Universidade Federal de Sergipe
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia
de Materiais
Dissertação de Mestrado
Síntese e Caracterização de Hidroxiapatita
Enriquecida com Prata e Zinco para Aplicação em
Engenharia Tecidual Óssea
Ivory Marcos Gomes dos Santos
São Cristóvão
Fevereiro de 2012
IVORY MARCOS GOMES DOS SANTOS
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE HIDROXIAPATITA
ENRIQUECIDA COM PRATA E ZINCO PARA APLICAÇÃO
EM ENGENHARIA TECIDUAL ÓSSEA
Orientador: Prof. Dr. Euler Araujo dos Santos
SÃO CRISTÓVÃO, SE – BRASIL FEVEREIRO DE 2012
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S237s
Santos, Ivory Marcos Gomes dos
Síntese e caracterização de hidroxiapatita enriquecida com prata e zinco para aplicação em engenharia tecidual óssea / Ivory Marcos Gomes dos Santos. – São Cristóvão, 2012.
68 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Engenharia de Materiais) – Núcleo de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais, Universidade Federal de Sergipe, 2012.
Orientador: Prof. Dr. Euler Araújo dos Santos.
1. Engenharia de materiais. 2. Hidroxiapatita - Características. 3. Engenharia biomédica. 4. Troca iônica. I.Título.
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SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE HIDROXIAPATITA ENRIQUECIDA COM PRATA E ZINCO PARA APLICAÇÃO EM ENGENHARIA TECIDUAL ÓSSEA
Ivory Marcos Gomes dos Santos
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E ENGENHARIA DE MATERIAIS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIA E ENGENHARIA DE MATERIAIS.
Aprovada por:
___________________________________________ Prof. Euler Araujo dos Santos, D.Sc. ___________________________________________ Profª. Lidia Ágata de Sena, D.Sc. ___________________________________________ Prof. Luis Eduardo Almeida, D.Sc.
SÃO CRISTÓVÃO, SE – BRASIL FEVEREIRO DE 2012
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Dedico esse trabalho a mim. E a todas as coisas boas que ainda estão por vir.
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AGRADECIMENTOS
À Deus por ter me dado forças e coragem todos os dias da minha vida. À “minha família” pelo apoio e o suporte incondicional oferecido.
Ao Professor Euler Araujo dos Santos pela orientação, responsabilidade e comprometimentos com o nosso trabalho.
Aos Professores Luis Eduardo Almeida e Cristiane Xavier Resende pelas sugestões e discussões para a realização deste trabalho.
Ao Professor Frederico Guilherme de Carvalho Cunha por toda a amizade, humildade e confiança concedida desde a época de graduação.
À Professora Elizabeth de Freitas Andrade por todo apoio, carinho, atenção e incentivo durante grande parte do processo da minha formação acadêmica, principalmente nos momentos em que nem eu acreditava em mim mesmo. Obrigado por tudo!
Aos professores do Núcleo de Pós-Graduação de Ciência e Engenharia de Materiais pela contribuição para a minha formação.
Aos colegas de laboratório, Vilany, Silmara, Amanda, Leila e Gilderman, pelas longas conversas e por todo o apoio concedido. Sem a ajuda de vocês tudo seria bem mais difícil!
Aos meus amigos e colegas que me acompanharam. Em especial, para Genelane, Charlene, Ana Paula, Michelline, Cristiane, Gabriela, Elísio, Anderson, Denilson.
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Ao meu amigo Fabiano Osmir por todo o apoio e acolhimento concedido, principalmente nos momentos de dúvidas, anseios e inquietações que surgiram pelo meio do caminho. Serei eternamente grato por tudo!
Aos técnicos, Carolina Mangieri e Wilson Neri, do Instituto Tecnológico e de Pesquisas do Estado de Sergipe (ITPS), e Adriana, Colchiran e Márcio, do Departamento de Física (DFI) pelo auxilio por todo o auxílio prestado.
Às secretárias, Geocelly, Karine, Thaís e Claúdia por todo o apoio prestado. E ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa concedida.
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Resumo da Dissertação apresentada ao P2CEM/UFS como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciência e Engenharia de Materiais (M.Sc.).
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE HIDROXIAPATITA ENRIQUECIDA COM PRATA E ZINCO PARA APLICAÇÃO EM ENGENHARIA TECIDUAL ÓSSEA
Ivory Marcos Gomes dos Santos Fevereiro/2012
Orientador: Euler Araujo dos Santos
Programa de Pós Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais
O principal objetivo desse trabalho foi estudar a incorporação individual e simultânea dos íons Zn2+ e Ag+ e seus efeitos sobre as características físico-químicas da hidroxiapatita (HA) visando sua aplicação na engenharia tecidual óssea. Análises químicas confirmaram a presença de 0,10% de Zn2+ e 0,13% de Ag+ (em relação à quantidade de Ca2+ presente). A síntese da HA enriquecida com os metais não causou modificações significativas do índice de cristalinidade em relação a HA pura e nem induziu a transformação de fases das amostras, após calcinação. O Zn2+ não afetou de forma significativa os parâmetros de rede em relação àqueles calculados para a HA pura. Já a entrada do Ag+ produziu uma grande contração da célula unitária. Com relação ao alongamento do cristal, foi possível observar que após a calcinação houve uma tendência dos cristais em adquirir formas mais esféricas. A imersão das amostras em solução simuladora do plasma sanguíneo (SBF) proporcionou a entrada de carbonato na HA, provocando ainda uma redução significativa do tamanho dos cristalitos, acompanhada de uma diminuição no alongamento e no índice de cristalinidade em relação aquelas que não entraram em contato com a solução.
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Abstract of the thesis presented as part P2CEM/UFS as part of the requirements for the Degree of Master of Science and Materials Engineering (M.Sc.).
SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF HYDROXYAPATITE ENRICHED WITH SILVER AND ZINC APPLICATION FOR BONE TISSUE ENGINEERING
Ivory Marcos Gomes dos Santos February/2012
Advisor: Euler Araujo dos Santos
Department: Materials Science Engineering
The main objective of this work was to study the individual and simultaneous incorporation of Zn2+ and Ag+ ions and their effects on physical-chemical characteristics of the hydroxyapatite (HA) for their application in bone tissue engineering. The chemical analyses confirmed the presence of 0.10% of Zn2+ and 0.13% of Ag+ (relatively to the quantity of Ca2+ ions). The insertion of the metal ions into HA did not cause significant modifications in the crystallinity index compared to pure HA. In the same way, no phase transformation was verified after insertion. No effect was noticed on the lattice parameters after the insertion of Zn2+ comparatively to those calculated to the pure HA. Conversely, the insertion of Ag+ induced a remarkable contraction of the unit cell volume. The thermal treatment strongly increased the crystallite growth for all samples, and also promoted the change from stretched crystals before calcination to spherical ones after calcination. The immersion of the specimens in the simulated body fluid (SBF) allowed the incorporation of carbonate into the HA structure, causing a significant reduction in the crystallite size, accompanied by a stretched and crystallinity index.
