UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
ONDINA KARLA MOUSINHO DA SILVA ROCHA
ANÁLISE DA PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO 27 (HSP27) EM CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE LÍNGUA ORAL
NATAL/RN 2018
Ondina Karla Mousinho da Silva Rocha
ANÁLISE DA PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO 27 (HSP27) EM CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE LÍNGUA ORAL
Dissertação apresentado ao Programa de Pós-graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Patologia Oral.
Orientadora: Profª Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel.
NATAL/RN 2018
Dedico esta pesquisa a todas as pessoas que lutam contra o câncer!
“O câncer é tão incapaz... Ele não pode mutilar o Amor,
Não pode bater a Esperança, Não pode corroer a Fé, Não pode destruir a Paz, Não pode arruinar a Confiança, Não pode apagar as Lembranças,
Não pode silenciar a Coragem, Não pode invadir a Alma, Não pode comprometer a Vida Eterna,
Não pode saciar o Espírito,
Nem tampouco diminuir o poder da Ressurreição” (Rógerio Canciam)
Agradeço primeiramente a Deus, por ter me dado saúde e força para superar
as dificuldades e por sempre ter colocado pessoas maravilhosas na minha vida. Obrigada Senhor, por mais uma conquista.
À minha mãe avó Leide Mousinho da Silva (in memorian), que sonhou junto
comigo e torceu por cada conquista por mim alcançada. A senhora sempre estará presente em todas as escolhas da minha vida e em todo o meu crescimento como profissional e como ser humano. Saudade Eterna.
Ao meu pai avô Orlando Ferreira da Silva, que com os seus atos me ensinou os
valores da vida, que juntamente com a minha querida avó me fez entender e sentir o amor incondicional. Sou muito grata por terem me criado como filha, por terem me dado toda a educação e estrutura para que hoje eu pudesse estar a um passo de mais uma conquista.
À minha família, por terem me acompanhado nesta trajetória, por
compreenderem as minhas escolhas e ausência. Obrigada por todo apoio e incentivo!
A todos os meus amigos, que enchem minha vida de momentos inesquecíveis,
em especial a Évllon Sá.
Ao meu esposo Marcelo Torres, por todo o amor, carinho e compreensão
nesses anos ao meu lado.
À minha orientadora Profª Márcia Cristina da Costa Miguel, por toda
preocupação, paciência e dedicação; por todos os ensinamentos a mim fornecidos, que foram fundamentais para minha formação como profissional. Foi uma grande satisfação ter sido orientada por uma pessoa maravilhosa, na qual tenho um enorme orgulho. Obrigada por tudo!
A todos os professores do programa de pós-graduação de Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – Ana Miryam Medeiros, Antônio
Costa, Bruno Gurgel, Carlos Augusto Barboza, Éricka Janine, Hebel Galvão, Kênio Lima, Leão Pinto, Lélia Batista, Lélia Maria Queiroz, Patrícia Oliveira, Pedro Paulo Santos e Roseana Freitas.
A todos os meus inesquecíveis professores da graduação, em especial à Profª.
Marize Raquel Diniz Rosa, Profº Paulo Rogério Ferreti Bonan, Profª Ana Karina Maciel Andrade.
Aos funcionários e técnicos da UFRN, em especial aos do laboratório de
Patologia Oral.
À minha turma de mestrado, Caio César, Cristianne Kaline, Dáurea Adília,
Deborah Gondim, Everton Freitas, Glória Maria, Israel Leal, Juliana Campos, Larissa Amaral, Mariana Xerez, Rômulo Augusto e Yailit Martinez. As doutorandas Hellen Bandeira, Hianne Morais e Rafaella Bastos. Agradeço por todos esses anos
inesquecíveis de convivência, principalmente por tornarem meus dias mais leves. Aos meus irmãos patológicos, Luiz Arthur e Laudenice de Lucena por toda contribuição nesta pesquisa, por todos os conhecimentos compartilhados e por todo carinho.
Aos doutorandos, Amanda Gonzaga, Hugo Costa, Leorik Pereira, Luciana
Castro, Mara Luana, Maria Luiza, Patrícia Peixe, Rodrigo Mafra, Salomão Israel e Tiago João por serem sempre prestativos e atenciosos. Obrigada por toda paciência!
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa.
RESUMO
O carcinoma de células escamosas de língua oral (CCELO) apresenta altas taxas de morbidade e mortalidade. Novos métodos de detecção precoce e avaliação de risco estão sendo estudados com o intuito de predizer o prognóstico dos pacientes e direcionar um tratamento diferenciado. Neste contexto, vários biomarcadores moleculares têm sido investigados com esta finalidade, dentre eles a heat shock protein 27 (HSP27). Esta pesquisa objetivou analisar se a HSP27 exerce alguma influência nos CCELOs, além de correlacionar a sua imunoexpressão com parâmetros clinicopatológicos e com a sobrevida dos pacientes. A amostra foi constituída por 55 casos de CCELO e 20 espécimes de mucosa oral normal. Para o estudo histomorfológico foram utilizados os sistemas de gradação de malignidade propostos pela OMS em 2005, por Brandwein-Gensler et al. (2005) e por Almangush et al. (2014). A expressão da HSP27 foi avaliada através do Sistema de Escore de Imunorreatividade (IRS). Para verificar a associação de imunopositividade da HSP27 com os parâmetros clinicopatológicos foram utilizados os testes estatísticos de Qui-quadrado de Pearson e o Exato de Fisher. As curvas para análise de sobrevida foram realizadas pelo método de Kaplan Meier. Para todas as avaliações foram considerados valores significativos com p<0,05. Foi observado um maior IRS para a mucosa oral normal quando comparado aos casos de CCELO (p<0,001), indicando que há uma redução de expressão desta proteína nestas neoplasias, embora este achado seja documentado na literatura, os mecanismos envolvidos não são esclarecidos, estudos moleculares específicos são necessários a fim de elucidar os eventos genéticos e epigenéticos envolvidos na redução da expressão da HSP27 nos casos de CCELO. Não foram encontradas associações significativas entre a imunomarcação desta proteína com os parâmetros clinicopatológicos e com a sobrevida dos pacientes, sugerindo que esta proteína parece não influenciar o prognóstico dos pacientes com CCELO.
ABSTRACT
Oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) presents high rates of morbidity and mortality. New methods of early detection and risk assessment have being studied aiming to predict the prognosis of patients and directing a differentiated treatment. In this context, several molecular biomarkers have been investigated for this purpose among them the heat shock protein 27 (HSP27). This study aimed to analyze whether HSP27 has some influence on the OTSCC, in addition to correlating its immunoexpression with clinicopathological parameters and patient survival. The sample consisted of 55 cases of OTSCC and 20 specimens of oral normal mucosa. For the histomorphological study, it was used the malignancy grading systems proposed by WHO in 2005, by Brandwein-Gensler et al. (2005) and by Almangush et al. (2014). The expression of HSP27 was evaluated through the Immunoreactive Scoring System (IRS). To verify the association of HSP27 immunopositivity with the clinicopathological parameters, it was used the Pearson’s chi-square and Fisher’s exact test. The curves for survival analysis were performed using the Kaplan Meier method. For all evaluations, the significance values were set at p<0.05. A higher IRS for the oral normal mucosa was observed when compared to OTSCC cases (p<0.001), indicating that there is a reduction of expression of this protein in these neoplasms, despite this finding is documented in the literature, the involved mechanisms are unclear, so, specific molecular studies are needed to elucidate the genetic and epigenetic events involved in the reduction of HSP27 expression in OTSCC cases. No significant associations were found between the immunostaining of this protein and the clinicopathological parameters and patient survival suggesting that this protein does not seem to influence the prognosis of OTSCC patients.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Mecanismo de regulação da síntese da HSP... 31 Figura 2 - Aspectos morfológicos do CCELO... 53 Figura 3 - Padrões avaliados no modelo de risco de Brandwein-Gensler em
CCELO... 54 Figura 4 - Avaliação da profundidade de invasão e brotamentos tumorais em
CCELO... 55 Figura 5 - Imunoexpressão da HSP27 em mucosa oral normal e CCELO... 59 Figura 6 - Imunoexpressão da HSP27 em CCELO... 60 Gráfico 1 - Estimativa de Sobrevida livre da doença...
