T
OXOPLASMOSE
SUÍNA.
2.
ESTUDO COMPARATIVO DAS
PROVAS DE IMUNOFLUORESCfiNCIA
INDIRETA E HEMAGLUTINA@iO,
PARA
A AVALIA@iO DE ANTICORPOS
ANTI-TOXOPLASMA EM
SOROS SUÍNOS
M. M. Ishikda,2 T. L. D ‘AngeZino3 eJ Mlk
souzd
1
NTRODU@O
Entre as provas imunológicas mais freqüentemente utilizadas no es- tudo epidemiológico da toxoplasmose destacam-se, a rea@0 de frxacáo do com- plemento (FC), a rea@0 de Sabin-Feld-
man (SF) ou teste do corante, a rea@0 de
’ Este é o segundo de urna sé& de três artigos a serem publicados, em 1986. no Bohío de h Oficim Janitmiz
Panamerkatia. 0 primeiro, em que se estuda a inocu- lacao experimental de taquizoítos de Toxopbsma gon- dii por via intraperitoneal e a evolucáo dos anticorpos comprovados pelas provas de imunofluorescência in- direta e de hemaglutina@o foi publicado no Val. 100. No. 4. 0 terceiro, em que se calcula a prevalência da infecfão toxoplásmica em suínos pelas provas de imu- nofluorescência indireta e de hemaglutinacáo, será publicado no Val. 100, No. 6.
2 Universidade de Sáo Paulo, Faculdade de Medicina Ve- terinária e Zootecnia, Departamento de Medicina Ve- terinária Preventiva e Saúde Animal, Sao Paulo, Brasil. 3 Universidade de Sáo Paulo, Faculdade de Medicina Ve- terinária e Zootecnia, Departamento de Clínica Mé- dica, Sao Paulo.
’ Universidade de Sáo Paulo, Faculdade de Saúde Pública, Departamento de Epidemiologia, Sáo Paulo.
hemaglutina@o (HA) e a de imunofluo- rescência indireta (IFI).
A tradicional prova de Sabin- Feldman (1) foi, durante muito tempo, utilizada em soros de animais, sendo paulatinamente substituída pela prova de imunofluorescência indireta (2) , que náo prescinde do microscópio de fluorescencia, mas apresenta elevada sen- sibilidade e especificidade, ou pela prova de hemaglutina@o (3), menos sofisti- cada e que exige para a sua execu@o apenas placas e pipetas apropriadas.
A rea@0 de IFI é de aceita@0
universal, tanto para a espécie humana como para algumas espécies anima& por ser considerada de fácil realiza@o, de grande sensibilidade, bastante econômi- ca e, praticamente, isenta de problemas de infeccão acidental de laboratoristas e é indicada para uso rotineiro no diagnós- tico da toxoplasmose (4).
Por outro lado, a partir da pri- meira utilita@o da HA no diagnóstico
desta protozoonose (3), esta rea@0 vem gradativamente assumindo um impor- tante papel na imunosorologia toxoplás- mica (J, 6). Apresenta maior facilidade de execu@o e interpretaSao, nao propor- cionando riscos de acidentes laboratoriais e permitindo a armazenagem do antígeno em geladeira por muito tempo (7), sendo indicada ainda para utiliza@0 rotineira em clínicas e hospitais veteriná- rios, pois necessita de pouca quantidade de soro ou sangue, além de utilizar um antígeno de fácil obtencáo no comércio e de resultados mais rápidos (8).
A rea@0 de HA apresenta in- contestáveis vantagens quando com- parada às provas de SF e IFI, pelo menos para a espécie humana. Assim, com re- la@o à primeira, tem a vantagem de dis- pensar 0 fator acessório e 0 antígeno vivo e, em relacáo à segunda, dispensa o mi- croscópio de fluorescencia o que, aliado à elevada praticabilidade, torna-a reco- mendável também para fins de inquéri- tos epidemiológicos.
Diversas modificacões foram propostas com o intuito de adaptar a HA e torná-la aplicável a soros de suínos. Substituiu-se, inicialmente, o soro nor- mal de coelho pelo soro normal de suíno e realizaram-se a lavagem e ressuspensáo dos eritrócitos com ácido tânico a 0 “C, após o que a prova de HA passou a ser exequível, fornecendo resultados compa- ráveis (90% de concordância) aos obtidos pela prova de Sabin-Feldman (9). Poste- riormente outras alterasoes foram sendo introduzidas à técnica original (3). 0 ácido tânico foi substituído pelo bis- diato-benzidina, no tratamento dos eritrócitos sensibilizados (10) e recomen- dado o uso do papel de filtro especial para a colheita de amostras de sangue, conhecido mais tarde como papel de No- buto (II).