viii SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 1 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 5 2.1. HIDROXIAPATITA ... 6 2.2. MÉTODO DE OBTENÇÃO DA HA ... 10
2.3. INCORPORAÇÃO IÔNICA NA ESTRUTURA DA HA ... 12
2.3.1. Prata ... 13
2.3.2. Zinco ... 14
2.4. EFEITOS BIOLÓGICOS DA PRATA E DO ZINCO ... 16
2.4.1. Prata ... 16 2.4.2. Zinco ... 19 3. OBJETIVO... 22 3.1. OBJETIVO GERAL ... 23 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 23 4. MATERIAS E MÉTODOS ... 24 4.1. SÍNTESE DA HA ... 25 4.1.1. Produção da HA Pura ... 25
4.1.2. Incorporação dos Metais a Estrutura da HA ... 25
4.2. ESTABILIDADE TÉRMICA APÓS SÍNTESE ... 26
4.3. CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS OBTIDAS ... 27
4.3.1. Composição das Amostras ... 27
4.3.2. Estrutura da HA ... 28
4.3.3. Morfologia dos Cristais ... 30
4.4. IMERSÃO EM SOLUÇÃO SIMULADORA DO PLASMA SANGUÍNEO (SBF) ... 30
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4.5. ANÁLISE ESTATISTICA DOS RESULTADOS ... 31
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 33
5.1. INCORPORAÇÃO DOS METAIS A ESTRUTURA DA HA ... 34
5.1.1. Composição... 34
5.1.2. Estrutura dos Cristais ... 38
5.1.3. Morfologia dos Cristais ... 45
5.1.4. Tamanho dos Cristais ... 47
5.2. IMERSÃO EM SOLUÇÃO SIMULADORA DO PLASMA SANGUÍNEO (SBF) ... 48
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 55
7. PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS ... 58
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Exemplos de fosfatos de cálcio, com seu respectivo nome, fórmula química e relação Ca/P (GUASTALDI et al., 2010, DOROZHKIN., 2009 e LEGEROS et al., 2001) ... 7 TABELA 2. Concentração do Zn2+ em tecidos e órgãos do organismo (ITO et al., 2005) ... 20 TABELA 3. Concentração do Zn2+ e Ag+ no tecido ósseo (ppm) (BOANINI et al., 2010) ... 26 TABELA 4. Concentração relativa dos íons Zn2+ e Ag+ (MN+) em comparação aos íons Ca2+ ... 26 TABELA 5. Ordem de adição, ordem e grau de pureza dos reagentes para a preparação de dois litros da solução SBF ... 31 TABELA 6. Proporção de elementos presentes (em mol) nas amostras calcinadas a 1000°C por 2h ... 34 TABELA 7. Parâmetros de rede calculados a partir dos dados do DRX para as amostras antes e depois da calcinação . ... 44
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Representação dos sítios Ca I e Ca II da HA com relação aos grupos fosfatos e hidroxila (Ca: verde; O: vermelho; P: roxo; H: branco). Esquema modificado
de LAURENCIN et al. (2011) ... 9
FIGURA 2. Espectros obtidos por FTIR para as amostras antes da calcinação ... 36
FIGURA 3. Espectros obtidos por FTIR para as amostras depois da calcinação a 1000°C por 2h ... 36
FIGURA 4. Espectros obtidos pela Espectroscopia Raman para as amostras depois da calcinação a 1000°C por 2h ... 37
FIGURA 5. Difratogramas de Raios X obtidos das amostras antes da calcinação ... 39
FIGURA 6. Difratograma de Raios X obtidos das amostras depois da calcinação a 1000°C por 2h ... 40
FIGURA 7. Índice de cristalinidade relativa antes e depois da calcinação ... 42
FIGURA 8. Alongamento dos cristais antes e depois da calcinação... 46
FIGURA 9. Tamanho de cristalito antes e depois da calcinação ... 47
FIGURA 10. Espectros obtidos por FTIR para a amostra de HA calcinada a 1000°C por 2h antes e após a imersão em SBF por 4 dias ... 50
FIGURA 11. Espectros obtidos por FTIR para a amostra de HA-Zn calcinada a 1000°C por 2h antes e após a imersão em SBF por 4 dias ... 50
FIGURA 12. Espectros obtidos por FTIR para a amostra de HA-Ag calcinada a 1000°C por 2h antes e após a imersão em SBF por 4 dias ... 51
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FIGURA 13. Espectros obtidos por FTIR para a amostra de HA-ZnAg calcinada a 1000°C por 2h antes e após a imersão em SBF por 4 dias ... 51 FIGURA 14. Difratograma de Raios X das amostras de HA calcinadas com metais após 4 dias de imersão em SBF ... 52 FIGURA 15. Índice de cristalinidade relativo calculado a partir das amostras após imersão por 4 dias em SBF ... 53 FIGURA 16. Alongamento dos cristais calculado a partir das amostras após imersão por 4 dias em SBF ... 53 FIGURA 17. Tamanhos de cristalito calculados a partir das amostras após imersão por 4 dias em SBF ... 54
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CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
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Diversos tipos de materiais são utilizados na área de saúde, principalmente os biomateriais. Segundo dados da ANVISA (2010), o Brasil possui mais de 300.000 produtos para a área de saúde que podem ser classificados na categoria de biomateriais. Com base nesses dados, pode-se perceber que há uma relação com o envelhecimento da população com a utilização desses materiais. De acordo com dados estatísticos obtidos pelo Censo de 2010 realizado pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2010), o Brasil possui mais de 19 milhões de pessoas com idade superior a 60 anos ou mais.
Com o aumento do percentual de idosos, haverá um crescimento significativo no número de pessoas com problemas de saúde relacionados a doenças ósseas degenerativas, como a osteoporose. Atualmente, vários substitutos biológicos são desenvolvidos para reparar o osso danificado, abrangendo desde enxertos para preenchimento de cavidades ósseas até próteses e implantes.
Durante um procedimento cirúrgico para a implantação de um biomaterial pode ocorrer à deposição de bactérias patogênicas que podem se associar, formando um biofilme, levando o material a sua perda séptica. Sabe-se que cerca de 3% dos procedimentos para a implantação de um biomaterial no corpo são acometidos por infecções (SHIMAZAKI et al., 2010). Estima-se que em torno de 15 a 30 mil dólares são necessários para tratar um paciente que tenha algum tipo de infecção provocada pela formação de biofilmes na superfície de próteses ou implantes ortopédicos (DIAZ et al., 2009).
A maior parte das bactérias patogênicas se associa em colônias, o que proporciona proteção contra agentes antibacterianos externos, e garante a proliferação dos microrganismos dentro do biofilme. A sua estratificação em camadas relacionadas ao gradiente de penetração de antibióticos, faz com que as bactérias mais interiores ao biofilme recebam uma dosagem menor do que aquela considerada letal, aumentado severamente o risco de resistência por parte dessas bactérias.
Outro grande problema no desenvolvimento de resistência das bactérias contra antibióticos nos dias atuais está associado à sua utilização indiscriminada e incorreta por grande parte da população (ZHANG et al., 2010 e ROCHA et al., 2011). Antibióticos
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têm ação sistêmica, não localizada, e expõe todas as bactérias do corpo, ou seja, mesmo aquelas não relacionadas à infecção, a um potencial aumento de resistência. Sendo assim, o desenvolvimento de novas técnicas de combate às bactérias tem sido estimulado. Com a finalidade de amortizar a resistência bacteriana a agentes antibacterianos, diversos tipos de drogas existentes têm sido modificados e tantas outras até mesmo descobertas (HUH et al., 2011). Materiais podem adquirir características bactericidas em função da incorporação de antibióticos na sua composição (JONES et
al., 2010). Além do mais, eles podem ter suas propriedades superficiais modificadas,
para que possam dificultar a formação do biofilme na superfície do material.
Atualmente, a utilização da prata como agente bactericida vem ganhando espaço novamente no meio médico. A ação da prata já é conhecida desde a antiguidade e tem sido uma alternativa viável em relação aos antibióticos comuns, tendo um amplo espectro de atuação sob diversas cepas de bactérias (ZHANG et al., 2010). A utilização deste metal, mesmo em pequenas quantidades (0,01 e 0,1% em peso) (STANIC et al., 2011), proporciona uma relevante atividade bactericida, acelerando a eficácia e eficiência do tratamento. A manipulação físico-química de compostos metálicos de prata é relativamente mais rentável do ponto de vista econômico em comparação aos custos de produção e modificação dos antibióticos mais utilizados atualmente. Nesse sentido, diversas propostas de incorporação de prata a biomateriais vêm sendo descritas na literatura (STANIC et al., 2011 e ZHANG et al., 2010). No entanto, como um agente bactericida, a prata tem efeito citotóxico em concentrações superiores a 10% em peso (NATH et al., 2010), podendo reduzir a biocompatibilidade desses materiais.
Vários estudos têm avaliado a atuação de zinco no metabolismo do tecido ósseo (BOANINI et al., 2010, TANG et al., 2009 e ZHENDONG et al., 2010). O zinco é um metal essencial para a sobrevivência e manutenção dos organismos vivos, estando presente no corpo humano em sua maior quantidade no tecido ósseo. Sabe-se que a sua deficiência no organismo pode gerar sérios problemas de formação do esqueleto com a diminuição da densidade óssea. A diferenciação das células responsáveis pela degradação óssea (osteoclastos) é inibida na presença deste metal, ao mesmo tempo em que ele induz o aumento da atividade das células que produzem osso (osteoblastos), estimulando a síntese de proteínas (BOANINI et al., 2010 e TANG et al., 2009).
