NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ANA LIA MAZZETI
Benznidazol em combinação com alopurinol:
aumento da atividade anti- Trypanosoma cruzi in vitro e in vivo
OURO PRETO
2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Benznidazol em combinação com alopurinol:
aumento da atividade anti- Trypanosoma cruzi in vitro e in vivo
AUTOR: Ana Lia Mazzeti
ORIENTADORA: Maria Terezinha Bahia
CO-ORIENTADORA: Lívia de Figueiredo Diniz
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação de Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração: Imunobiologia de Protozoários.
OURO PRETO 2014
M477b Mazzeti, Ana Lia.
Benznidazol em combinação com alopurinol [manuscrito]: aumento da atividade anti-Trypanosoma cruzi in vitro e in
vivo / Ana Lia Mazzeti. - 2014. 67f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientador: Profa. Dra. Maria Terezinha Bahia. Coorientador: Profa. Dra. Lívia de Figueiredo Diniz. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas.Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas.
Área de Concentração Imunobiologia de Protozoários. 1. Chagas, Doença de. 2. Trypanosoma cruzi. 3.
Tripanossomose - Tratamento. I. Bahia, Maria Terezinha. II. Diniz, Lívia de Figueiredo. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.
CDU: 616.937
Aos meus pais, Marina e Luiz, pelo apoio incondicional. A minha família pelo companheirismo. Ao Carlos pelo amor e companhia. A todos do LADOC pelo aprendizado.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por guiar meus passos e pela proteção.
À minha família por ser meu alicerce e meu porto seguro. Aos meus pais, Luís e Marina, por me apoiar em tudo na minha vida e por darem meios para que eu pudesse conseguir o que quero. Aos meus irmãos, Júlio e Juliana por serem meus companheiros. Meus tios, tias e primas pela constante presença e incentivo. Vô e vó, pelo exemplo, orações e, principalmente, pelo amor.
A todos meus amigos de Guaranésia e Ouro Preto por tornarem minha jornada mais divertida.
A República Patotinha, moradoras, ex-alunas e D. Linda, por me proporcionarem um lar nesta cidade.
Ao Carlos por todo amor, companheirismo, compreensão, ajuda, enfim por tudo, simplesmente essencial em minha vida.
A todos os colegas do Laboratório Doença de Chagas, alunos de iniciação, mestrandos e doutorandos pela ajuda e pelo conhecimento compartilhado.
Aos colegas de mestrado pelo convívio e ajuda essenciais na minha caminhada. A Lívia e Lud pela ajuda e pelos conhecimentos partilhados, imprescindíveis para minha formação.
À professora Terezinha pela orientação e suporte para que eu pudesse executar este trabalho com qualidade.
À UFOP, Capes, DNDi (Drugs for Neglected Diseases Initiative) e Fapemig pelo apoio financeiro.
E a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Trypanosoma cruzi e a doença de Chagas ... 2
1.1. Quimioterapia para a doença de Chagas ... 4
1.2. Os inibidores da via de salvação de purinas ... 7
1.4 A terapia de combinação de fármacos no tratamento da infecção por T.cruzi .. 9
2. JUSTIFICATIVA ... 11 3. OBJETIVOS ... 13 3.1. Objetivo geral ... 14 3.2. Objetivos específicos ... 14 4. METODOLOGIA ... 15 4.1. Parasito ... 16 4.2. Fármacos ... 16 4.3. Experimentos in vitro ... 16 4.3.1. Cultivos de células H9c2 ... 16
4.3.2. Obtenção de formas tripomastigotas de cultura celular ... 17
4.3.3. Ensaios de citotoxicidade ... 17
4.3.4. Avaliação da atividade anti-T. cruzi dos fármacos benznidazol e alopurinol sobre formas amastigotas: definição da IC-50 ... 18
4.3.5. Avaliação da interação de benznidazol e alopurinol sobre formas amastigotas ... 19
4.3.6. Análise estatística – experimentos in vitro ... 20
4.4. Experimentos in vivo ... 20
4.4.2. Infecção e esquema de tratamento ... 21
4.4.3. Avaliação da eficácia do tratamento ... 21
4.4.4. Exame de sangue fresco ... 23
4.4.5. Extração do DNA e realização da PCR de sangue periférico... 23
4.4.6. Mortalidade ... 24
4.4.7. Avaliação Sorológica ... 24
4.4.8. Análise estatística dos experimentos in vivo ... 25
5. RESULTADOS ... 26
5.1. Resultados in vitro ... 27
5.1.1. Determinação da citotoxicidade dos compostos avaliados e de suas combinações para células de mamíferos ... 27
5.1.2. Avaliação da atividade anti-T.cruzi alopurinol e benznidazol utilizando células H9c2 infectadas pela cepa Y ... 28
5.2. Resultados in vivo ... 34
6. DISCUSSÃO ... 44
7. CONCLUSÃO ... 533
RESUMO
O tratamento da doença de Chagas apresenta limitações relacionadas à sua eficácia variável, particularmente na fase crônica, e aos efeitos adversos frequentes, que podem levar à interrupção do tratamento. A terapia de combinação de fármaco parece ser uma estratégia ideal, já que pode contribuir para o aumento da eficácia do tratamento, diminuição da toxicidade e da probabilidade de desenvolvimento de resistência. No presente estudo foi avaliada a atividade do alopurinol (Al) em combinação com o benznidazol (Bz) na infecção experimental por T. cruzi. Inicialmente, foi verificada a atividade da combinação Bz/Al sobre a infecção de células H9c2 infectadas pela cepa Y de T. cruzi, incubando-as com diferentes concentrações de cada composto isoladamente ou em combinação. Foi utilizado, in vitro, o método de diluição “tabuleiro de dama” (checkerboard) e os resultados foram analisados utilizando índice de combinação (CI) calculado pelo software Calcusyn. A avaliação global dos resultados demonstrou que os CI variaram no intervalo de 0,62 a 1,76, o que sugeriu um efeito aditivo resultante da associação in vitro dos compostos avaliados. Posteriormente, foi realizada a avaliação in vivo da combinação Bz/Al. Para isso, camundongos Swiss fêmeas foram inoculados com 5000 formas tripomastigotas sanguíneos da cepa Y de T.
cruzi. O tratamento foi administrado por via oral durante 20 dias consecutivos, iniciado
quatro dias após a inoculação. Os animais foram tratados com Bz (100, 75, 50 e 25 mg/kg) ou Al (90, 60 e 30 mg/kg) isoladamente ou em combinação (Bz/Al: 75/90 75/60 75/30, 50/90 , 50/60, 50/30, 25/90 , 25/60 e 25/30 mg/kg ). Os seguintes parâmetros foram utilizados para determinação da cura parasitológica: exame de sangue a fresco durante e até 60 dias após o tratamento e ensaio de PCR em tempo real de amostras de sangue (30 e 180 dias após o tratamento). A análise dos níveis de parasitemia após o tratamento com Bz mostrou um efeito tripanocida dose-dependente. Entretanto, mesmo havendo uma redução significativa do nível de parasitemia após o tratamento, a cura parasitológica foi identificada apenas nos animais tratados com 75 e 100mg de Bz por kg de peso corporal (20 e 70 % de cura, respectivamente). De forma diferente, não foi verificada efeito dose-dependente resultante do tratamento com Al. Além disso, não foi observada redução da parasitemia nem cura entre os animais que receberam diferentes doses desse fármaco. Posteriormente, foi avaliado o efeito das combinações entre Bz/Al,
in vivo. O efeito benéfico das combinações dos fármacos foi demonstrado pela redução
combinação. Além disso, foi observado um aumento no índice de cura entre os animais tratados com os fármacos em combinação, uma vez que a administração de Bz-75 mg/kg + Al-90 mg/kg ou Bz-75 mg/kg + Al-60 mg/kg induziu 100 % de cura, e a combinação de Bz-75 mg/kg + Al-30 mg/kg ou Bz-50 mg/kg + Al-60 mg/kg induziu, respectivamente, 80 e 20 % de cura. Em conclusão, a combinação de Bz e Al apresentou um efeito benéfico, uma vez que foi identificada cura parasitológica em uma proporção maior de animais tratados com os medicamentos em associação do que naqueles que receberam as mesmas doses de cada fármaco em monoterapia. Nossos resultados reforçam a importância da identificação de combinações de compostos já comercializados que apresentem uma interação positiva no tratamento da infecção por
T. cruzi. Esta abordagem pode contribuir para otimizar os custos e tempo investidas na
pesquisa relacionada à toxicidade e a biodisponibilidade de novas drogas para o consumo humano.
