com um odor desagradável que pode causar sérios problemas de saúde e também problemas ambientais (FAUQUHAR, 1997; SEGUI, 2009).
O souring é um problema generalizado em toda a indústria do petróleo, que ocorre tanto em operações onshore (reservatórios terrestres, pouco profundos onde a redução de sulfato por BRS mesófilas é prevalente) quanto offshore (reservatórios no fundo do mar em que a injeção de água do mar fornece uma fonte de sulfato para a atividade de BRS termófilas) (GIEG et al., 2011; NEMATI et al., 2001).
Esse biofenômeno representa um impacto considerável na produção, pois contribui para o aumento da biocorrosão, reduz a qualidade do petróleo produzido, afeta a produtividade dos poços pela geração de incrustantes e potencializa os riscos ambientais devido à toxicidade do sulfeto. Além disso, a necessidade de remoção do H2S antes da utilização do petróleo e da reciclagem da água produzida, aumenta os custos de produção (HUBERT; VOORDOUW, 2007; TANG et al., 2009).
Estudos microbiológicos para determinar a presença ou ausência de BRS indígenas e a quantificação dos nutrientes disponíveis e limitantes antes da injeção de água, pode ajudar na concepção de medidas de prevenção contra a acidificação dos campos de petróleo (MAGOT et al., 2000).
3.5. Corrosão Microbiologicamente Influenciada (CMI)
Interações físico-químicas entre um material metálico e o seu ambiente pode conduzir a corrosão. A corrosão eletroquímica é uma reação que envolve a transferência de elétrons a partir de metais de valência zero para um aceptor de elétrons externo, causando liberação dos íons metálicos para o meio circundante e
deterioração do metal.Este processo ocorre através de uma série de reações químicas (anódicas e catódicas), em contato direto ou em estreita proximidade, com a superfície metálica (BEECH; SUNNER, 2004).
Vários micro-organismos, nomeadamente, bactérias, fungos e algas, estão envolvidos no processo de corrosão de superfícies. A deterioração de metais devido à atividade microbiana é denominada biocorrosão ou corrosão microbiologicamente influenciada (BEECH; SUNNER, 2004; CORTEZ, 2009), que pode ser atribuída, sobretudo, à colonização inicial de metais e ligas de uso industrial através da formação de biofilmes, à produção de metabólitos secundários corrosivos como o H2S e à despolarização catódica (VIDELA, 2002).
Os biofilmes são ecossistemas microbianos extremamente complexos, podendo ser constituídos por uma diversidade de micro-organismos. Estas estruturas são constituídas de agregados celulares; material polimérico extracelular (EPS) resultante do metabolismo microbiano; matéria orgânica e inorgânica; e, principalmente, de água (Figura 3) (VIDELA, 2002).
Figura 3.Desenvolvimento de biofilme microbiano.
Fonte: Davis (2007).
Os biofilmes são formados em diversos estágios: 1 - adesão de organismos planctônicos na superfície sólida; 2 - adesão e multiplicação de micro-organismos aeróbios (sésseis); 3 - crescimento celular e produção de EPS; 4 - crescimento de micro-organismos anaeróbios internamente ao biofilme; e 5 - desenvolvimento adicional, formando o biofilme maduro, o que pode favorecer o desprendimento das camadas mais externas (MADIGAN et al., 2010).
A produção de EPS permite a sobrevivência celular pela fixação a várias superfícies em seu ambiente natural sob a forma de incrustações. Nesses biofilmes
formam-se zonas anaeróbias, ainda que em meios oxigenados, fornecendo aos micro-organismos condições favoráveis para o seu crescimento (HAMILTON, 1985).
As bactérias que se encontram agregadas, devido ao biofilme, apresentam algumas vantagens sobre as planctônicas, uma vez que se tornam menos vulneráveis à ação de antimicrobianos e biocidas em geral, bem como se encontram mais protegidas de fatores ambientais agressivos. Por outro lado, podem estabelecer-se ambientes simbióticos, facilitando assim a aquisição de nutrientes e a manutenção da espécie (CORTEZ, 2009).
Os biofilmes formados em superfícies de materiais metálicos alteram os processos eletroquímicos da interface solução/metal fornecendo um ambiente propício às atividades metabólicas das bactérias associadas à biocorrosão, levando a corrosão do substrato colonizado. Isto é feito por deposição física de substâncias tóxicas, a formação de subprodutos ácidos e corrosivos, por despolarização da célula de corrosão através do aumento da utilização de hidrogênio, de oxigênio ou de composto de ferro no ambiente (OSSAI et al., 2015).
