Natal/RN 2016
UNIVERDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
INSTITUTO DE QUÍMICA
Ingrid de Castro dos Santos
Estudo da composição química de Croton argenteus e perfil da atividade antioxidante e bacteriostático.
Natal/RN 2016
Ingrid de Castro dos Santos
Estudo da composição química de Croton argenteus e perfil da atividade antioxidante e bacteriostático.
Monografia apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito obrigatório à obtenção do título de Bacharel em Química.
Orientadora: Profª. Dra. Renata Mendonça Araújo.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Instituto de Química – IQ
Santos, Ingrid de Castro Dos.
Estudo da composição química de Croton argenteus e perfil da atividade antioxidante e bacteriostático / Ingrid de Castro Dos Santos. - 2016.
43 f.: il.
Monografia (graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Instituto de
Química, Natal, 2016.
Orientador: Profª Drª Renata Mendonça Araújo.
1. Óleos essenciais - Monografia. 2. Croton argenteus - Composição - Monografia. 3. Plantas - Análise - Monografia. 4. Fitoquímicos - Monografia. 5. Química - Monografia. I. Araújo, Renata Mendonça. II. Título.
Ingrid de Castro dos Santos
Natal/RN 2016
Estudo da composição química de Croton argenteus e perfil da atividade antioxidante e bacteriostático.
Monografia submetida ao Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito obrigatório à obtenção do título de Bacharel em Química.
Orientadora: Profª. Dra. Renata Mendonça de Araújo.
Aprovado em: ____/____/_______
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________ Profa. Dra. Renata Mendonça Araújo (Orientadora)
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
_________________________________________ Prof. Dr. Fabiano do Espírito Santo Gomes (Membro)
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
_________________________________________ Ms. Maria de Fátima Rocha de Lima (Membro)
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, meu Senhor e salvador, meu guia, meu amigo, meu pai. Pela vida, por minha força que vem de Ti, por seu imenso amor.
A minha família pelo apoio que permitiu que eu chegasse até aqui. Em especial a Thiago Oliveira pelo seu amor, carinho e incentivo durante todos esses anos, me trazendo muita felicidade e me ajudando no que fosse preciso, sempre acreditando em mim.
A minha orientadora Profa. Dra. Renata Mendonça pela orientação, dedicação e oportunidade de aprendizado durante este projeto.
Ao Laboratório de Isolamento e Síntese de Compostos Orgânicos (LISCO), pela oportunidade e aprendizado adquirido. Aos membros do grupo de Produtos Naturais: Mayra, Monara, Fatynha, Rusceli e Marcela que muito me ajudaram mostrando suas experiências, minimizando meus erros, tirando minhas dúvidas, que Deus retribua à cada um conforme aquilo que me proporcionaram.
Á minhas amigas Evelin Helena e Aline Marques pelo companheirismo, atenção e carinho durante minha jornada acadêmica sempre me encorajando e acreditando no meu potencial.
Agradeço a todos que me ajudaram, diretamente ou não, durante toda minha trajetória acadêmica, serei sempre grata.
“Não te mandei eu? Esforça-te, e tem
bom ânimo; não temas, nem te espantes;
porque o Senhor teu Deus é contigo, por
onde quer que andares.”
RESUMO
Croton argenteus, é um arbusto encontrado no sertão do nordeste do Brasil,
pertencente ao gênero Croton, que é o segundo maior gênero da família Euphorbiaceae, com cerca de 1.200 espécies. Oferece uma grande variedade de espécies, as quais vêm sendo estudadas por apresentarem atividades terapêuticas no tratamento de doenças. Estudos relatam que essas propriedades biológicas são atribuídas aos óleos essenciais de espécies desse gênero, os quais têm demonstrado efeito antinociceptivo, anti-inflamatório, capacidade de cicatrização de feridas e atividades antimicrobianas.Este trabalho teve como objetivo analisar a composição química do óleo essencial das folhas de C.argenteus, a atividade antioxidante e a atividade bacteriostática dos extratos. O óleo essencial foi obtido das folhas frescas por hidrodestilaçãoe a sua composição química foi analisada através de CG-EM. Foi possível identificar 15 constituintes químicos correspondendo a 66% em massa da amostra, nos quais os compostos majoritários foram óxido de cariofileno (26,6%) seguido de espatulenol (9,0%) e cariofileno (4,8%).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Estruturas químicas dos constituintes majoritários presente nos óleos essenciais de C.blanchetianus, C. cordiifolius Baill, C. campestris,C. argyrophyllus e
C. zehntneri. ... 15
Figura 2-Parte aérea de Crotonargenteus ... 17
Figura 3- Ramos de Croton argenteus ... 17
Figura 4-Exemplos de compostos derivados do Isopreno ... 19
Figura 5-Exemplos das principais classes de terpenos ... 20
Figura 6-Cromatograma CG/EM de OECA... 32
Figura 7-Espectro de massa do constituinte D-Limoneno ... 34
Figura 8-Espectro de massa do constituinte Linalool ... 34
Figura 9-Espectro de massa do constituinte α-Copaeno ... 34
Figura 10-Espectro de massa do constituinte Biciclosesquifelandreno ... 34
Figura 11-Espectro de massa do constituinte Cariofileno ... 34
Figura 12-Espectro de massa do constituinte α-Humuleno ... 35
Figura 13-Espectro de massa do constituinte γ-Muuroleno ... 35
Figura 14- Espectro de massa do constituinte Espatulenol ... 35
Figura 15-Espectro de massa do constituinte Óxido de Cariofileno ... 35
Figura 16- Espectro de massa do constituinte Ledol ... 36
Figura 17-Espectro de massa do constituinteτ-Muurolol ... 36
Figura 18- Espectro de massa do constituinte α-cadinol ... 36
Figura 19-Espectro de massa do constituinte β-Guaieno ... 36
