(22) Data do Depósito: 07/11/2014 (43) Data da Publicação: 07/06/2016 (21)
BR 102014027804-4 A2
Ministério da Indústria, Comércio Exterior
República Federativa do Brasil
Instituto Nacional da Propriedade Industrial e Serviços
*BR102014027804A
(54) Título: PROCESSO DE
DESENVOLVIMENTO DE HEPARINA NÃO FRACIONADA DE ALTO PESO MOLECULAR, HEPARINA NÃO FRACIONADA DE ALTO PESO MOLECULAR E USOS DA MESMA (51) Int. Cl.: A61K 31/727; A61K 31/715; C08B 37/00
(52) CPC: A61K 31/727; A61K 31/715; C08B 37/0075
(73) Titular(es): UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO (72) Inventor(es): MATHEUS BERTANHA, ANDREI MOROZ, MARCONE LIMA SOBREIRA, SÉRGIO LUIS FELISBINO, ELENICE DEFFUNE (74) Procurador(es): FABÍOLA DE MORAES SPIANDORELLO
(57) Resumo: PROCESSO DE
DESENVOLVIMENTO DE HEPARINA NÃO FRACIONADA DE ALTO PESO MOLECULAR, HEPARINA NÃO FRACIONADA DE ALTO PESO MOLECULAR E USOS DA MESMA. presente invenção refere-se ao processo de desenvolvimenro de orna heparina neo fracionada de alto peso molecoler. A mesma é prodozida por filtração por peso molecular em tubo de concentração e purificações moleculares utilizando heparina não funcionada (HNF) que possui um "pool" de moléculas de variados pesos moleculares (5000 a 33000 Da) e então elimina a fração de baixo peso, pois o filtro elimina as moléculas menores que 1000Da, restando heparina de alto peso molecular. Experimentos in vitro, preliminares, comprovaram que células tumorais
apresentaram significativa diminuição na celular ao frasco de cultura.
PROCESSO DE DESENVOLVIMENTO DE HEPARINA NÃO FRACIONADA DE ALTO PESO MOLECULAR, HEPARINA NÃO FRACIONADA DE ALTO PESO
MOLECULAR E USOS DA MESMA CAMPO DA INVENÇÃO
[1] A presente invenção se insere no campo de aplicação da Química, Farmácia, Medicina e, mais especificamente, na
médicas uma vez desenvolvimento de
área de que se heparina
preparações para finalidades refere ao
não fracionada
processo de de alto peso molecular e uso da mesma para tratamento, controle, e prevenção de câncer metastático.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[2] A coleta de sangue de animais com uso de diferentes heparinas tem comportamento di verso em cultura celular, aderindo mais ou menos aos frascos de cultura, na dependência da formulação da heparina utilizada. Em estudo descrito na literatura, identificou-se em cultura de células tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTMta) de coelhos a diferença da adesão e proliferação celular, na dependência das características farmacológicas da heparina utilizada como meio de coleta.
[3] Este experimento tinha como objetivo estimular as CTMta de coelhos a se diferenciarem em endotélio, dentro de uma proposta em modelo animal, com vistas à engenharia de tecidos na área vascular. As culturas foram suplementadas com heparina não fracionada (HNF) uma vez que a mesma, em princípio, em baixas dosagens, auxilia na diferenciação endotelial. Porém observou se de forma repeti ti v a que as culturas suplementadas com HNF não apresentavam a esperada aderência celular aos frascos de cultura. Com base nesses
resultados e em relatos sustentados de que os pacientes portadores de câncer metastático em tratamento com heparina vêm apresentando sobrevida maior que os indivíduos sem este tratamento r a presente invenção
desenvolvimento de heparina não
refere-se ao processo de fracionada de alto peso molecular e seu uso no tratamento do câncer, inibindo a adesão e multiplicação de células neoplásicas.
[4] Sabe-se que o câncer (CA) metastático constitui-se uma das patologias mais devastadoras da atualidade, mantendo altas taxas de morbimortalidade e com os piores resultados nos tratamentos existentes. É de fundamental importância o desenvolvimento de novas medicações que venham a colaborar com a melhora da sobrevida e aumento das chances de cura nesta patologia.