As BRS são apontadas como o grupo responsável pelos casos mais graves da CMI, estando intimamente relacionadas com a biocorrosão de materiais de ferro e aço usados na indústria (BEECH; SUNNER, 2004). A biocorrosão, aliada à potencialização do souring biogênico e ao plugueamento da formação rochosa, levam ao decréscimo da produção de petróleo e a deterioração de estruturas metálicas e equipamentos, além de provocar danos ao meio ambiente e à saúde humana (ALMEIDA et al., 2006; SEGUI, 2009; TANG et al., 2009).
Os problemas associados à biocorrosão e bioincrustação (acumulação indesejável de depósitos de natureza biológica sobre uma superfície) de sistemas industriais variam desde a contaminação microbiológica até falhas estruturais devido à corrosão. As partes do sistema que frequentemente sofrem de tais riscos são: sistemas de refrigeração (abertos ou fechados); linhas de injeção de água; tanques de armazenamento; sistemas de tratamento de água residual; sistemas de filtração; tubulações; membranas de osmose reversa; e sistemas de distribuição de água potável (VIDELA, 2002).
Para evitar a biocorrosão os métodos empregados devem abordar as seguintes questões fundamentais: inibição do crescimento e/ou atividade metabólica dos micro-organismos e a modificação do ambiente no qual o processo de corrosão ocorre (para evitar a adaptação das bactérias às condições existentes). Os métodos comumente
utilizados para prevenir e controlar a CMI são: procedimentos de limpeza; uso de biocidas; revestimentos protetores; e a proteção catódica (VIDELA, 2002).
3.6. Métodos de prevenção e controle do souring e CMI
Vários métodos podem ser empregados para prevenir e/ou controlar o souring e a CMI. A escolha do método será definida pela relação custo-benefício, ou seja, eficiência pretendida e estimativa de custos (GALVÃO, 2008).
Estratégias para o controle do souring e CMI em reservatórios de petróleo incluem: injeção de AP com baixos teores de sulfato; remoção mecânica do biofilme; controle da atividade microbiana por injeção de biocidas; injeção de nitrato e/ou nitrito para inibir a atividade de BRS; combinar tratamentos, tais como injeção de nitrito com molibdato e/ou biocidas; formação de biofilmes protetores com bactérias benéficas; ou ainda, micro-organismos antagonistas à atividade das BRS (GIEG et al., 2011).
3.6.1. Limpeza mecânica
Envolve qualquer método capaz de remover depósitos formados sobre superfícies metálicas. Dentre esses métodos, o tratamento por pigging (utilização de instrumentos que se deslocam no interior do sistema com a pressão da água ou do próprio fluido transportado na tubulação, removendo depósitos orgânicos, incrustações ou qualquer material que esteja aderido à parede interna da tubulação), se mostra o mais eficaz. A limpeza mecânica também pode ser realizada por escovação, materiais abrasivos ou utilização de jatos d’água com alta pressão (GALVÃO, 2008).
3.6.2. Proteção catódica
Proteger catodicamente uma estrutura significa eliminar, por processo artificial, as áreas anódicas da superfície do metal fazendo com que toda a estrutura adquira
comportamento catódico. Como consequência, o fluxo de corrente elétrica ânodo/cátodo deixa de existir e a corrosão é eliminada. Os métodos de proteção catódica são: proteção catódica galvânica e proteção catódica por corrente impressa (GALVÃO, 2008).
3.6.3. Biocidas
Os biocidas são compostos individuais (ou uma mistura de compostos) capazes de matar micro-organismos ou inibir o crescimento microbiano.Eles podem ser inorgânicos ou orgânicos e a sua eficácia depende da natureza dos micro-organismos a serem eliminadas e das condições de operação do sistema a ser tratado (VIDELA, 2002).
Os biocidas de amplo espectro incluem glutaraldeído, tetrakis (hidroximetil) fosfonio sulfato (THPS), cloreto de benzalcônio, formaldeído, hipoclorito de sódio, cocodiaminas, entre outros (VIDELA; HERRERA, 2005).
Normalmente, os biocidas comercialmente disponíveis são tóxicos e não biodegradáveis, alguns, potencialmente perigosos para o pessoal de campos petrolíferos e o meio ambiente. Eles também são caros e requerem aplicação repetida ou contínua para que sejam eficazes. Além disso, o uso contínuo de biocidas pode levar ao aparecimento de populações microbianas resistentes, através da resistência bioquímica ou por falta de penetração nos biofilmes, in situ, em gasodutos (GIEG et al., 2011).
