Quantificação de compostos bioativos em carne de
novilhos dos Açores.
Ana Catarina Ferreira Teixeira Silva
Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em
Engenharia Alimentar – Qualidade e Segurança Alimentar
Orientadores: Professora Doutora Luísa Cristina Pereira Roseiro
Professor Doutor António Pedro Louro Martins
Júri:
Presidente: Doutora Margarida Gomes Moldão Martins, Professora Auxiliar com Agregação do Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa.
Vogais:
Doutora Teresa de Jesus da Silva Matos, Professora Auxiliar do Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa.
Doutora Luisa Cristina Pereira Roseiro, Investigadora Auxiliar do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária, orientadora.
Agradecimentos
A realização deste trabalho só foi possível graças ao contributo de várias pessoas. Os meus sinceros agradecimentos:
Em primeiro lugar, à Doutora Cristina Roseiro, investigadora auxiliar do INAV e minha orientadora neste estágio, por todo o tempo e apoio dedicados à realização deste trabalho. A sua ajuda e orientação foram fundamentais para a conclusão desta dissertação.
Ao Doutor Carlos Santos por todo o apoio ao longo da realização deste estágio e pela boa disposição que mantinha diariamente, aliviando o “stress” de todos.
À Engenheira Helena por toda a paciência, apoio e ensinamentos na realização da parte laboratorial, essencial para a realização deste trabalho.
Ao professor doutor Pedro Louro, coordenador desta dissertação e meu professor do Instituto Superior de Agronomia, que estabeleceu o contacto com o INIAV e possibilitou a realização deste estágio.
Às minhas amigas Sofia Salvador e Diana Vieira, colegas de curso e de estágio, que me acompanharam ao longo destes meses. Sem eles tudo teria sido mais difícil, especialmente as horas de almoço. Obrigada pela amizade, companheirismo e boa disposição
Resumo
A carne desempenha um papel fundamental na dieta humana, tendo vindo a ser considerada como um alimento funcional devido à presença de compostos com capacidade antioxidante. O presente estudo teve como principal objetivo a caraterização de compostos bioativos presentes em carne de novilhos criados na Região Autónoma dos Açores. Esta caraterização baseou-se na análise de compostos com atividade antioxidante nomeadamente coenzimas Q (Ubiquinona), creatina, carnosina e anserina tendo em conta a influencia de fatores, tais como raça, peso, idade, solar de produção (Faial, Pico, São Jorge e Terceira) e tipo de músculo (Longissimus dorsi e Bíceps femoris).
Os resultados revelaram que o tipo de músculo foi o fator com maior influência nos teores dos compostos bioativos estudados. O músculo Biceps femoris apresentou concentrações mais elevadas de coenzimas Q10 e anserina relativamente ao músculo Longissimus dorsi, 2,42 mg/100g e 136,6 mg/100g, respetivamente. Animais cruzados de
Charolês revelaram teores mais elevados de coenzima Q10, 2,80 mg/100g, enquanto que
animais cruzados de Limousine apresentaram teores superiores em creatina, carnosina e anserina, 904,2 mg/100g, 461,6 mg/100g e 128,3 mg/100g, respetivamente. Em média, a carne dos novilhos dos Açores apresentou teores de anserina e creatina cerca de 2 a 4 vezes superiores aos referidos na bibliografia.
A carne de animais com idade inferior a 12 meses e de animais com peso inferior a 300kg apresentaram concentrações superiores de coenzima Q10, 2,27 mg/100g e 2,28
mg/100g, respetivamente. Enquanto que, concentrações mais elevadas de creatina, carnosina e anserina foram encontradas em carne de animais de idade e peso superior.
Os animais proveniente da ilha de São Jorge apresentaram valores superiores de coenzimas Q10 e creatina, 2,67 mg/100g e 968,3 mg/100g, respetivamente, enquanto que
animais da ilha do Faial revelaram teores mais elevados em carnosina e anserina, 492,0 mg/100g e 135,6 mg/100g, respetivamente.
Abstract
The meat plays a key role in the human diet and has been considered as a functional food due to the presence of compounds with antioxidant capacity. This study aimed to characterize the bioactive compounds present in meat from steers produced in the Azores. This characterization was based on the analysis of compounds with antioxidant activity including coenzyme Q (ubiquinone), creatine, carnosine and anserine taking into account the influence of factors such as breed, weight, age, production geographical region (Faial, Pico, Sao Jorge and Terceira) and muscle type (Longissimus dorsi and Biceps femoris).
The results showed that the muscle type was the factor with the greatest influence on the content of bioactive compounds studied. Biceps femoris muscle showed higher concentrations of coenzyme Q10 and anserine in relation to the Longissimus dorsi muscle,
2.42 mg/100 g and 136.6 mg/100g, respectively. Charolais crossbred showed higher levels of coenzyme Q10, 2.80 mg/100g, while Limousine crossbred showed higher levels of creatine,
carnosine and anserine, 904.2 mg/100g, 461.6 mg/100g and 128 3 mg/100g, respectively. On average, the meat of the steers produced in Azores presented anserine and creatine contents about 2 to 4 times higher than those reported in literature.
Meat produced from animals younger than 12 months and of animals weighing less than 300kg had higher concentrations of coenzyme Q10, 2.27 mg/100 g and 2.28 mg/100g,
respectively. Whereas, higher concentrations of creatine, carnosine and anserine were found in older and heavier animals.
The animals produced in São Jorge island showed higher values of coenzyme Q10
and creatine, 2.67 mg/100g and 968.3 mg/100 g, respectively, while Faial island animals have shown higher levels of carnosine and anserine, 492, 0 mg/100g and 135.6 mg/100g, respectively.
Índice Agradecimentos...2 Resumo... 3 Abstract... 4 Índice de figuras...7 Lista de tabelas...9 Lista de abreviaturas...10 I. Introdução...11
II. Revisão Bibliográfica...13
1. Breve caraterização do sector da Carne...13
1.1. Europa...13
1.2. Portugal...13
2. Arquipélago dos Açores...15
3. Sistema de produção IGP...15
4. Qualidade da carne...16
4.1. Caraterísticas sensoriais...16
4.1.1. Cor... 16
4.1.1.1. Fatores com influência na cor da carne...18
4.1.2. Flavour...19
4.1.3. Suculência...19
4.1.4. Tenrura...19
4.2. Caraterísticas nutricionais...20
4.3. Processos oxidativos na carne...21
4.3.1. Oxidação Lipídica...22
4.3.2. Oxidação Proteica...23
4.4. Compostos bioativos presentes na carne...23
4.4.1. Coenzimas Q...24
4.4.2. Péptidos bioativos...27
III. Materiais e Métodos...30
1. Identificação da amostra em estudo...30
1.1. Procedimento analítico...30
1.1.1. Determinação de Coenzima Q9 e Q10 em carne por HPLC...30
1.1.2. Determinação de péptidos funcionais em carne por HPLC...32
2. Validação do método...33
2.1. Linearidade...33
2.2. Determinação dos Limites de Deteção (LD) e de Quantificação (LQ)...34
2.4. Análise estatística...35
IV. Resultados e Discussão...36
1. Validação do método...36 1.1. Linearidade...36 1.1.1. Coenzimas Q...36 1.1.2. Creatina e dipéptidos...37 1.2. Limites analíticos...38 1.3. Taxas de recuperação...39
2. Influencia do solar de produção, raça, tipo de músculo e idade no teor de Coenzimas Q da carne de novilho dos Açores...39
3. Influencia do solar de produção, raça, tipo de músculo e idade no teor de creatina, carnosina e anserina da carne de novilho dos Açores...48
V. Conclusões...60
Índice de figuras
Figura 1: Produção anual de carne de bovino, Estatísticas Agrícolas 2014 (INE)...14
Figura 2: Consumo de carne per capita (kg/hab) por tipo de carne no ano de 2014, INE 2014 ... 14
Figura 3: Consumo humano de carne per capita (kg), entre 2004 e 2014. Fonte: INE, 2014. ... 15
Figura 4: Interconversões redox da Mioglobina visíveis na superfície da carne...17
Figura 5: Oxidação/Redução da Ubiquinona...25
Figura 6: Estrutura química da Carnosina e Anserina. Fonte: Liu, 2011...27
Figura 7:Cromatograma da solução padrão das coenzimas Q...32
Figura 8: Cromatograma da solução padrão dos péptidos bioativos...33
Figura 9: Gráfico da curva padrão para a coenzima Q9...37
Figura 10: Gráfico da curva padrão para a coenzima Q10...37
Figura 11: Gráfico da curva padrão para a creatina...37
Figura 12: Gráfico da curva padrão para a carnosina...38
Figura 13: Gráfico da curva padrão para a anserina...38
Figura 14: Médias das concentrações (mg/100g) para as coenzimas Q9, ilha versus músculo. ... 41
Figura 15: Médias das concentrações (mg/100g) para as coenzimas Q10, ilha versus músculo... 42
Figura 16: Médias das concentrações (mg/100g) para as coenzimas Q9, raça versus músculo... 43
Figura 17: Médias das concentrações (mg/100g) para as coenzimas Q10, raça versus músculo... 43
Figura 18: Médias das concentrações (mg/100g) para as coenzimas Q9, peso versus músculo... 44
Figura 19: Médias das concentrações (mg/100g) para as coenzimas Q10, peso versus músculo... 44
Figura 20: Médias das concentrações (mg/100g) para as coenzimas Q9, idade versus músculo... 45
Figura 21: Médias das concentrações (mg/100g) para as coenzimas Q10, idade versus músculo... 45
Figura 22: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de CoQ10 para novilhos de S. Miguel, raça versus músculo...46
Figura 23: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de CoQ9 para novilhos de S. Miguel, raça versus músculo...46
Figura 24: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de CoQ9, para novilhos de S.