Palavras chaves: Doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, terapia de combinação, Benznidazol, Alopurinol.
ABSTRACT
Current chemotherapy for Chagas disease is unsatisfactory due to its limited and variable efficacy, particularly in chronic phase, and frequent side effects that can lead to treatment discontinuation. Combined therapy is envisioned as an ideal approach since it may improve treatment efficacy and decrease toxicity and resistance likelihood. In this work, we evaluated the activity of the alopurinol (Al) in combination with the benznidazole (Bz) upon T. cruzi infection. First, we investigated the activity of the Bz/Al combination on intracellular parasites of Y stain by incubating T. cruzi-infected H9c2 cells with different concentrations of each compound alone or in combination. In
vitro drug interactions were assessed using a “checkerboard method” and the results
were analyzed by calculating of the combination index (CI) using Calcusyn software.The overall assessment of the results demonstrated CI (0,62 a 1,76) suggesting an in vitro additive effect between the evaluated drug combination. Subsequently, the in
vivo evaluation of the Bz/Al combination was performed in mice infected with 5000
blood tripomastigotes of Y stain. Treatment was administered orally for 20 consecutive days, beginning at 4 days after inoculation. Animals were treated with Bz (100, 75, 50 e 25 mg/kg) or All (90, 60 e 30 mg/kg) alone or in combination (Bz/Al: 75/90, 75/60, 75/30, 50/90, 50/60, 50/30, 25/90, 25/60 e 25/30 mg/kg). The parameters chosen to determine parasitological cure were parasitaemia during and up to 60 days after treatment and blood real time PCR assay (30 and 180 days post treatment). First, the effects of several doses of each drug alone on the evolution of the infection in mice were evaluated. The analysis of parasitemia levels after Bz-treatment showed a dose-dependent trypanocidal effect. Although there was significant reduction in the level of parasitemia after treatment, parasitological cure was documented only in animals treated with 75 and100 mg of Bz per kg of body weight (20 and 70 % of cure, respectively). Differently, a dose-dependent effect was not observed among treated animal and the parasitemia reduction or cure was not verified among animals that received different doses of Al. In a second series of data analyses, the activities of the combinations of the Bz/Al were compared. Here the beneficial effect of the drug combinations was demonstrated by a significant reduction of parasitemia detected in all animals that received the combination therapy. Besides increase in rate of cure among animals treated with combination therapy was observed, since the combination of the Bz-75 mg/kg + Al-90 mg/kg or Bz-75 mg/kg + Al-60 mg/kg induced 100% of cure, and the
combination of 75 mg/kg + Al-30 mg/kg or Bz-50 mg/kg + Al-60 mg/kg induced, respectively, 80 and 20% of cure. In conclusion, the combination of Bz and Al suggest a beneficial effect, as parasitological cure was observed in a higher proportion of animals treated with the drugs in association than in animals receiving the same dose of each of the drugs in monotherapy. Our results reinforce the importance of identifying already-marketed compounds with synergistic effects. This approach may help avoid expensive and time-consuming research on the toxicity and biological availability of drugs for human consumption.
Keywords: Chagas disease, Trypanosoma cruzi, combination therapy, Allopurinol, Benznidazol.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Fórmula estrutural do benznidazol [n-benzyl-2-(2-nitro-1h-imidazol-1-yl)acetamide] ... 5
FIGURA 2: Fórmula estrutural do alopurinol [1,5-diidro-4h-pirazol[3,4-d]-pirimidina-4-ona] ... 7
FIGURA 3: Desenho esquemático do método de “tabuleiro de damas” de diluição de fármacos para testes de combinação in vitro. Foram utilizadas concentrações fixas de alopurinol (500, 100 ou 10 µm) e associadas a diferentes concentrações de benznidazol (5; 2,5; 1,25 ou 0,625 µM). Al - Alopurinol, Bz- benznidazol ... 19
FIGURA 4: Representação cronológica do experimento utilizado para avaliação de cura. Os camundongos foram inoculados com 5000 tripomastigotas da cepa Y de
Trypanosoma cruzi e tratados com 25, 50, 75 e 100 mg/kg de benznidazol e 30, 60 e 90
mg/kg de alopurinol em monoterapia ou em combinação. Foi realizado exame de sangue a fresco antes e após a imunossupressão com ciclofosfamida e coletas de sangue para PCR e sorologia 30 e 180 dias após o fim do tratamento. (dpt: dias pós tratamento)...22
FIGURA 5: Ensaio para avaliação da citotoxidade induzida por diferentes concentrações de alopurinol ou benznidazol isoladamente ou em combinação. Percentual de redução da resazurina por células H9c2 incubadas por 72 horas com diferentes concentrações de alopurinol (Al), benznidazol (Bz), com combinações de alopurinol e benznidazol (Bz+Al) e com dimetilsulfóxido (DMSO). CNT – células não tratadas. A leitura da reação foi feita seis horas após a adição do corante. * indica diferença significativa, com relação ao controle não tratado, ao nível de
p<0,001...28
FIGURA 6: Atividade alopurinol sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Y de
Trypanosoma cruzi. Dez mil células foram infectadas pela cepa Y e posteriormente
calculou-se o percentual de células infectadas após os diferentes tratamentos, bem como a inibição da infecção ... 29
FIGURA 7: Atividade do benznidazol (Bz) e do alopurinol (Al) utilizados isoladamente sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Y de Trypanosoma cruzi. Dez mil células foram infectadas pela cepa Y e posteriormente incubadas na presença ou ausência de concentrações decrescentes de alopurinol e benznidazol, por 72 horas. Cada ponto das curvas de dose-resposta correnponde à média de dois experimentos independentes. O IC-50 foi calculado utilizando-se o software calcusyn. ... 30
FIGURA 8: Atividade do benznidazol e do alopurinol isoladamente ou em combinação sobre o índice endocítico de células H9c2 pela cepa Y de Trypanosoma cruzi. Dez mil células foram infectadas pela cepa Y e posteriormente incubadas na presença ou ausência de concentrações decrescentes de alopurinol e benznidazol, isoladamente ou em combinação. * indica diferença em relação às duas drogas administradas em monoterapia (p<0,01). CI: Controle infectado: células infectadas não tratadas ... ..31
FIGURA 9: Isobolograma representativo das interações in vitro do alopurinol e benznidazol contra amastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi. Os números na abcissa representam os índices de combinação do benznidazol e os na ordenada, do alopurinol, calculados a partir do índice endocítico das monoterapias e das combinações. Os dados representam a média de dois experimentos independentes. ... 33
FIGURA 10: Atividade do benznidazol e do alopurinol isoladamente ou em combinação sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Y de Trypanosoma cruzi. Fotomicrografias representativas dos efeitos anti-Trypanosoma cruzi do benznidazol e alopurinol em monoterapia ou em combinação no tratamento de células H9c2 infectadas pela cepa Yde
T. cruzi ... 34
FIGURA 11: Efeito do tratamento com diferentes doses de alopurinol nos níveis de parasitemia. (A) Curva de parasitemia detectada no sangue periférico de 10 camundongos infectados pela cepa Y de Trypanosoma cruzi e tratados com 30, 60 e 90 mg/kg de alopurinol por 20 dias consecutivos e controle sem tratameno (NT). (B) Log do
máximo da parasitemia detectada no sangue periférico desses animais. O insert representa a análise da correlação (Pearson) entre a dose administrada e a parasitemia. ... 35
FIGURA 12: Efeito do tratamento com diferentes doses de benznidazol nos níveis de parasitemia. (A) Curva de parasitemia detectada no sangue periférico de 10 camundongos infectados pela cepa Y de Trypanosoma cruzi e tratados com 25, 50, 75 e 100 mg/kg de benznidazol por 20 dias consecutivos e controle sem tratamento (NT). (B) Log do máximo da parasitemia detectada no sangue periférico desses animais. o insert representa a análise da correlação (Pearson) entre a dose administrada e a parasitemia. ... 36