Em Sáo Paulo, a prova de IFI foi adaptada para soros de suínos (12) re-
velando urna concordância de 96,4% quando comparada com os resultados obtidos pela técnica de Sabin-Feldman, bem como urna estreita correlacáo entre os títulos de anticorpos medidos por urna e por outra prova, avaliada pelo coefi- ciente de correla@o de Spearman (S = 0,93). Recomenda-se ainda, a utili- za@o da imunofluorescência indireta para fins de inquérito epidemiológico.
A literatura, porém, é omissa no que se refere à caracteriza@o de pro-
vas Iaboratoriais quanto a sensibilidade e especificidade (13), bem como a co-posi- tividade (valor preditivo de um resultado positivo), e co-negatividade (14) (valor
preditivo de um resultado negativo). Portanto, considerando-se a necessidade de se procurar provas labora- toriais compatíveis com as exigencias práticas de diagnóstico como: facilidade de obten@o de amostras de sangue, de execu@o e de apresentagáo dos resulta- dos, objetivou-se, neste experimento, avaliar comparativamente à IFI a concor- dancia da prova de HA. Complementar- mente, objetiva-se avaliar os valores de co-positividade e co-negatividade da prova de HA.
M
ATERIAISE
3
MÉTODOS
5
<
Colheram-se 273 amostras de i$sangue de suínos de matadouro, e em duplicata, durante a rotina de sangria, s sendo urna em tubo de centrifuga, para
e aplica@0 da prova de IFI, e outra, em pa- . pel de filtro especial, papel de Nobuto, z para a prova de HA. 9)
No laboratório, procedeu-se à $ separa@0 dos soros sanguíneos para a .M realiza@o da prova de IFI, enquanto os 2 papéis de filtro eram secos emantidos em
A prova de IFI foi realizada se- gundo a técnica descrita por Camargo
(IS) e adaptada para a espécie suína por Ishizuka (12).
A prova de HA foi realizada empregando-se antígeno liofrlizado, se- gundo a técnica adaptada por Hanaki
(10) para a espécie suína, a partir da téc- nica original de Jacobs e Lunde (3,J, utili- zando pipetas e placas para microtitu- la@o (Cooke Engineering Co.).
Analisaram-se os resultados obtidos utilizando-se as seguintes técni- cas: estatística Kappa, para medir con- cordancia (16), e o teste binomial (17), para as comparacóes entre as provas.
RE
SULTADOS
Para um estudo inicial da con- cordancia de resultados entre as provas de
IFI e HA, constituiu-se a tabela 1 onde estáo inseridos os resultados expressos em títulos de anticorpos anti-Toxopl’asma (recíproca da dilui@o), avaliados por am- bas as provas.
Observou-se que, dentre os resultados positivos a pelo menos um dos métodos, 39,2% (621153) forneceram resultados concordantes e tiveram o mesmo título em ambas as provas, en- quanto que 50,6% (801158) apresen-
taram discrepancia de urna dilu@o e
lO,l% (161158) se afastaram de duas di- luiSoes ou mais, sendo que títulos mais elevados foram observados somente pela
IFI .
Pela observa@0 da tabela 1,
verifica-se certa tendência a urna distri- bui@o triangular, favorecendo o lado re- presentado pela prova de imunofluores- cência indireta. Com esses dados, elaborou-se a tabela 2, onde estáo apre- sentados os resultados de ambas as pro- vas, classificados em reagentes e náo reagentes.
Pelos dados da tabela 2, veri- fica-se que as provas apresentaram em 84,2 % dos casos resultados concordantes e em 15,8% resultados discordantes, re- spectivamente 230 e 43 soros, sendo que estes últimos foram reagentes somente à prova de IFI. 0 grau de concordância Kappa foi da ordem de 69,2%. Revela ainda, que a porcentagem de reagentes pela IFI (158/273=57,9%) é maior do que a obtida pela HA (115/273= 42,1% ). 0 teste binomial para a diferen- sa de propo@es de duas popula@es cor- relatas apresentou, neste caso, resultado significativo ao nível de rejeisão adotado de 5%.
TABELA 1. Número de soros de suinos, segundo os títulos de anticorpos anti- ?bxap/asma avaliados pelas provas de imunofluorescência indireta (IFI) e de he- maglutina@o (HA). São Paula, 1983.