Miguel... 47
Figura 25: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de CoQ10, para novilhos de S. Miguel... 47
Figura 26: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de creatina, ilha versus músculo.. 49
Figura 27: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de carnosina, ilha versus músculo. ... 50
Figura 28: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de anserina, ilha versus músculo. 50 Figura 29: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de creatina...51
Figura 30: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de carnosina...51
Figura 31: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de anserina...52
Figura 32: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de creatina...53
Figura 33: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de carnosina...53
Figura 34: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de anserina...53
Figura 35: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de creatina...54
Figura 36: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de carnosina...54
Figura 37: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de anserina...55
Figura 38: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de creatina em novilhos de S. Miguel, raça vs músculo...57
Figura 39: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de carnosina em novilhos de S. Miguel, raça vs músculo...57
Figura 40: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de anserina em novilhos de S. Miguel, raça vs músculo...57
Figura 41: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de creatina em novilhos de S. Miguel, peso vs músculo...58
Figura 42: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de carnosina em novilhos de S. Miguel, peso vs músculo...58
Figura 43: Concentrações médias (mg/100g) dos teores de anserina em novilhos de S. Miguel, peso vs músculo...59
Lista de tabelas
Tabela 1: Concentrações e quantidades adicionadas de padrões para o cálculo da Taxa de Recuperação.
Tabela 2: Limites analíticos em mg/100g para as coenzimas Q e péptidos bioativos. Tabela 3: Taxas de recuperação em % para cada antioxidante.
Tabela 4: Teores médios das coenzimas Q9 e Q10 (mg/100g) obtidos para as amostras de
carne de novilho dos Açores.
Tabela 5: Significância dos efeitos dos vários fatores para as coenzimas Q, consideradas no modelo de análise de variância.
Tabela 6: Significância dos efeitos individuais e das interações dos fator peso, raça e tipo de músculo, consideradas no modelo da ANOVA, para novilhos de S. Miguel.
Tabela 7: Teores médios ( erro padrão) de creatina, carnosina e anserina (mg/100g) obtidos para as amostras de carne de novilho dos Açores.
Tabela 8: Significância dos efeitos dos vários fatores, para os péptidos bioativos, considerados no modelo de análise de variância.
Tabela 9: Significância dos efeitos dos vários fatores, para os péptidos bioativos em novilhos provenientes de S. Miguel, considerados no modelo de análise de variância.
Lista de abreviaturas
Ld - Longissimus dorsi Bf – Biceps femoris CoQ –Coenzimas Q
SAL – Superfície Agrícola Útil
IGP – Indicação Geográfica Protegida CLA – Ácido Linoleico Conjugado DMb – Desoximioglobina
OMb – Oximioglobina MMB – Metamioglobina
PUFA – Ácidos Gordos Polinsaturados ROS – Espécies Reativas de Oxigénio
INIAV – Instituto Nacional de Investigação Agraria e Veterinária HPLC – Cromatografia Liquida de Alta Eficiência
LD – Limite de Deteção LQ – Limite de Quantificação TR – Taxa de Recuperação SP – Solar de Produção
I. Introdução
As sociedades modernas são dinâmicas, adaptam-se às diferentes realidades objetivas e subjetivas. A alimentação não foge à regra. Desde os primórdios que as dietas evoluem consoante vários fatores, de natureza social, económica, científica, religiosa e ambiental. A indústria alimentar também tem acompanhado essa evolução dinâmica, procurando produtos e formulações mais inovadoras para satisfazer as exigências dos consumidores e a constante mudança dos mercados (FAO, 2015).
Com o aumento da incidência de doenças crónicas (cancro e doenças cardiovasculares) a procura por alimentos com propriedades funcionais que possam contribuir para a diminuição do risco do seu aparecimento é cada vez maior. Vários estudos têm sido feitos em busca de alimentos com propriedades funcionais. Nesse sentido, a carne tem desempenhando um papel fundamental na dieta humana, fornecendo vários nutrientes, proteínas de elevado valor biológico, ferro, zinco e selénio (Pereira et al., 2013; Descalzo & Sancho, 2008). A razão pela qual a carne é considerada uma fonte essencial em determinados micronutrientes, deve-se ao fato de apenas esta ter uma grande biodiversidade nestes compostos. Existem dois importantes micronutrientes que só podem ser encontrados na carne: vitamina A e vitamina B12, ambas não podem ser compensadas pela ingestão de vegetais ou derivados (Biesalski, 2005). Para além das suas propriedades nutricionais, a carne tem vindo a ser considerada um alimento contendo compostos bioativos, tais como os dipéptidos, carnosina e anserina, a creatina e as coenzima Q10 (ubiquinona), todos eles com propriedades antioxidantes (Descalzo & Sancho, 2008).
As propriedades antioxidantes da carne têm sido estudadas não só pelos benefícios para a saúde humana mas também pelo papel que desempenham na qualidade da carne, mantendo as características sensoriais, proporcionando um maior tempo de vida útil e atuando contra as principais causas de deterioração: a oxidação lipídica e proteica. Estas propriedades são influenciadas por vários fatores, entre eles: a raça, a idade, o peso, o tipo de músculo e sobretudo a dieta a que os animais são sujeitos. Vários estudos feitos anteriormente demonstram que as pastagens têm grande influência na concentração de compostos antioxidantes no músculo. Os animais criados em pastagens naturais apresentam valores mais elevados de compostos antioxidantes do que animais criados de modo intensivo e à base de ração.
O presente estudo foi delineado com o objetivo de efetuar uma caracterização funcional da carne de novilhos produzidos na Região Autónoma dos Açores. Para tal, efetuou-se a análise de uma gama alargada de compostos bioativos naturais com atividade antioxidante, nomeadamente a creatina, carnosina, anserina e as coenzimas Q9 e Q10 (ubiquinona). Foi
também objeto deste estudo, a avaliação da influência de vários fatores no teor destes compostos, tais como a raça, o sexo, a idade e o peso do animal, o tipo de músculo (Longissimus dorsi e Bíceps femoris) e o solar de produção (Pico, Faial, São Jorge e Terceira).
II. Revisão Bibliográfica
1. Breve caraterização do sector da Carne
1.1.Europa
A carne representa uma parte importante da dieta alimentar europeia, sendo uma fonte de proteínas de elevado valor biológico, ajustada às exigências dos consumidores europeus, para além de, através do seu teor de gordura, constituir uma fonte de energia.
O sector da carne é um dos mais importantes da agricultura da União Europeia. Os quatro principais tipos de carne (carne de bovino, de suíno, de aves de capoeira e de caprino e ovino) representam cerca de um quarto do valor total da produção agrícola (Comissão Europeia – Direção Geral da Agricultura).