63 Gráfico 2 - Curvas de Kaplan-Meier com estimativas de sobrevida livre da doença
para hábito de beber... 64 Gráfico 3 - Estimativa de Sobrevida global... 67 Gráfico 4 - Curva de Kaplan-Meier com estimativa de sobrevida global para
recidiva dos tumores...
68 Gráfico 5 - Curvas de Kaplan-Meier com estimativas de sobrevida global para o
modelo BD... 68 Quadro 1 -
Sistema de gradação histopatológica da OMS (2005)... 40 Quadro 2 - Modelo de risco histológico proposto por Brandwein-Gensler et al.
(2005)……… 41 Quadro 3 -
Modelo BD de Almangush et al. (2014)... 42 Quadro 4 - Variáveis dependentes... 45 Quadro 5 - Variáveis independentes... 45
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Tabela 1 Frequência dos casos de CCELO segundo sexo, idade e hábitos dos pacientes. Natal – RN, 2018... 48 Tabela 2 Frequência dos casos de CCELO de acordo com os critérios do TNM e
estágio clínico. Natal – RN, 2018... 49 Tabela 3 Análise do comportamento clínico da doença após o tratamento inicial.
Natal-RN, 2018... 50 Tabela 4 Associação do estadiamento clínico em relação a parâmetros epidemiológicos
e clínicos. Natal-RN. 2018... 51 Tabela 5 Análise morfológica dos casos de CCELO. Natal-RN, 2018... 56 Tabela 6 Associação da Gradação da OMS, risco histológico de Brandwein-Gensler,
modelo BD e parâmetros clínicos. Natal-RN, 2018 ... 57 Tabela 7 Análise comparativa da imunoexpressão da HSP27 em CCELO e mucosa oral
normal segundo o Sistema de Escore de Imunorreatividade (IRS). Natal-RN, 2018 ... 58 Tabela 8 Associação da expressão do HSP27 em relação aos parâmetros
clinicopatológicos. Natal-RN, 2018... 61 Tabela 9 Sobrevida livre de doença dos casos de CCELO de acordo com os parâmetros
epidemiológicos, clinicopatológicos e imunoistoquímico. Natal-RN, 2018... 62 Tabela 10 Associação dos óbitos em relação aos parâmetros epidemiológicos,
clinicopatológicos e imunoistoquímico. Natal-RN, 2018... 65 Tabela 11 Taxa de sobrevida global dos casos de CCELO de acordo com os parâmetros
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BD - Brotamentos e profundidade de invasão, do inglês Budding and Depth of invasion CCE - Carcinoma de Células Escamosas
CCEBL - Carcinoma de Células Escamosas de Base de Língua CCECP - Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço CCELO - Carcinoma de Células Escamosas de Língua Oral CCEO - Carcinoma de Células Escamosas Oral
CRNN - Cornulina, do inglês Cornulin
CXCR1 - Receptor de quimiocinas CXC tipo 1, do inglês C-X-C motif chemokine receptor 1
HPV - Papilomavírus Humano, do inglês human papillomavirus HSE - Elemento de Choque Térmico, do inglês Heat Shock Element HSF - Fator de Choque Térmico, do inglês Heat Shock Factor HSP - Proteína de Choque Térmico, do inglês Heat Shock Protein INCA - Instituto Nacional do Câncer
IRS - Sistema de Escore de Imunorreatividade, do inglês Immunoreactive scoring system
MAPK - Proteína Quinase Ativada por Mitógeno, do inglês Mitogen-Activated Protein Kinase
NF-κb - Fator Nuclear Kappa B, do inglês facto nuclear kappa B OMS - Organização Mundial da Saúde
PTEN - Homólogo da Fosfatase e Tensina, do inglês Phosphatase and Tensin Homolog SEP53 - Proteína de Choque Térmico Epitelial Escamosa 53, do inglês Squamous Epithelial heat shock Protein 53
Ser326 - Resíduo de serina 326
TEM - Transição epitélio-mesênquima
TGF-β - Fator de transformação de crescimento Beta, do inglês Transforming Growth Factor Beta
TNM - Sistema de estadiamento de tumores malignos - (T) tamanho do tumor primário, (N) envolvimento de linfonodos locais, (M) metástases à distância
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 21
2 REVISÃO DA LITERATURA... 24
2.1 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL... 24
2.2 PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO 27... 29
3 OBJETIVOS... 35 3.1 OBJETIVO GERAL... 35 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 35 4 MATERIAIS E MÉTODOS... 37 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS... 37 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO... 37 4.3 POPULAÇÃO... 37 4.4 AMOSTRA... 37 4.4.1 Critérios de inclusão ... 38 4.4.2 Critérios de exclusão... 38 4.5 ESTUDO CLÍNICO... 38 4.6 ESTUDO HISTOMORFOLÓGICO... 39 4.7 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO... 42
4.7.1 Análise da marcação imunoistoquímica... 43
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 44
4.8.1 Variáveis elencadas para os testes estatísticos ... 44
5 RESULTADOS... 48 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA... 48 5.2 ANÁLISE CLINICOPATOLÓGICA... 51 5.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA... 52 5.4 ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA... 58 5.5 ANÁLISE DE SOBREVIDA... 61 6 DISCUSSÃO... 70 7 CONCLUSÃO... 80 REFERÊNCIAS... 82
APÊNDICES... 92 ANEXOS... 97
1 INTRODUÇÃO
O câncer oral é responsável por aproximadamente 2,1% de todas as neoplasias malignas no mundo, sendo o carcinoma de células escamosas (CCE) o mais prevalente, correspondendo a mais de 90% de todos os cânceres da cavidade oral. A sua patogênese é complexa e surge como resultado de múltiplos eventos moleculares a partir do efeito combinado da predisposição genética e exposição aos carcinógenos ambientais (GUPTA et al., 2016).
As altas taxas de mortalidade dos carcinomas de células escamosas orais (CCEO) estão relacionadas ao diagnóstico tardio, curso agressivo da doença, resistência ao tratamento e recorrência (GUPTA et al., 2016; KREPPEL et al., 2016). Apesar dos enormes progressos nas últimas décadas, o prognóstico ainda é desfavorável e a sobrevida atual de 5 anos é inferior a 50% na maioria dos estudos, uma vez que a maior parte dos pacientes apresenta metástases no momento do diagnóstico (LIU et al., 2015). Dessa forma, novos métodos de detecção precoce e avaliação de risco são necessários para guiar o tratamento e melhorar a sobrevida dos pacientes. Neste contexto, marcadores moleculares podem ter papel significativo na detecção do prognóstico, da progressão da doença e da escolha do tratamento adequado (TROIANO et al., 2016).
Dentre estes biomarcadores, destacam-se as heat shock proteins (HSPs), chaperonas moleculares altamente conservadas, que regulam a síntese, dobramento, montagem e degradação de proteínas. Além de seus efeitos citoprotetores, estudos relatam que as HSPs podem induzir a proliferação de células malignas, angiogênese e resistência ao tratamento (ETO et al., 2016). Existem várias isoformas das HSPs, no entanto, nos últimos anos, a HSP27 tem recebido maior atenção por sua associação à progessão de tumores e por gerar resistência às estratégias terapêuticas em vários tipos de câncer (OWEN et al., 2016).
A HSP27 tem sido considerada um marcador válido para determinar o prognóstico da doença, visto que, a sua desregulação tem sido observada durante a carcinogêsese de alguns órgãos e tecidos em associação com o grau de diferenciação e a agressividade dos tumores (WANG et al., 2009; KAIGORODOVA et al., 2016). Estudos têm demonstrado que esta proteína facilita múltiplos processos da
tumorigênese, sendo capaz de promover a sobrevivência das células através da inibição da apoptose e senescência celular (GE et al., 2017).