Figura 20-Espectro de massa do constituinte allo-Aromadendreno ... 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1-Volumes do óleo essencial extraído do C. argenteus ... 25
Tabela 2- Rendimento dos extratos obtidos do C. argenteus ... 25
Tabela 3-Resultado do teste microbiológico ... 26
Tabela 4-Valores de absorbância e médias da AA%. ... 27
Tabela 5-Valores de absorbância e AA% para OECA ... 30
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1- Atividade antioxidante do extrato CAFE ... 28
Gráfico 2- Atividade antioxidante do extrato CACE ... 28
Gráfico 3-Atividade antioxidante do extrato CACH ... 29
Gráfico 4- Atividade antioxidante do extrato CAFH ... 29
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
OE Óleo Essencial
OECA Óleo Essencial de Croton argenteus CAFE Croton argenteus Folha Etanólico
CAFH Croton argenteus Folha Hexânico
CACE Croton argenteus Caule Etanólico
CACH Croton argenteus Caule Hexânico
CG-EM Cromatografia Gás/líquido acoplada à Espectroscopia de Massa AA% Atividade Antioxidante
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
CIM Concentração Inibitória Mínima CBM Concentração Bactericida Mínima
SUMÁRIO
1 Introdução ... 12
2 Considerações sobre o gênero Croton ... 14
2.1 Considerações Botânicas ... 14
2.2 Atividade Biológica em espécies do gênero Croton ... 14
2.3 Croton argenteus ... 17 3 Óleos Essenciais ... 18 3.1 Terpenos ... 19 4 Objetivos ... 21 4.1 Objetivos Gerais ... 21 4.2 Objetivos Específicos ... 21 5 Parte Experimental ... 22
5.1 Extração do Óleo Essencial ... 22
5.2 Obtenção dos Extratos ... 22
5.3 Caracterização do óleo por CG/ME ... 22
5.4 Testes antimicrobianos com as bactérias Eschecheria coli e Sthaphylococus aureus do óleo essencial e extratos da folha de Croton argenteus ... 23
5.5 Estudo para a Atividade Antioxidante (AA%) ... 23
6 Resultados e Discussão ... 25
6.1 Extração do óleo e extratos orgânicos ... 25
6.2 Testes antimicrobianos com as bactérias Eschecheria coli e Sthaphylococus aureus do óleo essencial e extratos da folha de Croton argenteus ... 26
6.3 Análise da Atividade Antioxidante ... 26
7 Caracterização química do óleo essencial do Croton argenteus ... 32
8 Conclusão ... 38
12
1 Introdução
Há muito tempo as plantas têm papel fundamental na vida do homem sendo como fonte de alimentos, habitação, trabalho, no tratamento de doenças, utensílios para manifestações artísticas, culturais e religiosas. Até o século XIX, os recursos terapêuticos eram formados principalmente por plantas e extratos vegetais, o que pode ser ilustrado pelas Farmacopéias da época. Assim, as plantas representavam a principal matéria prima da maioria dos medicamentos que pouco se diferenciavam dos remédios utilizados na medicina popular (SIMÕES et al., 2004).
A flora brasileira é mundialmente conhecida por ser uma fonte de substâncias químicas com atividade biológica, onde o Nordeste possui grande destaque pela ampla diversidade de plantas aromáticas e com propriedades terapêuticas. Com isso, a busca por novos compostos é particularmente motivada pela grande diversidade de espécies vegetais brasileiras, cujas atividades biológicas não são completamente conhecidas (RAMOS et al., 2009).
Croton é um dos maiores gêneros da família Euphorbiaceae, com cerca de
1.200 espécies. Várias espécies desse gênero podem ser encontradas no nordeste brasileiro, geralmente são conhecidas como marmeleiro ou velame e usadas na medicina popular no tratamento de inflamações, ulceras e hipertensão. Estudos realizados com espécies deste gênero relatam a presença de alcalóides, flavonóides, proantocianidinas, diterpenos, triterpenos e esteróides, que atribuem propriedades terapêuticas a muitas espécies (SALATINO, 2007). E a maioria das espécies são produtoras de óleos essenciais ricos em monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanóides, com grande diversidade estrutural, o que as torna fontes propícias de substâncias bioativas (PALMEIRA JR. et al., 2006).
Os óleos voláteis, conhecidos como óleos essenciais são representantes de uma classe de metabólitos secundários importantes neste gênero. Salantino et al., (2007) realizou um estudo dos óleos essenciais com cerca de trinta espécies de
Croton, os resultados indicaram que alguns destes óleos são ricos em terpenóides e
fenilpropanóides, e outros são ricos somente em terpenóides.
Estudos relatam que os óleos essenciais de espécies desse gênero têm demonstrado efeito antinociceptivo, anti-inflamatório, capacidade de cicatrização de
13
feridas e atividades antimicrobianas (CRAVEIRO A. A. et al., 1981; COELHO DE SOUZA et al., 2012).
A espécie C. argenteus não possui estudo relatado na literatura, logo este trabalho pretende contribuir para o conhecimento químico e biológico desta espécie através do estudo fitoquímico realizado através de métodos cromatográficos associados à espectroscopia de massa, e testes bacteriostático e antioxidante.
14
2 Considerações sobre o gênero Croton 2.1 Considerações Botânicas
O gênero Croton é o segundo maior gênero da família Euphorbiaceae, com cerca de 1.200 espécies. Apresenta distribuição pantropical, embora a maioria dos seus representantes ocorra nas Américas. Na América do Sul, aproximadamente 350 espécies se concentram no Brasil, país como maior número de espécies, amplamente distribuídas nos mais diversos ambientes (SILVA et al., 2010).
As espécies deste gênero têm sido amplamente estudadas em relação aos seus constituintes voláteis e não-voláteis. Muitas espécies são produtoras de um grande número de metabolitos secundários os quais pertencem às classes dos alcalóides, fenilpropanóides e terpenóides (RANDAU et al., 2004).