Progressivamente, os mercados das carnes estão a regressar à normalidade, após alguns problemas nos últimos anos devido a crises sanitárias. No que respeita à carne de bovino, o consumo comunitário é superior à oferta interna, com um Grau de Autoaprovisionamento de cerca de 97,9% (2004), o que representou uma redução de 4,1% face ao ano anterior (MADRP, 2007).
1.2.Portugal
Desde que Portugal aderiu à União Europeia a carne tem vindo a ocupar um papel fundamental no quotidiano dos portugueses, aumentando de forma considerável o seu consumo. Com o aumento do consumo de carne, também a sua produção aumentou. No entanto, a produção de carne em Portugal não faz face às necessidades exigidas, o que se traduz num aumento da importação destes produtos (PDRC 2014-2020 – Diagnóstico, GPP).
Em 2014, a produção total de carne teve um ligeiro aumento, obtendo valores aproximados de 83 mil toneladas/ano (82 mil toneladas/ano em 2013), (INE, 2014). Em contra partida, a produção de carne de bovino tem vindo a diminuir nos últimos três anos, tendo obtido o valor de 79 843 mil toneladas no ano 2014 o que reflete uma descida de 5% em relação ao ano anterior, figura 1. Os aspetos menos positivos a que a carne de bovino tem sido associada, nomeadamente a relação entre o consumo exagerado deste tipo de carne e a ocorrência de cancro do colón e de doenças cardiovasculares, tem sido um dos principais fatores que contribui para a redução deste consumo.
Object 3
Figura 1: Produção anual de carne de bovino, Estatísticas Agrícolas 2014 (INE).
Nos últimos anos, o consumo de carne per capita em Portugal tem vindo a aumentar. Entre os anos 2012 e 2014, de acordo com o Instituto Nacional de Estatística, o consumo total de carne passou de 105,9 kg/hab para os 108,1 kg/hab. Este aumento deve-se essencialmente ao consumo de carnes de aves que representam atualmente 35% do consumo total de carne. A carne de suíno, tal como em anos anteriores, continua a ser o tipo de carne mais consumida, tendo um valor anual de 43,9 kg/hab, representando assim 41% do total de carne consumida. A carne de bovino, surge em terceiro lugar, representando assim 16% do total de carne consumida em 2014, (INE, 2014) (Figura 2).
Object 5
Figura 2: Consumo de carne per capita (kg/hab) por tipo de carne no ano de 2014, INE 2014
Em relação ao consumo de carne de bovino, este não tem sofrido alterações significativas nos últimos dez anos, figura 3. O consumo deste tipo de carne, no final do ano de 1999, sofreu uma quebra quer no consumo, quer na oferta devido à encefalopatia espongiforme bovina (BSE), mas atualmente o seu consumo mantém-se estável, (MADRP, 2007).
Figura 3: Consumo humano de carne per capita (kg), entre 2004 e 2014 (INE, 2014).
2. Arquipélago dos Açores
O arquipélago dos Açores, situado no oceano atlântico, possui as condições edafo-climáticas essenciais para a produção de pastagens que permitem a alimentação de bovinos em meio natural durante todo o ano. Esta região é composta por nove ilhas tendo uma área total de 2 332 km2, onde o clima é ameno, com fracas oscilações térmicas ao longo do ano
(18°C), húmido e com elevada precipitação. A paisagem de verde matizado reflete a ocupação do solo, uma vez que 94% da superfície agrícola útil (SAU) são pastagens, prados e forragens (FAA, 2014). Deste modo, o arquipélago dos Açores é um local único e com todas as condições para uma produção de carne de qualidade extrema.
A produção de carne de bovino nos Açores remonta à época do povoamento destas ilhas, em meados do século XV. Desde essa altura, a qualidade organolética, o aroma e o sabor da carne produzida são evidenciados por vários historiadores. Desta forma, foi importante proteger e expandir esta tipologia de produção. No ano 2000, foi reconhecida a Indicação Geográfica pela Proteção pela Comissão Europeia, fazendo assim da carne dos Açores um produto com Indicação Geográfica Protegida (IGP) (FAA, 2014).
Entende-se por Indicação Geográfica Protegida os produtos agrícolas ou géneros alimentícios que têm origem numa determinada região e que possuem características que são atribuídas a essa origem geográfica e cuja produção ou transformação ocorreram nessa mesma área (FAA, 2014).
3. Sistema de produção IGP
Designa-se por Carne dos Açores IGP a “obtida de bovinos nascidos, criados e abatidos na Região Autónoma de Açores (Ilha de Santa Maria, São Miguel, Terceira, São Jorge, Pico, Faial, Graciosa, Flores e Corvo), com características da carne segundo a classe etária e os moldes tradicionais de produção”. Atualmente, não existem indicações quanto ao uso de raças e cruzamentos, sendo as mais utilizadas no sistema de vaca aleitante em cobrição natural as raças Charolesa, a Limousine e a Simmental Fleckvieh (FAA, 2014).
O modo de produção desta carne certificada assenta no recurso a pastagens naturais, num sistema de vaca aleitante, sendo as crias amamentadas pelos menos até aos 3 meses de idade. Após esta idade e até ao abate, a alimentação passa a ser constituída com erva das pastagens naturais ou melhoradas, sendo esta complementada com silagens e fenos (FAA, 2014; Caderno de especificações). Os produtos mais usuais para suplementar a alimentação são, nomeadamente, cereais (trigo, aveia, cevada e milho), proteaginosas (tremocilha e tremoço doce), bagaços de oleaginosas (soja e girassol), luzerna desidratada, polpa de citrino, polpa e folhagens de beterraba, rama de amendoim e destilados de milho (Caderno de especificações).
Neste modo de produção (IGP) não é permitida a estabulação, pelo que os animais são suplementados com baixos teores de cereais e têm acesso permanente às pastagens. Desta forma, este sistema de produção permite conferir elevados padrões de qualidade e bem-estar animal proporcionando um equilíbrio ambiental (FAA, 2014).
Os animas produzidos à base de forragens proporcionam uma carne com um valor nutricional superior e sabor distinto, quando comparado com um animal alimentado com um regime à base de cereais e alimento composto. Este valor é conseguido devido ao baixo teor de gordura, a elevadas concentrações de ácidos gordos benéficos à saúde humana (ómega-3) e à maior proporção de antioxidantes presentes na carne (FAA, 2014).
4. Qualidade da carne
O conceito “qualidade” por vezes é muito subjetivo. Para o consumidor em geral, a qualidade sensorial dos alimentos é a mais importante, sendo o fator que mais influencia a escolha no momento da compra. Assim sendo, a qualidade da carne é geralmente definida pela composição em gordura e pelos parâmetros sensoriais, tais como a cor, o cheiro, a suculência, a tenrura e o flavour (FAO, 2016).
4.1.Caraterísticas sensoriais
4.1.1. Cor
A cor é uma das principais caraterísticas sensoriais da carne no que diz respeito à sua aceitação por parte dos consumidores. É frequente os consumidores associarem esta caraterística como um indicador de frescura e salubridade (Mancini & Hunt, 2005).
A mioglobina é a principal proteína responsável pela cor da carne embora outras proteínas, como a hemoglobina e o citocromo C possam também contribuir. A mioglobina é uma proteína solúvel em água, contendo 8 α-hélices (A-H) ligadas por curtas regiões não
helicoidais. Representa cerca de 90%-95% do pigmento muscular, sendo a sua concentração influenciada pelos fatores raça, idade, composição nutricional e nível de exercício do animal (Mancini & Hunt, 2005; Youling et al, 1999).
De todos os resíduos da mioglobina, a histidina é o que requer mais atenção, pois desempenha um papel fundamental na estrutura e função da mioglobina. Existem três formas químicas da mioglobina que têm influência na cor da carne, são elas a desoximioglobina (DMb), a oximioglobina (OMb) e a metamioglobina (MMb) (Mancini & Hunt, 2005). As reações entre estas três formas de mioglobina são reversíveis e estão em equilíbrio dinâmico, havendo conversão constante entre estas formas como descreve a figura 4.
Figura 4: Interconversões redox da Mioglobina visíveis na superfície da carne.