Vários autores têm estudado a desregulação desta proteína em carcinomas de esôfago (IQBAL et al., 2016; LUZ et al., 2017), laringe (KAIGORODOVA et al., 2016; KARAM et al., 2017), mama (LIU et al., 2015), hepatocelular (ETO et al., 2016; KHAN et al., 2016; HUNG et al., 2017), ovário (PAI et al., 2015), pulmão (CHOI et al., 2017; SHENG et al., 2017), gástrico (GE et al., 2017), renal (WU, CHANG, PAN, 2017), neuroendócrino (MARINOVA et al., 2013), coloretal (GHOSH et al., 2013) e na cavidade oral (LEE et al., 2012, ZHENG et al., 2017).
A compreensão do papel da HSP27 no CCEO não está bem esclarecida. Novas pesquisas são necessárias para melhor entender a importância desta proteína na patogênese do câncer bucal (POPLI et al., 2015). Portanto, o objetivo desta pesquisa foi analisar se a HSP27 exerce alguma influência nos carcinomas de células escamosas de língua oral (CCELO), além de correlacionar a sua imunoexpressão com parâmetros clinicopatológicos e com a sobrevida dos pacientes. Com os resultados obtidos, espera-se contribuir para o melhor esclarecimento da função desta proteína no deespera-senvolvimento do CCELO.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL
O câncer destaca-se no âmbito da saúde pública, devido a sua alta taxa de incidência e mortalidade. A sua estimativa para o Brasil, nos anos 2016 e 2017, aponta a ocorrência de aproximadamente 600 mil novos casos. No Nordeste, o câncer oral ocupa a quinta posição entre os homens (6,86/100 mil), e a nona entre as mulheres (4,11/100 mil), com risco estimado de 11,27 e 4,21 novos casos a cada 100 mil homens e mulheres, respectivamente (INCA, 2015). Deve-se ressaltar que a incidência do câncer bucal apresenta diferenças entre os países, como também entre regiões de um mesmo país. Essas divergências podem ser atribuídas às diferenças socioeconômicas, culturais e à exposição aos fatores de risco específicos desses locais (PHUSINGHA et al., 2016).
O CCE é o tipo histológico predominante no câncer bucal. Trata-se de uma neoplasia epitelial agressiva e invasiva, geralmente associada à metástases regionais no momento do diagnóstico. Dentre os fatores de risco, envolvidos no desenvolvimento desta lesão, estão os fatores extrínsecos e intrínsecos. Os fatores extrínsecos abrangem o consumo de tabaco e álcool, considerados os principais agentes etiológicos no processo da carcinogênese; além do envolvimento de alguns vírus e também da exposição solar em CCE de lábio. Já os fatores intrínsecos incluem diversos mecanismos, dentre eles: alterações genéticas, deficiências nutricionais e o estado imunológico do paciente (HAN et al., 2016; MORAIS et al., 2017).
O tabagismo e o etilismo correspondem a, aproximadamente, 65% do risco de desenvolver o câncer oral. Quando há a combinação desses dois fatores, é observado um sinergismo entre eles, aumentando a possibilidade de desenvolver esta neoplasia (INCA, 2015). No entanto, estudos têm mostrado um aumento significativo na frequência destas lesões, mesmo com a redução destes hábitos em vários países, o que indica que outros fatores, também, podem desempenhar papéis significativos na etiologia do CCEO (CHEN et al., 2016).
Alguns vírus têm sido considerados fatores de risco para esta neoplasia. Dentre eles, o papilomavírus humano (HPV) é o mais importante, sendo encontrado em 24% dos cânceres orais, principalmente em região de orofaringe. O câncer de orofaringe está
normalmente associado ao HPV de alto risco, especialmente o tipo 16. O HPV causa desregulação dos oncogenes virais, levando a uma superexpressão das oncoproteínas virais E6 e E7, que são associadas à carcinogênese e podem estar correlacionadas com a gravidade da doença (ECONOMOPOULOU et al., 2016; PHUSINGHA et al., 2016).
A exposição prolongada à radiação solar ultravioleta (UV) é considerada o principal fator etiológico na epidemiologia do câncer de lábio, principalmente, em indivíduos de pele clara. A maioria dos casos é diagnosticada no lábio inferior, provavelmente, por ser uma área mais exposta à radiação solar (BOZAN et al., 2016). A incidência do CCE de lábio está declinando globalmente, com estimativa atual de 0,4 em 100.000 pessoas por ano, possivelmente, em consequência do aumento da conscientização e uso de protetores solares (HAN et al., 2016).
Dentre os fatores intrínsecos, as alterações genéticas destacam-se no desenvolvimento do câncer. Estas alterações podem envolver a ativação de proto-oncogenes, inativação de genes supressores de tumor, modificações no processo de segregação de cromossomos, perda de heterozigosidade, instabilidade telomêrica, desregulação de pontos de controle do ciclo celular e defeitos no reparo do DNA. Estes processos são complexos e, na maior parte, estão inter-relacionados (INCA, 2015; ALI et al., 2017).
O CCEO pode surgir a partir de lesões potencialmente malignas prévias, como leucoplasia e eritroplasia, as quais se caracterizam histopatologicamente por hiperceratose e displasia epitelial (YU et al., 2016). Contudo, existem três problemas ao considerar a displasia epitelial como evento precoce da carcinogênese. Primeiro, o diagnóstico é subjetivo, já que a classificação da displasia epitelial pode sofrer variações entre os observadores. Segundo, nem todas as lesões que exibem displasia tornam-se lesões malignas. Terceiro, o carcinoma pode desenvolver-se a partir de lesões sem a presença de displasia, em biópsias prévias (CHAUDHARI et al., 2016; GUPTA; GUPTA; MIGLANI, 2016), bem como em mucosa oral clinicamente saudável (SHUBHASINI et al., 2017).
Na maioria dos casos, o CCEO, afeta homens entre a quinta e oitava décadas de vida. Apenas 1-6% dos casos ocorrem em pacientes com menos de 40 anos, sendo raros em crianças e adolescentes. Em pacientes jovens, vários fatores etiológicos podem ser atribuídos ao desenvolvimento da doença, tais como: predisposição genética, infecção
viral, hábitos alimentares, imunodeficiência e exposição ocupacional ao agente carcinogênico. No entanto, a possibilidade de existência de uma ação cancerígena do tabaco e do álcool é baixa, visto que, neste grupo, o tempo de exposição seria curto para definir a relação causa-efeito (KAUR; SINGH; CHOPRA, 2016).
O CCEO pode acometer a língua, o assoalho da boca, a mucosa jugal, o palato duro, o rebordo mandibular e maxilar, a região de vestíbulo e o trígono retromolar. Dependendo do agente etiológico, clinicamente, esta neoplasia pode exibir padrões variáveis. Em pacientes tabagistas e etilistas, por exemplo, a língua é a região mais comumente afetada. Nos portadores do HPV há uma forte associação com a localização orofaríngea. No Sudeste Asiático e Sul da Ásia, o sítio mais prevalente é a mucosa jugal, em virtude, principalmente, da prática de mascar betel. No carcinoma do vermelhão do lábio, indivíduos expostos excessivamente à radiação solar, apresentam o lábio inferior como local de maior acometimento. Embora existam aspectos clínicos variados, a maioria dos CCEOs apresenta-se clinicamente como uma úlcera indolor, sem cicatrização, que geralmente permanece despercebida por um longo período de tempo até o surgimento dos sintomas (BOZAN et al., 2016; YU et al., 2016; GADBAIL et al., 2017).
A língua compreende um dos sítios de maior acometimento dos carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço (CCECP). Os CCEs de língua são classificados em dois subtipos, de acordo com a localização: CCE de língua oral (CCELO), que tem origem nos dois terços anteriores; e CCE de base de língua (CCEBL), que surge no terço posterior, sendo considerado constituinte da orofaringe. O CCELO é o tipo mais agressivo dos CCEOs, apresentando pobre prognóstico, baixas taxas de sobrevida, invasão local rápida e propensão a metástases linfonodais precoces. Acredita-se que as suas características estruturais, como o seu alto conteúdo de fibras musculares e redes linfáticas podem propriciar a disseminação tumoral (ALMANGUSH et al., 2014; YAN-YAN et al., 2017).