Estudos realizados com algumas espécies de Croton de ocorrência brasileira têm possibilitado o isolamento de 109 compostos pertencentes às diversas classes estruturais tais como diterpenos (35,6%), alcalóides (24,8%) flavonóides (12,8%) e triterpenos (11%) (TORRES, 2008).
Este gênero é predominante na região Nordeste, principalmente no cerrado, caatinga (vegetação semi-árida) e nos campos rupestres, onde as folhas e cascas são utilizadas na forma de chá; seus usos incluem tratamento de câncer, problemas gastrointestinais, diabetes, feridas externas, febre, hipercolesterolemia, hipertensão, inflamação, malária, dor, úlceras e obesidade (SALATINO, 2007).
2.2 Atividade Biológica em espécies do gênero Croton
O uso popular diversificado desse gênero pode ser explicado pela presença de diversos componentes com atividades biológicas (BLOCK et al., 2004).
No estudo realizado com o óleo essencial de C. zehntneri verificou que seus constituintes principais, anetol e estragol, têm demonstrado efeitos antiespasmódico e gastroprotetores (COELHO DE SOUZA et al., 2012).
O diterpenoclerodanotrans-desidrocrotonia (DCTN), isolado da espécie C.cajucara, apresentou diversas atividades biológicas expressivas como
15
hipoglicêmica, hipolipidêmica, antigenotópica, antiulcerogênica, antitumoral, antiinflmatória e antinociceptiva, antiestrogênica e cardiovascular (COSTA et al., 2007; MACIEL et al., 2002). Ensaios com flavonóides extraídos dessa mesma espécie também foi observada atividade antiinflamatória e antioxidante (NARDI et
al., 2007).
Alguns dos componentes ativos presentes no óleo essencial de
C.blanchetianus como 1,8-cineol, guaiazulene, e β-cariofileno têm sido relatados por
possuírem propriedades antiinflamatória, analgésica e antioxidante (SANTOS et al. 2005).
Estudos anteriores têm relatado os efeitos anti-inflamatórios, antiulcerogênicos, anti-diabéticos e antibacterianos do Croton campestris, popularmente conhecido como"Velame-do-campo".Os principais constituintes do óleo essencial das folhas são β-cariofileno (17%) e biciclogermacreno (16,2%) (ALMEIDA et al., 2012)
O constituinte majoritário do C. cordiifolius Baill, 1,8-cineol, apresentou atividades antiin amatória e analgésica, antitumoral, gastroprotetora,e hepatoprotetora (NOGUEIRA et al., 2015).
Ramos et al., (2013) observou que o óleo essencial do C.argyrophyllus apresentou atividade antioxidante de C. argyrophyllus, tal propriedade poderia ser responsável por seus efeitos anti-inflamatórios. O O.E. de C. argyrophyllus é quimicamente composto por terpenos (sesquiterpenos e monoterpenos), com o biciclogermacreno (14.60%), o composto majoritário seguido de espatulenol (8.27%), e (E)-cariofileno (6.79%).
A análise fitoquímica do óleo essencial das folhas de C. somderianus revelou a presença dos constituintes guaiazuleno, -cariofileno e 1,8- cineol, os quais podem ser atribuídos os efeitos farmocológicos antiinflamatório, antinociceptivo e gastroprotetora (AMARAL, 2004).
Na figura 1, observam-se os principais constituintes dos óleos essenciais das seguintes espécies de Croton: C.blanchetianus, C. cordiifolius Baill, C. campestris,
C. argyrophyllus e C. zehntneri.
16
cordiifolius Baill, C. campestris,C. argyrophyllus e C. zehntneri.
O 1,8-cineol Guaiazulene Biciclogermacreno HO H H H H Espatulenol
O
Anetol E- Cariofileno Fonte: Autor, 2016.17
2.3 Croton argenteus
C. argenteus é considerada uma espécie neotropical, sendo um pequeno
arbusto que pode chegar a 80 cm de altura, com folhas de coloração verde escura, aveludadas e flores amareladas (MORON RODRIGUEZ et al.2006) como mostrado nas figuras 2 e 3.
Figura 2-Parte aérea de Crotonargenteus
Fonte: Profª.Dra. Renata Mendonça Araújo (UFRN)
Figura 3- Ramos de Croton argenteus
18
3 Óleos Essenciais
Os óleos essenciais naturais de plantas aromáticas são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, bioativas, e apresentam odor forte e geralmente agradável, são incolores quando recentemente extraídos ou ligeiramente amarelados de aparência oleosa. São extraídos de diversas partes das plantas (flores, inflorescências, sementes, folhas, gravetos, cascas, frutos e raízes) por processos específicos. Tem como característica principal a volatilidade, que os difere dos óleos fixos que são misturas de substâncias lipídicas (SIMÕES et al., 2004).
A extração pode ser feita partindo de flores, folhas, frutos, sementes, parte aérea, caules e raízes. Ainda que todas essas partes possuírem óleos, algumas são mais concentradas que outras (SIMÕES et al., 2000). Essas extrações podem ocorrer por destilação de arraste a vapor ou hidrodestilação, que é a técnica mais empregada por ser uma forma rápida e econômica, compressão de vegetais ou ainda uso de solventes.
As substâncias químicas encontradas nos óleos essenciais da maioria das espécies de Croton são formadas por ésteres de ácidos graxos, terpenóides, fenilpropanonas, álcoois, aldeídos e em alguns casos, por hidrocarbonetos alifáticos. No entanto, os óleos essenciais, apresentam composição química rica em fenilpropanóides e terpenóides (mono e sesquiterpenos), exceto algumas que apresentam apenas terpenóides (SALATINO, 2007). Os compostos terpênicos mais frequentes nos óleos são os monoterpenos (cerca de 90%) e os sesquiterpenos, podendo também estar presente os diterpenos quando extraídos com solventes orgânicos (SIMÕES et al., 2007).