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Recentemente, diversos grupos de pesquisas têm voltado a sua atenção para o desenvolvimento de compostos de fosfato de cálcio dopados com metais que possuem funcionalidades biológicas específicas para aplicações como enxertos ósseos. Nesse trabalho, propomos a produção de uma hidroxiapatita (HA) com propriedades bactericidas usando a prata como agente. Ao mesmo tempo, para promover um ganho de biocompatibilidade em função da ação ligeiramente tóxica da prata, propomos a inclusão do zinco à estrutura da HA, concomitantemente a inserção da prata.
A inserção simultânea de íons metálicos à HA ainda é pouco explorada e a proposição de um material desse tipo requer um estudo de caracterização que permita definir como a entrada desses metais ocorre, e como eles poderiam agir. Deste modo, o objetivo desse trabalho foi sintetizar uma hidroxiapatita contendo prata e zinco em concentrações baixas e funcionais, que permitissem a associação de uma ação bactericida e estimuladora da atividade osteoblástica, respectivamente, mas sem alterações significativas dos parâmetros físico-químicos e de estabilidade térmica desses compostos.
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CAPÍTULO II
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2.1. HIDROXIAPATITA (HA)
O uso da HA é intensamente difundido em aplicações ortopédicas e ortodônticas. Na área de biomateriais, a ampla aplicabilidade deste fosfato de cálcio está relacionada ao fato da sua composição química, composta basicamente por cálcio e fósforo, ser semelhante à fase mineral de ossos, dentes e alguns tecidos calcificados. Desta forma, este material tem a capacidade de induzir a formação do osso na região comprometida. Além do mais, pode favorecer a biocompatibilidade de próteses e implantes, atuando na interface implante-tecido.
O fato da superfície da HA ter a capacidade de adsorver moléculas, como proteínas, enzimas e aminoácidos, potencializa suas aplicações, principalmente na indústria farmacêutica. Atualmente, medicamentos funcionalizados podem ser incorporados na HA, possibilitando que este material possa ser aplicado no tratamento e na prevenção de doenças ósseas cancerígenas (SYGATOWICZ et al., 2010).
A reabsorção é uma característica desejável para alguns tipos de biomateriais. Apesar das diversas aplicações biológicas promissoras, o uso da HA é limitado em função da sua lenta taxa de degradação, que pode induzir a uma resposta imunológica do organismo (GUASTALDI et al., 2010 e COSTA et al., 2009). A incorporação de íons metálicos, tais como o tais como o Mg2+, Zn2+, Sr2+, Mn2+, à estrutura da HA têm sido utilizada como alternativa para aumentar a sua solubilização em processos biológicos (BOANINI et al., 2010). Estas substituições iônicas possibilitam que a HA tenha propriedades físico-químicas e características biológicas específicas, que variam em função dos efeitos biológicos dos íons. Alguns autores recomendam que a utilização da HA seja associada a diversos tipos de materiais, como: elastina, colágeno, quitosana, entre outros (LUO et al., 2011 e VENKATESAN et al., 2011). Esses tipos de associações diminuem o efeito do desalojamento das partículas na região de implantação.
As aplicações da HA não são limitadas apenas às aplicações relacionadas à materiais biomédicos, mas também em questões ambientais. Este material pode ser utilizado para minimizar problemas de poluição ambiental, principalmente em rios e mares, na absorção de produtos tóxicos e compostos metálicos (COSTA et al., 2009).
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Pois estes materiais possuem uma notável capacidade de absorção, que está diretamente relacionada às características de porosidade do material. Quando utilizada em forma compacta, a HA também pode ser utilizada em sistemas de purificação de água, atuando como filtros para a retenção de diversos tipos de impurezas.
Atualmente, existe uma ampla variedade de compostos de fosfato de cálcio que são estudados e aplicados para regeneração do tecido ósseo. Normalmente, esses compostos podem ser classificados de acordo com a razão molar Ca/P, que variam entre 0,5 e 2,0. Dentre os diversos fosfatos de cálcio existentes, podemos mencionar a nomenclatura de alguns deles, com o seu respectivo valor de razão Ca/P, e sua fórmula química (TABELA 1).
TABELA 1. Exemplos de fosfatos de cálcio, com seu respectivo nome, fórmula química e relação Ca/P (GUASTALDI et al., 2010, DOROZHKIN, 2009 e LEGEROS et al., 2001).
Fosfato de cálcio Fórmula química Ca/P
Fosfato Tetracálcico (TeCP) Ca3(PO4)2 2,00
Hidroxiapatita (HA) Ca10(PO4)6(OH)2 1,67
Fosfato de Cálcio Amorfo (ACP) Ca3(PO4)2.nH2O 1,50
Fosfato Tricálcico (α, β, γ) (TCP) Ca3(PO4)2 1,50
Fosfato Octacálcico (OCP) Ca8H2(PO4)6.5H2O 1,33
Mono-hidrogênio fosfato cálcio di-hidratado (DCPD) CaHPO4.2H2O 1,00
Mono-hidrogênio fosfato cálcio (DCP) CaHPO4 1,00
Pirofosfato de Cálcio (CPP) CaHPO4 1,00
Pirofosfato de cálcio di-hidratado (CPPD) Ca2P2O7 1,00
Pirofosfato de cálcio di-hidratado (CPPD) Ca2P2O7.2H2O 1,00
Fosfato heptacálcico (HCP) Ca7(P5O16)2 0,70
Di-hidrogênio fosfato tetracálcico (TDHP) Ca4H2P6O20 0,67
Fosfato monocálcico mono-hidratado (MCPM) Ca(H2PO4)2.H2O 0,50
Geralmente, a degradação dos compostos de fosfato de cálcio depende da razão Ca/P (BOANINI et al., 2010). A HA é um material pouco solúvel em comparação as demais biocerâmicas de fosfato de cálcio mencionadas anteriormente (TABELA 1). A
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taxa de solubilização pode depender da área superficial, cristalinidade e porosidade do material. Além do mais, há uma dependência das condições do meio de imersão, como pH, temperatura, etc.
A HA pura não pode ser encontrada em sistemas biológicos naturais. No entanto, a HA carbonatada (não estequiométrica), além de ser encontrada na natureza, também é utilizada em diversas aplicações. Este composto, que é deficiente em cálcio pela entrada do grupo carbonato (CO32-) à estrutura, que pode ser representado fórmula
química (LEGEROS et al., 2001): [(Ca,X)10(PO4,HPO4,CO3)6(OH,Y)2], onde X são
representados pelos cátions (Mg2+, Na2+, Sr2+, etc.) que podem substituir os Ca2+, e Y são os ânions (Cl-, F-, etc.) que podem substituir o grupo hidroxila (OH-).
A HA é um de fosfato de cálcio hidroxilado estável e solúvel (BOANINI et al., 2010), com fórmula química dada por Ca10(PO4)6(OH)2. O valor correspondente a razão
molar Ca/P é de 1,67 (TABELA 1), sendo o mesmo para a fluorapatita [Ca10(PO4)6F2] e
cloroapatita [Ca10(PO4)6Cl2], que diferentemente da HA, possuem suas hidroxilas
substituídas por F- e Cl -, respectivamente.
Em temperaturas inferiores a de 250°C, a HA pode cristalizar-se sob a forma monoclínica, para temperaturas superiores, existe uma transição alotrópica da forma monoclínica para hexagonal (COSTA et al., 2009). Em temperatura ambiente, algumas impurezas ou substituições parciais podem contribuir para estabilização da forma hexagonal. Sendo assim, os cristais da HA, geralmente, exibem uma conformação hexagonal. Nesta forma possui uma densidade de 3,16 g/cm3, com parâmetros de rede definidos por: a = b = 9,4302, c = 6,8911 Å (DOROZHKIN, 2009).
A célula unitária hexagonal da HA é formada por 10 íons Ca2+, 6 grupos fosfatos (PO43-) e 2 íons hidroxila (OH-). Os íons Ca2+ estão distribuídos em diferentes sítios,
denominados sítio Ca I e sítio Ca II (FIGURA 1).