ESTADO DA TÉCNICA
[5] O pedido de patente W02013045955 refere-se à
utilização de derivados de heparina para a prevenção e I ou tratamento de metástases do câncer. Tal documento descreve o uso de uma substância, uma mudança molecular na heparina com sulfatação ou hidratação, de forma que o resultado obtido é uma substância sem poder anticoagulante. O peso molecular varia entre 300 Da e 30000 Da, diferente do que é proposto na presente invenção.
[6] O pedido de patente US2012027744 refere-se à
heparinase III e os seus derivados. As formas modificadas de heparinase III têm atividade enzimática reduzida, que são úteis para uma variedade de fins. Tal documento não entra em conflito com a presente invenção, pois descreve uma modificação na molécula de heparinase III pura, substância diferente da proposta pela mesma.
[7] O pedido de patente CN102309748 descreve a aplicação de heparina fibronectina N-terminal e C-terminal combinando peptídeos de domínio para a elaboração de um medicamento para resistir à invasão de células de câncer de
fígado e metástases. Tal documento refere-se ao processo de adesão de uma heparina ao polipeptídio de fibronectina fora do foco da presente invenção.
[8] O pedido de patente W003047501 descreve um tratamento para o câncer e, em particular, os compostos terapêuticos que bloqueiam a capacidade de citocinas e quimiocinas de promoverem metástases de células malignas. O composto terapêutico compreende
carboxilado e I ou sulfatado, de
um oligossacarídeo preferência numa forma substancialmente purificada, que é uma heparina ou um heparan-sulfato derivado de um composto sacarídeo. Tal documento consiste de um oligossacarídeo sulfatado ou carboxilado purificado, com peso molecular inferior a 3000 Da, mas preferencialmente entre 400 e 1100 Da. Embora apresente a mesma função, trata-se de uma heparina de extremo baixo peso molecular, ao contrário da proposta na presente invenção.
Objetivos e vantagens da invenção
[ 9] A presente invenção tem por objetivo a obtenção de uma nova heparina de alto peso molecular através do processo de filtração, com uso da mesma para fabricação de uma composição para tratamento, controle, e prevenção de câncer metastático.
[ 10] Frente ao desafio do tratamento do câncer, este medicamento pode ajudar no tratamento/controle/prevenção da progressão do câncer para câncer metastático e ainda pode
ser coadjuvante no tratamento do câncer em fases menos avançadas.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[11] A presente invenção refere-se ao processo de desenvolvimento de uma heparina não fracionada de alto peso molecular. A mesma é produzida por filtração por peso molecular em tubo de concentração e purificações moleculares utilizando heparina não fracionada (HNF) que possui um "pool" de moléculas de variados pesos moleculares (5000 a 33000 Da) e então elimina a fração de baixo peso pois o filtro elimina as moléculas menores que 10000 Da, restando heparina de alto peso molecular (HAPM) . Experimentos in
células tumorais
vi tro, preliminares, comprovaram que apresentaram significativa diminuição na adesão celular ao frasco de cultura.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[12] A Figura 1 mostra imagens representativas da contagem celular: A. Controle; B HBPM; C NHF; D HAPM.
[13] A Figura 2 representa graficamente a contagem celular do controle - linhagem PC3 em cultura celular com DMEM-F12 aditivada com 10% SFB (x104 células).
[14] A Figura 3 representa graficamente a contagem celular da linhagem de PC3 em cultura celular com DMEM-F12 aditivada com 10% SFB (x104 células) na presença de heparina de baixo peso molecular (HBPM) .
[15] A Figura 4 representa graficamente a contagem celular da linhagem de PC3 em cultura celular com DMEM-Fl2 aditivada com 10% SFB (x104 células) na presença de heparina não fracionada (HNF) .
celular da linhagem de PC3 em cultura celular com DMEM-Fl2 aditivada com 10% SFB (xl04 células) na presença de heparina de alto peso molecular (HAPM).