Para auxiliar a classificação das neoplasias malignas, foi desenvolvido o sistema de estadiamento clínico TNM (ANEXO A) (T - extensão anatômica da doença, considerando as características do tumor primário; N - disseminação linfática; e M - presença ou ausência de metástases à distância). Este sistema visa auxiliar na escolha de uma terapia direcionada e na melhoria do prognóstico dos pacientes. No entanto, as
variações na resposta ao tratamento e prognóstico são altas para estas neoplasias, uma vez que existem pacientes com o mesmo estadiamento clínico que apresentam desfechos diferentes, mesmo submetidos aos tratamentos adequados (SAWAZAKI-CALONE et al., 2015).
As taxas de sobrevida de 5 anos para os pacientes com CCEO em estágio I são superiores a 80%, mas diminuem para 40% nos estágios mais avançados (III/ IV) (LIU et al., 2015). Aproximadamente dois terços dos casos são diagnosticados em estágio avançado. Por isso, vários estudos têm avaliado os padrões biológicos associados à agressividade e prognóstico do tumor. Entretanto, o estadiamento TNM ainda é considerado o fator prognóstico mais importante (CUTILLI et al., 2016; KREPPEL et al., 2016).
Histopatologicamente, o CCEO é caracterizado pela invasão de células epiteliais escamosas malignas através da membrana basal para o tecido conjuntivo. Estas células podem proliferar individualmente ou agrupadas em ilhas e cordões. As células malignas, geralmente, exibem citoplasma eosinofílico abundante, núcleos hipercromáticos, aumento da relação núcleo-citoplasma e graus variados de pleomorfismo celular e nuclear. Perólas de ceratina e ceratinização celular individual também podem ser vistas. No microambiente tumoral ainda pode ser observado a formação de novos vasos e a presença de células inflamatórias (NEVILLE et al., 2016).
Muitos modelos de classificação histopatológica foram introduzidos para complementar as limitações do estadiamento TNM nos CCEO (SAWAZAKI-CALONE et al., 2015). Broders (1920) foi o primeiro a introduzir um sistema de classificação histopatológica, posteriormente utilizado pela OMS. Este sistema avalia apenas o grau de diferenciação das células neoplásicas. No entanto, estudos posteriores detectaram falhas ao correlacionar o sistema de gradação proposto por Broders (1920) e o prognóstico dos CCEOs. Logo mais, outras classificações foram sendo propostas, como as de Lund et al. (1975), Anneroth e Hansen (1984) e Anneroth, Batsakis e Luna (1987). Esta última classificação considerava as características das células tumorais e também aspectos relacionados ao hospedeiro, considerando 8 parâmetros morfológicos.
Em sequência, Bryne (1998) sugeriram a modificação da classificação descrita por Anneroth, Batsakis e Luna (1987), considerando o front de invasão tumoral, reduzindo a análise para 5 padrões morfológicos. Logo mais, Bryne et al. (1992)
removeram a contagem do número de mitoses e preconizaram 4 parâmetros de avaliação no front de invasão tumoral: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e infiltrado linfoplasmocitário.
No ano de 2005, a Organização Mundial de Saúde (OMS) classificou os CCEOs de acordo com a diferenciação epitelial em: bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pobremente diferenciado (BARNES et al., 2005). Os tumores bem diferenciados são caracterizados pela invasão em grandes ilhas, apresentando características semelhantes ao tecido de origem; enquanto os pobremente diferenciados tendem a exibir projeções irregulares, pequenas ilhas e células individuais dispersas no front tumoral. Estas células exibem diferenciações escamosas mínimas ou ausentes, o que dificulta o diagnóstico e requer a confirmação por marcadores imunoistoquímicos, como: AE1/ AE3, CK5/6, p63 e p40. A invasão perineural e linfovascular também pode ser observada em tumores pobremente diferenciados (EL-NAGGAR et al., 2017).
Brandwein-Gensler, em 2005, propôs o modelo de risco histológico, baseado na avaliação de três parâmetros histopatológicos: pior padrão de invasão, resposta linfocitária do hospedeiro e invasão perineural. Para cada um destes parâmetros são atribuídos escores de 0 a 3. De acordo com o somatório dos escores, os tumores podem ser classificados em: baixo risco (escore 0), risco intermediário (escore 1-2) e alto risco (escore ≥ 3). Este sistema tem apresentado correlação significativa com a sobrevida dos pacientes com CCEO em vários estudos (BRANDWEIN-GENSLER et al., 2010; LI et al., 2013). No entanto, a sua associação com o prognóstico ainda é controversa (RODRIGUES et al., 2014).
Há pouco tempo, Almangush et al. (2014) desenvolveram o modelo BD, baseado em dois parâmetros: padrão de invasão do tumor ou tumour budding ‘B’ (presença de células neoplásicas isoladas ou pequenos agrupamentos < 5 células no front de invasão) e profundidade de invasão tumoral ou depth of invasion ‘D’ (medida a partir da superfície do tumor para o ponto mais profundo de invasão). Os escores de 0 a 2 são atribuídos a cada padrão analisado. O somatório dos escores podem classificar os tumores em: baixo risco (escore 0), risco intermediário (escore 1) e alto risco (escore 2). Embora seja uma proposta recente, trata-se de um sistema simples que vem mostrando resultados positivos para avaliar o prognóstico dos pacientes com CCEO (SAWAZAKI-CALONE et al., 2015; STRIEDER et al., 2017).
O principal tratamento para o CCEO ainda é a remoção cirúrgica com margem de segurança adequada, combinada com o esvaziamento cervical, na presença de linfonodos positivos. A abordagem terapêutica eletiva, quando não há evidência clinica-radiológica de metástase linfonodal (cN0), permanece controversa, em relação ao risco de metástases ocultas (SAGHEH et al., 2016). Rajapakshe et al. (2015) ao avaliarem os fatores que poderiam influenciar na sobrevida dos pacientes com CCEO, observaram que a realização da dissecção do pescoço, como forma profilática, não oferece benefício a sobrevida dos pacientes com tumores em estágios iniciais. No entanto, D’Cruz et al. (2015) ao analisarem o efeito da dissecção linfonodal eletiva e terapêutica sobre a sobrevida dos individuos com CCEO, constataram que as maiores taxas de sobrevida global livre da doença foram em pacientes com tumores em estágios iniciais tratados com dissecção eletiva do pescoço. Sugerindo que este procedimento deve ser realizado mesmo nos estágios iniciais para detectar possíveis metástases ocultas.
Como tratamento adjuvante, a radioterapia pós-operatória, isolada ou combinada com a quimioterapia, tem sido utilizada, para favorecer os resultados cirúrgicos ou como método paliativo (GARZINO-DEMO et al., 2016). No entanto, as terapias atuais, já mencionadas, possuem limitações e apresentam efeitos colaterais significativos (GONG et al., 2017).
Diante do exposto, visando superar as limitações já mencionadas e identificar os eventos iniciais envolvidos na transformação celular maligna, as pesquisas buscando marcadores biológicos têm sido cada vez mais disseminadas (CHAUDHARI et al., 2016).
2.2 PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO 27
As células malignas estão em constante estresse celular devido à rápida proliferação e diminuição do controle de qualidade na síntese de proteínas. A homeostase proteica é essencial para a sobrevivência das células em estados fisiológicos e patológicos. Entre os mecanismos biológicos complexos que regulam a proteostase estão as chaperonas moleculares altamente conservadas, conhecidas como proteínas de choque térmico (HSPs) (VAHID; THAPER; ZOUBEIDI, 2017).
As HSPs foram descobertas em 1962, como um conjunto de proteínas encontradas em eucariotas e procariotas, induzidas por hipertermia e outras injúrias celulares (NAGARAJA; ASEA, 2010). Estas proteínas, em mamíferos, foram classificadas em grupos de acordo com sua mobilidade eletroforética: baixo peso molecular (HSP10, HSP27 e HSP40) e alto peso molecular (HSP60, HSP70, HSP90 e HSP170) (MUSCHTER et al., 2018).