O sítio Ca I é formado por 4 íons Ca2+ alinhados em colunas paralelas ao eixo c, com 6 átomos de oxigênio pertencentes a diferentes tetraedros PO43- e 3 outros átomos
de oxigênio relativamente distantes. Já o sítio Ca II é constituído por 6 íons Ca2+, formando uma estrutura hexagonal, perpendicular à direção c. No entanto, este sítio
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possui 2 coordenações a menos em relação ao sítio Ca I, sendo coordenado por 6 átomos de oxigênio e um íon OH-, que está situado no interior do canal do cálcio (FIGURA 1). Este íon está situado a 0,9 Å abaixo do plano formado pelo sítio Ca II, formando um ângulo de 30° em relação ao eixo c (DRIESSENS et al., 1990).
FIGURA 1. Representação dos sítios Ca I e Ca II da HA com relação aos grupos fosfatos e hidroxila (Ca: verde; O: vermelho; P: roxo; H: branco). Esquema modificado de LAURENCIN et al. (2011).
A base da célula unitária é formada por 6 átomos de fósforo que estão rodeados por 4 átomos de oxigênio [O(I), O(II), O(III)], dando origem aos 6 tetraedros do PO4
3-(ELLIOTT, 1994). Os tetraedros dos PO43- estão arranjados de tal forma que formam
dois tipos de canais que são perpendiculares ao plano basal. Cada célula unitária é formada por dois canais, com cerca de 2 Å de diâmetro, que são ocupados pelos Ca2+ do sítio Ca I. Ambos os canais estão alinhados paralelamente aos eixos ternários, estando localizados a uma distância de z = 0 e z = ½ do parâmetro de rede cristalino. HA outro canal, com um diâmetro em torno de 3,0 a 3,5 Å, que é ocupado pelos Ca2+ pertencente ao sítio Ca II, que estão localizados em z = ¼ e z = ¾. A distinção entre a forma
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hexagonal e a monoclínica pode ser dada no interior destes canais (ELLIOTT, 1994). De forma que, distorções na rede da HA, principalmente do íon OH-, podem tornar a estrutura mais monoclínica, tornando o arranjo mais fechado.
A existência de dois sítios para o Ca2+ na estrutura da HA implica em consequências importantes nas propriedades e características do material, uma vez que prováveis substituições iônicas podem ocorrer individualmente ou simultaneamente em ambos os sítios. Geralmente, as substituições catiônicas e aniônicas ocorrem com maior facilidade no sítio Ca II em comparação com o sítio Ca I. A coordenação do íon OH -com o Ca2+, torna o sítio Ca II mais susceptível a essas substituições, pois o OH- está ligado a apenas um íon Ca2+ (FIGURA 1). Já o sítio Ca I, o íon Ca2+ está ligado a átomos de oxigênios pertencentes aos grupos PO43-, sendo uma estrutura mais rígida
(LAURENCIN et al., 2011).
2.2. MÉTODO DE OBTENÇÃO DA HA
Uma das metodologias mais utilizadas para a obtenção da HA é o método de precipitação química em meio aquoso. Esta técnica é amplamente utilizada pelo baixo custo dos procedimentos empregados, principalmente em relação aos reagentes utilizados e a simplicidade do método preparação. Para a obtenção da HA por este método deve haver o controle do pH da solução, temperatura, taxa de adição dos reagentes utilizados, tempo de agitação, tempo de envelhecimento, e temperatura de calcinação (USKOKOVIC et al., 2011 e LOURENÇO et al., 2009).
O monitoramento do pH influência diretamente na estequiometria, morfologia e no tamanho dos cristalitos da HA. Em geral, os compostos de fosfato de cálcio que são sintetizados em meio ácido, possuem uma baixa relação razão molar Ca/P, caracterizando formação de uma apatita deficiente em cálcio (DOROZHKIN, 2009). As melhores condições para a obtenção de uma HA com alta cristalinidade podem ser dadas, principalmente, em meios com pH entre 9,5 e 12 (BOANINI et al., 2010). De modo que, a elongação e o crescimento dos cristais são favorecidos pela combinação de elevados valores de pH e temperatura de precipitação (OZEKI et al., 2010).
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A velocidade de gotejamento dos reagentes influencia diretamente na cinética da reação química da solução e, consequentemente, na sua homogeneidade no final do procedimento. Para garantir que ocorra a nucleação de partículas maiores e menos aglomeradas, a velocidade de titulação deve ser lenta (USKOKOVIC et al., 2011). Em paralelo, o tempo de reação pode influenciar na cristalinidade, no tamanho do cristalito (BOANINI et al., 2010), e aumentar a relação Ca/P, diminuindo a deficiência de cálcio da apatita. Deste modo, reações de precipitação rápidas podem favorecer a formação de um composto de fosfato de cálcio amorfo (ACP).
As partículas obtidas por esta metodologia têm uma tendência a serem aglomeradas, devido à tensão superficial da água, que podem provocar defeitos estruturais no material formado. Esta tensão pode influenciar tanto na solubilidade quanto na aglomeração das partículas da HA (USKOKOVIC et al., 2011). Alguns métodos de síntese têm sido desenvolvidos para substituir a água por outro solvente menos polar (ARAUJO, 2006), de modo a diminuir a tensão superficial e evitar a aglomeração de partículas. Outros processos incorporam agentes modificadores de superfície nas partículas, como grupos orgânicos funcionais, que dificultam esta aglomeração, aumentando a homogeneidade do material formado ao final do processo de síntese (COSTA et al., 2009).
Sabe-se que a temperatura na qual ocorre a precipitação influência diretamente na fase, no tamanho e na morfologia dos cristais de HA formados. O equilíbrio de uma reação química para a obtenção da HA pelo método de precipitação química em meio aquoso, através do equilíbrio do sistema Ca(OH)2-H3PO4-H2O, depende da temperatura
da reação (ELLIOTT, 1994). É sabido que temperaturas de precipitação em torno de 25-37°C são necessárias para obter uma HA com fase mineral semelhante ao osso (ARAUJO, 2006).
A energia fornecida ao material durante a calcinação atua diretamente no nível de organização dos átomos, influenciando no tamanho e na morfologia dos cristais. Existem dois tipos de HA que devem ser considerados: as calcinadas em altas temperaturas, que apresentam boa cristalinidade e cristais grandes, e as que são calcinadas em baixas temperaturas, que apresentam baixa cristalinidade e cristais pequenos (COSTA et al., 2009). Temperaturas mais altas permitem a obtenção de pós
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mais cristalinos, e mais resistentes, o que facilita a sua manipulação, diferentemente quando a temperatura é baixa, uma vez que o material obtido possui uma fragilidade acentuada.
O método de obtenção da HA em meio aquoso requer uma prática metodológica concisa e sistemática, com a finalidade de obter pós biocompatíveis em meio biológicos. Se o controle das variáveis que envolvem o processo de síntese não forem monitorados cuidadosamente pode ocorrer à formação de compostos de fosfato de cálcio menos estáveis.
2.3. INCORPORAÇÃO IÔNICA NA ESTRUTURA DA HA
A estrutura da HA, formada por grupos fosfatos (PO43-), hidroxilas (OH-) e íons
cálcio (Ca2+), permite substituições catiônicas e aniônicas. O Ca2+ pode ser substituído por metais, tais como o Mg2+, Zn2+, Sr2+, Mn2+ etc. Os grupos fosfatos, por carbonatos (CO32-) e vanadatos (VO43-), e as hidroxilas, por carbonatos, fluoretos e cloretos
(COSTA et al., 2009). Desta forma, cada agrupamento iônico pode ser substituído por outro de mesma valência ou similar.
As apatitas minerais e biológicas contém uma grande quantidade de defeitos estruturais provenientes das substituições iônicas (USKOKOVIC et al., 2011), que podem provocar modificações à estrutura do material, como alterações nos parâmetros de rede da célula unitária, na morfologia e no tamanho dos cristais. Além do mais, podem influenciar diretamente na solubilidade e estabilidade térmica do material.