HA IFI <64 <16 115 16 41 64 1 256 - 1 024 1 4 096 Total 158 - 64 39 30 8 1 7% 256 17 8 5 30 1 024 4 096 Total 115 41 40 - 47 3 20 1 3 4 3 2::
TABELA 2. Número de soros de suínos, segundo 0 resul- tado das provas de imunoluoresdncia indireta (IFI) e de hemaglutina~ão (HA). Sáo Paulo, 1983.
HA IFI Negativos Negativos 115 Positivos 43 Total 158 Positivos Total 0 115 115 158 (57.9%) 115 273 (42.1%) (100%)
Em relacão à IFI, neste caso empregada somente como referencia, a prova de HA apresentou um índice de co- positividade de 72,3% (115/158) e de co-negatividade de 100% (1151115).
Através do exame da litera- tura depreende-se que, para os estudos de prevalência, as reagóes de Sabin-Feld- man, de IFI e de HA foram usadas com maior freqüência. No entanto, nesses re- latos, observa-se que não existe urna pa- dronizasão dos antígenos utilizados nos inquéritos realizados, como também náo existe uniformidade de dilui@es nas pro- vas e nem na considera@0 dos títulos a serem imputados como positivos, fatores esses que, provavelmente, podem causar dificuldades na avalia$io epidemiológica da toxoplasmose .
A prova de IFI, para fms de avaliasão de anticorpos anti-Toxopdu.sma em soros de suínos, mostrou-se adequada para fins de levantamentos sorológicos (12). A desvantagem dessa prova refere- se ao uso do microscópio de fluorescên- cia, inacessível a muitos pesquisadores, principalmente aos veterinários de campo.
A prova de HA foi preconi- zada pois se caracterizava pela maior praticabilidade do que a de IFI, dispen-
sando, inclusive, o microscópio de fluorescência (3). ModificaSões poste- riores (9, 10) adaptaram a referida prova para a espécie suína que foi testada, nesta pesquisa, comparando-a à prova de IFI.
A análise dos dados cons- tantes da tabela 1 permitiu avaliar, ini- cialmente, a concordância dos títulos de anticorpos, medidos pelas provas de IFI e HA e, apesar da concordância ser da or- dem de 39,2%, a discordância foi, na quase totalidade dos casos (50,6%), de apenas urna diluisão. A prova de IFI de- monstrou maior número de títulos eleva- dos, daí a tendencia à distribui@o trian- gular verificada nessa tabela, que favorece o lado representado por esta prova.
Os resultados apresentados na tabela 2 mostraram existir urna concor- dância náo ajustada para o acaso, entre os resultados obtidos com as duas provas, da ordem de 84,2%. Por outro lado, a concordância medida pela estatística Kappa, que leva em considera@0 acertos devidos puramente ao acaso, foi de 69,2 % . A prova de IFI, porém, detectou maior porcentagem de reagentes do que a de HA. Este fato foi comprovado pelo teste binomial, que apresentou resultado
estatisticamente signifkativo, demons- “z trando ser a primeira prova mais sensível “r do que a segunda. Isto é facilmente com- 5 preensível pelo fato da prova de IFI per-
2 mitir a observa@0 de resultados positivos s em menores diluicões, pois inicia-se a 2 prova com diluisáo 1:16, contra 164 na
prova de HA. A implica@0 de maior im-
5
portância nessa diferensa se refere ao E valor da taxa de prevalência da doenfa . que variará segundo a técnica empre- gada.
% Os índices de co-positividade
e co-negatividade da prova de HA, utili-
i z zando-se a IFI como prova de referencia, 3 foram 72,8% (115/158) e 100% (1151 G
11.5) respectivamente. Este tipo de
-
ve1 determinar a verdadeira prevalência de urna doenfa, e entáo a validade de um determinado teste é julgada medindo-se sua associa@o com um outro bem estabe- lecido (14).
Da tabela 2 depreende-se ainda que 158 (57,9%) dos 273 suínos examinados, abatidos em matadouro, foram reagentes à prova de IFI, enquanto
que ll 5 (42,1% ) foram reagentes à prova de HA. Este aspecto deve ser ressal- tado, pois revela que um grande número dos suínos destinados à alimenta@0 hu- mana, albergam o Toxophsma gondii,
havendo, portanto, o risco de infectar os consumidores.
C
ONCLUS6ES
Os resultados obtidos através da metodologia empregada permitem concluir:
1 As provas de imunofluores- cência indireta e de hemaglutinacáo apresentaram urna concordância da or- dem de 84,3 % . Pela estatística Kappa, que leva em considerasão os possíveis acertos devidos ao acaso, a concordancia foi de 69,2%.