3.6.4. Uso de molibdato
O íon molibdato (MoO42-) é um inibidor metabólico de baixa toxicidade específico de BRS (DE JESUS, 2015). Ele entra na célula por um sistema de transporte de sulfato e interfere com a formação de APS, a forma ativa do sulfato na célula durante as reduções assimilativa e desassimilativa. A presença do molibdato leva à formação de adenosina fosfomolibdato na célula, em vez de adenosina fosfosulfato, o que provoca escassez de compostos de enxofre reduzidos necessários ao crescimento bacteriano (NAIR et al., 2015; PATIDAR; TARE, 2005).
O molibdato é um inibidor do processo de redução de sulfato, mas a sua eficácia depende do metabolismo das BRS: é eficaz quando elas estão reduzindo ativamente sulfato, mas ineficaz se as BRS estão fermentando ou em estado de repouso (baixa concentração de sulfato) (GIEG et al., 2011). Uma alternativa para o controle das BRS com o uso de molibdato é a adição consorciada nitrito/molibdato (dois inibidores metabólicos de BRS), que apresenta atividade inibitória sinérgica, podendo controlar a produção biogénica de H2S (PERCIVAL, 1999; PREDICALA et al., 2008).
Além de ser um inibidor metabólico, o molibdato também pode atuar como um inibidor anódico, formando um filme protetor nas estruturas metálicas, passivando o metal e reduzindo a corrosão (MODESTO, 2008).
3.6.5. Inibição microbiana da corrosão
É a diminuição da reação de corrosão geralmente realizada por substâncias (inibidores de corrosão) que, quando adicionadas em pequenas quantidades para um determinado ambiente, diminui a taxa de ataque por este meio ambiente a um metal (VIDELA; HERRERA, 2005).
A dificuldade na eliminação das BRS aderidas às estruturas metálicas na forma de biofilmes e a crescente taxa de resistência dos micro-organismos às estratégias classicamente usadas (antibióticos/biocidas) tem impulsionado pesquisas que visam o desenvolvimento de estratégias alternativas para o controle da biocorrosão (ALBUQUERQUE et al., 2014).
A utilização de micróbios antagonistas ou o produto de seu metabolismo para eliminar micro-organismos causadores de corrosão é uma alternativa que vem sendo cada vez mais estudada. Diferentes mecanismos têm sido propostos para explicar a inibição da corrosão por bactérias, tais como: consumo de oxigénio na superfície do metal devido a formação de biofilme; formação de materiais inorgânicos; geração de antimicrobianos por biofilmes; produção de biossurfactante secretado pelo biofilme; e inibição de corrosão por bacteriófagos (MORADI et al., 2015).
3.7. Antagonismo microbiano
O alto custo, toxicidade e por vezes ineficácia das atuais estratégias físicas e químicas para controlar a corrosão têm chamado atenção para a utilização de micro-organismos em mecanismos inibitórios, e isso tem gerado grande interesse. Alguns dos métodos inibidores incluem aplicações de bactérias redutoras de nitrato, biofilmes regenerativos, substâncias antimicrobianas (SAM) e uso de bacteriófagos (ZARASVAND; RAI, 2014).
3.7.1. Exclusão biocompetitiva
A Inoculação de bactérias como antagonistas competitivas em campos de petróleo tem sido proposta para o controle da acidificação (ZUO, 2007). O antagonismo bacteriano é um processo em que o crescimento e atividade de um micro-organismo inibe o crescimento de outro (KRISTIJA; BAI, 2013).
Além de BRS, muitos outros micro-organismos, tais como bactérias redutoras de nitrato heterotróficas (BRN) e bactérias redutoras de nitrato oxidante sulfeto (BRN-OS) podem estar presentes nos campos de extração de petróleo. Essas bactérias estão envolvidas em estratégias de atenuação do sulfeto (Figura 4) (TANG et al., 2009).
A injeção de nitrato estimula o crescimento de BRN, que irão competir com as BRS pelas mesmas fontes de carbono, tais como ácidos graxos voláteis. A energia gerada na redução de nitrato é maior do que a energia obtida a partir da redução de sulfato, promovendo uma atividade mais intensa das BRN que, por seu metabolismo energeticamente mais favorável, provoca uma redução das fontes nutricionais disponíveis para o desenvolvimento das BRS (VIDELA; HERRERA, 2005).