A incorporação do CO32- na HA pode aumentar de forma significativa à
instabilidade estrutural da apatita formada. Existem dois tipos de classificação para uma HA carbonatada: a do tipo A, quando o OH- é substituído pelo CO32-, causando um
aumento no parâmetro de rede a, seguido por uma diminuição no parâmetro c; e do tipo B: quando o PO43- é substituído pelo CO32-, proporcionando uma diminuição no
parâmetro de rede a, e um aumento no parâmetro c (USKOKOVIC et al., 2011 e GUASTALDI et al., 2010). E ainda pode ocorrer a substituição do tipo AB, em que o PO43- e o OH- podem ser substituídos pelos grupos CO32- (SLOSARCZYK et al., 2005).
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A presença do CO32- à estrutura da HA pode favorece a redução da cristalinidade
e ao aumento de solubilidade (BOANINI et al., 2010). Convêm mencionar que a cinética de solubilidade da HA depende das características físico-químicas do meio, dos componentes químicos presentes no material, e do tipo de solução de imersão.
O principal problema na incorporação de íons metálicos à estrutura da HA está relacionado à diminuição da estabilidade térmica. Uma vez que a inserção de íons em grandes quantidades pode provocar alterações na rede do material, comprometendo o processamento desses materiais em altas temperaturas. Geralmente, para tornar os materiais mais estáveis são empregados tratamentos térmicos que podem induzir transformações de fases no material formado, tornando-o menos estável. Além do mais, subprodutos indesejados podem ser formados, como o óxido de cálcio (CaO), que é conhecido por ser citotóxico às células, e outros compostos de fosfato de cálcio menos estáveis, que podem aumentar a instabilidade térmica do material, tornando apatita deficiente em cálcio.
2.3.1. Prata
Como foi mencionado anteriormente, à estrutura da HA existem dois sítios (Ca I e Ca II) que são susceptíveis a processos de substituições iônicas. A substituição do Ca2+ pelo íon de prata (Ag+) ocorre preferencialmente no sítio Ca II. Pois, a coordenação do OH- com o Ca2+ torna este sítio mais flexível e menos compacto em relação ao sítio Ca I, onde os Ca2+ estão confinados pelos tetraedros dos PO43- (LAURENCIN et al.,
2011) (FIGURA 1). A incorporação deste íon na rede pode provocar alterações nos valores dos parâmetros de rede da célula unitária e, consequentemente, no seu volume (STANIC et al., 2011 e NATH et al., 2010).
Através da análise quantitativa dos resultados de Difração de Raios X (DRX), RAMESHBADU et al. (2007) observaram que a entrada do Ag+ nos sítios da HA provocou o aumento dos valores dos parâmetros de rede a e c, que contribuiu de forma significativa para a extensão da célula unitária. Os resultados mencionados no trabalho de STANIC et al. (2011) também mostraram a influência deste íon no aumento da célula unitária da HA. Tal comportamento pode ser atribuído ao fato do raio do Ag+ (0,128 nm) ser maior em relação ao do Ca2+ (0,099 nm).
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SYGNATOWICZ et al. (2010) puderam correlacionar a transformação de fases da HA com a incorporação do Ag+ na sua estrutura. Os autores observaram a formação da fase fosfato β-tricálcico (β-TCP) em amostras calcinadas a 800°C e 900°C que continham 5 e 10% em peso do Ag+. Dados obtidos por RIGO et al. (2010) também apresentaram a formação desta fase em amostras contendo este íon na concentração de 0,1 M que foram calcinadas a 800°C. Provavelmente, o fato de STANIC et al. (2011) terem utilizado baixas concentrações do Ag+ (0,01 e 0,1% em peso) foi um fator determinante para que não houvesse transformação de fases no material analisado.
NIRMALA et al. (2011) realizaram um estudo em uma HA com Ag+ através da Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios X (XPS, X-Ray Photoelectron
Spectroscopy). Esta técnica foi utilizada com o intuito de realizar uma análise
quantitativa da composição química do material em níveis atômicos. A partir dos espectros obtidos pelos autores, foi possível observar que os valores de energia mensurados poderiam estar relacionados a diferentes estados de oxidação da prata, como óxido de prata (Ag2O) ou hidróxido de prata (AgOH), que poderiam estar
presentes tanto no interior quanto na superfície da HA formada. Já com o auxílio da Espectroscopia RAMAN, SINGH et al. (2010) puderam confirmar a ligação do Ag+ com o íon O-, formando o Ag-O na rede da HA.
2.3.2. Zinco
A incorporação do zinco (Zn2+) à estrutura da HA pode provocar alterações no tamanho e na morfologia dos cristais de apatita formados (STANIC et al., 2010 e TANG et al., 2010). Este íon pode contribuir de forma significativa para a diminuição de cristalinidade, aumentando a instabilidade térmica do material (BOANINI et al., 2010).
Os resultados de STANIC et al. (2010) mostraram que à medida que ocorreu o aumento do teor de Zn2+ (0,01 e 0,1% em peso), houve o aumento do parâmetro de rede
a e a diminuição do c, provocando diminuições nos valores das células unitárias. Pois o
raio iônico do Zn2+ (0,074 nm) é menor em relação ao do Ca2+ (0,099 nm). Comportamento semelhante pode ser observado por LI et al. (2008) com 10 e 20% em peso de Zn2+. Adicionalmente, foi observado pelos autores que o aumento da
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concentração deste íon nos sítios da HA provocou a expansão da célula unitária. Já REN
et al. (2009) utilizaram o Refinamento de Rietveld para estudar os efeitos da
incorporação deste íon nos sítios da HA através de cálculos computacionais do tipo ab
início. Com os dados obtidos, foi possível observar que concentrações maiores do que
10% do Zn2+ apresentaram um aumento dos valores dos parâmetros de rede a e c. MATSUNAGA et al. (2010) estudaram o mecanismo de incorporação do Zn2+ na HA através da Espectroscopia de Absorção de Raios X (XAS, X-Ray Absorption
Spectroscopy). Seus estudos evidenciaram que os Zn2+ podem substituir tanto os íons Ca2+ quantos as vacâncias provocadas pela saída dos Ca2+ no sítio Ca II. As substituições dos íons Zn2+ nas vacâncias requerem uma quantidade de energia menor, sendo mais estáveis e favoráveis do ponto de vista termodinâmico. Também foi analisado a influência do pH com relação a energia de formação dos retículos, onde foi observado que as soluções mais alcalinas (pH 10-12) apresentaram uma maior estabilidade.
Assim como MATSUNAGA et al. (2010), SHEHA et al. (2007) mencionaram que o controle do pH da solução de obtenção da HA pode favorecer a incorporação do Zn2+. De modo que, o efeito da diminuição da cristalinidade provocada por este íon (STANIC et al., 2010 e TANG et al,. 2010) pode ser compensado pelos efeitos que a alcalinidade do meio pode provocar sobre a formação dos cristais. Pois soluções alcalinas favorecem a formação de apatitas biológicas com alta cristalinidade (BOANINI et al., 2010).
NORHIDAYU et al. (2008) observaram o aparecimento da fase β-TCP em amostras de HA com 15% em peso de Zn2+ que foram calcinadas a 800 e 900°C. Em particular, os dados obtidos por LI et al. (2008) apresentaram a formação da fase fosfato de zinco hidratado [CaZn2(PO4)2.2H2O] em uma concentração de 40% em peso deste
íon. Já SAHA et al. (2010) fizeram um estudo de biocompósitos de HA com óxido de zinco (ZnO), onde foi possível observar a formação da fase fosfato α-tricálcico (α-TCP) nas amostras com as maiores concentrações do Zn2+ (10, 20, 30% em peso) que foram calcinadas a 1250°C.
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2.4. EFEITOS BIOLÓGICOS DA PRATA E DO ZINCO 2.4.1. Prata
Diversos grupos de pesquisas têm voltado a sua atenção para o desenvolvimento de materiais com propriedades e características bactericidas usando agentes metálicos bactericidas. Uma das vantagens da utilização desses agentes metálicos está relacionada à possibilidade de tratar pontualmente e de forma mais eficiente a infecção (HUH et al., 2011). Atualmente, metais com características biologias funcionais têm sido utilizados para a produção de biocerâmicas de fosfato de cálcio, representando uma alternativa viável para a produção de enxertos ósseos ativadores da regeneração óssea ou mesmo bactericidas.