FIGURA 13: Efeito do tratamento com alopurinol e benznidazol, isoladamente ou em combinação na reativação natural da parasitemia. Log do máximo da parasitemia detectada no sangue periférico de animais (n=10) que apresentaram reativação da parasitemia até 30 dias após o tratamento (antes da imunossupressão). Os animais foram inoculados com 5000 tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi e tratados com diferentes doses de benznidazol ou alopurinol e com diferentes combinações destes compostos. Barras brancas: monoterapia com benznidazol; barras pretas: monoterapia com alopurinol , barras listradas: terapia combinada. +: diferença significativa com monoterapia de Al; *: diferença significativa com monoterapia com Bz. ... 41
FIGURA 14: Efeito do tratamento com alopurinol e benznidazol, isoladamente ou em combinação na reativação parasitemia após a imunossupressão. Log do máximo da parasitemia detectada no sangue periférico de animais (n=10) que apresentaram reativação da parasitemia após a imunossupressão com ciclofosfamida realizada 30 dias após o tratamento. Os animais foram inoculados com 5000 tripomastigotas da cepa Y de
Trypanosoma cruzi e tratados com diferentes doses de benznidazol ou alopurinol e com
diferentes combinações destes compostos. Barras brancas: monoterapia com benznidazol; barras pretas: monoterapia com alopurinol; barras listradas: terapia combinada, +: diferença significativa com monoterapia de Al; *: diferença significativa com monoterapia com Bz... 42
FIGURA 15: Efeito do tratamento com alopurinol e benznidazol, isoladamente ou em combinação na nos níveis de anticorpos anti-T. cruzi. Níveis de anticorpos da classe IgG detectados no soro dos animais (30 e 180 dias após o tratamento). Os animais foram inoculados com 5000 tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi e tratados com diferentes doses de benznidazol ou alopurinol e com diferentes combinações destes compostos. ... ..43
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Efeitos anti-Trypanosoma cruzi do benznidazol e alopurinol em monoterapia ou em combinação no tratamento de células H9c2 infectadas pela cepa Y: % de inibição do índice endocítico em relação ao controle e índice de combinação...32 TABELA 2: Percentagem de animais infectados pela cepa Y de Trypanosoma cruzi que
apresentaram supressão da parasitemia após o tratamento com diferentes doses de benznidazol ou alopurinol, em monoterapia ou em combinação, e o número de doses necessárias para a indução da negativação da parasitemia. ... 38 TABELA 3: Reativação da parasitemia e positividade da PCR de camundongos infectados
pela cepa Y de Trypanosoma cruzi e tratados com diferentes doses de benznidazol ou alopurinol em monoterapia ou em combinação...40
LISTA DE ABREVIATURAS
% percentagem
AIDS acquired immunodeficiency syndrome Al Bz Alopurinol Benznidazol Cy Ciclofosfamida CI combination index CO2 Dióxido de carbono
DMEM Dulbecos Medium DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico k-DNA DNA do cinetoplasto
DNDi Drugs for Neglected Disease
Initiative
DP Desvio padrão
dpt Dias pós-tratamento dNTP’s Desoxinucleotideos DTU Discrete typing units
ELISA Enzyme Linked
ImmunoSorbent Assay ESF Exame de sangue a fresco
g Gramas h Horas HGPRT Hipoxantina guaninafosforribosiltransferase IE Índice endocítico IgG Imunoglobulina G Kg Quilograma
LIT Liver Infusion Tryptose
Log Logarítimo µL Microlitro mL Mililitro mg Miligrama ng Nanograma µg Micrograma µM Concentração micromolar mM Concentração milimolar mpk Miligramas por quilograma
ND Não detectado
NT Não tratado
nm Nanômetros
p Significância
PBS phosphate buffered saline PCR Reação em Cadeia Polimerase SFB Soro fetal bovino
RNA Ácido ribonucléico rpm Rotações por minuto TNFα Fator de necrose tumoral α WHO World Health Organization
1.1 Trypanosoma cruzi e a doença de Chagas
A tripanossomíase americana, descoberta e descrita por Carlos Chagas em 1909, apresenta como agente etiológico o protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi, o qual pertence à família Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastida, cuja principal característica é a presença de uma organela denominada cinetoplasto (Chagas, 1909).
Primitivamente uma enzootia, a infecção pelo T.cruzi passou a constituir-se em problema de saúde pública devido à domiciliação dos insetos vetores. Em condições naturais, o parasito apresenta um complexo ciclo de vida que se alterna entre diferentes hospedeiros: vertebrados de diversas ordens e invertebrados pertencentes à família Reduviidae, subfamília Triatominae, popularmente conhecidos como barbeiros. Existem 141 espécies (Schofield & Galvão, 2009) conhecidas de triatomíneos, no entanto, somente algumas espécies pertencentes aos gêneros Triatoma, Rhodnius e
Panstrongylus têm importância destacada como vetores de T. cruzi entre seres humanos
e animais domésticos (WHO, 2002).
O ciclo no hospedeiro invertebrado inicia-se pela ingestão das formas tripomastigotas sanguíneas durante o repasto sanguíneo de triatomíneos em um hospedeiro infectado por T. cruzi. No tubo digestivo do triatomíneo, estas formas se diferenciam em formas epimastigotas, que ao atingirem o intestino médio multiplicam-se por divisão binária. Posteriormente, estas formas migram para a porção posterior do tubo digestivo do vetor dando início ao processo de metaciclogênese do parasito originando os tripomastigotas metacíclicos (Garcia et al., 1999; Teixeira et al., 2009). A infecção do hospedeiro vertebrado ocorre através da penetração destas formas eliminadas nas fezes e/ ou urina do triatomíneo na pele lesada ou através da penetração na mucosa íntegra do hospedeiro (Brener, 1973; Andrade & Andrews, 2005).
Após a penetração, as formas tripomastigotas metacíclicas são capazes de invadir qualquer célula nucleada do hospedeiro e, no citoplasma destas, se diferenciam em formas amastigotas as quais se multiplicam. Após alguns ciclos de replicação, os amastigotas diferenciam em tripomastigotas que saem da célula e caem na circulação, sendo denominadas tripomastigotas sanguíneas, podendo infectar outras células ou reiniciar o ciclo de infecção, caso ingeridas por um novo inseto vetor (Brener, 1973; Andrade & Andrews, 2005).
A infecção humana por T. cruzi também pode ocorrer por vias alternativas como, por exemplo, por via oral através da ingestão de alimentos contaminados (Dias, 2006;
Nóbrega et al., 2009), transfusões sanguíneas (Schmunis, 1999), transplantes de órgãos (Altclas et al., 2005), transmissão congênita (Torrico et al., 2004), acidentes de laboratório, dentre outras.
Segundo a Organização Mundial de Saúde há cerca de 7-8 milhões de indivíduos infectados pelo T. cruzi atualmente (WHO, 2013). Com a intensa migração da população de áreas endêmicas da América Latina para áreas não endêmicas, a doença de Chagas se encontra em profunda expansão para Estados Unidos, Japão, Canadá e Austrália e países da Europa, onde hoje residem cerca de 300.000 a 400.000 indivíduos infectados (Schumunis, 2007). Estima-se que mais de 10.000 mortes anuais sejam causadas pela doença em todo o mundo (WHO, 2010).
A doença de Chagas apresenta duas fases: aguda e crônica. A fase aguda corresponde ao período inicial da infecção, caracterizado por intensa proliferação do parasito nos tecidos do hospedeiro. Esta fase persiste por cerca de dois meses e apresenta-se assintomática na maioria dos casos. Quando presentes, os principais sintomas são febre, edema, poliadenia, alterações eletrocardiográficas, hepato-esplenomegalia e perturbações neurológicas (Dias, 1992). Em crianças e pacientes imunodeprimidos, a fase aguda sintomática muitas vezes pode ser fatal, devido a casos de meningo-encefalite e, mais raramente a miocardite aguda difusa (Barret, 2003; Remme, 2006).