Por outro lado, as BRN-OS são quimiolitotróficas, ou seja, utilizam a energia da oxidação do sulfeto para obter energia, reduzindo o nitrato a nitrito (VOORDOUW, 2011). Sendo assim, essas bactérias não competem com as BRS por compostos orgânicos. O nitrito gerado pelo metabolismo das BRN-OS inibe o crescimento das BRS, pois esse composto inibe a enzima sulfito redutase, responsável por catalisar a redução do sulfito a sulfeto nas BRS (ZARASVAND; RAI, 2014).
Figura 4. Ilustração esquemática da interação dos ciclos enxofre/nitrogênio que podem
ocorrer em reservatórios de petróleo.
Fonte: Gieg et al., p. 273, (2011). As interseções entre os ciclos biogeoquímicos do nitrogênio e do enxofre são: 1 - amonificação; 2 - sulfetogênese; 3 - oxidação parcial e completa de sulfeto; 4 - competição de BRN e BRS por doadores de elétrons, juntamente com a redução incompleta de nitrato em nitrito; 5 - reação química com sulfeto e nitrito; 6 - inibição da atividade da enzima sulfito redutase pelo nitrito.
As bactérias oxidantes de sulfeto são conhecidas pelo importante papel na remoção de H2S in situ a partir dos reservatórios de petróleo onshore e offshore e são utilizadas nos processos ex situ para o tratamento de gás ácido e águas carregadas de sulfeto (TANG et al., 2009).
A abordagem microbiana que propõe a alteração das características da água produzida com nitrato ou uma combinação de nitrato e BRN-OS, surgiu como uma opção atraente para controlar o souring (TANG et al., 2009). No entanto, apesar dessa metodologia ter se mostrado eficiente no controle da biocorrosão, a sua ação em campos petrolíferos nem sempre é previsível. Tais incertezas têm estimulado um exame dos mecanismos fundamentais da inibição pela utilização de nitrato/nitrito, revelando um conjunto complexo de interações biológicas, bioquímicas e abióticas (Figura 4).A importância dessas reações varia entre os reservatórios com diferentes condições físico-químicas, microbiota e regimes de tratamento secundário (GIEG et al., 2011).
3.7.2. Biofilmes protetores e agentes antimicrobianos
Algumas bactérias produzem biofilmes que inibem a biocorrosão através de uma série de mecanismos: remoção de agentes de corrosão, produção de peptídeo inibidor dentro do biofilme, eliminação de bactérias causadoras de corrosão por agente antimicrobiano e a produção de biossurfactante (ZARASVAND; RAI, 2014; ZUO, 2007).
Moradi et al. (2015) avaliando o efeito inibidor da corrosão pela formação de biofilmes protetores observaram que a bactéria Vibrio neocaledonicus sp. e seu subproduto metabólico aumentou em mais de sessenta vezes a proteção contra a corrosão do aço carbono. Esse efeito foi causado pela formação de uma camada inibidora de EPS que cobriu completamente as superfícies metálicas.
Em outro estudo, Jayaraman et al. (1999) avaliando a inibição de BRS por produção de peptídeos antimicrobianos em biofilmes produzidos por Bacillus
subtilis, descobriram que estas substâncias foram capazes de inibir o crescimento das
bactérias Desulfovibrio vulgaris e D. gigas, reduzindo significativamente as taxas de corrosão em condição de cultura contínua. Segundo os autores, a produção dessas substâncias no biofilme tem duas vantagens: a primeira é que ela evita a dificuldade de difusão biocida em biofilme e a segunda é que mantêm uma concentração mais elevada do antimicrobiano dentro do biofilme devido às substâncias exopoliméricas que formam a matriz do biofilme e impedem a sua difusão.
A produção de agentes antimicrobianos por bactérias também pode eliminar os micróbios associados à biocorrosão. Magalhães (2014), estudando micro-organismos antagonistas às BRS oriundas de amostras de água produzida, observou que substâncias produzidas pelas bactérias Halomonas aquamarina e Marinobacter
hydrocarbonoclasticus, ambas com metabolismo desnitrificante, foram capazes de
inibir o crescimento da bactéria Desulfovibrio vulgaris.
Várias bactérias produzem biossurfactantes com atividade antimicrobiana. Os raminolipídeos de P. aeruginosa e a surfactina de B. subtilis funcionam como antibióticos, solubilizando os principais componentes das membranas celulares microbianas (LIN, 1996). Através da excreção destes biossurfactantes no meio, os micro-organismos adquirem maior chance de sobrevivência e maior competitividade na busca por nutrientes (NITSCHKE; PASTORE, 2002).