A prata é um metal que pode ser encontrado no esmalte e na dentina, em quantidades variáveis entre 0,6 a 2 ppm (BOANINI et al., 2010). Em tais concentrações, a atividade bactericida é quase desprezível e, portanto, a produção de biomateriais com ação bactericida requer a incorporação desse metal em concentrações maiores. Mesmo na forma de oxido e sais, a prata consegue exibir atividade bactericida (RAMESHBADU et al., 2007), o que possibilita a sua incorporação em cerâmicas e outros materiais que necessitam de tratamento térmico. Além da prata, também podem ser utilizados como agentes bactericidas o óxido de cálcio (CaO), óxido de cobre (CuO) (SAHA et al., 2010; STANIC et al., 2010), óxido de magnésio (MgO) e o óxido de zinco (ZnO) (SAHA et al., 2010).
Os materiais contendo prata, principalmente quando utilizados na forma de nanopatículas, tem uma atividade bactericida em um amplo espectro de bactérias, tais como: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis,
Leuconostoc mesenteroides, Bacillus subtilis, Klebsiella mobilis, e Klebsiella pneumonia entre outras (JONES et al., 2010). Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis são bactérias que são amplamente encontras em infecções de
próteses e implantes (PANDIAN et al., 2010 e BAI et al., 2010). Além disso, a prata é considerada um agente antimicrobiano, que se caracteriza pela sua ação efetiva em na morte e impedimento de duplicação não somente de bactérias (ação bactericida), como
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também de vírus (ação antivirótica) e fungos (ação fungicida) (RAMESHBADU et al., 2007).
É de suma importância que a formação de biofilmes no biomaterial seja evitada em qualquer etapa do processo de implantação e integração do implante no organismo. Tendo em vista esta finalidade, diversos tipos de materiais de uso biomédico possuem prata na sua composição, com o intuito de inibir a adesão e a proliferação de bactérias na superfície do material, consequentemente, evitar a formação de biofilmes.
Geralmente, as estruturas membranosas das bactérias possuem ponto isoelétrico acima de 7,0, o que confere uma carga de superfície negativa no pH do corpo (JONES
et al., 2010). Estas cargas negativas estão presentes principalmente em proteínas
transmembranares em contato com o meio extracelular. Isso faz com que os íons de prata carregados positivamente possam interagir diretamente com essas proteínas alterando suas estruturas e, consequentemente, suas sinalizações, que modificam as funções celulares da bactéria e induz sua morte ou inibição de proliferação.
Nanopartículas de prata podem penetrar no interior de microrganismos e alterar a estrutura do seu DNA, modificando também sua habilidade de replicação, e interferindo diretamente no metabolismo celular das bactérias, através de reações químicas com os seus componentes celulares (NETO, 2010). Deste modo, HA alterações significativas na permeabilidade da membrana, conduzindo as células do microrganismo à incapacidade de regular o transporte através da membrana plasmática e, finalmente, causando a sua morte (STANIC et al., 2010). Diversos estudos por microscopia eletrônica mostraram que nanopartículas de prata podem aderir e penetrar em bactérias Escherichia coli (FENG et al., 2000). Estudos feitos através da Microscopia de Força Atômica (AFM, Atomic Force Microscopy) também identificaram os efeitos deste íon em bactérias Escherichia coli e Staphylococcus
epidermis (YANG et al., 2010).
O fato da HA ser um material que tem uma alta capacidade de adsorção de proteínas e outros compostos orgânicos pode favorecer a deposição, proliferação e diferenciação de bactérias em sua superfície. Diversas pesquisas estão voltadas para a avaliação da atividade bactericida da prata, em compostos a base de fosfato de cálcio
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(ZHANG et al., 2010; DIAZ et al., 2009). A prata pode ser incorporada na HA por diversos metodologias, como o método sol-gel, deposição por sputtering, hidrotérmico (BAI et al., 2010), precipitação por química em meio aquoso (STANIC et al., 2011).
STANIC et al. (2011) avaliaram a atividade bactericida da HA dopada com Ag+, em diferentes concentrações. Para a avaliação foi utilizado o teste de halo de inibição para a avaliação do material obtido frente aos microrganismos Escherichia coli,
Staphylocccus aureus e Candida albicans em amostras com o Ag+ (0,1% em peso). Os resultados apresentaram uma resposta bactericida satisfatória e relevante em detrimento as amostras com que tinham concentrações de 0,01% em peso deste íon. A cultura de bactérias que continham Staphylococcus aureus apresentou-se mais resistente em comparação às demais.
TRUJILLO (2010) realizou um estudo com uma HA contendo Ag+ sobre filmes de titânio, em concentrações de 0,5 e 1,5% em peso. O efeito bactericida foi testado em bactérias Staphylococcus epidermidis, e Pseudomonas aeruginosa. Em geral, foi observado que as amostras que apresentaram maior quantidade de bactérias mortas, tinham maior teor do Ag+ na sua estrutura, para os dois tipos de bactéria.
O Ag+ pode ser citotóxico às células, diminuindo a biocompatibilidade do material (NATH et al., 2010). Os testes in vitro realizados por QU et al. (2011) indicaram que a proliferação e diferenciação dos osteoblastos (células responsáveis pela síntese da matriz óssea) são mais acentuadas em biocerâmicas de fosfato de cálcio contendo concentrações mínimas de Ag+. SANDUKAS et al. (2011) realizaram estudos da adesão de osteoblastos em substratos de titânio com HA dopada com Ag+ (1,3 e 6% em peso). Em que, foi possível observar que a menor quantidade do Ag+ favoreceu a proliferação e diferenciação dos osteoblastos.
Segundo os estudos de QU et al. (2011), a produção de fosfatase alcalina (enzima relacionada à diferenciação de osteoblastos) foi mais evidente nas amostras com 0,6% em peso do Ag+, influenciando diretamente as atividades metabólicas dos osteoblastos. Resultados semelhantes foram obtidos por CHEN et al. (2007) com a concentração de 1% em peso deste íon.
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Com testes in vitro, SINGH et al. (2011) avaliaram o efeito do Ag+ na biocompatibilidade da HA. Através de análises das micrografias de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), os autores observaram que os efeitos citotóxicos sobre os fibroblastos (células responsáveis pela síntese do colágeno que garantem a alta resistência do osso foram mais acentuados nas amostras com os maiores teores deste íon (0,5% em peso). Já as que continham os menores teores de Ag+ (0,2 e 0,3% em peso ) apresentaram um aumento da atividade celular.
2.4.2. Zinco
O zinco (Zn2+) é um dos metais essenciais para a manutenção das atividades fisiológicas e metabólicas do organismo. No corpo é um dos principais componentes inorgânicos, podendo ser encontrado na maior parte do organismo. Entretanto, em determinados órgãos e tecidos do organismo a sua presença é mais abundante (TABELA 2), especialmente em ossos, dentes e tecidos calcificados. BOANINI et al. (2010) mencionou que no esmalte e na dentina do dente contém em torno de 263 e 173 ppm, respectivamente.
O Zn2+ pode promover a proliferação e adesão de osteoblastos, estando envolvido no metabolismo de muitas enzimas e proteínas, como a fosfatase alcalina (TANG et al., 2009). Este íon quando incorporado em compostos de fosfato de cálcio favorece a proliferação de osteoblastos, inibem a adesão de osteoclastos, dificultando o processo da matriz óssea (BOANINI et al., 2010, TANG et al., 2009 e ZHENDONG et
al., 2010).
Testes in vitro realizados por YANG et al. (2011) indicaram que uma HA com Zn2+ (10% em peso) teve uma produção significativa de fosfatase alcalina e um aumento da proliferação e diferenciação dos osteoblastos. Já ZHANG et al. (2009) avaliaram a compatibilidade in vivo de um cimento ósseo a base de HA com Zn2+ (8% em peso) e quitosana. Os resultados indicaram uma excelente atividade de regeneração óssea da região comprometida.
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ZHANG et al. (2010) avaliaram, com testes in vitro e in vivo, a influência do Zn2+ (6% em peso) em ligas de magnésio. Os resultados indicaram que, apesar da presença deste íon ter contribuído para o aumento da taxa de degradação do material, houve um aumento da sua biocompatibilidade.