Reação 1: Oxigenação
A mioglobina na forma reduzida, desoximioglobina, ocorre quando não há presença de oxigénio. Isto resulta numa coloração vermelho-púrpura ou rosa-púrpura típica da embalagem a vácuo ou logo após o corte do músculo. Para manter a mioglobina no estado de desoximioglobina é necessário que exista baixa concentração de oxigénio (<1,4 mmHg) (Mancini & Hunt, 2005).
A oxigenação ocorre quando a mioglobina é exposta ao oxigénio dando origem à formação da oximioglobina (MbO2) (fig.5). Esta reação é caraterizada pelo aparecimento de
uma coloração vermelho-cereja brilhante. Com o aumento de oxigênio, a oximioglobina penetra mais abaixo da superfície da carne. A profundidade de penetração do oxigénio e a espessura da camada de oximioglobina vai depender da temperatura da carne, da pressão parcial do oxigénio, do pH, e da competição por oxigénio por outros processos respiratórios (Mancini & Hunt, 2005).
Figura 5: Reação de oxigenação da Mioglobina
Reação 2: Oxidação
A descoloração da carne é, muitas das vezes, apenas referida como a quantidade de área da superfície que está coberta pela metamioglobina. Contudo, as formas subsuperficiais da mioglobina também desempenham um papel importante na aparência da carne. Este fato acontece porque a camada de metamioglobina que se localiza entre a oximioglobina superficial e a desoximioglobina interior, torna-se gradualmente mais espessa, deslocando-se para a superfície. A formação da metamioglobina depende de varridíssimos fatores, tais como a pressão parcial de oxigénio, a temperatura, o pH, a atividade b redutora da carne e o crescimento microbiano (Mancini & Hunt, 2005).
Reação 3: Oxidação e Redução
A redução da metamioglobina é fundamental para a estabilidade da cor da carne e depende das enzimas que eliminam o oxigénio do músculo.
Como se pode ver pelo diagrama da figura 4, a redução da oximioglobina na superfície da carne fresca é uma reação que se dá nos dois sentidos. Contudo, a oximioglobina não é convertida diretamente em desoximioglobina. Em primeiro lugar, deve existir baixas pressões de oxigénio, isto é, tem que haver consumo de oxigénio para que a oxidação de oxi para metamioglobina aconteça. De uma forma geral, a formação subsequente da desoximioglobina é uma questão que levanta vários problemas, uma vez que esta vai depender da capacidade redutora do músculo (Mancini & Hunt, 2005).
4.1.1.1. Fatores com influência na cor da carne
A cor da carne pode ser influenciada por inúmeros fatores. A espécie, a idade, a dieta, o tipo metabólico do músculo, o teor de mioglobina do músculo e o seu estado químico, a pressão parcial de oxigénio são fatores que influenciam a cor da carne fresca. Vários estudos têm mostrado que a dieta, o teor de glicogénio do músculo, a taxa de arrefecimento e a presença de antioxidantes são fatores com influência na cor da (Mancini & Hunt, 2005).
De acordo com Vestergaard, Oksberg and Henckel (2000), dietas à base de forragens promovem o metabolismo oxidativo, ao contrário do metabolismo muscular anaeróbio e do armazenamento de glicogénio. Consequentemente, animais alimentados à base de forragens possuem menos glicogénio, apresentam um pH muscular mais elevado e uma cor muscular mais escura do que os animais alimentados à base de concentrados.
Por outro lado, Lynch (2002), refere que o regime de alimentação, o tipo de pastagem e também os alimentos compostos para animais são fatores com influência na variabilidade da cor da carne de novilhos. Em geral, novilhos de pastoreio apresentam maior estabilidade na cor do músculo longissimus do que novilhos alimentados com silagens e concentrados. Os autores atribuíram esta variabilidade na cor à relação entre a oxidação lipídica e o pigmento, particularmente à estabilidade dos ácidos gordos polinsaturados. Também a alimentação do animal suplementada com antioxidantes naturais tem revelado ter influencia na estabilidade da cor da carne. A presença de antioxidantes no músculo previne a sua oxidação, retardando a conversão da mioglobina em metamioglobina contribuindo para a melhoria da cor.
4.1.2. Flavour
O sabor e o aroma da carne estão interligados para criar a sensação que o consumidor tem durante a mastigação. Este atributo é extremamente complexo e os componentes da carne por ele responsáveis não estão, ainda, completamente identificados. Inúmeros compostos têm sido identificados como responsáveis pelo sabor e aroma da carne. Os produtos de degradação do ATP, produzidos durante a maturação da carne, tais como a inosina monofosfato e a hipoxantina e a quantidade de gordura intramuscular (marmoriado) contribuem para a implementação do sabor e aroma da carne. A espécie, a dieta do animal, os métodos de confeção e conservação da carne são fatores que influenciam este parâmetro de qualidade (FAO, 2016).
4.1.3. Suculência
A sensação de maior ou menor suculência da carne está diretamente relacionada com a maior ou menor libertação de liquido do músculo na fase inicial da mastigação e com o maior ou menor fluxo salivar produzido. Uma vez que o fluxo salivar é estimulado pela presença de gordura, a suculência depende, não só da capacidade de retenção de água, como também da quantidade de gordura intra e intermuscular presente na carne e sua composição em ácidos gordos.
4.1.4. Tenrura
A sensação de tenrura está relacionada, essencialmente, com aspetos relacionados com a mecânica da mastigação, nomeadamente com a facilidade de quebra em fragmentos (força de corte) e com a quantidade de resíduo que permanece na boca. A tenrura da carne resulta da influência de dois componentes estruturais existentes no músculo, nomeadamente os componentes miofibrilhares e o tecido conjuntivo. Alterações na estrutura destes componentes durante a vida do animal ou post-mortem, originam variações
significativas nesta característica, fundamental para a aceitabilidade do produto final. A idade e o sexo do animal, o tipo de músculo e o método de arrefecimento das carcaças são fatores com influencia na variabilidade deste atributo. A adoção de regimes de arrefecimento rápidos e precoces com o intuito de alcançar temperaturas internas que permita a desmancha e comercialização das carcaças o mais rapidamente possível e diminuir as perdas por exsudação, pode afetar negativamente a tenrura da carne obtida, pela ocorrência do fenómeno da contração pelo frio (cold-shortening).
O processo de maturação da carne constitui uma tecnologia que deve ser utilizada para melhorar não só das características organoléticas e sensoriais da carne, como também aumentar a sua ternura, levando a numa maior aceitação por parte dos consumidores.
4.2.Caraterísticas nutricionais
De acordo com a legislação Europeia, o termo carne refere-se às partes edíveis retiradas da carcaça de animais, incluindo bovinos, suínos, ovinos e caprinos, bem como solípedes domésticos; aves; lagomorfos; animais de caça e selvagens (Pereira & Ana, 2013). A carne desempenha um papel fundamental na dieta humana, essencial para um bom crescimento e desenvolvimento (Higgs, 2000).
Proteínas
É considerada uma importante fonte de proteínas com alto valor biológico, sendo altamente digerível, cerca de 94% em comparação com a digestibilidade de 78% em feijão e 86% em trigo. O músculo contém cerca de 20-25% de proteína, fornecendo os aminoácidos essenciais como a lisina, a treonina, a metionina, a fenilalanina, o triptofano, a leucina, a isoleucina e a valina (Williams, 2007).
Vitaminas e minerais
A carne vermelha é também uma excelente fonte em vitaminas e minerais. A sua ingestão contribuí com cerca de 25% da dose diária recomendada em riboflavina, vitaminas B3, B6 e B5 por 100g de carne e dois terços da dose diária recomendada da vitamina B12 na mesma porção de alimento (Williams, 2007).
A carne de bovino é efetivamente uma das melhores fontes de selénio. Este é considerado um dos componentes com maior potencial antioxidante, atuando contra doenças coronárias e na prevenção de doenças cancerígenas. As carnes vermelhas conseguem proporcionar entre 20-25% da dose recomendada por 100g de alimento (Williams, 2007; Higgs, 2000).