Na maioria das espécies de Croton, tais componentes voláteis, que são os responsáveis pelo agradável aroma dessas plantas (RANDAU et al., 2004), apresentam uma enorme diversidade estrutural, o que aumenta as chances desses óleos essenciais de se tornarem verdadeiras fontes de substâncias bioativas.
19
3.1 Terpenos
Geralmente, o principal componente volátil de um óleo essencial pertence a uma classe de substâncias químicas chamadas terpenos ou terpenóides, quando apresentam oxigênio na estrutura (CAREY, 2011; SOLOMONS, 2013). Os terpenóides compõem uma grande variedade de substâncias vegetais, sendo que esse termo é empregado para designar todas as substâncias cuja origem biossintética deriva de unidades do isopreno de fórmula química - CH3C(CH2)CHCH2. As estruturas carbonadas dos terpenóides são formadas pela condensação de um número variável de unidades isoprênicas (SIMÕES et al. 2004). Na figura 4, observam-se exemplos de terpenos.
Figura 4-Exemplos de compostos derivados do Isopreno
Isopreno HO Pineno Limoneno Humuleno Cariofileno Linalol Fonte: Autor, 2016.
20
Os principais terpenos são: os monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40). Porém os terpenos mais frequentes nos OE são os monoterpenos (cerca de 90% dos óleos voláteis) e os sesquiterpenos (SIMÕES et al. 2004), a figura 5 mostra alguns exemplos desses compostos.
Figura 5-Exemplos das principais classes de terpenos
Fonte: Carey, Química Orgânica, V 2-2011
No óleo essencial do C.heliotropiifolius Kunth 13,2% dos constituintes era monoterpenos e 80,7% sesquiterpenos, sendo o eucaliptol, um monoterpeno, o composto majoritário (ANGÉLICO et al, 2012). Para o C. cordiifolius Baill foi confirmada a presença de 1,8- cineol e -felandreno, ambos monoterpenos (NOGUEIRA et al., 2015).
21
4 Objetivos
4.1 Objetivos Gerais
Determinar a composição química do óleo essencial do Croton argenteus e perfil das atividades antioxidante e antibacteriana.
4.2 Objetivos Específicos
Extrair do óleo essencial por hidrodestilação;
Obter os extratos hexânico e etanólico das folhas e caule do C. argenteus; Caracterizar o óleo essencial por CG/EM;
Realizar os testes microbiológicos; Determinar a atividade antioxidante;
22
5 Parte Experimental
5.1 Extração do Óleo Essencial
Exemplares de Croton argenteus foram coletados no município do Crato, em julho de 2015, no interior do estado do Ceará. A exsicata de Nº. 122245 está depositada no Herbário Alexandre Leal Costa, do Departamento de Biologia da Universidade Federal da Bahia.
As folhas frescas foram utilizadas para a extração do óleo essencial pelo método de hidrodestilação. Foram realizadas 7 extrações e em cada extração as folhas eram submersas em 1 L de água destilada em um balão de destilação sobre uma manta de aquecimento. Este balão foi acoplado ao aparelho tipo Clevenger modificado por Gottlieb (GOTTLIEB; MAGALHÃES, 1960) A extração durou cerca de 4 horas após a água entrar em ebulição. Ao final da extração, o óleo foi coletado e tratado com clorofórmio (CHCl3) e sulfato de sódio anidro (Na2SO4), este serve como agente dessecante, removendo os resíduos de água presente no óleo.
5.2 Obtenção dos Extratos
Uma quantidade das folhas remanescentes da extração do óleo (420 g) foi submetida à extração por solvente, utilizando etanol. Num frasco, as folhas foram imersas no solvente durante 48h em temperatura ambiente, seguidas de filtração. O procedimento de extração foi repetido. As soluções etanólicas foram evaporadas a pressão reduzida e reunidas para a obtenção do extrato seco denominado - CAFE (8,904g). Logo após, as folhas foram submetidas a uma nova extração utilizando hexano como solvente. Este procedimento foi realizado duas vezes com intervalos de 48h em temperatura ambiente, e as soluções hexânicas foram concentradas resultando na obtenção do extrato seco, denominado CAFH (6,614g).
Os caules também foram submetidos ao mesmo procedimento. O material vegetal seco e moído (727,5g) proporcionou a obtenção dos extratos denominados CACE (10,971g),proveniente da extração com o solvente etanol e CACH (2,432g), extraído com o solvente hexano.
5.3 Caracterização do óleo por CG/ME
O óleo essencial foi submetido a análises qualitativas por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa (CG-EM).
23
As análises foram realizadas em CG-EM da marca Shimadzu, modelo GCMSQP2010 Plus. As análises foram realizadas em coluna capilar RTx-5 (30 m x 0,25mm e espessura de filme 0,25 µm), sendo utilizado hélio (He) como gás de arraste, em fluxo de 1,0 mL/min. A injeção em modo splitless foi realizada com injetor a 220ºC. A temperatura da fonte de íons e da interface foi de 240ºC. O forno foi programado para uma temperatura de 60ºC, com posterior incremento de 3ºC/min até 240ºC.
5.4 Testes antimicrobianos com as bactérias Eschecheria coli e Sthaphylococus aureus do óleo essencial e extratos da folha de Croton argenteus
Os testes microbiológicos foram realizados no laboratório de ensaios Imunológicos, Antimicrobianos, e de Citoxicidade do Departamento de Microbiologia, do Cento de Biociências da UFRN. As amostras foram codificadas em 1- Extrato Etanólico (44mg/ml), 2-Extrato Hexânico (44mg/ml), 3-Óleo essencial de C.
argenteus (450mg/ml). As amostras foram testadas com as bactérias Eschecheria coli ATCC 25922 – Bactéria Gram-negativa e Staphylococcus aureus ATCC 25923 –
Bactéria Gram-positiva. A metodologia utilizada para a obtenção da concentração inibitória mínima (CIM) foi o teste de microdiluição em caldo- Mueller hinton (MH), e para a obtenção da concentração bactericida mínima (CBM) foi utilizado o método de semeio em spot em ágar BHI. Em todos os testes a metodologia utilizada foi realizada em triplicata. O solvente utilizado para diluir as amostras para controle negativo foi Tween 80 a 5% (solvente usado para diluir as amostras1 e 2) e DMSO a 5% (solvente usado para diluir a amostra 3). Já para o controle positivo foi usado Gentamicina.