TABELA 2. Concentração do Zn2+ em tecidos e órgãos do organismo (ITO et al., 2005).
Sistema e tecidos do corpo Concentração (ppm)
Organismo 28-33 Epiderme 70,5 Derme 12,6 Músculo 38-57 Osso 125-250 Plasma Sanguíneo 0,69-1,21 Próstata 102 Ruins 52-75
Não há um consenso na literatura quanto à atividade bactericida do Zn2+. Segundo HUH et al. (2011), o ZnO tem sido empregado na composição química de materiais biomédicos como agente bactericida, podendo também ser usado como carregador de fármacos. Pouco é sabido na literatura em relação aos mecanismos da ação bactericida de compostos metálicos com Zn2+. A reação química entre o ZnO e água produz um radical OH-, que pode induzir a lise da membrana celular, provocado a morte do microrganismo (SAHA et al., 2010). Adicionalmente, a produção do peróxido de oxigênio (H2O2), que pode ser produzido na presença deste óxido metálico, pode ser
um fator determinante para que o material possa ter uma atividade bactericida. HUH et
al. (2011) mencionaram que o H2O2 produzido a partir de nanopartículas de ZnO,
podem causar danos estruturais na parede celular do microrganismo.
O trabalho de STANIC et al. (2010) avaliou a atividade bactericida das amostras da HA com o Zn2+, em concentrações de 0,010 e 0,10% em peso, frente as cepas
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resultados, os autores não observaram uma atividade bactericida relevante. Provavelmente, a quantidade deste íon que foi utilizado durante o processo de síntese deve ter influenciado na ineficácia do efeito bactericida das amostras. Diferentemente de SAHA et al. (2010) que obtiveram resultados significativos quanto a atividade bactericida dos biocompositos de HA com Zn2+ (30% em peso) frente as bactérias
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CAPÍTULO III
OBJETIVO
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3.1. OBJETIVO GERAL
O principal objetivo desse trabalho foi sintetizar uma hidroxiapatita contendo prata e zinco em concentrações baixas e funcionais que permitam a associação de uma ação bactericida e estimuladora da atividade osteoblástica, mas sem alterações significativas dos parâmetros físico-químicos e de estabilidade térmica desses compostos.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Sintetizar uma HA contendo prata e zincopelo método de precipitação em meio aquoso.
Avaliar o efeito desses metais à estrutura da HA por meio de análises físico-químicas.
Avaliar o comportamento do material em fluidos biológicos, que simulam o plasma sanguíneo.
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CAPÍTULO IV
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4.1. SÍNTESE DA HA 4.1.1. Produção de HA Pura
Para a preparação das hidroxiapatitas foi utilizado o método de precipitação em meio aquoso, através de uma reação típica ácido-base entre o hidróxido de cálcio [Ca(OH)2] e o ácido fosfórico [H3PO4], nas concentrações de 0,198 e 0,119 mol/L,
respectivamente.
A solução ácida foi gotejada gradativamente sob uma velocidade aproximada de 2,0 mL/min na solução básica em constante agitação. O pH da solução foi monitorado de forma que nunca estivesse abaixo de 10 durante a neutralização, controlado através da adição do hidróxido de potássio (KOH).
Durante o processo de síntese, a temperatura da solução permaneceu em torno de 37°C. Após a reação, a suspensão obtida foi envelhecida sob as mesmas condições de temperatura e pH por 24h, com o intuito de possibilitar a homogeneização do tamanho dos cristalitos. Posteriormente, a suspensão foi filtrada em funil de Buchner, lavada com água destilada até que o filtrado exibisse o mesmo pH da água destilada usada.
Após o processo de filtragem, o precipitado foi seco em estufa a 120°C por 24h. O material seco foi triturado em um grau de ágata, peneirado (peneira de Mesh 140, abertura de 108 μm) e armazenado em um ambiente livre de umidade.
4.1.2. Incorporação de Metais a Estrutura da HA
As concentrações dos íons metálicos foram determinadas com a finalidade de que o material não apresentasse variações significativas nos parâmetros físico-químicos, na estabilidade térmica e não tivesse uma resposta citotóxica frente às células. Deste modo, as quantidades dos íons utilizados para a preparação das amostras foram estabelecidas em baixos teores, similares aos que são encontrados no tecido ósseo (TABELA 3). Pois baixas concentrações tendem a aumentar a biocompatibilidade do material, além de diminuir possíveis efeitos que podem comprometer a sua estrutura (BOANINI et al., 2010). Testes posteriores poderão avaliar se as amostras sintetizadas
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possuem efeito bactericida (pela presença do Ag+) e atividade óssea indutiva (pela presença do Zn2+).
TABELA 3. Concentração do Zn2+ e Ag+ no tecido ósseo (ppm) (BOANINI et al., 2010).
Concentração do Zn2+ e Ag+ no tecido ósseo (ppm)
Íon Esmalte Dentina Osso Zn2+ 263 173 39
Ag+ 0,6 2 -
Para a preparação das hidroxiapatitas enriquecidas com os íons metálicos, foram utilizados como fonte de Zn2+ e Ag+ o cloreto de zinco (ZnCl) e o nitrato de prata (AgNO3), respectivamente. A nomenclatura usada para cada tipo de amostra e a
quantidade relativa dos íons em relação ao Ca2+ está apresentada na TABELA 4.
TABELA 4. Concentração relativa dos íons Zn2+ e Ag+ (Mn+) em comparação aos íons Ca2+.
Quantidade Relativa (Mn+ mol/Ca2+ mol) Amostras Zn2+ Ag+
HA - -
HA-Zn 0,10% -
HA-Ag - 0,13%
HA-ZnAg 0,10% 0,13%
Por questões de estabilidade no meio, o Zn2+ foi adicionado à solução de Ca(OH)2. Enquanto, o Ag+ foi adicionado à solução de H3PO4.
4.2. ESTABILIDADE TÉRMICA APÓS SÍNTESE
Os materiais obtidos na forma de pó foram submetidos a um tratamento térmico (calcinação) para verificar a estabilidade térmica e as tendências das mudanças
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estruturais de HA em alta temperatura. Neste sentido, as amostras foram calcinadas a 1000ºC por 2h em um forno Mufla sob uma taxa de aquecimento de 2,8ºC/min. O pó resultante do processo de calcinação foi devidamente armazenado em ambiente seco e livre de umidade.
4.3. CARACTERIZAÇÕES DAS AMOSTRAS OBTIDAS 4.3.1. Composição das Amostras
As amostras foram submetidas a uma análise química por Fluorescência de Raios X (FRX) para monitorar de forma quantitativa e qualitativa, os elementos presentes. O princípio básico de funcionamento desta técnica fundamenta-se no processo de excitação dos elétrons dos átomos. De modo que, a energia resultante das transições energéticas é emitida sob a forma de Raios X com energias específicas para cada tipo de interação, permitindo a definição da natureza química dos elementos presentes nas amostras e suas quantidades. As análises foram feitas com o material calcinado num espectrofotômetro de Fluorescência de Raios X por Energia Dispersiva Modelo SHIMADZU 720, localizado no Instituto Tecnológico e de Pesquisas do Estado de Sergipe (ITPS).
A Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR, Fourier
Transform Infrared Spectroscopy) foi utilizada com o objetivo de identificar a presença
dos grupos OH- e PO43- que definem a formação da HA (ELLIOTT, 1994). As
moléculas são identificadas a partir dos modos de vibração, rotação e translação de compostos moleculares. Estas vibrações são provocadas pela radiação no infravermelho incidida no material durante o período de realização das análises. Para este fim, as amostras foram analisadas no modo transmitância, varrendo o espectro no intervalo de 4000 a 500 cm-1, utilizando um espectrofotômetro da PERKIN ELMER FT-IR SYSTEM SPECTRUN BX, instalado no Polo de Novas Tecnologias da Universidade Federal de Sergipe (UFS).
A Espectroscopia Raman foi utilizada com o intuito de se complementar a caracterização dos compostos moleculares presentes nas amostras. Para este fim, foi utilizado um espectrômetro Raman Dispersivo modelo SENTERRA fabricado pela
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BRUKER, localizado no Polo de Novas Tecnologias da Universidade Federal de Sergipe (UFS). Os espectros Raman foram obtidos com um feixe de laser em 633 nm, utilizando uma potência de 20 mW, com abertura de 2 mm, varrendo o espectro no intervalo de 400 a 1600 cm-1.