O ferro é outro dos nutrientes essenciais ao desenvolvimento humano que está presente na carne em quantidades entre 50-60% sob a forma hemica. A sua ingestão deficitária é a causa mais comum de anemia, em todo o mundo. As carnes vermelhas contribuem com cerca de 14% do total de ferro ingerido diariamente (Higgs, 2000).
A absorção de zinco a partir de uma dieta rica em proteína animal é maior do que em alimentos de origem vegetal, sendo a carne uma das principais fontes deste componente (Williams, 2007). Aproximadamente 20-40% do zinco é absorvido a partir do consumo de carne (Higgs, 2000).
Teor lipídico
O teor em gordura na carne depende muito do tipo de músculo, da idade do animal e especialmente da alimentação a que este é sujeito. Contrariamente ao que tem sido referido ao longo dos anos, a carne não é apenas constituída por gorduras saturadas. Atualmente, o teor de gordura da carne vermelha é mais baixo do que no passado o que faz com que a percentagem de ácidos gordos seja significativamente diferente (Higgs, 2000). A maior parte da gordura saturada presente na carne vermelha são os ácidos palmítico e esteárico, sendo este último neutro no que respeita à afectação do colesterol. O ácido mirístico é dos ácidos gordos saturados que mais contribui para o teor de colesterol, mas está presente na carne em quantidades muito pequenas. Ao longo dos anos a gordura saturada presente na carne tem vindo a diminuir, estimando-se que apenas contribuí com 2g de gordura saturada na dieta humana (Higgs, 2000).
Cerca de 40% da gordura presente na carne está na forma de ácido oleico, o principal ácido monoinsaturado deste alimento (Higgs, 2000). Os ácidos gordos polinsaturados (PUFA) representam cerca de 11-29% do total de ácidos gordos, especialmente os Omega-3 e os Omega-6. Os animais cuja alimentação é feita à base de pastoreio possuem mais ácidos gordos Omega-3 do que animais alimentados à base de grão e concentrado (Williams, 2007). O ácido linoleico conjugado (CLA) é uma mistura de isómeros do ácido linoleico cujo teor total na carne pode variar de 0,17 a 1,35 % de gordura. Esta variação está relacionada com a raça, maneio alimentar e modo de produção. O interesse do CLA na dieta humana tem vindo a crescer ao longo dos anos, devido às sua propriedades anticancerígenas (Higgs, 2000).
4.3.Processos oxidativos na carne
A oxidação é uma das principais causas da deterioração da qualidade da carne. A carne torna-se suscetível à deterioração oxidativa devido à presença de lípidos insaturados, pigmentos hemicos, catalisadores e a inúmeros agentes oxidantes presentes nos tecidos
musculares. Esta deterioração manifesta-se pela descoloração da carne, desenvolvimento de flavour indesejável, formação de compostos tóxicos, diminuição do tempo de vida útil do alimento ou por perdas de nutrientes naturalmente presentes (Folowo & Peter, 2014).
Apenas uma pequena parte do oxigénio consumido durante as reações metabólicas é convertido em radicais livres, sob a forma de espécies reativas de oxigénio (ROS). Estas espécies, desempenham um papel fundamental nos processos biológicos, interagindo com as proteínas, ácidos gordos e ácidos nucleicos, sendo considerados agentes intermediários nas reações de oxidação-redução.
Quando a produção de ROS não ocorre em excesso, não ultrapassando assim a capacidade da barreira endógena de antioxidantes, existem benefícios tais como, o controlo da expressão de genes, a regulação celular e a defesa contra possíveis agentes patogénicos. Por outro lado, quando a produção de ROS é em excesso e a atividade antioxidante é baixa, há uma maior probabilidade de ocorrerem danos nos componentes celulares, podendo conduzir a uma resposta autoimune nociva e ao stress oxidativo. O stress oxidativo é utilizado para descrever os danos oxidativos que resultam de um balanço crítico entre os radicais livres e a defesa dos antioxidantes (Folowo & Peter, 2014).
A oxidação das frações lipídicas e proteicas tem vindo a ser considerada a maior causa (não microbiana) da deterioração da qualidade da carne durante o processamento. Este facto deve-se à predisposição quer dos lípidos, quer das proteínas para a oxidação, uma vez que ocorre uma rápida perda de antioxidantes endógenos do músculo após o abate do animal. Contudo, a suscetibilidade da carne aos processos oxidativos é também influenciada por outros fatores, sendo eles a raça do animal, o tipo de músculo e a dieta consumida durante a fase de crescimento (Folowo & Peter, 2014).
4.3.1. Oxidação Lipídica
Os lípidos estão distribuídos ao longo do espaço intra e extracelular da carne, como os tiacilglicerois, os fosfolípidos e os esteróis. Como são muito instáveis, sofrem facilmente oxidação, especialmente após o abate e durante o armazenamento. A oxidação lipídica origina odores a ranço, desenvolvimento de off-flavours, diminuição do tempo de prateleira, descoloração, perda de valor nutricional e acumulação de compostos tóxicos prejudiciais à saúde (Chaijan, 2008; Richard set al., 2002).
A oxidação lípica é uma reação em cadeia com três fases, a fase de iniciação, de propagação e de terminação com a produção de radicais livres. A reação de iniciação produz o radical alquilo que reage com o oxigénio formando os radicais peróxido na reação de propagação. Os radicais peróxido reagem com os ácidos gordos insaturados e formam
os hidroperoxidos, que promovem a oxidação da mioglobina resultando na deterioração da cor e formação de odores indesejáveis na carne fresca. (Chaijan, 2008; Descalzo et al., 2005).
A interação entre os radicais alquilo e peroxido levam à formação de produtos não radicais tais como aldeídos, alcanos e dienos conjugados (Wasowicz et al., 2004). A formação dos aldeídos está diretamente relacionada com a deterioração da cor da carne, com a estabilidade e funcionalidade proteica e com o desenvolvimento do odores indesejáveis. A existência destes compostos na carne tem sido também associada ao aparecimento de problemas graves na saúde, como o desenvolvimento de cancro e o aparecimento de doenças como a aterosclerose (Andrew, 2014). A taxa e a extensão das reações de oxidação lipídica são influenciadas por uma vasto conjunto de fatores, sendo eles o teor em ferro, a distribuição dos ácidos gordos insaturados, o pH da carne e os níveis de antioxidantes (Wasowicz et al., 2004).
4.3.2. Oxidação Proteica
De acordo com Shacter, 2000, a oxidação proteica é descrita como a modificação covalente de uma proteína induzida pelas ROS ou pela reação com os produtos secundários do stress oxidativo. Pode ocorrer através de uma reação em cadeia de radicais livres, como na oxidação lipídica, ou pode advir da interação entre as proteínas, especialmente dos grupos azotados ou de enxofre presentes nos resíduos de aminoácidos reativos, e os hidroperoxidos ou os produtos secundários da oxidação lipídica (aldeídos ou açúcar reduzido) (Folowo & Peter, 2014).
A modificação da proteína muscular é o resultado da desnaturação e da proteólise que induz alterações na qualidade da carne. Estas alterações podem ser a nível da textura, da cor, do aroma, da capacidade de retenção de água e da função biológica. A oxidação proteica induz múltiplas transformações físico-químicas, nutricionais e na composição em aminoácidos, bem como um decréscimo na biodisponibilidade de aminoácidos, na solubilidade e na digestibilidade proteica (Folowo & Peter, 2014).
4.4.Compostos bioativos presentes na carne
Uma das forma mais eficazes de retardar/prevenir a oxidação lipídica e proteica nos alimentos é através da atividade dos antioxidantes. Estes conseguem controlar os substratos de oxidação, os prooxidantes e ainda conseguem inativar os radicais livres (Wasowicz et al, 2004).
O termo antioxidante refere-se a qualquer molécula com a capacidade de estabilizar ou desativar os radicais livres nas células (Kaliora et al, 2006). Uma definição mais ampla de
antioxidante sugere que é “qualquer substância que, em baixas concentrações quando comparada às do substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação deste substrato de maneira eficaz” (Sies, 1993). A defesa antioxidante é constituída por compostos não enzimáticos, onde se incluem os antioxidantes endógenos e compostos enzimáticos como o superóxido dismutase, a catalase e a glutationa peroxidase que reagem com os compostos oxidantes protegendo as células e os tecidos do stress oxidativo (Descalzo & Sancho, 2008; Traber, 1997).