As HSPs auxiliam na síntese e dobramento de diversas outras proteínas em condições normais e representam um dos mecanismos de defesa em resposta a diversos tipos de estresse (VAHID; THAPER; ZOUBEIDI, 2016). Na proteção e tolerância ao estresse a nível biológico, as HSPs também estão envolvidas na detecção e reparação ou degradação de proteínas anormais, no transporte intracelular de proteínas e na regulação da morte celular apoptótica (ETO et al., 2016).
Em condições normais, as HSPs são expressas em baixas concentrações. No entanto, em situação de estresse ou injúrias celulares, as HSPs aumentam acentuadamente como um mecanismo de defesa para possibilitar que as células sobrevivam às condições letais (GE et al., 2017). A transcrição do gene HSP é regulada pelo fator de choque térmico (HSF) que assegura a ativação transcricional durante o estresse celular e o desativa após a sua recuperação (SAINI; SHARMA, 2017). Em contraste, o HSF1 parece manter-se constitutivamente ativo em células malignas, indicando a presença de estresse proteotóxico crônico (DAI; SAMPSON, 2016).
Entre os HSFs, o HSF1 é o principal regulador da transcrição das HSPs em mamíferos. Em condições de estresse, o HSF se separa das HSPs e forma um trímero que entra no núcleo e liga-se ao elemento de choque térmico (HSE), região promotora das HSPs - Figura 1 (SAINI; SHARMA, 2017). Quando esta ligação acontece entre o HSF1 e o HSE ocorre a transcrição de genes que codificam as três principais famílias das HSPs induzidas pelo estresse e associadas ao câncer - HSP70, HSP27 e HSP90 (AZAD et al., 2015).
Além de sua função citoprotetora, as HSPs podem promover a carcinogênese e parecem desempenhar duplo papel em sua patogênese. As HSPs demonstram ser importantes para a sobrevivência e proliferação de células tumorais. Por outro lado, elas também podem viabilizar a imunidade tumoral estimulando os mecanismos da imunidade inata e aprimorando a apresentação cruzada de antígenos tumorais para os
linfócitos. As HSPs intracelulares permitem que as células sobrevivam em condições adversas, devido as suas propriedades antiapoptóticas, podendo interagir com várias proteínas envolvidas na morte celular. Em contraste, as HSPs extracelulares ou localizadas na superfície das membranas celulares induzem respostas imunes (POPLI et al., 2015).
Figura 1 – Mecanismo de regulação da síntese da HSP.
Fonte: Adaptação de Saini, Sharma (2017).
A HSP27 é uma proteína de baixo peso molecular que apresenta elevada expressão em diferentes neoplasias e acredita-se estar envolvida na proliferação e diferenciação celular, apoptose, invasão e metástase. A sua desregulação tem sido observada em vários tipos de câncer e está sendo associada com agressividade do tumor, pobre prognóstico e resistência à terapia (CHENG et al., 2015; KARAM et al., 2017).
A alta expressão da HSP27 tem sido correlacionada com um pior prognóstico em várias neoplasias malignas, incluindo o carcinoma de laringe (KAIGORODOVA et al., 2016); carcinoma de mama (LIU et al., 2015), carcinoma hepatocelular (KHAN et al., 2016), carcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC) (TSAI et al., 2014) carcinoma de ovário (LU et al., 2016), carcinoma de cólon (BAUER et al., 2012) e
carcinoma coloretal (WANG et al., 2012). No CCEO, esta associação com o prognóstico não é bem estabelecida (POPLI et al., 2015). Alguns estudos revelaram associação entre a diminuição da expressão da HSP27, pobre diferenciação dos CCEOs e pior prognóstico; e o aumento da expressão com CCEOs bem diferenciados (WANG et al., 2009; MOHTASHAM et al., 2011). Por outro lado, outras pesquisas não mostraram correlação entre a expressão de HSP27 com a gradação histológica e a sobrevida dos pacientes (LEE et al., 2012).
Yasuda et al. (2017) identificaram que o gene HSP27, em resposta ao estresse, é expresso preferencialmente em células malignas e podem ser induzidos por ativação constitutiva do HSF1 na sua forma fosforilada. Neste estudo, o HSF1 foi ativado por fosforilação do resíduo de serina 326 (Ser326) em células iniciadoras do câncer. Esta fosforilação específica foi essencial para a transcrição da HSP27. Também observaram que os níveis de expressão da HSP27 aumentaram para as amostras fosforiladas e diminuíram para as não fosforiladas. Estudos recentes demonstraram que o mTOR tem papel importante na regulação da resposta ao estresse e na fosforilação do HSF1 em Ser326. Dessa forma, o mTOR ativado ao fosforilar o HSF1 (Ser326), pode induzir a expressão da HSP27.
A HSP27 está envolvida em múltiplas vias de sinalização que são importantes para o processo da tumorigênese, dentre elas: a p53 implicada na supressão tumoral; e o NF-kB (Fator nuclear kappa B) envolvido na progressão tumoral e metástase. A expressão da HSP27 suprime a via da p53, inibindo o acúmulo de p21, podendo levar as células malignas a evadirem-se da senescência e desenvolverem tumores. Já a via NF-kB, ao ser regulada pela HSP27, poderia tornar as células cancerosas resistentes à apoptose. Além disso, várias funções importantes das proteínas podem ser remodeladas pela HSP27 para a sobrevivência destas células (CHENG et al., 2015).
Cheng et al. (2015) ao avaliarem o papel da HSP27 nos carcinomas hepatocelulares, observaram que a superexpressão de HSP27 foi correlacionada com o aumento da ativação de múltiplas vias de proliferação e sobrevivência celular, adesão celular, regulação de citoesqueleto de actina, via de sinalização MAPK (Proteína quinase ativada por mitógeno), Wnt, ErbB e TGF-β (Fator de transformação do crescimento beta).
No câncer de mama a baixa regulação da HSP27 induz a expressão do homólogo da fosfatase e tensina (PTEN), um gene de supressão tumoral, indicando que a HSP27 regula negativamente a PTEN. No adenocarcinoma gástrico há uma superexpressão do receptor de quimiocinas CXC tipo 1 (CXCR1), responsável pelo desenvolvimento e progressão do câncer. O silenciamento do gene CXCR1 em linhagens celulares de carcinoma gástrico leva a diminuição da expressão da HSP27, sugerindo uma associação entre CXCR1, HSP27 e o desenvolvimento do câncer (WU et al., 2017). Já no câncer de próstata a alta imunoexpressão da HSP27 atua através da STAT-3 promovendo a proliferação e sobrevivência das células tumorais (YU et al., 2017).
Zheng et al. (2017) observaram que em linhagens de CCELO quimioresistentes, a HSP27 extracelular ao se ligar ao TLR5 (receptor Toll-like 5), ativa a sinalização NF-kB para manter a sobrevivência celular. Já a HSP27 intracelular liga-se a BAX e BIM para reprimir sua translocação para mitocôndria, e subsequente inibe a liberação do citocromo C, resultando na inibição da apoptose mitocondrial.
Os mecanismos moleculares responsáveis pela regulação da expressão das HSP27 em células cancerígenas ainda não estão bem estabelecidos, mas podem ser tumor-específicos. Há pouca informação desta proteína no CCEO e sobre como as HSPs afetam os eventos moleculares envolvidos na proliferação e invasão tumoral (POPLI et al. 2015).
Dentre os novos alvos moleculares, a HSP27 é considerada uma proteína promissora para futuras estratégias terapêuticas contra o câncer. A elevada expressão desta proteína vem sendo associada à resistência a vários agentes quimioterápicos. Estudos mostram que a HSP27 está envolvida na resistência à cisplatina em alguns tipos de câncer, como o câncer de óvario. Todavia, os mecanismos, pelos quais as células tumorais desenvolvem resistência à cisplatina, permanecem obscuros. Contudo, acredita-se que a neutralização da HSP27 inverta o quadro de resistência à quimioterapia e seja uma estratégia atraente para terapia (LU et al., 2016).