Com o desenvolvimento da resposta imune do hospedeiro, as manifestações da fase aguda regridem e instala-se gradativamente a fase crônica da doença, na qual a parasitemia e o parasitismo podem permanecer escassos por toda a vida do indivíduo não tratado (Dias, 1992). Nesta fase, a maioria dos pacientes é assintomática, caracterizando a forma clínica indeterminada da doença, os quais podem permanecer assim indefinidamente. Entretanto, mesmo após um longo período assintomático, cerca de 25% dos indivíduos podem desenvolver a forma cardíaca, 6-9% a forma digestiva e 3% podem sofrer envolvimento do sistema nervoso periférico (Coura 1983, 1985; Pereira, 1985; Moncayo, 1999). Uma pequena porção dos indivíduos na fase crônica pode vir a desenvolver a forma mista, onde são observadas alterações cardíacas e digestivas (Rezende, 2000; Rassi et al., 2010). As diferentes formas clínicas são responsáveis por elevada morbidade em adultos jovens, economicamente produtivos, sendo o acometimento cardíaco a manifestação mais grave e frequente, levando tipicamente a arritmias, fenômenos tromboembólicos, falência cardíaca e morte súbita (Chapadeiro, 1999; Nunes et al., 2012).
Os mecanismos envolvidos na patogênese da doença de Chagas ainda não estão suficientemente esclarecidos. Atualmente sabe-se que o parasito é responsável por desencadear e manter a reação inflamatória relacionada à doença (Jones et al. 1993; Higuchi, 1993a), e esse processo de injúria pode ser amplificado por eventos autoimunes associados à genética do parasito e do hospedeiro (Leon et al. 2003). Considerando que as alterações imunopatológicas progridem ao longo da evolução da doença crônica e que o parasito desempenha papel essencial no desenvolvimento do dano cardíaco observado na cardiopatia chagásica (Barbosa et al. 1986; Higuchi et al. 1993a; Higuchi 1993b), o tratamento etiológico eficaz se faz absolutamente necessário.
1.1.Quimioterapia para a doença de Chagas
Desde sua descoberta, em 1909, várias substâncias foram testadas no intuito de se obter um tratamento eficaz para a doença de Chagas. Os primeiros compostos avaliados na quimioterapia experimental dessa enfermidade foram o atoxyl (arsênico), a tintura de fucsina, o tártaro emético (antimonial pentavalente) e o cloreto de mercúrio. Porém, todos eles se mostraram ineficazes (Coura & Castro, 2002).
Até o final da década de 60, vários outros compostos foram testados, mas sem resultados promissores. Em 1967, foi introduzida na terapêutica da doença de Chagas uma classe de fármacos mais eficazes no tratamento, os nitrofuranos (Bock et al., 1969). Entre estes, o nifurtimox ganhou mais destaque por ser o mais efetivo. E em 1972, o benznidazol, um derivado 2-nitroimidazólico, foi descoberto e incluído no tratamento da doença de Chagas.
Depois de quase quatro décadas o nifurtimox e benznidazol ainda são os únicos medicamentos disponíveis para o tratamento humano desta enfermidade. No Brasil, a utilização do nifurtimox foi descontinuada, sendo o benznidazol atualmente produzido e distribuído pelo Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco [LAFEPE], após os direitos de patente e tecnologia terem sido cedidos ao governo brasileiro pelo grupo suíço Roche® em 2003 (MS, 2003).
O benznidazol é um composto nitro-heterocíclico, apresentando um grupo nitro ligado ao anel imidazol, como apresentado na figura 1. Este composto funciona como pró-fármaco e deve ser submetidos à ativação mediada por enzimas nitroredutases para exercer seus efeitos tóxicos (Wilkinson & Kelly, 2009). Seu mecanismo de ação ainda não está completamente elucidado, mas sabe-se que o benznidazol age através de
estresse redutivo, o qual envolve reações covalentes de macromoléculas pela nitrorredução de radicais intermediários e vários componentes celulares, como RNA, lipídeos e proteínas de T. cruzi (Docampo, 1990). Também atua sobre o genoma do parasito, inibindo a síntese de DNA, RNA e proteínas além de acelerar a degradação dessas macromoléculas. O menor potencial de atividade detoxificante do parasito contra os radicais livres formados o faz mais susceptível a tais intermediários oxigenados que as células dos vertebrados (Stoppani, 1999).
Figura 1:Fórmula estrutural do benznidazol [N-benzyl-2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)acetamide]
O benznidazol é eficaz principalmente quando utilizado para tratar a fase aguda da doença de Chagas. O tratamento é administrado por via oral, duas vezes ao dia, durante 60 dias. Devido à sua baixa solubilidade em água (Leonardi et al., 2009) e consequentemente limitada absorção gastrintestinal, há a necessidade de se administrar elevadas doses desse fármaco (Lamas et al., 2006). Dessa forma, o tratamento induz muitas reações adversas, e em muitos casos, os pacientes interrompem a administração do fármaco antes de completado o esquema terapêutico (Cançado, 2002; Coura & Castro, 2002). A descontinuação do tratamento pode contribuir para o fracasso terapêutico e para o aumento da chance de desenvolvimento de resistência do parasito ao fármaco.
O tratamento com benznidazol quando utilizado na fase crônica, período no qual a maioria dos indivíduos é diagnosticada, apresenta reduzida eficácia, com taxas de cura variáveis, deste ausência até 19,1% de cura (Ferreira, 1990; Viotti et al., 1994, 2006; Suasnábar et al., 2000; Braga et al., 2000; Lauria-Pires et al., 2000; Cançado, 2002; Lana, et al., 2009). As razões para diferenças na eficácia do benznidazol nas fases aguda e crônica ainda não estão totalmente claras, mas alguns pesquisadores sugerem que possivelmente estão relacionadas às propriedades farmacocinéticas desfavoráveis do fármaco, como a meia-vida relativamente curta e a limitada penetração tecidual (Lamas
et al., 2006, Urbina, 2009). Além disso, há cepas do parasito que são naturalmente
resistentes ao tratamento com benznidazol e nifurtimox (Filardi & Brener, 1987).
Dadas as limitações apresentadas pelo tratamento etiológico disponível para a doença de Chagas, é evidente a necessidade da busca por novas drogas e/ou estratégicas terapêuticas para os milhões de indivíduos na fase crônica da doença. Além da triagem empírica de substâncias, novos alvos para o desenvolvimento de terapias anti-T. cruzi são propostos com base nos estudos acerca das vias fisiológicas, bioquímicas e moleculares do parasito e do hospedeiro (Urbina, 2009). A pesquisa racional aborda ainda alvos farmacológicos baseados em vias metabólicas do parasito compartilhadas com outros microorganismos, o que possibilita a avaliação da atividade anti-T. cruzi de compostos utilizados para outras etiologias já licenciados para uso humano.
Apesar do grande número de moléculas avaliadas experimentalmente in vitro, poucos são os compostos que apresentaram capacidade de induzir cura parasitológica ou interferir na evolução da doença em modelos animais. Os estudos pré-clínicos realizados ao longo dos anos identificaram algumas classes farmacológicas e estratégias terapêuticas que são especialmente promissoras. Dentre essas prováveis alternativas, alguns compostos destacam-se por serem capazes de induzir cura parasitológica na infecção experimental, como os inibidores da biossíntese de ergosterol (Molina et al., 2000; Urbina & Docampo, 2003), inibidores da cruzipaína (Engel et al.,1998), derivados nitroimidazólicos (Bahia et al., 2012) ou de interferir no curso da infecção, como as arilimidamidas (Soeiro et al., 2013), inibidores da tripanotiona redutase (Blau
et al., 2013), complexos de rutênio carreadores de moléculas com atividade tripanocida
(Silva et al., 2010) e inibidores da via de salvação de purinas.