Os antioxidantes atuam em diferentes níveis na proteção do organismo. O primeiro mecanismo de defesa ocorre contra os radicais livres, impedindo a sua formação, particularmente na inibição das reações em cadeia com o ferro e o cobre. O segundo mecanismo de defesa, assenta na restauração das lesões causadas pelos radicais livres. Este processo está relacionado com a eliminação dos danos causados na molécula de ADN e a reconstituição das membranas celulares que ficaram danificadas (Sies, 1993).
Vários estudos têm demonstrado que, o modo de produção dos animais influencia a concentração do antioxidantes endógenos nos tecidos musculares da carne e a composição em ácidos gordos. Animais criados em pastagens têm tendencialmente níveis mais elevados de compostos antioxidantes, possuem teor mais elevado de ácidos gordos polinsaturados (PUFA) e ácido linoleico conjugado (CLA), do que os animais criados em estábulos e à base de ração (Descalzo & Sancho, 2008).
Neste sentido, a carne tem vindo a ser estuda não só pelas suas caraterísticas nutricionais, mas também pelos seus inúmeros compostos bioativos (Williams, 2007). Segundo Lee e Ho, 2002, um componente bioativo é aquele que proporciona benefícios à saúde, inclusive a prevenção e tratamento de determinadas doenças. Exemplos destes compostos são os antioxidantes endógenos como as coenzimas Q (ubiquinonas), a carnosina, a anserina, a cretina e glutationa (Williams, 2007; Purchas et al, 2004).
4.4.1. Coenzimas Q
Estrutura e Distribuição
A coenzima Q (CoQ), também conhecida por ubiquinona (2,3-dimetoxi-5-metil-6-decaprenil-1,4-benzoquinona), é um lípido solúvel presente em todas as células e membranas dos organismos aeróbios (Mattila & Kumpulaine, 2001). A CoQ é constituída por um anel benzoquinona ligado a uma cadeia de 9 (coenzima Q9) ou 10 (coenzima Q10)
unidades de isopreno. A CoQ pode ser encontrada em várias estruturas celulares, incluindo o retículo endoplasmático, lisossomas e sobretudo nas mitocôndrias, onde desempenha um papel importante da cadeia de transporte de eletrões, atuando na sua transferência entre os
complexos I e II para o complexo III (Frederick, 2001; Bentinger et al, 2007; Mattila & Kumpulaine, 2001; Reig et al, 2015; Purchas et al, 2004; Turunen et al, 2004).
As CoQ9 e CoQ10 são substâncias muito hidrofóbicas, podendo por isso ser
encontradas sob a forma de agregados micelares dissolvidos nas bicamadas lipídicas. O grupo funcional na ubiquinona é o anel quinona que pode estar sob a forma oxidada (CoQ -ubiquinona) ou sob a forma reduzida (CoQH2 - ubiquinol) (Figura 5). A percentagem da
forma reduzida nas membranas ronda os 30% a 60%, dependendo do metabolismo celular. Este grupo é mais hidrofílico podendo estar mais próximo da superfície e nas membranas subcelulares. A mudança de posição com a oxidação/redução, pode causar alterações nas propriedades estruturais e enzimáticas das membranas (Frederick, 2001). A forma predominante da CoQ em seres humanos e na maioria dos animais é a CoQ10 (Mattila &
Kumpulaine, 2001; Frederick, 2001). Estudos têm demonstrado que a ubiquinona (especialmente na sua forma reduzida) pode atuar como antioxidante, protegendo as membranas celulares e as lipoproteínas dos danos causados pelos radicais livres (Mattila & Kumpulaine, 2001) e que, quer a CoQ9 quer a CoQ10 são igualmente eficientes como
antioxidantes e estão distribuídos de igual forma nos tecidos e membranas (Bentiger et al, 2007).
Figura 5: Oxidação/Redução da Ubiquinona
(Fonte WWW.GOOGLE.PT/SEARCH?Q=2,3-DIMETOXI-5-METIL-6-DECAPRENIL-1,4-BENZOQUINONA)
Função antioxidante
Sendo a CoQ um componente endógeno das células e tendo capacidade antioxidante, faz com que seja um excelente protetor das lipoproteínas conta os estados oxidativos, não só na membrana da mitocôndria mas em toda a célula. Da mesma forma, é um ótimo regenerador de outros antioxidantes, nomeadamente da vitamina E (Reig et al, 2015).
Segundo Bentiger et al, 2007, ao longo dos anos tem sido demonstrado que a coenzima Q, na forma reduzida (ubiquinol), é um antioxidante bastante efetivo e inibidor da peroxidação lipídica. A sua eficácia como inibidor da peroxidação lipídica é baseada no complexo de interação no processo de peroxidação. A primeira ação é o mecanismo de prevenção da CoQH2 contra a formação de lípidos radicais peroxil (LOO) durante a fase de
iniciação. Isto acontece porque a CoQH2 reduz o iniciador radical perferril (FeO2-)com a
formação da ubisemiquinona e H2O2 (Bentinger et al, 2007; Turunen, 2004).
A coenzima Q na forma reduzida, atua na prevenção da peroxidação lipidica, mas não só, atua também contra a oxidação proteica, pela inibição da iniciação do radical perferril e pela capacidade antioxidante que quebra a cadeia, impedindo assim a propagação (Bentinger et al, 2007).
Papel na saúde
Vários estudos têm apontado para os benefícios da CoQ na saúde. Este antioxidante endógeno tem vindo a ser descrito como um potencial agente contra diversas doenças e patologias, causadas pelo stress oxidativo. A baixa concentração de CoQ nos tecidos acontece por razões de ordem genética, causadas pela idade ou por doenças. Várias doenças têm sido reportadas, pela baixa concentração deste antioxidante no organismo, entre outras, doença de Parkinson, Alzhemer, Diabetes, Aterosclerose e doenças Cardiovasculares (Bentinget et al, 2007; Turunen, 2004). Sabe-se atualmente que, o aumento da produção de radicais livres durante o desenvolvimento destas doenças é uma caraterística importante. Nesse sentido, a resposta do organismo é tentar neutralizar essa produção excessiva, através dos antioxidantes endógenos.
Por exemplo, segundo Kaliora et al, 2007, no caso de doentes com diabetes, em que a regulação dos níveis de glucose e insulina no sangue podem desenvolver doenças cardiovasculares, a ingestão de CoQ10 tem demonstrado uma diminuição do stress oxidativo nas células e, consequentemente, uma melhoria na sensibilidade e regulação da insulina.
Contudo, quando o organismo é exposto a fatores como o álcool, medicação, infeções, dieta pobre, toxinas, radiações ou outros stress, os antioxidantes endógenos não conseguem proporcionar uma defesa adequada contra o stress oxidativo. Uma das formas de combater as baixas concentrações destes antioxidantes é através da alimentação (Kaliora et al, 2006). As coenzimas Q9 e Q10 estão presentes numa ampla gama de
alimentos, tais como por exemplo, nos rebentos de soja, amêndoas, nozes, amendoins, avelãs, vegetais verdes (espinafres, brócolos), carnes (bovino, suíno, frango), ovos e alguns peixes gordos (salmão, cavala, sardinha). As doses de CoQ9 e CoQ , que se consegue
obter através da ingestão destes alimentos são apenas cerca 25%, dos quais aproximadamente 2-3 mg/dia, são fornecidas pela carne, peixe com elevado teor de gordura, nozes e certos óleos. Cerca de 1mg/dia é fornecido por frutas, legumes, lacticínios, ovos e cereais. No entanto, a ingestão de cerca de 2-5 mg/dia não é suficiente para suprimir as necessidades do organismo, isto porque, apenas 10% é absorvida lentamente do trato gastrointestinal devido ao seu elevado peso molecular e à sua baixa solubilidade em água.
4.4.2. Péptidos bioativos
Para além das ubiquinonas, também a anserina, a carnosina e a creatina são considerados compostos bioativos, que podem ser encontrados na carne fresca, em diferentes proporções. A carnosina e a creatina têm sido consideradas como componentes nutraceuticos, e como existem naturalmente no músculo da carne e na maioria dos tecidos, este alimento tem vindo a ser referido como uma excelente fonte de compostos bioativos (Liu, 2011).