Assim, constata-se que a HSP27 parece ser um biomarcador de prognóstico e alvo terapêutico promissor para os pacientes com câncer, uma vez que esta proteína regula numerosos processos envolvidos na carcinogênese, desta forma, este trabalho objetiva avaliar a imunoexpressão desta HSP em CCELO.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar se a proteína de choque térmico 27 (HSP27) exerce alguma influência nos CCELOs.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar um estudo histomorfológico dos casos de CCELO, utilizando 3 sistemas de gradação histopatológica: (1) gradação da OMS (2005); (2) modelo de risco histológico de malignidade proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005); (3) modelo BD (Budding-Depth) proposto por Almangush et al. (2014);
Analisar a expressão imunoistoquímica da HSP27 nas amostras dos CCELOs e comparar a imunoexpressão da HSP27 entre os CCELOs e espécimes de mucosa oral normal;
Correlacionar a imunoexpressão do HSP27 com parâmetros clinicopatológicos e com a sobrevida dos pacientes portadores de CCELO.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Antes de sua realização, esta pesquisa foi submetida e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Conforme parecer nº 2.155.630 (ANEXO C), seu protocolo foi aprovado em 07 de junho de 2017.
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
Esta pesquisa foi caracterizada como um estudo transversal e retrospectivo com análise comparativa das características clínicas, histopatológicas e imunoistoquímicas da expressão da HSP27 nos espécimes de CCELO.
4.3 POPULAÇÃO
A população objeto do presente estudo foi constituída por casos de CCELO e espécimes de mucosa oral normal, arquivados no Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande no Norte/ UFRN, Natal-RN.
4.4 AMOSTRA
Para o estudo histomorfológico e imunoistoquímico, a amostra foi por conveniência, constituída por 55 casos de CCELO obtidos nos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande no Norte/UFRN, Natal-RN. Os prontuários deveriam encontrar-se com os dados necessários para a realização do estudo.
Foram incluídos ainda 20 fragmentos de mucosa oral normal para o controle, selecionados nos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte/UFRN - Natal RN, a partir de espécimes advindos de pacientes submetidos a tratamento cirúrgico para remoção de lesões benignas, cujas bordas apresentavam epitélio oral não neoplásico.
4.4.1 Critérios de inclusão
1. Foram incluídos casos primários de CCELO tratados por excisão cirúrgica, sem histórico prévio de radioterapia ou quimioterapia;
2. Os casos selecionados deveriam possibilitar a realização do estudo histomorfológico e imunoistoquímico;
3. Os prontuários deveriam conter dados clínicos sobre TNM, bem como dados relacionados à recorrência e sobrevida dos pacientes;
4. Os pacientes deveriam ter pelo menos 60 meses de acompanhamento clínico.
4.4.2 Critérios de exclusão
1. Casos de CCEO de língua localizados em orofaringe; 2. Casos em que foi realizada apenas a biópsia incisional; 3. Casos tratados apenas com radioterapia e/ou quimioterapia;
4. Ausência de dados no prontuário a respeito do TNM, recorrência e sobrevida.
4.5 ESTUDO CLÍNICO
As informações clínicas dos casos selecionados para participar desta pesquisa, tais como: gênero, idade, metástase linfonodal, metástase à distância, recidiva local, sobrevida, tratamento, data do último acompanhamento ou do óbito, foram coletados dos prontuários médicos dos pacientes e transcritos em fichas previamente elaboradas (APÊNDICE A). Foram considerados para estudo os casos que tinham pelo menos cinco anos de acompanhamento para que assim pudessem ser obtidos os dados de recidiva e sobrevida.
Os desfechos investigados foram:
(1) Sobrevida global – tempo desde o início do tratamento até o óbito ou última informação de acompanhamento;
(2) Sobrevida específica da doença – tempo desde o início do tratamento até o óbito devido ao câncer ou a última data de acompanhamento clínico;
(3) Sobrevida livre de doença – tempo desde o início do tratamento até o diagnóstico da primeira recorrência/segundo tumor primário (local ou regional) ou metástase (regional ou distante).
4.6 ESTUDO HISTOMORFOLÓGICO
As lâminas coradas pela técnica de hematoxilina e eosina de cada espécime foram escaneados pelo Scanner Pannoramic MIDI (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121) e visualizadas através do software Pannoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121). Posteriormente, as amostras de CCELO foram avaliadas e classificadas de acordo com os critérios propostos pelo sistema de gradação da OMS (2005), modelo de risco histológico de malignidade de Brandwein-Gensler et al. (2005) e pelo modelo BD de Almangush et al. (2014) (APÊNDICE B).
O sistema de gradação histopatológica proposto pela OMS (2005) classifica as neoplasias malignas em três categorias de acordo com o grau de diferenciação celular, em: bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pobremente diferenciado. Para a sua classificação foram utilizados os critérios presentes no quadro 1 (BARNES et al., 2005).
Para a classificação proposta por Brandwein-Gensler et al. (2005) foram avaliados: o pior padrão de invasão, a resposta linfocítica do hospedeiro na interface do tumor e a invasão perineural. Para cada caso uma pontuação foi dada por parâmetros, gerando um escore de risco. Quando o escore foi igual a 0, o caso foi considerado de
baixo risco; escore 1 ou 2 foi de risco intermediário; e escore 3 ou mais, alto risco (Quadro 2).
O modelo BD descrito por Almangush et al. (2014) avalia os ninhos de células tumorais e a profundidade de invasão do tumor. O ninho de células tumorais define-se como a presença de células tumorais isoladas ou pequenos agrupamentos com menos de 5 células tumorais na frente invasiva do tumor. Já a profundidade de invasão é medida desde a superfície do tumor até o ponto mais profundo de invasão tumoral. Dessa forma, os resultados da análise dos padrões histopatológicos foram classificado em três escores que podem ser 0, 1 e 2 de acordo com o baixo, médio ou elevado risco, respectivamente (Quadro 3).
Quadro 1 – Sistema de gradação histopatológica da OMS (2005).
Parâmetros Características
Bem diferenciado Arquitetura tecidual semelhante ao padrão normal do epitélio
escamoso
Moderadamente diferenciado Certo grau de pleomorfismo nuclear e atividade mitótica
Pouca ceratinização
Pobremente diferenciado
Predomínio de células imaturas Numerosas mitoses típicas e atípicas Mínima ceratinização
Quadro 2 – Modelo de risco histológico proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005). Variável Histopatológica Definição Pontuação Pior padrão de invasão
Tipo 1 Invasão compressiva 0
Tipo 2 Crescimento finger-like 0
Tipo 3 Ilhas tumorais grandes contendo mais de 15 células por ilha
0
Tipo 4 Ilhas tumorais pequenas contendo 15 células ou menos por ilha
1
Tipo 5 Tumor satélite, igual ou maior que 1mm distante do tumor principal (20x)
3
Resposta linfocítica do
hospedeiro
Tipo 1 (Forte) Tecido linfoide presente de forma contínua e densa/Agregados linfoides no front invasivo em cada um
dos campos (4x)
0
Tipo 2 (Intermediário)
Resposta intermediária do hospedeiro/ Agregados linfoides na inetrface em alguns, mas não todos os campos (4x)
1
Tipo 3 (Fraco) Pouca ou nenhuma resposta do hospedeiro/ Ausência de agregados
linfoides 3 Invasão perineural Nenhum Nenhum 0 Pequenos nervos
Tumor envolvendo pequenos nervos (menores que 1mm de diâmetro)
1
Grandes nervos Tumor envolvendo grandes nervos (igual ou maior que 1mm de diâmetro)
Quadro 3 – Modelo BD de Almangush et al. (2014).
4.7 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
Os espécimes dos CCELO e da mucosa oral normal, fixados em formol a 10% e emblocados em parafina, foram submetidos a cortes histológicos de 3m de espessura, os quais foram estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas e preparadas com adesivo à base de 3-aminopropyltrietoxy-silano (Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). Posteriormente, o material foi submetido ao anti-HSP27 (Clone G31; Cell Signaling Technology®, diluição 1:4000; incubação 60’). Como controle negativo, alguns cortes passaram pelo processamento imunoistoquímico sem exposição ao anticorpo primário, para confirmar a especificidade da coloração.