5.5 Estudo para a Atividade Antioxidante (AA%)
O procedimento utilizado foi fundamentado segundo Souza (2007), com modificações. Com 3g de cada extrato de C. argenteus preparou-se uma solução na concentração de 500 µg/mL pela dissolução em metanol (solução
24
mãe). Através desta solução mãe foram preparadas diluições nas concentrações de 25, 50, 75, 100, 150 e 250 µg/mL com volumes totais de 2,0 mL cada. De cada uma destas diluições e da solução mãe foram removidas alíquotas de 0,3 mL, em triplicata, e a cada uma destas foi adicionado 2,7 mL de DPPH, totalizando 3 mL. O branco foi preparado pela mistura de 2,7 mL de metanol com 0,3mL das amostras. Preparadas as soluções esperou-se 30 minutos para então iniciar as medidas de absorbância, onde foi utilizado o comprimento de onda λ=517 nm. Os valores médios obtidos foram aplicados na equação abaixo:
Onde:
Absamostra = 0,3 mL da Amostra + 2,7 mL de DPPH Absbranco = 0,3 mL da amostra + 2,7 mL de MeOH Abscontrole = DPPH puro (0,04 mg/mL)
25
6 Resultados e Discussão
6.1 Extração do óleo e extratos orgânicos
O rendimento do óleo essencial pode ser observado na tabela 1, o qual é calculado em % volume/massa, ou seja, volume (ml) do óleo por massa (g) do material vegetal seco, conforme a Farmacopéia brasileira. É observado um rendimento relativamente bom, visto que por ser uma mistura muito volátil o rendimento costuma ser baixo.
Tabela 1-Volumes do óleo essencial extraído do C. argenteus
O rendimento percentual dos extratos obtidos é mostrado na tabela 2, onde observa-se um resultado melhor para os extratos da folha, já que para ambos extratos a massa obtida foi relativamente maior.
Tabela 2- Rendimento dos extratos obtidos do C. argenteus
Extratos Massa Obtida (g) Rendimento %
Massa da Folha (g) CAFE 8,9 2,120
420 CAFH 6,6 1,575
Massa do Caule (g) CACE 10,9 1,508
727,5 CACH 2,4 0,334
Extração Massa de folhas (g) Volume de óleo (mL) Rendimento %
1 341 0,4 0,117 2 325 0,4 0,123 3 400 0,5 0,125 4 420 0,5 0,119 5 440 0,5 0,113 6 460 0,6 0,130 7 580 0,6 0,103 Fonte: Autor, 2016. Fonte: Autor, 2016.
26
6.2 Testes antimicrobianos com as bactérias Eschecheria coli e
Sthaphylococus aureus do óleo essencial e extratos da folha de Croton argenteus
O extrato Etanólico, o extrato Hexânico, e o óleo essencial obtidos de C.
argenteus foram investigados quanto a suas atividades microbiológicas em meio as
bactérias Eschecheria coli ATCC 25922 (Gram-negativa) e Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Gram-positiva). Observou-se que o extrato hexânico apresentou atividade bacteriostática, para as bactérias E. coli e S. aureus, inibindo o crescimento de ambas na máxima concentração (22 mg/ml). O Óleo essencial, apresentou atividade apenas frente à S. aureus, na concentração de 225 mg/mL, já que não inibiu o crescimento da bactéria E. coli. Quanto ao extrato etanólico, ambas as bactérias apresentaram resistência, ou seja, não apresentou atividade bacteriostática, conforme mostra a tabela 3.
Tabela 3-Resultado do teste microbiológico
Amostra Bactérias
Staphylococcus aureus Escherichia coli
Extrato Etanólico (CIM) Não inibiu Não inibiu
Extrato Etanólico (CBM) Não inibiu Não inibiu
Extrato Hexânico (CIM) 22mg/mL 22mg/mL
Extrato Hexânico (CBM) Subst. Bacteriostática Subst. Bacteriostática
Óleo essencial (CIM) 225mg/mL Não inibiu
Óleo essencial (CBM) Subst. Bacteriostática Não inibiu
Fonte: Autor, 2016
6.3 Análise da Atividade Antioxidante
A técnica foi adaptada de Sousa et al. (2007), com modificações. O procedimento é baseado na medida da capacidade antioxidante de uma substância em sequestrar o radical DPPH, o qual possui um radical livre estável em virtude da deslocalização do elétron desemparelhado, atribuindo-lhe cor violeta, caracterizada por uma banda de absorção máxima de 517 nm. O DPPH é reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela. Quanto maior o consumo de DPPH pela amostra, maior é sua atividade antioxidante (AA%) (ALVES et al., 2007).
Foram realizadas análises das soluções dos extratos de C. argenteus com DPPH no intuito de quantificar a capacidade em capturar radicais livres (DPPH). Os
27
resultados foram expressos em porcentagem de inibição de oxidação, ou seja, a porcentagem de atividade antioxidante é correspondente à quantidade de DPPH consumida pelo antioxidante. Quanto maior o consumo de DPPH pela amostra, maior é sua atividade antioxidante (AA%) (ALVES et al, 2007). Sendo assim, quanto maior a concentração da amostra, menor a absorbância, maior o consumo de DPPH.
A tabela 4 mostra os valores obtidos de absorbância para cada solução e a média das atividades antioxidante, já que foram feitas em triplicatas.
Tabela 4-Valores de absorbância e médias da AA%.