2 Os índices de co-positividade e de co-negatividade da hemaglutina@o, em rela@ à imunofluorescência in- direta, foram respectivamente, 72,8% e
100%.
RE
SUMO
0 objetivo deste artigo é fazer urna compara@0 dos resultados das pro- vas de imunofluorescência indireta (IFI) e
de hemaglutina@o (HA), de anticorpos anti-Toxoplasma, em soros de suínos, e
calcular quantos soros eram positivos e quantos negativos a ambas as provas (co- positividade e co-negatividade). Para a realiza@0 do estudo de concordancia das provas examinaram-se 273 suínos abati- dos em matadouro utilizando a prova es- tatística Kappa, que leva em conside- ra@o acertos devidos ao acaso, obtendo urna concordância de 69,2 % . 0 índice de co-positividade de HA, em relacáo à IFI, foi de 72,8% e o de co-negatividade foi de 100% . q
A
GRADECIMENTOS
Ao Laboratório Daiichi-Seya- ku Co. do Japáo, por ter cedido gen- tilmente o papel de filtro e antígeno liofilizado usado no teste de hemagluti- na$o .
RE
FERkNCIAS
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7 8 9 10 11 12
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RE
SUMEN
TOXOPLASMOSIS
PORCINA. 2. ESTUDIO
COMPARATIVO DE LAS
PRUEBAS DE
INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA Y
H-EMAGLUTINACION PARA
COMPROBAR LA
EXISTENCIA DE
ANTICUERPOS CONTRA
i!-OXOPLAS1MA
EN SUEROS
PORCINOS
El objetivo de este artículo es efectuar una comparación de los resultados
de las pruebas de inmunofluorescencia in-
directa (IEI) y de hemaglutinación (HA) sobre
anticuerpos contra Toxoplásma en sueros por- s tinos y calcular cuántos sueros eran positivos y ‘>r
cuántos negativos a ambas pruebas (copo- 5 sitividad y conegatividad). Para la realización 2 del estudio de concordancia de las pruebas se $ examinaron 273 cerdos sacrificados en mata- deros. Se utilizó la prueba estadística Kappa, 2 que toma en consideración los aciertos debi-
2 dos al azar; la prueba dio una concordancia R de 69,2%. El índice de copositividad de HA 2
en relación con IFI fue de 72,8 % y de conega- .
tividad de 100%. 4;
e 2
S
UMMARY
SUMÉ
PORCINE TOXOPLASMOSIS.
2.COMPARATIVE STUDY
OF INDIRECT
IMMUNOFLUORESCENCE
AND
HEMAGGLUTINATION
TESTS FOR ASSESSMENT OF
Z-DXOPLASMA ANTIBODIES
IN PORCINE SERA
This article compares the results of indirect immunofluorescence (HF) and he- magglutination (HA) tests for TOxoplasma an- tibodies in sera from pigs, and calculates how many sera are positive and how many nega- tive to both tests (copositivity and conegativ- ity). To determine the agreement between these tests, 273 pigs killed in slaughterhouses were examined and the findings subjected to the Kappa statistical test, based on random matches. A correlation of 69,2 % was ob- tained; the index of HA copositivity with UF
was 72,8%, and that of conegativity 100%.
TO_XOPLASMOSE
PORCINE.
2. ET,UDE COMPAI%ATIVE
DES EPREUVES
D’IMMUNOFLUORESCENCE
IND@ECTE ET
D’HEM~GGLUTINATION
POJJR VERIFIER LA
PRESENCE
D’ANTICORPS
CONTRE LA
TQXOPLASMOSE DANS LES
SERUMS PORCINS
L’objet de cet article est de com- parer les résultats des épreuves d’immuno- fluorescente indirecte (IFI) et d’hémaggluti- nation (HA) appliquées à des sérums porcins pour vérifier la présence d’anticorps centre la toxoplasmose et de déterminer cambien de sérums étaient positifs et cambien étaient né- gatifs dans les deux épreuves (copositivité et conégativité). Pour étudier la concordante des épreuves, on a examiné 273 porcs tués dans des abattoirs. Cet examen a fait inter- venir I’épreuve statistique Kappa, qui tient compte des résultats dus au hasard, et l’on a obtenu une concordante de 69,2 % . Lindice de copositivité de HA par rapport 5 IFI a été de
72,8% et l’indice de conégativité a été de