Descrição Histológica Escore BD
Tumor com uma profundidade de invasão < 4 mm e com < de 5 brotamentos tumorais no front invasivo do tumor
0
O tumor deverá ter apenas uma das seguintes características:
- Tumor com uma profundidade de invasão ≥ 4 mm e com < 5 brotamentos tumorais no front invasivo do tumor; - Tumor superficial com < 4 mm e com ≥ 5 brotamentos tumorais no front invasivo do tumor
1 a
1 b
Tumor com uma profundidade de invasão ≥ 4 mm e com ≥ 5 brotamentos tumorais no front invasivo do tumor
Após as etapas de desparafinização e rehidratação, para a recuperação antigênica os cortes foram submetidos ao Trilogy (Cell Marque, CA, USA), em uma concentração de 1:100 em água destilada em panela pressurizada (Pascal). Posteriormente, as amostras sofreram o bloqueio da peroxidase endógena com H2O210Vol (15 minutos em temperatura ambiente) e após lavagem em água corrente, incubadas em bloqueador de proteína (ThermoScientific, Runcorn, UK) por 5 minutos em temperatura ambiente, a qual bloqueia as ligações inespecíficas. Em seguida, foram realizadas duas lavagens em tris-hidroximetil-aminometano (TRIS, Sigma Chemical, St Louis, MO, USA) (pH 7,4) com duas trocas de 5 minutos para então haver a incubação do anticorpo primário anti-HSP27. Posteriormente, as amostras foram incubadas com o sistema Hidef (Cell Marque, CA, USA) durante 60 minutos à temperatura ambiente, intercaladas por lavagens em TRIS. Após esta incubação, foi realizada a revelação com diaminobenzidina (DAB, Sigma Chemical, St Louis, MO,USA) em câmara escura, passando por água destilada, contra-coloração com hematoxilina de Mayer (1 minuto), lavagem em água corrente (5 minutos), água destilada com duas trocas (5 minutos). O processo foifinalizado com desidratação, diafanização e montagem da lamínula contra a lâmina em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA) para observação em microscópio de luz.
4.7.1 Análise da Marcação Imunoistoquímica
A análise da imunoexpressão da HSP27 nos casos de CCELO e na mucosa oral normal foi fundamentada na marcação citoplasmática, sendo consideradas positivas as células que apresentaram pigmentos de coloração acastanhada. Esta análise foi realizada em dois momentos distintos por um único examinador, treinado previamente. Todos os casos da amostra foram escaneados pelo Scanner Pannoramic MIDI (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121) e as imagens obtidas visualizadas através do software Pannoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121). Foram selecionados 5 campos utilizando a amplitude de 33,33, correspondendo ao aumento de 400x do microscópio de luz. Nos CCELO a análise foi realizada no front tumoral.
Para quantificar a imunoexpressão da HSP27 nos CCELO e na mucosa oral normal, foi utilizada uma adaptação da metodologia proposta por Luz et al. (2017). A expressão da proteína foi avaliada com base na intensidade de imunomarcação citoplasmática e na porcentagem de células tumorais imunopositivas em 5 campos selecionados. Para a intensidade de marcação foi considerado escore 0 (negativo), 1 (fraca), 2 (moderada) e 3 (forte). A porcentagem de células imunomarcadas foi classificada em escores - 0 (negativo), 1 (1-10%), 2 (11-50%), 3 (51-80%) e 4 (>80%) (APÊNDICE C). Posteriormente, foi realizada a multiplicação do escore de intensidade de marcação pelo escore de porcentagem de células imunomarcadas. A multiplicação resultou no Sistema de Escore de Imunorreatividade (IRS), que variou de 0 -12. O IRS total do caso foi estabelecido de acordo com a mediana dos IRS dos 5 campos analisados.
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram organizados em um banco de dados informatizado com o auxílio do programa estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na versão 22.0. Posteriormente, os resultados foram submetidos às análises descritivas e testes estatísticos adequados com o objetivo de avaliar as hipóteses aventadas no presente projeto. Para todos os testes estatísticos foi estabelecido um nível de significância de 5% (p < 0,05).
4.8.1 Variáveis elencadas para os testes estatísticos
Para realizar os testes das hipóteses propostas foram elencadas as variáveis apresentadas nos quadros abaixo:
Quadro 4 – Variáveis dependentes.
Variável Dependente Categoria Classificação
Intensidade de imunomarcação das células
epiteliais pela HSP27 0 (negativo) 1 (fraco) 2 (moderado) 3 (forte) Nominal ordinal Porcentagem de imunomarcação das células
epiteliais pela HSP27 0 (negativo) 1 (1-10%) 2 (11-50%) 3 (51-80%) 4 (>80%) Nominal ordinal
Quadro 5 – Variáveis independentes.
Variável Independente Categoria Classificação
Gênero 1– Masculino
2 – Feminino Nominal mutuamente exclusiva
Idade
Valor absoluto Quantitativa discreta ≤ 60
>60 Nominal ordinal
Tratamento
1 – Cirurgia
2– Cirurgia e outros Nominal mutuamente exclusiva
TNM 1- T4N2M0; T3N2M0; T2N2M0 2-T1N1M0; T1N2M0; T2N1M0 3- T3N0M0; T4N0M0; 4-T2N0M0 5- T1N0M0 999- Sem dados Nominal ordinal Metástase 1 – sim
Para verificar diferenças significativas foram utilizados os testes de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis. Na busca de associações significativas foram adotados os testes Qui-quadrado de Pearson e Exato de Fisher. Essas análises foram realizadas no SPSS versão 22 (SPSS Inc.®).
A análise de sobrevida foi realizada com o auxílio do Stata/IC versão 12.0 (StataCorp, College Station, TX) utilizando o método de Kaplan Meier e o teste log-rank (para a avaliação da significância estatística das diferenças entre as curvas de sobrevida obtidas), foram confeccionadas as curvas de sobrevida global de cinco anos para cada uma das variáveis estudadas.
A regressão de Cox (modelo de riscos proporcionais de Cox) foi utilizada para determinar a harzard ratio (HR) e seu intervalo de confiança de 95%. Para todas as avaliações foram considerados valores significativos com p<0,05.
Recidiva loco regional 1 – sim
2 – não Nominal mutuamente exclusiva
Tempo de sobrevida Meses Quantitativa discreta
Desfecho
1-Óbito por câncer 2-Em progressão 3-Remissão
Nominal mutuamente exclusiva
Análise morfológica segundo a OMS (2005) 1- Bem diferenciado 2- Moderadamente diferenciado 3- Pobremente diferenciado Nominal ordinal
Análise morfológica segundo Brandwein-Gensler et al. (2005) 1-Alto Risco 2-Risco Intermediário 3-Baixo Risco Nominal ordinal
Análise morfológica segundo Almangush et al. (2014)
0-Alto Risco
1-Risco Intermediário 2-Baixo Risco
5 RESULTADOS
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A amostra deste estudo foi constituída por 55 casos de CCELO e 20 casos de mucosa oral normal. O perfil epidemiológico dos casos de CCELO utilizados nesse estudo encontra-se detalhado na Tabela 1.
Tabela 1 – Frequência dos casos de CCELO segundo sexo, idade e hábitos dos pacientes. Natal- RN, 2018. Parâmetro n (%) Sexo Masculino Feminino 37 (67,3) 18 (32,7) Idade Até 60 anos ≥ 60 anos 22 (40,0) 33 (60,0) Tabagismo Não Sim Não informado 4 (7,3) 42 (76,4) 9 (16,3) Etilismo Não Sim Não informado 9 (16,3) 29 (52,7) 17 (31,0) Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia oral/UFRN.
A maioria dos indivíduos da amostra foi do sexo masculino (37 /67,3%), com proporção entre o sexo masculino e feminino de 2,05:1. No momento do diagnóstico, as idades dos pacientes variaram de 25 a 95 anos (62,85 ±15,13). Dentre os hábitos, foi constatado que 42 indivíduos (76,4%) eram tabagistas e 29 (52,7%) eram etilistas.
A tabela 2 mostra a distribuição dos casos segundo os critérios do TNM e o estadiamento clínico da doença.