Com os valores da absorbância e da atividade antioxidante (AA%) obtidos, foram construídos gráficos da Atividade Antioxidante (AA%) versus a concentração em mg/mL. Para o cálculo do IC50 foi utilizada a equação da reta, substituindo o valor de y por 50 para obtenção da concentração da amostra com capacidade de reduzir 50% do DPPH, de acordo com os valores da tabela acima:
CAFE CACE CACH CAFH
Conc. Abs. AA% Abs. AA% Abs. AA% Abs. AA%
0,025 1,006 10,57 1,266 12,990 0,891 19,367 0,998 26,564 0,050 0,999 11,28 1,271 12,646 0,903 18,281 0,989 27,299 0,075 0,986 12,35 1,265 13,058 0,900 18,552 0,992 27,005 0,100 0,967 14,04 1,257 13,608 0,894 19,095 0,977 28,109 0,150 0,940 16,44 1,255 13,746 0,887 19,729 0,957 29,581 0,250 0,886 21,24 1,239 14,845 0,868 21,538 0,929 31,641 0,500 0,782 30,48 1,211 16,770 0,830 24,887 0,839 38,263 Fonte: Autor, 2016.
28
Gráfico 1- Atividade antioxidante do extrato CAFE
A correlação entre a atividade antioxidante (AA%) e a concentração do extrato CAFE da curva utilizada para o gráfico 1, forneceu um IC50 de 0,94 mg.mL-1, o IC50 representa a concentração de extrato necessária para atingir 50% de atividade antioxidante.
Gráfico 2- Atividade antioxidante do extrato CACE
A correlação entre a atividade antioxidante (AA%) e a concentração do extrato CACE da curva utilizada para o gráfico 2, forneceu um IC50 de 4,4 mg.mL-1.
Fonte: Autor, 2016.
29
Gráfico 3-Atividade antioxidante do extrato CACH
A correlação entre a atividade antioxidante (AA%) e a concentração do extrato CACH da curva utilizada para o gráfico 3, forneceu um IC50 de 2,3 mg.mL-1.
Gráfico 4- Atividade antioxidante do extrato CAFH
A correlação entre a atividade antioxidante (AA%) e a concentração do extrato CAFH da curva utilizada para o gráfico 4, forneceu um IC50 de 0,98 mg.mL-1.
Fonte: Autor, 2016.
30
As amostras dos extratos de C. argenteus apresentaram boa capacidade de consumo de DPPH, visto que as absorbâncias após reação de DPPH com as diferentes concentrações das amostras testadas tiveram um valor relativamente baixo à medida que a concentração aumentava, significando a alta atividade antioxidante para os extratos testados. Pelos valores de IC50, percebemos que os extratos das folhas têm maior atividade antioxidante, já que necessitam de uma concentração menor do extrato para atingir 50% da AA%. Segundo a literatura, essa diferença pode ser atribuída à presença e concentração de compostos aromáticos pertencentes à classe dos flavonóides, já que esses compostos têm boa capacidade de doar um próton para o DPPH e formar estruturas de ressonâncias estáveis, estabilizando assim o radical livre (ANGÉLICO, 2011).
O ensaio para o óleo essencial foi realizado com concentrações maiores a fim de obter melhores resultados, com os valores da tabela 5, foi obtido o gráfico 5, o qual mostra a curva da AA%.
Tabela 5-Valores de absorbância e AA% para OECA
Conc.(mg/mL) Abs. AA%
0,75 0,819 9,302 1,5 0,812 10,078 3 0,806 10,742 4,5 0,794 12,071 6 0,785 13,178 Fonte: Autor, 2016.
31
Gráfico 5-Atividade Antioxidante do óleo essencial de C. argenteus
Observa-se que a relação entre a atividade antioxidante (AA%) e a concentração para o óleo essencial como mostrado no gráfico 5, forneceu um IC50 de 57,2 mg.mL-1.Neste caso, o alto valor IC50 mostra o baixo potencial da atividade antioxidante, já que é necessária uma concentração alta de óleo. Esse fato pode ser explicado pela alta variedade e concentração de terpenos presentes no óleo.
32
7 Caracterização química do óleo essencial do Croton argenteus
O óleo essencial foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM). Os constituintes químicos foram identificados através de comparação de seus espectros de massa e índices de Kovats, corrigidos por regressão linear, e confirmados através de comparação visual com espectros de massas disponíveis na literatura (ADAMS, 2001).
Através desse método de separação foi possível identificar e quantificar 15 constituintes apresentados na tabela 6 correspondendo a 66% em massa, dos quais 2 são monoterpenos, 12 são sesquiterpenos e 1 diterpeno. Entre os compostos identificados estão óxido de cariofileno (26,6%) como composto majoritário, seguido de espatulenol (9,0%) e cariofileno (4,8%).
A composição química minoritária determinada por esse método de separação forneceu o cromatograma da figura 6, que indica os diferentes constituintes do óleo essencial do C. argenteus e cada pico representa um constituinte diferente, tendo para cada composto um tempo de retenção associado.
Figura 6-Cromatograma CG/EM de OECA
33
Tabela 6-Composição do óleo essencial de C.argenteus Tempo de
Retenção Composto Teor (%) IK-L IK-S Erro (%)
10.812 D-Limoneno 0,57 1029 993 3,5 13.424 Linalool 0,45 1097 1072 2,3 23.310 α-Copaeno 2,91 1377 1368 0,6 23.801 Biciclosesquifelandreno 4,03 1523 1383 9,2 24.791 Cariofileno 4,81 1419 1413 0,4 25.905 α-humuleno 3,47 1455 1446 0,6 27.889 γ-Muuroleno 1,85 1480 1506 -1,7 29.897 Espatulenol 9,03 1578 1566 0,8 30.058 Óxidode Cariofileno 26,61 1583 1571 0,8 30.640 Ledol 3,97 1569 1588 -1,2 31.753 -Muurolol 1,34 1646 1622 1,5 32.144 -Cadinol 4,8 1654 1633 1,2 36.228 β-Guaiene 0,78 1493 1756 -17,6 37.704 Allo-aromadendreno 0,76 1460 1800 -23,3 39.392 Fitol 0,61 1943 1851 4,7 Total 65,99
IK-L: Índice de Kovats encontrado na literatura (Adams, 2001) IK-S: Índice de Kovats calculado por regressão linear.