[ 17] A Figura 6 representa graficamente a média aritmética da contagem celular da linhagem de PC3 em cultura celular com DMEM-Fl2 aditivada com 10% SFB (Xl04
células) na presença dos diferentes tratamentos, com linha de tendência - 1= controle; 2=HBPM; 3=HNF e 4=HAPM.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[18] A presente invenção refere-se ao processo de desenvolvimento de uma heparina não fracionada (HNF) de alto peso molecular que compreende: Filtração da HNF com moléculas de peso entre 5000 Da a 33000 Da através da filtragem com filtro para 10000 Da, o qual é centrifugado por 15 a 25 minutos (média de 20 minutos) a 4500 rpm a 5300 rpm (média de 4900 rpm) e produz um filtrado de baixo peso e um sobrenadante retido livre das moléculas de menor peso molecular.
[ 19] Dessa forma foi obtida uma heparina de maior peso molecular e livre de heparina de baixo peso,
variando de 10000 Da a 33000 Da (peso aproximadamente 18000 Da)
Estudo in vi tro
com peso médio de
[20] Para os testes in vitro utilizaram-se 2Xl04 células da linhagem tumoral metastática prostática humana PC3 por poço da placa de cultura aderente de 6 poços, onde foram comparadas várias heparinas disponíveis no mercado e com pesos moleculares variados: 0,1 mg de heparina de baixo peso molecular (HBPM) ; O, 1 mg de HNF; e o controle do experimento sem adição de medicamentos. Após 48 h de
cultura, o meio sobrenadante foi removido cuidadosamente e o fundo da placa foi corado para proceder à contagem
celular e a observação microscópica. Diante dos resultados favoráveis à HNF que apresenta maior peso molecular e foi
capaz de inibir a adesão celular (contrariamente ao que se revela pela literatura científica que recomenda a
anticoagulação dos pacientes portadores de trombose venosa profunda e CA metastático com HBPM), foi delineado protocolo de produção de uma nova heparina, mais pesada.
[21] Deu-se seguimento ao protocolo de cultura celular
in vitro com as mesmas células PC3, onde foram plaqueadas
2X104 células por poço de placa aderente com 24 poços. Todos os procedimentos foram realizados em sextuplicada. Constituiu-se um grupo controle, um grupo com HBPM 0,1 mg, um grupo com HNF 0,1 mg e um grupo com o produto novo de heparina de maior peso molecular e livre de baixo peso molecular 0,1 mg (seis poços para cada teste)
o
experimento foi mantido em incubadora de C02 (5%), com meioDMEM-F12 apropriado para a cultura por 24 h. Procedeu-se a contagem das células aderidas após a retirada do meio, por tripsinização, centrifugação e contagem em microscópio, através da coloração das células e uso da câmara de Neubauer. Procedeu-se também a contagem das células não aderidas contidas no meio de cultura retirado previamente, por meio de centrifugação e contagem em microscópio, através da coloração das células e uso da câmara de Neubauer. Estas contagens foram realizadas em cinco replicatas de cada condição experimental. A última (sexta) replicata foi corada e observada ao microscópio.
mostram os resultados obtidos.
Tabela 1: Contagem celular
Poços Controle células
sx
104 3,5X 104 2,5X 104 7X 104 4X 104 CORADA aderidas Controlecélulas não 0,25X 104
o
O,SX 104o
0,25X 104-aderidas
Heparina de Baixo Peso
Molecular 5,5X104 3,5X104 2,5X104 6,0X104 4, OX104 CORADA
células aderidas Heparina de Baixo Peso 1,25X104 O, 75X104 1,75X104 0,5X104 1,5X104 Células não aderidas Heparina não fracionada 2,5X104 2,0X104 1,5X104 3,0X104 5,0X104 CORADA células aderidas Heparina não fracionada 1,25X104
o
0,25X104 1,75X104 1,25X104 -Células não aderidas Heparina de alto Peso Molecular - 3,0X104 1,5X104 2,0X104 6,0X104 1,5X104 CORADA células aderidas Heparina de alto Peso Molecular 1,0X104 1,0X10 1,25X104 1,0X104 1,25X104 -Células não aderidas[23] Em todos os poços foram plaqueadas 2Xl04 células PC3. O controle recebeu DMEM-F12 com 10% de soro fetal bovino. Em 5 poços foi procedida a contagem celular após 24
horas (células aderentes e não aderentes) e o último poço de cada experimento foi reservado para coloração histológica com corante azul de Toluidina e observação direta ao microscópio para garantia dos resultados, sendo que observou-se uma diminuição expressiva da quantidade de células aderidas no poço que utilizou a heparina não
fracionada de alto peso molecular, sendo os resultados estimados pela contagem de 5 campos aleatórios: controle com 4x104 células; HBPM com 3,7x104 células; HNF com 3,5x104 células; e HAPM com 2,8x104 células (Figura 1).