Dentre todos os compostos já estudados como alternativas para o tratamento da doença, dois inibidores da biossíntese de ergosterol, o posaconazol e o E1224 (pró-fármaco do ravuconazol) foram avaliados recentemente em ensaios clínicos de fase II, para o tratamento de indivíduos assintomáticos na fase crônica da doença de Chagas. Os inibidores da biossíntese de esteróis, a exemplo dos derivados azólicos desenvolvidos originalmente como antifúngicos, afetam a síntese de ergosterol, o esterol mais abundante na membrana celular de T. cruzi e indispensável à proliferação desse protozoário. Especialmente os inibidores da enzima 14α-demetilase (CYP51), que bloqueiam a síntese de ergosterol do parasito sem interferir na biossíntese de colesterol do hospedeiro, são em conjunto os mais promissores candidatos para o tratamento da doença de Chagas. O posaconazol e o E1224 foram escolhidos para avaliação em
ensaios clínicos devido à potente atividade anti-T.cruzi in vitro e in vivo (Urbina, 2009). Entretanto, os resultados de ambos os ensaios clínicos evidenciaram que apesar do posaconazol e E1224 apresentarem perfil favorável de segurança e toxicidade, falharam em induzir cura parasitológica em cerca de 90% dos pacientes tratados (Israel Molina, International Congress of Tropical Medicine, disponível em http://
ictmm2012.ioc.fiocruz.br/program_25_sept.html; Annual Meeting of the American
Society of Tropical Medicine and Hygiene November 2013). Esses estudos mostraram a necessidade de buscar novos fármacos e/ou protocolos de tratamento mais eficazes para os pacientes.
1.2. Os inibidores da via de salvação de purinas
Entre os alvos terapêuticos para o tratamento anti-T. cruzi encontram-se os inibidores da via de salvação de purinas, sendo a enzima chave desta via a hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT). Como os parasitas tripanossomatídeos são absolutamente deficientes na biossíntese de novo de purinas, eles obtêm essas substâncias essenciais a partir do organismo de hospedeiros vertebrados ou mesmo do meio de cultura (Urbina, 2007).
O alopurinol (figura 2) é um medicamento que tem sido utilizado durante muitos anos para o tratamento da hiperuricemia humana, sendo transformado em oxipurinol, um potente inibidor de xantina oxidase. Seu mecanismo de ação contra o T. cruzi consiste na utilização desse fármaco pela enzima HGPRT do parasito como um substrato alternativo, sendo então, incorporado ao seu RNA, gerando um nucleotídeo não funcional, o que leva à morte do parasito (Marr & Berens, 1978).
Figura 2: Fórmula estrutural do alopurinol [1,5-diidro-4H-pirazol[3,4-d]-pirimidina-4-ona]
O alopurinol já foi avaliado experimentalmente e na doença de Chagas humana, tanto em fase aguda quanto crônica. Ávila e Ávila (1981) demonstraram o benefício do tratamento com o alopurinol na infecção aguda de camundongos por T. cruzi. A administração intraperitoneal desse fármaco foi capaz de controlar a infecção, uma vez
que os níveis de parasitemia a taxa de mortalidade foram significativamente reduzidos após a intervenção terapêutica. De forma semelhante, Gobbi et al (2007) também identificaram que o alopurinol foi eficaz em modificar a evolução da infecção aguda pelo T. cruzi em camundongos. Os resultados obtidos demonstraram uma redução na parasitemia, porém não foi observada redução nas alterações eletrocardiográficas causadas pela infecção nem diminuição nos níveis de anticorpos anti-T. cruzi em relação aos animais infectados não tratados.
Já os resultados das avaliações de eficácia do alopurinol no tratamento da doença humana apresentam-se controversos. Em ensaio clínico realizado para o tratamento de indivíduos na fase aguda da infecção o alopurinol foi ineficaz, uma vez que a hemocultura e a sorologia permaneceram positivas nos pacientes após a intervenção terapêutica (Lauria-Pires et al, 1988). De forma semelhante, um estudo multicêntrico realizado em pacientes crônicos na Argentina, Brasil e Bolívia, mostrou que o alopurinol foi ineficaz em reduzir a carga parasitária nos pacientes avaliados (Rassi, 2007).
Por outro lado, um estudo realizado com pacientes residentes na Argentina (Gallerano, 1990) demonstrou que o tratamento com alopurinol apresentou eficácia semelhante à obtida com benznidazol e nifurtimox no tratamento da fase crônica da doença de Chagas, porém com menor indução de efeitos adversos. Resultados semelhantes foram obtidos por Apt et al. (1998) em um ensaio clínico com pacientes na fase crônica da doença no Chile. De acordo com esse autor, demonstrou-se que o alopurinol foi capaz de induzir diminuição na positividade dos testes xenodiagnósticos em 44% dos pacientes avaliados, além de reverter ou prevenir o desenvolvimento de alterações eletrocardiográficas após nove anos de seguimento. A avaliação destes mesmos pacientes nove anos após o estudo inicial demonstrou que o tratamento com alopurinol também foi eficaz em induzir redução das alterações eletrocardiográficas (Apt et al., 2003).
Neste cenário, outros compostos capazes de inibir a HGPRT em T. cruzi com estruturas análogas ao alopurinol têm sido desenvolvidos e testados in vitro, mas a atividade in vivo ainda não foi estabelecida (Raviolo, 2013). Assim, tendo em vista o limitado avanço no desenvolvimento pré-clínico, ensaios com inibidores da HGPRT para o tratamento da doença de Chagas humana só podem ser esperados a médio e longo prazo.
1.4 A terapia de combinação de fármacos no tratamento da infecção por
T.cruzi
Como as perspectivas para a introdução de novos compostos na quimioterapia da doença de Chagas pela indústria farmacêutica são pequenas, uma estratégia alternativa envolve a identificação de candidatos, entre os medicamentos já disponíveis no mercado, que poderiam ser usados em combinação para fornecer um resultado mais eficaz na terapêutica. Essa estratégia pode permitir a rápida inserção destes medicamentos no uso clínico (Dias & Dessoy, 2009).
A combinação de compostos é uma estratégia já utilizada com sucesso no tratamento de várias patologias, como doenças cardiovasculares, câncer e algumas doenças infecciosas, como tuberculose e AIDS, além de protozoonoses como toxoplasmose (Romand, 1993), leishmaniose (Dastgheib, 2012) e malária (Hwang,2006), inclusive no tratamento de indivíduos infectados por populações de microorganismos resistentes (Fivelman et al., 2004).
Neste cenário, a avaliação da terapia de combinação é importante, especialmente a curto prazo, apresentando vantagens como: (i) redução do tempo e dose do tratamento (minimizando a toxicidade, enquanto mantém a eficácia), (ii) uso de compostos que podem atuar sobre diferentes elementos celulares e vias metabólicas, (iii) redução do potencial de desenvolvimento de resistência aos fármacos (Vivas et al., 2008).
Araújo et al. (2000) avaliaram a eficácia da terapia de combinação de benznidazol e cetoconazol em camundongos infectados por cepas de T. cruzi que apresentam diferentes níveis de susceptibilidade ao benznidazol. Os resultados obtidos demonstraram que a combinação induz um efeito positivo em camundongos infectados pelas cepas CL e Y, o que não foi observado nos animais infectados pela cepa Colombiana.
Derivados azólicos utilizados em combinação com inibidores da biossíntese de ergosterol, que atuam em outros pontos da via de biossíntese do ergosterol, conduziram a um efeito positivo anti-T. cruzi (Lazardi et al. 1990, Maldonado et al. 1993). Urbina et
al. (1998) mostraram in vitro, a interação entre dois inibidores da biossíntese do
ergosterol, o cetoconazol e uma alilamina (SF-86327). Essas drogas atuam em diferentes pontos da via biossintética do ergosterol, quando utilizadas em combinação, apresentaram interação sinérgica na eliminação de formas epimastigotas e amastigotas
do parasito. Além disso, Benaim et al., (2006) identificaram que a atividade anti-T.
cruzi do composto antiarrítmico amiodarona é potencializado pelo posaconazol.
Diniz et al. (2013) também investigaram a ação curativa do benznidazol em combinação com o posaconazol. Animais infectados pela cepa Y de T. cruzi foram tratados com 25, 50, 75 ou 100 mg/kg/dia de benznidazol e com 5, 10 ou 20 mg/kg de posaconazol, administrados separadamente ou em combinação por 20 dias. Os autores observaram que os índices de cura obtidos nos tratamentos combinados foram maiores do que a soma daqueles verificados com a administração de cada droga separadamente, indicando um claro efeito benéfico da terapia de combinação.