O baixo rendimento observado ocorreu devido à presença de impurezas possivelmente provenientes do solvente de análise. Na lista de compostos identificados observamos uma grande quantidade de ciclo-hexano, além de acetamida e 2-butanal. Ao fazer o rendimento sem os interferentes, observamos um rendimento maior e um percentual de 40,3% de óxido de cariofileno, constituinte majoritário.
A seguir estão apresentados nas figuras 7 a 21, os espectros de massa, para cada constituinte volátil do óleo essencial de C. argenteus, assim como a estrutura química correspondente.
34
Figura 7-Espectro de massa do constituinte D-Limoneno
Figura 8-Espectro de massa do constituinte Linalool
Figura 9-Espectro de massa do constituinte α-Copaeno
Figura 10-Espectro de massa do constituinte Biciclosesquifelandreno
Figura 11-Espectro de massa do constituinte Cariofileno
Fonte: Autor, 2016.
Fonte: Autor, 2016.
Fonte: Autor, 2016.
35
Figura 12-Espectro de massa do constituinte α-Humuleno
Figura 13-Espectro de massa do constituinte γ-Muuroleno
Figura 14- Espectro de massa do constituinte Espatulenol
Figura 15-Espectro de massa do constituinte Óxido de Cariofileno
Fonte: Autor, 2016.
Fonte: Autor, 2016.
Fonte: Autor, 2016.
36
Figura 16- Espectro de massa do constituinte Ledol
Figura 17-Espectro de massa do constituinteτ-Muurolol
Figura 18- Espectro de massa do constituinte α-cadinol
Figura 19-Espectro de massa do constituinte β-Guaieno
Fonte: Autor, 2016.
Fonte: Autor, 2016.
Fonte: Autor, 2016.
37
Figura 20-Espectro de massa do constituinte allo-Aromadendreno
Figura 21-Espectro de massa do constituinte Fitol
Essa composição química é compatível com dados da literatura para espécies de Croton cujos óleos essenciais são caracterizados pela predominância de monoterpenos e sesquiterpenos como principais componentes (MECCIA et al., 2000).
Fonte: Autor, 2016.
Fonte: Autor, 2016.
38
8 Conclusão
Neste trabalho realizamos a caracterização química da composição volátil de C.
argenteus, onde foram identificados 15 constituintes, no qual se observou a
presença de óxido de cariofileno como constituinte majoritário, compatível com as informações da literatura sobre o gênero Croton.
Além disso, observou-se atividade bacteriostática presente apenas para o extrato hexânico frente as bactérias E. coli ATCC 25922 – Bactéria Gram-negativa e
S. aureus ATCC 25923 – Bactéria Gram-positiva. Os resultados da atividade
antioxidantes foram satisfatórios e compatíveis com a literatura, que relaciona esta atividade com a presença de composto aromáticos na composição de espécies bioativas.
Este estudo contribuiu para o conhecimento químico e biológico de C.
argenteus, haja vista que não existia nenhum trabalho sobre esta espécie na
literatura e os resultados estimulam a continuidades deste estudo, para isolamento dos constituintes com propriedades biológicas e aprofundamento dos testes.
39
REFERÊNCIAS
ADAMS, R. P. 2001. Identification of essential oil components by gas chromatography/quadrupole mass spectroscopy. Carol Stream, IL Allured.
ALMEIDA, Thiago Silva de et al. Chemical composition, antibacterial and antibiotic modulatory effect of Croton campestris essential oils. Industrial Crops and Products, v. 44, p. 630-633, 2012.
AMARAL, Jeferson Falcão do; Atividade antiinflamatória, antinociceptiva e gastroprotetora do óleo essencial de Croton sonderianus Muell. Dissertação de mestrado.Faculdade de Medicina. Curso de pós-graduação em Farmacologia Universidade Federal do Ceará. Fortaleza - 2004.
ALVES, Clayton Queiroz et al. Avaliação da atividade antioxidante de flavonóides. Diálogos & Ciência, v. 12, p. 1-8, 2007.
ANGÉLICO, E. C.; Costa,J. G. M. da; Galvão, F. F. R.; Santos, F. O.; Rodrigues, G. R. Composição Química doÓleo EssencialdasfolhasdeCrotonHeliotropiifolius KANT (sinônimo C. Rhamnifolius): Resultados Preliminares, Revista BioFar, Volume 07, Número 01,2012.
ANGÉLICO, Elissandra Couras, Avaliação das atividades antibacteriana e antioxidante de Crotonheliotropiifolius KUNTE e Crotonblanchetianus BAILL / Dissertação (Mestrado em Zootecnia), Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Saúde Tecnologia Rural.UFCG, CSTR. 2011.
BLOCK, S.; Baccelli, C.; Tinant, B.; Meervelt, L. C.; Rozenberg, R.; Jiwan, J-L.H.; Llabrès, G.; Pauw-Gillet, M-C.; QuetinLeclercq, J.; Diterpenes from the leavesof Croton zambesicus.Phytochemistry, v.65, p.1165- 1171, 2004.
CAMURÇA, Vasconcelos A. L.F.; Bevilaqua, C. M. L; Morais, S. M.; Maciel, M.V.; Costa, C. T. C.; Macedo, I. T. F.; Oliveira, L. M. B.; Braga, R. R.; Silva, R. A.;Vieira,
40
L.S.AnthelminticactivityofCrotonzehntneriandLippiasidoidesessential.Veterinar y.Parasitology, v. 148, n. 3–4, p. 288-294, 2007.
CAREY, Francis A. Química Orgânica, V. 2, 7ª ed. Porto Alegre, AMGH, 2011.