Carnosina e Anserina
A carnosina (N-β-alanina-L-histidina) é um dipéptidos que pode ser encontrado no músculo esquelético e em outros tecidos de mamíferos. Desempenha o papel de tampão de pH, possuí propriedades antioxidantes e reduz certas reações proteolíticas, associadas ao envelhecimento celular (Liu, 2011; Purchas et al, 2004).
A anserina (β-alanil-N-metilhistidina) é um N-metilado análogo à carnosina que pode ser encontrado principalmente em peixes e aves. A anserina possuí propriedades semelhantes às da carnosina, contudo é principalmente encontrada em espécies não mamíferas (Liu, 2011). Na figura 6, encontrem-se as estruturas da carnosina e da anserina.
Figura 6: Estrutura química da Carnosina e Anserina. Fonte: Liu, 2011
A carnosina tem uma via de síntese bastante simples, esta é sintetizada pela carnosina sintase a partir dos seus aminoácidos constituintes (β-alanina e histidina). A L-histidina é um aminoácido essencial, e por isso, apenas pode ser obtido através da
alimentação, enquanto que no caso da alanina isso não se verifica. Em alguns casos, a β-alanina é usada como suplemento para aumentar a concentração de carnosina no músculo (Liu, 2011). A hidrólise da carnosina é catalisada pela carnosinase. Em humanos foram encontradas duas formas: carnosinase no soro e carnosinase no tecido. Devido à existência da carnosinase no soro humano, a concentração e carnosina no sangue é bastante baixa (Liu, 2011). De acordo com Negai (2003), a contração muscular e atividade física influenciam todos os aspetos do metabolismo de síntese da carnosina.
A carnosina tem sido principalmente considerada como um antioxidante, um sequestrante não enzimático de radicais livres e uma molécula com função de tampão (Guiotto et al., 2005). Estudos recentes mostraram que a carnosina funciona como um anti-glicação de proteínas e compostos de baixo peso molecular que possuem grupos carbonilo, tais como aldeídos e cetonas (Hipkiss et al., 1994, 1995, 1998), prevenindo/mitigando a formação de malondialdeído altamente tóxico.
Tem sido referido que a carnosina reage com aldeídos de baixo peso molecular (produtos finais de glicação avançada - AGEs) e com os aldeídos formados a partir de ácidos gordos insaturados durante o stress oxidativo (4-hidroxinonenal, trans-2-hexenal), formados por ação das espécies reativas ao oxigénio e, assim, proteger estruturas celulares (ADN, proteínas, membranas) de tais moléculas. A capacidade de carnosina para inverter a agregação covalente da proteína induzida por glicação ou produtos de peroxidação de lípidos (como o malondialdeído) é de interesse terapêutico relevante para combater patologias relacionadas com a idade tais como a aterosclerose, doenças neurodegenerativas, catarata e diabetes (Liu, 2011).
Os processos oxidativos e a consequente degradação de lipídios e proteínas são mecanismos primários de deterioração da qualidade da carne, originado a perda de propriedades como o sabor, a cor e valor nutritivo e que limitam a vida de prateleira. A oxidação lipídica em carne e seus derivados podem ser controlados / mitigados através da adição de antioxidantes de preferência de origem natural, pelo facto dos consumidores apresentarem cada vez mais preocupações relacionadas com a segurança toxicológica dos compostos (antioxidantes) sintéticos (Liu et al, 2010;. Mitsumoto et al., 2005; Yen et ai, 2002). Assim, a carne ou produtos cárneos que contenham mais antioxidantes naturais são preferidos do ponto de vista do consumidor. Entre os vários compostos antioxidantes da carne, a carnosina é visto como um promissor, a partir da sua capacidade de quelar metais e de eliminar os radicais livres (Lee et al., 1998), bem como para interferir na etapa de iniciação da oxidação, diminuir a quantidade de peróxidos pré-formados e reagir com produtos secundários (Kansci et al., 1997). Estudos recentes tem evidenciado o efeito da
1991) e de bovino (Shantha et al, 1995). A carnosina também mostrou exercer significativa eficácia na manutenção da cor vermelha em carne picada irradiada e em rissóis crus durante o seu armazenamento (Badr, 2007).
Creatina
A creatina é um ácido orgânico azotado que existe naturalmente nos animais vertebrados, desempenhando funções essenciais no metabolismo energético celular. É lentamente convertida, de forma não enzimática, em creatinina pela remoção de água e a formação de uma estrutura em anel. A creatinina passa pelo sangue e é excretada através da urina (Purchas et al, 2004).
Mais de 90% da creatina está distribuída pelo tecido muscular. Nos humanos, a creatina é absorvida pelo intestino delgado, através da ingestão de alimentos, tais como carne fresca, peixe e produtos láteos. A carne é uma ótima fonte deste composto, comparando com outros alimentos (Liu, 2011).
Atualmente, não estão bem esclarecidas as propriedades antioxidantes da creatina. Contudo, Lawer et al (2001) coloca a hipótese da creatina promover funções antioxidantes no organismo.
III. Materiais e Métodos
A realização deste estudo decorreu no laboratório da Secção de Tecnologia de Carnes e Produtos Cárneos do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária (INIAV), tendo como principal objetivo a quantificação de compostos bioativos presentes na carne de novilho dos Açores (coenzimas Q9 e Q10, carnosina, anserina e creatina). Foi ainda avaliada
a influência de vários fatores, tais como a raça e idade do animal, tipo de músculo e solar de produção no teor destes compostos.
1. Identificação da amostra em estudo
Para o estudo em causa, foram usados 45 novilhos IGP criados na Região Autónoma dos Açores, seguindo critérios rigorosos de produção, das raças F1×Limousine e F1×Charolês, com pesos de carcaça compreendidos entre os 121 kg e os 466 kg e idades entre os 9 e os 22 meses, e provenientes de diferentes solares de produção, Pico, Faial, São Jorge e Terceira.
Foram também utilizados, 12 novilhos provenientes de São Miguel (Aberdeen-Angus vs
Holstein-Frisia e Limousine vs Holsteín-Frísia), com peso de carcaça entre os 266 kg e os
350 kg, e idades compreendidas entre os 15 e os 17 meses.
Quarenta e oito horas após o abate dos animais, foram recolhidas, de cada animal, amostras dos músculos Longissimus dorsi (Vazia) e Biceps femoris (Chã-de-fora). Após remoção da gordura e tecido conjuntivo superficial, as amostras foram homogeneizadas, utilizando uma picadora de placa perfurada (3 mm) e embaladas a vácuo em sacos plásticos COEX PA / PE - 20/70 (Plásticos Macar, S. Tirso, Portugal - permeabilidade ao oxigênio: 50 cm3 / m2 / dia / bar a 23 °C e 0% de humidade relativa). As amostras foram armazenadas a -80 °C até serem analisadas.
4.5.Procedimento analítico
Para a realização do estudo dos antioxidantes presentes na carne de bovino do Açores, foram utilizados procedimentos técnicos previamente implementados pelo Laboratório da Tecnologia de Carnes e Produtos Cárneos do INIAV.
4.5.1. Determinação de Coenzima Q9 e Q10 em carne por HPLC
As coenzimas Q9 e Q10 (ubiquinona) foram identificadas e quantificadas por
cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) com base na técnica descrita por Matilla and Kumpulainen (2001).
Reagentes NaCl a 0,15M Etanol, p.a. n-Hexano, p.a. 2-propanol, p.a. Acetonitrilo, para HPLC Tetrahidrofurano (THF), para HPLC Extração
Num tubo de centrifuga, homogeneizaram-se 4 g de amostra com 10 ml de solução NaCl a 0,15M em Polytron PT 3100 (Kinematica AG, Suíça) durante 2 min. Após a homogeneização, adicionaram-se 10 ml de etanol e agitou-se durante 1 min no vortex.
O homogeneizado obtido foi então extraído com 15 ml de n-hexano, agitado durante 1 min em vortex e centrifugado a 3000 rpm durante 5 min (Sorvall Instruments,
Wilmington, Delaware, USA) para separação das fases aquosa e orgânica.