O alopurinol também já foi avaliado em combinação com diferentes fármacos e sua eficácia no tratamento doença de Chagas já foi estabelecida por alguns esquemas de tratamento. Dessa forma, a associação da clomipramina e do alopurinol na fase aguda da infecção experimental por T. cruzi demonstrou melhora nos parâmetros de parasitemia, sobrevivência, eletrocardiograma, sorologia e histopatologia cardíaca, mas os mesmos efeitos foram verificados quando a clomipramina foi utilizada isoladamente.
Além disso, tratamento com alopurinol foi avaliado quando administrado após o tratamento com benznidazol, em diferentes esquemas, na fase aguda ou crônica da infecção de camundongos. Verificou-se que o alopurinol administrado imediatamente após o tratamento com benznidazol foi capaz de reduzir a parasitemia, a inflamação, o dano tecidual, além de reduzir os anticorpos específicos anti-T. cruzi. O esquema de tratamento utilizando o alopurinol durante a fase crônica, após a terapia com benznidazol na fase aguda, apresentou um maior efeito benéfico, através da redução da parasitemia e do grau de inflamação e fibrose (Grosso et al., 2013).
Dado o grande potencial da terapia de combinação de fármacos, Perez-Mazliah et
al (2012) realizaram um estudo piloto para avaliar os efeitos do tratamento combinado
de forma sequencial com alopurinol e benznidazol na fase crônica da infecção humana pelo T. cruzi. Os resultados mostraram que esta combinação induz modificações significativas das respostas imunológicas induzidas por células T e B, que seriam indicativas de uma redução da carga parasitária.
Considerando a necessidade de novas alternativas de tratamento para a doença de Chagas e especialmente o arsenal limitado de compostos que apresentam alguma atividade na infecção por T.cruzi, é clara a necessidade de busca de novas estratégias ou protocolos de tratamento utilizando os medicamentos já disponíveis.
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, as doenças podem ser classificadas como globais, negligenciadas e extremamente negligenciadas. Para doenças negligenciadas, a exemplo da doença de Chagas, leishmanioses, malária, tuberculose, não há investimento das indústrias farmacêuticas tradicionais em pesquisa, devido à falta de mercado significativo. Um estudo recente mostrou que dos 850 novos produtos farmacêuticos registrados de 2000 a 2011, apenas 1% corresponde a novos medicamentos para a terapia das doenças negligenciadas cujo impacto é global estimado em 11% (Pedrique et al., 2013).
Com relação à infecção por T. cruzi, na América Latina, as taxas de morbidade e mortalidade são maiores do que as relacionadas com a malária, a esquistossomose e a leishmaniose, caracterizando a doença de Chagas como um grave problema de saúde pública das nações em desenvolvimento (www.dndi.org). Os dois medicamentos utilizados para o tratamento dessa enfermidade, o benznidazol e o nifurtimox, induzem índices de cura absolutamente insatisfatórios quando utilizados no tratamento da fase crônica da doença, a mais prevalente em regiões endêmicas e não endêmicas. Além disso, outra limitação diz respeito à ocorrência de reações adversas em decorrência do tratamento com ambos os fármacos.
Nessa perspectiva, é evidente a necessidade de avaliação de novas estratégias terapêuticas para o tratamento da doença de Chagas. Atualmente, a terapia de combinação de fármacos apresenta-se como a perspectiva mais otimista na área de quimioterapia experimental da infecção por T. cruzi. A utilização de associações de compostos que apresentem algum efeito no decurso da infecção por T. cruzi pode levar à identificação de combinações de fármacos que induzam maior eficácia no tratamento ou mesmo possibilitem a redução nas doses dos medicamentos ou mesmo otimização do protocolo terapêutico.
O alopurinol é um medicamento utilizado da clínica contra hiperucemia, além disso, diversos estudos já fundamentaram sua avaliação na infecção por T. cruzi. Sendo o benznidazol o fármaco de referência para o tratamento da doença de Chagas, o presente trabalho justifica-se por avaliar as combinações de ambos os fármacos, pois, no caso de identificação de uma interação positiva entre eles, essa combinação apresenta viabilidade imediata para utilização no tratamento de indivíduos infectados pelo parasito.
3.1.Objetivo geral
Avaliar o efeito da terapia de combinação utilizando benznidazol associado ao alopurinol in vitro e in vivo na infecção por Trypanosoma cruzi.
3.2.Objetivos específicos
Avaliar comparativamente a atividade anti-T. cruzi in vitro dos compostos benznidazol e alopurinol isoladamente ou em combinação utilizando células H9c2 infectadas pela cepa Y de T. cruzi;
Identificar o efeito do tratamento com diferentes doses de benznidazol e alopurinol, em monoterapia ou em combinação, na evolução da infecção aguda de camundongos pela cepa Y de T. cruzi através dos parâmetros: exame de sangue a fresco e PCR.
Avaliar o efeito das combinações do benznidazol e alopurinol na resposta imune humoral, através da dosagem dos níveis de anticorpos IgG anti-T.cruzi detectados no soro dos animais.
4.1. Parasito
Foi utilizada a cepa Y de T. cruzi, classificada como DTU II (Zingales et al., 2009). Essa cepa foi isolada de um paciente na fase aguda da doença de Chagas por Pereira de Freitas, em 1950, em Marília (SP) e posteriormente estudada e descrita por Silva & Nussenzweig, 1953. A cepa Y (Zingales et al., 2009) foi escolhida por apresentar, nos estudos in vivo, características biológicas como a indução de alta parasitemia e 100% de mortalidade na infecção murina, facilitando, neste caso, a avaliação da atividade tripanocida de diferentes doses de cada composto, bem como das combinações. Além disso, é considerada parcialmente resistente ao tratamento com benznidazol (Filardi & Brener, 1987).
4.2. Fármacos
Os fármacos utilizados para as avaliações in vitro e in vivo, em monoterapia ou em combinação foram:
- Benznidazol (Bz): 2-nitro-imidazole-(N-benzil-2-nitro-1imidazoleacetamide) (Lafepe).
- Alopurinol (Al): 4-hidroxipirazol(3,4-d)pirimidina (Zyloric®, GlaxoSmithKline).
4.3. Experimentos in vitro
4.3.1. Cultivos de células H9c2
Células da linhagem H9c2 (American Type Culture Collection, ATCC: CRL 1446) provenientes do coração de ratos neonatos foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10% de SFB, 1% de glutamina 2 mM e 0,2% de gentamicina 200 µg/ml. Garrafas de cultura de 75 cm2 contendo estas células foram mantidas em estufas a 37 oC e 5% de CO2 e tripsinizadas semanalmente ou quando atingiam confluência para
4.3.2. Obtenção de formas tripomastigotas de cultura celular
As formas tripomastigotas da cepa Y utilizadas para infectar as células H9c2 foram obtidas a partir do sobrenadante de cultura de células infectadas. Para isso, células H9c2 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de SFB. Ao atingir cerca de 70% de confluência, a cultura foi infectada, na proporção de 10 parasitos por célula, com tripomastigotas sanguíneos oriundos do sangue de camundongos infectados pela cepa Y, no pico de parasitemia, que corresponde ao 8o dia de infecção. Após 24 horas de incubação a 37 ºC, 5% CO2, o meio de cultura foi
removido e os parasitos não internalizados, bem como detritos celulares, foram retirados através de sucessivas lavagens com PBS. Às células, foi adicionando meio DMEM suplementado com 10% de SFB, e novamente incubadas a 33º C por 72 a 96 horas, quando o sobrenadante foi coletado e centrifugado, a 600rpm, 24 ºC, por 2 minutos, para remoção dos debris celulares. Posteriormente, o sobrenadante, rico em parasitos, foi centrifugado a 3000 rpm, 4 ºC, 15 minutos e o sedimento ressuspendido em meio de cultura para posterior utilização nos experimentos. Apenas parasitos recém-liberados das células foram utilizados nos experimentos, uma vez que o sobrenadante era periodicamente coletado e meio de cultura fresco era novamente adicionado.