Tabela 2 – Frequência dos casos de CCELO de acordo com os critérios do TNM e estadiamento clínico. Natal-RN, 2018. Parâmetro n (%) Tamanho do tumor (T) T1 –T2 T3 –T4 Não informado 34 (61,8) 17 (30,1) 4 (8,1) Comprometimento linfonodal (N) N(-) N(+) Não informado 31 (56,4) 20 (36,3) 4 (7,3) Metástase à distância (M) M(-) M(+) Não informado 50 (90,9) 0 (0,0) 5 (9,1) Estadiamento clínico I-II III-IV Não informado 23 (41,8) 28 (50,9) 4 (7,3) Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia oral/UFRN.
A cirurgia foi a primeira modalidade terapêutica para todos os pacientes envolvidos no presente estudo. Em 15 pacientes (27,3%), a cirurgia foi a única abordagem terapêutica utilizada. Quarenta pacientes (72,7%) foram tratados pela associação de cirurgia e outros tratamentos como a radioterapia e/ou quimioterapia.
Após o tratamento inicial, o curso clínico da doença foi avaliado conforme a análise dos parâmetros apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 – Análise do comportamento clínico da doença após o tratamento inicial. Natal-RN, 2018. Parâmetro n (%) Recidiva local Ausente Presente 42 (76,4) 13 (23,6) Segundo tumor primário
Ausente Presente
50 (90,9) 5 (9,1) Metástase linfonodal após o tratamento
Ausente Presente
50 (90,9) 5 (9,1) Metástase à distância após o tratamento
Ausente Presente
53 (96,4) 2 (3,6) Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia oral/UFRN.
Posteriormente ao tratamento, as recidivas locais acometeram 13 indivíduos com tempo médio, em meses, de 12,85 (±7,69). Cinco pacientes desenvolveram novos tumores primários com média de tempo, em meses, de 34,00 (±16,17). Quanto ao comprometimento linfonodal, 5 pacientes desenvolveram metástase com tempo médio, em meses, de 27,00 (±17,32). Apenas 2 pacientes apresentaram metástase à distância no período de acompanhamento clínico com tempo médio, em meses, de 41,00 (±19,79).
Dos 55 pacientes, 15 (27,3%) foram a óbito após um tempo médio, em meses, de 13,60 ±12,52, todos relacionados à progressão da doença de base (CCELO).
5.2 ANÁLISE CLINICOPATOLÓGICA
Os resultados da associação entre o estadiamento clínico categorizado dos casos de CCELO e os parâmetros epidemiológicos e clínicos estão descritos na Tabela 4. Foi observada associação significativa entre a idade e estadiamento, no qual ter idade até 60 anos foi mais associado ao estadiamento III e IV. Um caso de recidiva, um de metástase linfonodal após tratamento e um caso de segundo tumor primário não entraram na análise de associação, pois não tinham TNM avaliado.
Tabela 4 – Associação do estadiamento clínico em relação a parâmetros epidemiológicos e clínicos. Natal-RN, 2018.
Parâmetro Estadiamento clínico** p
I ou II n (%) III ou IV n (%) Gênero Masculino Feminino 14 (41,2) 9 (52,9) 20 (58,8) 8 (47,1) 0,426 Idade Até 60 anos Maior que 60 anos
4 (20,0) 19 (61,3) 16 (80,0) 12 (38,7) 0,005* Tabagismo*** Não Sim 1 (25,0) 17 (42,5) 3 (75,0) 23 (57,5) 0,497 Etilismo**** Não Sim 6 (66,7) 10 (35,7) 3 (33,3) 18 (64,3) 0,136 Recidiva local Ausente Presente 19 (48,7) 4 (33,3) 20 (51,3) 8 (66,7) 0,509 Segundo tumor primário
Ausente Presente 20 (42,6) 3 (75,0) 27 (57,4) 1 (25,0) 0,316 Metástase linfonodal após tratamento
Ausente Presente 20 (42,6) 3 (75,0) 27 (57,4) 1 (25,0) 0,317 Metástase à distância após tratamento
Ausente Presente 22 (44,9) 1 (50,0) 27 (55,1) 1 (50,0) 1,000 Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia oral/UFRN. Teste Exato de Fisher para n<5 e Qui-Quadrado de Pearson para n>5. Legenda: *resultado significativo, **4 casos sem informação, ***7 casos sem informação, ****14 casos sem informação.
5.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA
A análise morfológica dos casos de CCELO evidenciou rompimento da membrana basal e invasão das células epiteliais neoplásicas para o tecido conjuntivo subjacente, em padrões de lenções, ilhas, cordões e individualmente. As células tumorais exibiram diferentes graus de ceratinização, com formação de pérolas de ceratina, pleomorfismo celular e nuclear, figuras de mitoses típicas e atípicas e nucléolos proeminentes. Foi possível observar que estas células adquiriram a capacidade de invadir estruturas adjacentes ao tumor, tais como: tecido muscular, adiposo, nervoso e glandular. O infiltrado inflamatório, presente no microambiente tumoral, variou de intenso a fraco, com resposta inflamatória escassa em alguns casos.
Na gradação da OMS, as neoplasias malignas foram classificadas de acordo com o grau de diferenciação celular (Figura 2ª e B). Para a classificação proposta por Brandwein-Gensler et al. (2005) foram avaliados o padrão de invasão, a resposta linfocítica do hospedeiro no front tumoral e a invasão perineural (Figura 3ª, B e C). No modelo BD foram analisados os ninhos de células tumorais e a profundidade de invasão do tumor (Figura 4ª, B e C).
A frequência das gradações histológicas da OMS, modelo BD e risco histológico proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) encontram-se na tabela 5, na qual se verifica que a maioria dos casos foram enquadrados como: bem diferenciado (56,4%), segundo a OMS; alto risco (69,1%), de acordo com o modelo BD; e de risco intermediário (54,5%) conforme a gradação proposta por Brandwein-Gensler et al. (2005).
Figura 2 – Aspectos morfológicos do CCELO. (A) Bem diferenciado, com numerosas pérolas de ceratina. (B) Pobremente diferenciado, exibindo ausência de ceratinização e comedonecrose em região central do lençol de células tumorais (HE/ Pannoramic Viewer – 200μm).
A
A
B
C
Ausência de células inflamatórias no front tumoral, com ilhas contendo menos de 15 células - padrão de invasão tipo 4. (B) Intenso infiltrado inflamatório no front tumoral, com padrão de invasão tipo 4. (C) Invasão perineural de pequeno nervo (HE/ Pannoramic Viewer - 200μm, 200μm, 100μm, respectivamente).
Profundidade de invasão menor que 4 mm, com ninhos contendo mais de 5 células no front tumoral. (B) Profundidade de invasão maior que 4mm. (C) Presença de mais de 5 ninhos com menos de 5 células no front tumoral (HE/ Pannoramic Viewer - 1000μm, 2000μm, 100μm, respectivamente).
A
B
Tabela 5 – Análises morfológicas dos casos de CCELO. Natal-RN, 2018. Gradação n (%) OMS Bem diferenciado Moderadamente diferenciado Pouco diferenciado 31 (56,4) 16 (29,1) 8 (14,5) Modelo BD Baixo risco Risco Intermediário Alto risco 3 (5,5) 14 (25,5) 38 (69,0) Risco de Brandwein-Gensler Baixo risco Risco Intermediário Alto risco 1 (1,8) 30 (54,5) 24 (43,6) Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia oral/UFRN.
As análises da associação entre as gradações histológicas de malignidade propostas e os parâmetros clínicos dos casos de CCELO utilizados no presente estudo estão descritos na Tabela 6. Para essa avaliação as gradações foram associadas em duas categorias devido à pequena quantidade de casos. Foi verificada associação significativa entre tamanho do tumor e o modelo de risco histológico proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005), sendo T3-T4 mais associado ao alto risco. Embora não tenha apresentado resultado significativo, no modelo BD foi evidenciado que a maioria dos casos T3 e T4 (88,2%), com comprometimento linfonodal (85%) e com o estadiamento clínico III e IV (82,1) foram classificados como de alto risco. Além disso, foi verificada associação entre metástase linfonodal após tratamento e o modelo BD, sendo a metástase mais associada aos riscos baixo e intermediário.