A Espectroscopia Raman e a Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier são técnicas utilizadas para análise química de amostras a partir da energia associada a moléculas e compostos. Mas há diferenças suficientes entre os tipos de grupos funcionais que são ativos no infravermelho e no Raman para tornar essas técnicas complementares ao invés de competitivas (JACINTHO, 2007). Ambas têm sido utilizadas para estudar a incorporação do grupo carbonato na estrutura de apatitas biológicas (ANTONAKOS et al., 2007). Pois a utilização do Raman possibilita a detecção de movimentos moleculares em menores níveis de energia que não são detectados por FTIR.
4.3.2. Estrutura da HA
As amostras foram caracterizadas, antes e depois da calcinação, por meio de Difração de Raios X (DRX) com o objetivo de identificar as fases cristalinas presentes e possíveis modificações estruturais e morfológicas. As analises dos difratogramas obtidos foram realizadas com auxílio dos cartões contidos no JCPDS (Joint Committee
on Powder Diffraction Standards) (HA no 9-432, α-TCP no 29-0359, β-TCP no 9-169,
Ag3(PO)4 no 6-505, Ag0 no 4-783 e CaO no 37-1497).
Os difratogramas foram obtidos variando 2θ de 5º a 60º, em modo contínuo (2°/min), passo de 0,02º e com um feixe de radiação operando no regime 40kV/40mA. Uma parte dos resultados foi obtida com a utilização da fonte de cobre (λCuKα = 1,5401
Å), enquanto a outra parte foi realizada com a fonte de cobalto (λCoKα = 1,7902 Å). O
equipamento usado para a realização das medidas foi um difratômetro de alta resolução RIGAKU DMAX 100, instalado no Polo de Novos Materiais da Universidade Federal de Sergipe (UFS).
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Para facilitar a comparação dos difratogramas obtidos com a utilização de fontes diferentes, todos os dados de ângulo de difração foram convertidos distância interplanar (LENG, 2008).
O cálculo dos parâmetros de rede a e c foram realizados em relação aos planos perpendiculares (002) e (300) da HA, respectivamente, usando a relação padrão entre as distâncias interplanares para uma célula unitária de um sistema hexagonal segundo a equação 1 (WEBSTER et al., 2004).
2 2 2 2 2 2 3 4 1 c l a k hk h d (1) Em que:
d é a distância entre planos adjacentes definidos pelos índices de Miller (h k l). Os termos a e c representam os parâmetros de rede da célula unitária.
O volume das células unitárias foi calculado usando a equação 2, de acordo com a geometria exibida para uma estrutura hexagonal.
V = 0,866a2c (2)
O índice de cristalinidade relativa (IC) desenvolvido por Landi et. al. (2000) foi calculado a partir dos difratogramas segundo a equação 3.
% 100 1 ) 300 ( ) 300 )( 112 ( b b d I I I I IC (3) Onde:
30
Id(112)(300) é definido pela intensidade mais baixa medida entre os picos
correspondentes aos planos (1 1 2) e (3 0 0).
I(300) representa a intensidade máxima do pico correspondente ao plano (3 0 0) da
HA.
4.3.3. Morfologia dos Cristais
O tamanho de cristalito (L) amostras foi estimado a partir da equação de Scherrer (STAN et al., 2007) levando em consideração os planos (0 0 2) da HA, de acordo com a equação 4.
cos 89 , 0 hkl B L (4) Em que:
λ representa comprimento de onda da radiação incidente (nm).
Bhkl é a largura a meia altura corrigida pela subtração da largura a meia altura do
pico principal do LaB6 obtido nas mesmas condições das amostras.
θ é o ângulo de difração correspondente ao plano (0 0 2) referente ao KαCu ou
KαCo.
O alongamento do cristal, que mede o caráter de assimetria do cristal, foi determinada pela relação entre as intensidades máximas dos planos (0 0 2) e (3 0 0), correspondente as direções [0 0 1] e [1 0 0], respectivamente (YANG et al., 2009).
4.4. IMERSÃO EM SOLUÇÃO SIMULADORA DO PLASMA CORPÓREO (SBF)
Os testes de imersão foram realizados com o intuito de verificar o comportamento do material em uma solução que simula a parte inorgânica do plasma
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sanguíneo. A solução SBF proposta por KOKUBO et al. (1990), mimetiza a parte inorgânica do plasma sanguíneo.
A solução SBF foi preparada segundo a norma ISO (ISO FDIS 23317, 2005). A tabela abaixo (TABELA 5) menciona os reagentes que foram utilizados para a preparação da solução, segundo a ordem de adição, quantidade e a pureza de cada um dos reagentes para preparar dois litros de solução.
TABELA 5. Ordem de adição, ordem e grau de pureza dos reagentes para a preparação de dois litros da solução SBF.
Ordem Reagente Fórmula Química Massa (g) Pureza 1° Cloreto de Sódio NaCl 23,98 99%
2° Cloreto de Potássio KCl 0,672 99%
3° Fosfato de Potássio Dibásico K2HPO4.3H2O 0,5221 98%
4° Cloreto de Magnésio MgCl2.6H2O 0,916 99%
5° Sulfato de Sódio Na2SO4 0,214 99%
6° Bicarbonato de sódio NaHCO3 1,050 99%
7° Cloreto de cálcio CaCl2 0,834 99%
Após o processo de calcinação, a massa do pó foi medida (0,3 g) e posteriormente depositada em um tubo de polietileno graduado que continha solução SBF. A proporção do volume da solução SBF utilizada para a realização dos testes foi de 10 mg/mL (LUKITO et al., 2005). O pó ficou em contato com a solução durante 4 dias. Os ensaios foram realizados com temperatura de 37°C e pH em torno de 7,4. Após o tempo determinado, a solução foi filtrada e o pó seco em estufa a 120°C por 24h.
4.5. ANÁLISE ESTÍSTICA DOS RESULTADOS
Todas as sínteses e ensaios de caracterização de DRX foram feitos em triplicata. E todos os valores calculados foram expressos como média ± desvio padrão. A significância estatística dos dados obtidos foi estimada usando-se análise de variância
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do tipo ANOVA (two-way) seguido do teste de Tukey. O nível de significância usado foi de 95%. Logo, diferenças em p 0,05 foram consideradas não significativas.
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CAPÍTULO V
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5.1. INCORPORAÇÃO DOS METAIS A ESTRUTURA DA HA 5.1.1. Composição
Uma análise quantitativa e qualitativa dos elementos químicos presentes nas amostras foi realizada por FRX. Deste modo, foi possível calcular o teor dos elementos Ca, P, Zn e Ag para cada condição de síntese (TABELA 6).
TABELA 6. Proporção de elementos presentes (em mol) nas amostras calcinadas a 1000°C por 2h.
Amostra Elementos (Ca + M)/P Ca P Zn Ag
HA 15,159 8,793 - - 1,72
HA-Zn 15,720 8,907 0,020 (0,13%*) - 1,77
HA-Ag 15,887 9,127 - 0,010 (0,06%*) 1,74
HA-ZnAg 17,245 9,593 0,020 (0,12%*) 0,020 (0,12%*) 1,80
* Os valores percentuais foram calculados pela razão (Mn+/Ca2+)×100%
Os resultados observados na tabela (TABELA 6) indicam que a presença do Zn2+ em solução afetou de forma significativa a incorporação do Ag+ à HA. Considerando-se a quantidade de Zn2+ adicionada no momento da síntese em relação à quantidade do Ca2+ obtém-se um valor percentual de 0,10%. Após análises por FRX foi possível verificar que essa quantidade foi ligeiramente alterada para valores maiores nas amostras obtidas. Já a quantidade do Ag+ adicionada durante a síntese em relação à quantidade do Ca2+ foi de 0,13%. Nesse caso, quando o íon Ag+ foi adicionado sem a presença do Zn2+ sua entrada foi reduzida quase pela metade (0,06%). No entanto, quando o Zn2+ esteve presente em solução, valores de 0,12% foram obtidos.