4.3.3. Ensaios de citotoxicidade
Para excluir os efeitos tóxicos das drogas sobre as células hospedeiras, culturas não infectadas pelo T. cruzi foram tratadas com altas concentrações de benznidazol e alopurinol isoladamente e em combinação. O experimento foi realizado conforme previamente padronizado (Diniz, 2013), utilizando a resazurina, um indicador colorimétrico de proliferação que se baseia na redução química do reagente devido à atividade metabólica das células. Através de reações de oxi-redução, o corante passa da cor azul (forma oxidada e não fluorescente) para rosa (forma reduzida, fluorescente), e esta mudança de cor pode ser medida pela leitura colorimétrica ou fluorimétrica (Fields e Lancaster, 1993; Ahmed et al., 1994).
Assim, duzentos microlitros de suspensão das células H9c2, na concentração de 5x103 células/mL, foram pipetados em placas de 96 poços e incubados a 37 ºC, 5% CO2
por 24 horas. O meio de cultura foi removido e substituído por 200 µL de meio contendo ou não concentrações decrescentes de benznidazol (6 diluições 1:2, a partir de
200 µM) ou alopurinol (6 diluições 1:2, a partir de 1000 µM) isoladamente ou em combinação, e a placa novamente incubada por 72 horas, a 37 ºC. Foram adicionados a cada placa: controles negativos (meio+resazurina), controles negativos (meio), controles positivos (meio+células), controles para avaliar o potencial dos fármacos (meio+droga, na ausência de parasitos) ou do DMSO (meio+DMSO) em reduzir o corante. A fim de avaliar a eficácia do método em detectar a morte celular, foram utilizadas concentrações decrescentes de DMSO sabidamente tóxicas para as células. Após as 72 horas de incubação, foram adicionados 20 µL de resazurina 1 mM a cada poço e a placa foi submetida a leitura espectrofotômetro de microplacas (570 nm e 600 nm). A porcentagem de inibição da proliferação induzida pelos compostos foi calculada considerando o percentual de redução das células incubadas na ausência de drogas.
4.3.4. Avaliação da atividade anti-T. cruzi dos fármacos benznidazol e alopurinol sobre formas amastigotas: definição da IC-50
A avaliação do efeito do tratamento com benznidazol e alopurinol sobre amastigotas da cepa Y foi realizada em células H9c2 infectadas. Foram plaqueadas 1x104células por poço, sobre lamínulas de 13 mm de diâmetro, em placas de 24 poços e incubadas por 24 horas a 37 ºC, 5% CO2. Formas tripomastigotas originadas de cultura de células, obtidas
conforme descrito anteriormente, foram utilizadas para infecção em uma razão de 20:1 (parasitos:células). Após 24 horas de interação, o sobrenadante foi removido e cada poço foi lavado no mínimo três vezes com PBS estéril, a fim de remover os parasitos não internalizados. Meio de cultura fresco contendo ou não os fármacos em diferentes concentrações foi adicionado a cada poço, em um volume total de 1 mL. As células foram novamente incubadas por 72 h, a 37 ºC. As concentrações iniciais de cada composto foram definidas a partir de experimentos preliminares (dados não mostrados). Em todos os experimentos foram utilizados controles, que corresponderam a células não infectadas e tratadas, não infectadas e não tratadas, infectadas e não tratadas. As lamínulas contendo as células foram lavadas com PBS, fixadas com metanol por cinco minutos e em seguida, coradas pela solução de Giemsa (10% em água destilada). Foram quantificados o número de células infectadas e o número de amastigotas por célula utilizando microscópio óptico. As imagens das células, visualizadas pela objetiva de 40x, foram digitalizadas através de microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite,versão 2.4.0R1). A determinação do efeito de cada uma das concentrações dos
fármacos isoladamente ou em combinação foi feita utilizando o índice do endocítico, que corresponde à média da percentagem de células infectadas multiplicada pelo número médio de amastigotas por célula. O índice endocítico observado nas células incubadas com os diferentes fármacos isoladamente ou em combinação foi utilizado para calcular o percentual de inibição da infecção com relação às células infectadas e não tratados.
% inibição = 100 – [ IETratado/IE Controle+] x100
A partir desses valores foram construídas as curvas de dose-efeito e cálculo da IC-50 com auxílio dos softwares Graph Pad Prism 5 e CalcuSyn. Todos os experimentos com amastigotas foram realizados em duplicatas, com no mínimo 2 repetições.
4.3.5. Avaliação da interação de benznidazol e alopurinol sobre formas amastigotas
Para avaliar o efeito da combinação de benznidazol e alopurinol foi utilizado o método de diluição do “tabuleiro de damas”. Concentrações fixas de alopurinol (500, 100 ou 10 5 µM) foram associadas a diferentes concentrações de benznidazol (5; 2,5; 1,25 ou 0,625 µM), como pode ser observado na figura 3. Além da avaliação do efeito das combinações, em cada experimento foi também realizada a incubação com os fármacos isoladamente. As células permaneceram na presença dos fármacos por 72 horas. Após esse período foram fixadas e coradas pelo Giemsa.
Al 500µM Bz 5 µM Al 100µM Bz 5 µM Al 10µM Bz 5 µM Bz 2,5 µM Bz 2,5 µM Bz 2,5 µM Bz 1,25µM Bz 1,25 µM Bz 1,25 µM Bz 0,625 µM Bz 0,625 µM Bz 0,625 µM
Figura 3: Desenho esquemático do método de “tabuleiro de damas” de diluição de fármacos para testes de combinação in vitro. Foram utilizadas concentrações fixas de alopurinol (500, 100 ou 10 µM) e
associadas a diferentes concentrações de benznidazol (5; 2,5; 1,25 ou 0,625 µM). Al - Alopurinol, Bz- benznidazol.
Como controles, foram avaliadas células não infectadas e tratadas, não infectadas e não tratadas, infectadas e não tratadas, a fim de avaliar toxicidade da terapia combinada, bem como células infectadas e não tratadas. A infecção e o tratamento das células foram realizados como descrito anteriormente. Após 72 horas de incubação a 37ºC, o sobrenadante foi removido, e as células então lavadas em PBS, fixadas e coradas para avaliação do índice endocítico, bem como o percentual de inibição da infecção, como já descrito.
4.3.6. Análise estatística – experimentos in vitro
Os valores de IC-50 (concentração de fármaco que induz 50% do efeito) foram obtidos através do software CalcuSyn, que utiliza o plot de efeito médio (median effect
plot).
Para classificar a natureza da interação entre alopurinol e benznidazol in vitro, foi inicialmente estimado o índice de combinação (CI-combination index), utilizando um programa estatístico específico para análise de combinações de compostos, o CalcuSyn. A partir desses valores foi classificada a presença e natureza da interação entre dois compostos. Se o CI ≤ 0,5 indica interação sinérgica; se >0,5 e ≤4, ausência de interação ou efeito aditivo e se >4, indica antagonismo (Seifert et al., 2006, 2011). Os isobologramas, que são a representação gráfica do efeito das combinações, foram construídos plotando-se o CI do alopurinol versus CI do benznidazol (Chou e Talalay,1984).
4.4. Experimentos in vivo 4.4.1. Modelo Animal
Todos os experimentos e protocolos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o uso de animais em pesquisa do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), além de serem aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFOP (número 2009/17). Foram utilizados camundongos Swiss, fêmeas, com idade variando entre 28 a 30 dias, pesando entre 18 e 22 g. Os animais foram fornecidos e mantidos no Centro de Ciência Animal da Universidade Federal de Ouro Preto.
4.4.2. Infecção e esquema de tratamento
Animais inoculados intraperitonealmente com 5.000 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y foram divididos em grupos de 10 animais, os quais receberam os compostos em diferentes doses isoladas ou em combinações de benzonidazol e alopurinol. Todos os compostos foram suspensos em água destilada usando 4% metilcelulose (Sigma®) e cada animal recebeu, de acordo com seu peso corporal, a suspensão do(s) fármaco(s) por gavagem.
Os grupos controle, utilizados para a comparação de eficácia do tratamento foram: um grupo não tratado, tratados com 100, 75, 50 e 25 mg/kg de benznidazol (Bz) e 90, 60, e 30 mg/kg de alopurinol (Al), em monoterapia.