Após centrifugação, a fase superior (n-hexano) foi removida com a ajuda de uma pipeta de Pasteur e guardada para posterior utilização. O resíduo foi de novo extraído com 15 ml de n-hexano, agitado no vortex durante 1 min e centrifugado a 3000 rpm durante 5 min.
Seguidamente, os dois extratos foram combinados e uma toma de 20 ml foi evaporada a 40 °C em evaporador rotativo (Heidolph Laborota 4000) O resíduo foi resuspendido em 3 ml de 2-propanol e filtrado através de membrana Acrodisc PTFE 0,45 µm. Posteriormente, 50 µl do filtrado foi injetado no sistema de HPLC.
Para cada amostra de músculo, os teores de coenzimas Q9 e Q10 foram
determinados em duplicado.
Condições de análise por HPLC
A identificação e quantificação das coenzimas Q9 e Q10 foi efetuada num sistema
HPLC da marca Waters constituído por um módulo de separação Alliance 2695 e um detetor de Photodiode Array (PDA) Waters 996 (Waters, Milford, MA). O software Empower Pro foi utilizado para análise dos cromatogramas obtidos.
A separação das coenzimas foi efetuada numa coluna Atlantis dC18 4.6x150mm, 3m, (Waters, Milford, MA) em fase isocrática e à temperatura ambiente. A fase móvel, constituída por acetonitrilo:tetrahidrofurano:água (55:40:5, v/v/v), foi utilizada à velocidade de fluxo de 1,5 ml min-1. As coenzimas foram detetadas a 275 nm e quantificadas através do
método do padrão externo.
CoQ9
CoQ10
Figura 7:Cromatograma da solução padrão das coenzimas Q.
4.5.2. Determinação de péptidos funcionais em carne por HPLC
Os dipéptidos bioativos (carnosina e anserina) e a creatina foram identificados e quantificados em simultâneo, por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) de acordo com o método descrito por Mora et al. (2007).
Reagentes Ácido clorídrico 37 % (HCL) Acetato de amónio Acetonitrilo Ácido trifluoracético Extração
Cinco gramas de amostra foram homogeneizados em Polytron PT 3100 (Kinematica AG, Suíça) durante 2 min. na presença de 15 mL de HCl (0,01 N). O extrato foi então centrifugado a uma velocidade de 10 000xg durante 20 minutos a 4 ºC (Sorvall Instruments, Wilmington, Delaware, EUA), sendo o sobrenadante sujeito a duas filtrações consecutivas através de filtro Watman nº41, seguida de uma nova filtração com filtro Watman nº42. A 2 ml do filtrado foram adicionados 6 ml de acetonitrilo sendo a mistura mantida em repouso durante 20 minutos a 4°C. Após este período, a mistura foi sujeita a uma nova centrifugação a 10 000xg durante 10 minutos a 4°C sendo o sobrenadante novamente filtrado através de
Para cada amostra de músculo, os teores de creatina, carnosina e anserina foram determinados em duplicado.
Condições de análise por HPLC
A análise cromatográfica dos dipéptidos e creatina foi efetuada num sistema HPLC da marca Waters constituído por um módulo de separação Alliance 2695 e um detetor de UV Waters 2487. Para a separação dos dipéptidos e da creatina utilizou-se uma coluna Atlantis HILIC sílica 4.6x150 mm, 3 μm (Waters, Milford, MA) à temperatura ambiente. A eluição foi efetuada em gradiente linear com uma mistura de acetato de amónio 0.65 mM (pH 5.5) em água/acetonitrilo (25:75) como solvente A e acetato de amónio 4.55 mM (pH 5.5) em água/acetonitrilo (70:30) como solvente B. O gradiente variou de 0 a 100% do solvente B em 13 min a uma velocidade de fluxo de 1,4 mL min-1. A separação foi
monitorizada usando um detetor UV/VIS (Waters 2487 Dual λ Absorbance detetor, Waters, Milford, MA) a 214 nm
Figura 8: Cromatograma da solução padrão dos péptidos bioativos.
5. Validação do método
Um método analítico requer uma garantia de que os seus resultados são fiáveis, e como tal este deve ser sujeito a uma avaliação designada por validação. A validação pode ser definida como a “Avaliação sistemática de um procedimento analítico para demonstrar que está sob as condições nas quais deve ser aplicado” (Ribani, 2004). Os parâmetros analíticos utilizados para esta validação são, normalmente, entre outros, a linearidade, limites de deteção (LD) e quantificação (LQ) e a taxa de recuperação (TR).
5.1.Linearidade
Segundo Ribani (2004), define-se linearidade como “a capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em estudo,
dentro de uma determinada faixa de aplicação”. A linearidade pode ser representada pela seguinte expressão:
y=ax+b
Onde, Y – resposta medida a – declive da reta x – concentração do analítico b – interseção dos eixosA linearidade dos métodos analíticos utlizados foi calculada através de 6 concentrações, em duplicado, para cada um dos diferentes padrões. Com os resultados obtidos, construíram-se as curvas padrão para cada um dos antioxidantes em análise . Estes gráficos são designados por curvas padrão.
5.2.Determinação dos Limites de Deteção (LD) e de Quantificação (LQ)
O limite de deteção (LD) define-se pela menor concentração da substância em analise que pode ser detetada, mas não necessariamente, quantificada (Ribani, 2004). É calculado pela seguinte expressão:
LD=
LQ
3
O limite de quantificação (LQ) representa a menor concentração da substância em análise que pode ser medida, (Ribani, 2004). Neste estudo, o LQ é considerado como a concentração do padrão mais baixa.
5.3.Determinação das Taxas de Recuperação
A Taxa de Recuperação é definida como a relação da quantidade da substância a analisar que é extraída e possível de ser quantificada em função da quantidade presente. Para o cálculo da Taxa de Recuperação utilizou a expressão seguinte:
Taxade recupera çã o (%)=
Camostra 1−Camostra 2
Cadic .
× 100
Onde:
Camostra1 - Amostra com adição de padrão
Camostra2 - Amostra sem adição de padrão
Os intervalos aceitáveis de recuperação, dependendo da complexidade do método analítico e da matriz da amostra, pode ser de 50 a 120%, com desvio padrão relativo até 15%.
Para cada método de análise, o cálculo das taxas de recuperação foi executado em simultâneo para os diferentes compostos. Adicionaram-se os diferentes padrões à amostra, e procedeu-se ao processo de extração e quantificação. As concentrações e quantidades de padrões adicionadas estão representadas na Tabela 1.
Tabela 1: Concentrações e quantidades adicionadas de padrões para o cálculo da Taxa de Recuperação.
Composto Concentração da Solução-Mae(mg/mL) Quantidade adicionada
Coenzima Q9 0,1 1 mL Coenzima Q10 0,1 3 mL Creatina - 20 mg (puro) Carnosina - 30 mg (puro) Anserina - 20 mg (puro) 5.4.Análise estatística
A análise estatística dos resultados obtidos foi efetuada através do software JMP statistical (Version 9.0.1, SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA, 2010). A influência da raça, idade, peso, tipo de músculo e solar de produção nos diferentes antioxidantes analisados foi avaliada através de uma Analise de Variância (two-way ANOVA). Quando os fatores ou as suas interações apresentaram diferenças significativas (P<0,05), as médias foram comparadas pelo teste de Tukey HSD post hoc test. Uma vez que este estudo teve como objetivo a avaliação da influência de uma série de fatores, músculo (M), raça (R), idade (I), peso (P) e solar de produção (SP) nos teores dos vários antioxidantes, e pelo facto do músculo ter revelado, de forma sistemática, influenciar a variação dos resultados obtidos, optou-se por introduzir no modelo estatístico os fatores individuais e as interações entre o músculo e os restantes fatores em estudo (MxR; MxI; MxP; MxSP).
As medições em diferentes músculos do mesmo animal não são observações independentes, por essa razão o tipo de músculo foi tratado como uma medida repetida dentro de cada animal. Para avaliar a influência do fator idade e peso dos animais, as amostras em estudo foram agrupadas em 2 classes de idade e peso. Relativamente à idade estabeleceu-se o limite de 12 meses (animais com idades inferiores e superiores a 12 meses) e para o peso o limite de 300 kg (animais com peso inferior e superior a 300 kg).