COELHO-DE-SOUZA, A. N., Lahlou, S., Barreto, J. E.F., Yum, M. E.M., Oliveira, A. C., Oliveira, H. D., Celedônio, N. R., Feitosa, R. G.F., Duarte, G. P., Santos, C. F., de Albuquerque, A. A.C. and Leal-Cardoso, J. H., Essential oil of Croton zehntneri and its major constituent anethole display gastroprotective effect by increasing the surface mucous layer. Fundamental & Clinical Pharmacology, v.27; p.288– 298.2012.
COSTA, M. P.; MAGALHÃES, N. S. S.; GOMES, F. E. S.; MACIEL, M. A. M.; DONNICI, C. L. A review of the biologicaz activities of trans-desidrocrotonina a natural product obtained from de Croton cajucara. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 17:: 275-286. 2007.
COUTINHO, M. A. S.; Muzitano, M. F.; Costa, S. S. Flavonoids: Potential therapeutic agents for the inflammatory process. Revista Virtual Química, v. 1, n. 3, p. 241 – 256, 2009.
CRAVEIRO,A. A.; Fernandes, A. G.; Andrade, C. H. S., Matos, F. J. A., Alencar,J .W., Machado, M. I. L. (1981) Óleos essenciais de plantas do Nordeste. Edições UFC, Fortaleza.
GOTTLIEB, O. R.; Magalhães, M. T. Modified distillation trap. Chemist Analyst, v. 49, p. 114, 1960.
MACIEL,M. A. M.; Pinto, A. C.; Veiga Jr, V. F. Plantas medicinais: a necessidade de estudosmultidisciplinares. Química Nova,v. 25, n. 3, p. 429-438, 2002.
MORON RODRIGUEZ, Francisco et al. Validaciónpreclínica de extractos fluidos de Crotonargenteus L. Revista CubanaPlantMed, Ciudad de la Habana, v. 11, n. 2, jun. 2006.
41
MECCIA, G., L. B. Rojas, C. Rosquete & A. San Feleciano. Essential oil of
Croton ovalifolius Vahl from Venezuela. Journal Flavour Fragrance, v 15:: 144-146.
2000.
NARDI, G. M.; Dalbo, S.; Monache, F. D.; Pizzolatti, M. G.; Ribeiro-Dovalle, R. M. Antinociceptive effect of Croton celtidifolius Baill (Euphorbiaceae). Journal of Ethnopharmacology, v. 107: 73-8. 2006.
NOGUEIRA, L. de M.; Silva, M. R.;Santos,S. M. et al., “Antinociceptive Effect of the Essential Oil Obtained from the Leaves of Croton cordiifolius Baill. (Euphorbiaceae) in Mice”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, vol. 2015.
PALMEIRAS JUNIOR, S. F.; Alves, F. S. M.; Vieira, L. F A.; Conserva, L. M.; Lemos, R. P. L. Constituintes químicos da folhas deCrotonsellowii (Euphorbiaceae), Revista Brasileira de Farmacogcognosia, v.16, n.3, p.397-402,2006.
RAMOS, S. C. S.; Oliveira, J. C. S.; Câmara, C. A. G.; Castelar, I.; Carvalho, A. F. F. U.; Lima Filho, J. V. Antibacterialandcytotoxicpropertiesof some plantcrudeextractsused in Northeasternfolkmedicine.Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n.2ª, p. 376-381, Abr./Jun. 2009.
RAMOS, José Mirabeau O. et al . Chemical constituents and potential anti-inflammatory activity of the essential oil from the leaves of Croton argyrophyllus. Rev. bras. farmacogn., Curitiba , v. 23, n. 4, p. 644-650, Aug. 2013.
RANDAU, K. P.; Florêncio, D. C.; Ferreira, C. P.; Xavier, H. S.; 2004. Estudo FarmacognósticodeCrotonrhamnifolius H.B.K. e Crotonrhamnifolioidespax&hoffm. (Euphorbiaceae). RevistaBrasileira de Farmacgnosia, v.14, n.2, p.89-96.
RUFINO, M. S. M.; Alves, R. E.; Brito, E .S; Morais, S. M.; Sampaio, C. G.; Jimenez, J. P.; Calixto, F. D. S.;Determinação da atividade antioxidante total em frutas pela captura do radical livre DPPH.Comunicado Técnico Embrapa, 127: 1-4, 2007.
42
SALATINO, Antonio; Salatino, Maria L. Faria; Negri, Giuseppina. Traditional uses, chemistry and pharmacology of Croton species (Euphorbiaceae). J. Braz. Chem. Soc., São Paulo , v. 18, n. 1, p. 11-33, 2007 .
SANTOS, F. A.; Jeferson, F. A.; Santos, C. C.; Silveira, E. R.; Rao, V. S. N.AntinociceptiveeffectofleafessentialoilfromCrotonsonderianus in mice.Life Sciences, v. 77,n.23, p. 2953–2963, 2005
SILVA, Juliana Santos et al.;Sinopse das espécies de Croton L. (Euphorbiaceae) no estado de Pernambuco, Brasil. Acta Bot. Bras., São Paulo, v. 24, n. 2, p. 441-453, Jun. 2010.
SIMÕES, C. M. O. Farmacognosia: da planta ao medicamento.2 ed.PortoAlegre/Florianópolis: UFRGS. UFSC, 2000. cap. 18
SIMÕES, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; De Mello, J. C. P.; Mentz, L. A.; Petrovick, P. R. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. 5ª ed., Porto Alegre/ Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2004.
SOLOMONS, T. W. Graham. Química Orgânica, v.2 10ª ed. Rio de Janeiro. LTC, 2013.
SOUSA, C. M. M.;et al.; Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química Nova, 30(2): 351-355, 2007.
TORRES, M. C. M.;Estudo Químico e Biológico de Crotonregelianus Var. matosii (Euphorbiaceae). 2008. 8p. Dissertação (Mestrado em Química Orgânica). Universidade Federal do Ceará.