Nos grupos que receberam a terapia combinada a administração foi assim realizada:
Grupo 1 - 75 mg de Bz por quilo de peso + 30 mg de Al por quilo de peso Grupo 2 - 75 mg de Bz por quilo de peso + 60 mg de Al por quilo de peso Grupo 3 - 75 mg de Bz por quilo de peso + 90 mg de Al por quilo de peso Grupo 4 - 50 mg de Bz por quilo de peso + 30 mg de Al por quilo de peso Grupo 5 - 50 mg de Bz por quilo de peso + 60 mg de Al por quilo de peso Grupo 6 - 50 mg de Bz por quilo de peso + 90 mg de Al por quilo de peso Grupo 7 - 25 mg de Bz por quilo de peso + 30 mg de Al por quilo de peso Grupo 8 - 25 mg de Bz por quilo de peso + 60 mg de Al por quilo de peso Grupo 9 - 25 mg de Bz por quilo de peso + 90 mg de Al por quilo de peso
O tratamento foi iniciado imediatamente após a detecção de parasitemia patente, que corresponde ao quarto dia após a inoculação dos animais, e administrado por 20 dias consecutivos para todos os grupos.
4.4.3. Avaliação da eficácia do tratamento
A cura parasitológica foi determinada a partir da análise de testes independentes (Caldas et al., 2008): exame de sangue a fresco antes e após imunossupressão com ciclofosfamida (Baxter Oncology, Alemanha), além do teste de PCR em tempo real 30 e
180 dias após o tratamento. Os animais foram considerados curados quando apresentaram resultados negativos em todos os testes realizados.
A parasitemia foi avaliada durante e até 30 dias após o tratamento para detectar a ocorrência da supressão (durante o tratamento) e/ou a reativação natural da parasitemia após o término do tratamento. Os animais que não apresentaram a reativação da parasitemia nesse período foram submetidos a três ciclos de imunossupressão com ciclofosfamida (Baxter Oncology, Alemanha). Cada ciclo corresponde a administração por 4 dias consecutivos, com intervalo de 3 dias entre cada ciclo. A parasitemia foi avaliada diariamente durante e até 10 dias após a imunossupressão. A PCR e sorologia foram realizadas 30 e 180 dias após o tratamento apenas nos animais que apresentaram resultados negativos nos testes anteriores (Figura 4).
Figura 4: Representação cronológica do experimento utilizado para avaliação de cura. Os
camundongos foram inoculados com 5000 tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi e tratados com 25, 50, 75 e 100 mg/kg de benznidazol e 30, 60 e 90 mg/kg de alopurinol em monoterapia ou em combinação. Foi realizado exame de sangue a fresco antes e após a imunossupressão com Ciclofosfamida e coletas de sangue para PCR e sorologia 30 e 180 dias após o fim do tratamento. (dpt: dias pós tratamento).
4.4.4. Exame de sangue fresco
Para a realização deste procedimento, 5µL de sangue da veia caudal de cada camundongo foi coletado e a quantificação foi feita pela técnica descrita por Brener (1962).
4.4.5. Extração do DNA e realização da PCR de sangue periférico
A PCR de sangue periférico foi realizada em dois momentos: 30 dias e 180 dias após o fim do tratamento. Foram coletados 200 µL de sangue de cada camundongo pelo plexo venoso retro-orbital e adicionados a 35 μL de solução de citrato de sódio com concentração de 129 mM. O material foi armazenado a 4-8 ºC até o momento da extração, realizada no mesmo dia. Para a extração do DNA genômico foram transferidos os 200 µL de sangue coletado de cada animal para microtubos de 1,5 mL contendo 600 µL de Solução de Lise Celular (Wizard® Genomic). Este conteúdo foi homogeneizado por lenta inversão (seis vezes) e mantido a temperatura ambiente por 10 minutos. Os microtubos foram centrifugados por 40 segundos a 14000 rpm e o sobrenadante foi retirado com auxílio de uma pipeta, restando apenas 10-20 μL de líquido residual, os quais foram levados ao vórtex por 30 segundos, a fim de haver a ressuspensão das células brancas do sangue. Posteriormente foram adicionados 200 μL de solução de lise nuclear (Wizard® Genomic), os quais foram incubados por 60 minutos em banho-maria a 37oC. Os microtubos foram retirados do banho-maria, e após 10 minutos, quando atingiram a temperatura ambiente, foram adicionados 67 μL da solução de precipitação protéica (Wizard® Genomic) aos microtubos, os quais foram homogeneizados em vórtex por 30 segundos e, posteriormente, centrifugados por 4 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante de cada amostra contendo o DNA foi transferido para novos microtubos de 0,6 mL, contendo 200 μL de isopropanol. Os microtubos foram invertidos cerca de 10 vezes e agitados para que houvesse a precipitação do DNA e centrifugados por 90 segundos a 14000 rpm. O sobrenadante foi descartado e foram adicionados 300 μL de etanol 70% seguido de centrifugação por 90 segundos a 14000 rpm. Após o descarte do sobrenadante, o microtubo foi invertido sobre papel absorvente para secagem por cerca de 30 minutos, sendo o DNA reidratado em seguida com 67μL da solução de reidratação (Wizard® Genomic) e incubado a 4o C por 48 horas.
Para cada amostra, analisada em duplicata, a reação de PCR continha 2 μL de DNA genômico (50 ng), 0,35 μM de oligonucleotídeos iniciadores específicos para a repetição de 195 pares de bases (pb) do DNA de T. cruzi, TCZ-F GCTCTTGCCCACAMGGGTGC-3’, onde M = A ou C (Invitrogen), e TCZ-R 5’-CCAAGCAGCGGATAGTTCAGG-3’, (Moser et al. 1989, modificado por Cummings & Tarleton 2003)o qual amplifica um produto de 182 pb, 5 μL de Sybr®Green PCR
Mastermix, e água Milli-Q para um volume final de reação de 10 μL. Separadamente,
para cada amostra era também realizada uma reação em duplicata para dosar o TNF-α, utilizado como controle endógeno normalizador contendo 2 μL de DNA genômico (50 ng), 0,50 μM de oligonucleotídeos iniciadores TNF-5241 5’-TCCCT
CTCATCAGTTCTATGGCCCA-3’ e TNF-5411 5’-CAGCAAGCA
TCTATGCACTTAGACCCC-3’ (Cummings & Tarleton, 2003), o qual amplifica um produto de 170 pb, 5μL de “Sybr® Green PCR Mastermix”, e água Milli-Q para um volume final de reação de 10 μL. As reações foram distribuídas em placas de 96 poços (Fast 96-Well Reaction Plate, 0,1 mL, MicroAmp™), centrifugadas por 2 minutos a 200
x g e levadas ao termociclador StepOnePlus (Apllied Biosystems). O programa de
termociclagem consistia de aquecimento a 95o C por 10 minutos, 40 ciclos de 94o C por 15 segundos e 64,3o C por 1 minuto, com aquisição da fluorescência a 64,3o C. A amplificação foi imediatamente seguida por um programa de melting com desnaturação inicial a 95o C por 15 segundos, resfriamento a 60o C por 1 minuto e aumento gradual de temperatura de 0,3o C/s até 95o C. Cada placa continha um controle negativo da extração (proveniente de camundongo normal), em duplicata, para sangue, e um controle negativo da PCR, em duplicata, com água no lugar de DNA, para a reação com oligonucleotídeos iniciadores de T. cruzi e do TNF-α (Cummings & Tarleton, 2003). 4.4.6. Mortalidade
A taxa de mortalidade foi calculada pela observação diária dos animais durante e até 30 dias após o término do tratamento. Os resultados foram expressos em percentagens. 4.4.7. Avaliação Sorológica
Para esta avaliação foi realizada a coleta de sangue 30 e 180 dias após o tratamento. Foram coletados aproximadamente 500 µL de sangue não heparinizado do seio venoso retro-orbital dos camundongos e transferido para tubos eppendorf de 1,5 mL, sendo estes centrifugados a 3500 rpm por 10 minutos. Os soros foram armazenados em novos