[24] Na Figura 2 observa-se que no controle encontram-se as células com as maiores taxas de adesão. Na Figura 3, experimento com HBPM, a média de células aderidas é semelhante ao controle; no entanto, a média de células não aderidas é maior. Na Figura 4, observa-se que a HNF modula a adesão, ou seja, inibe de certa forma. Já na Figura 5, a HAPM na dose utilizada, tende a impedir a adesão das células da linhagem PC3.
[25] Assim, a heparina não fracionada de alto peso molecular obtida pelo processo já anteriormente descri to neste relatório pode ser usada na fabricação de um medicamento para tratamento/controle/prevenção da progressão do câncer para câncer metastático e ainda pode ser complementar no tratamento do câncer em fases menos avançadas.
[26] Embora a presente invenção tenha sido descrita e ilustrada em sua versão
que a mesma não é
preferida, limitada.
deve Assim modificações, adaptações, variações,
ser compreendido sendo, várias substituições, combinações e equivalentes podem ser praticadas, sem que se desvie do escopo da invenção, conforme estabelecido nas reivindicações.
REIVINDICAÇÕES
1. Processo de desenvolvimento de heparina não
fracionada de alto peso molecular CARACTERIZADO por ser um
processo de filtração de moléculas de heparinas não
fracionadas com peso molecular entre 5000 e 33000 Da
através da filtragem com filtro para 10000 Da.
2. Processo, de acordo com a rei vindicação 1,
CARACTERIZADO por o filtro ser centrifugado por 15 a 25
minutos, média de 20 minutos, entre 4500 rpm a 5300 rpm,
média de 4900 rpm, e produzir um filtrado de baixo peso e
um sobrenadante retido livre das moléculas de menor peso
molecular.
3. Heparina não fracionada de alto peso molecular
CARACTERIZADA por ser produzida pelo processo, conforme
definido nas reivindicações 1 e 2.
4 . Heparina, de acordo com a reivindicação 3,
CARACTERIZADA por compreender moléculas com peso de 10000
Da a 33000 Da e peso médio de 18000 Da.
5. Uso da heparina não fracionada de alto peso
molecular, conforme definida nas reivindicações 3 e 4,
CARACTERIZADO por ser na fabricação de um medicamento para
tratamento, controle, e prevenção de câncer metastático.
6. Uso da heparina não fracionada de alto peso
molecular, conforme definida nas reivindicações 3 e 4,
CARACTERIZADO por ser na fabricação de um medicamento para
complementar no tratamento do câncer em fases menos
8 7 6 5 4 3 2 1
o
Figura 1 1 2 3 4 5 Figura 27 6 -5 4 3 2 1
o
1 2 6 5 4 3 2 1o
1 2 3 4 5 Figura 3 3 4 5 Figura 4 na Baixo Peso não aderidas7 6 5 4 3 2 1
o
5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 o 1 2 o 1 2 3 4 5 Figura 5 3 4 Figura 6 5 de alto Peso Molecular-cels aderidas não aderidas aderidas --Linear (Aderidas) --linear (Nào aderidas)RESUMO
PROCESSO DE DESENVOLVIMENTO DE HEPARINA NÃO FRACIONADA DE ALTO PESO MOLECULAR, HEPARINA NÃO FRACIONADA DE ALTO PESO
MOLECULAR E USOS DA MESMA
A presente invenção refere-se ao processo de
desenvolvimento de uma heparina não fracionada de alto peso molecular. A mesma é produzida por filtração por peso molecular em tubo de concentração e purificações moleculares utilizando heparina não fracionada (HNF) que possui um "pool" de moléculas de variados pesos moleculares (5000 a 33000 Da) e então elimina a fração de baixo peso, pois o filtro elimina as moléculas menores que 10000 Da, restando heparina de alto peso molecular. Experimentos in vitro, preliminares, comprovaram que células tumorais apresentaram significativa diminuição na adesão celular ao frasco de cultura.
