KRAS Mutation Detection:
A New Look at an Old Gene
Detecção da Mutação do KRAS:
Uma Nova Olhada em um Velho Gene
A introdução de drogas de moléculas pequenase de anticorpos monoclonais humanos como novas terapias que tem como alvo receptores específicos e proteínas em vias específicas de transdução de sinal renovaram o interesse nos genes que tinham sido anteriormente identifi-cados como estando envolvidos no processo tumorigênico. O primeiro desses genes foi o ERBB23 [v-erb-b2 homólogo do oncogene viral da leucemia eritroblástica 2, homólogo (aviário) do oncogene derivado do neuro/glioblastoma ] oncogene (também conhecido como HER2), um membro da família do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), que está am-pliado no câncer de seio humano. Interesses diagnósticos nesse gene nunca foram grandes até que esse receptor se tornasse o alvo da Herceptin, a primeira terapia de anticorpo mo-noclonal contra um receptor celular. Similar-mente, EGFR se tornou o alvo tanto das terapias de anticorpos monoclonais que têm como alvo o domínio de ligação e as drogas de moléculas pequenas que inibem sua atividade da tirosina quinase. KRAS (homólogo do oncogene viral do sarcoma de rato v-Ki-ras2 Kirsten ) é um conhe-cido oncogene que tipicamente funciona na via EGFR. Embora as mutações nesse oncogene sejam conhecidas por estar associadas com vá-rios tipos de câncer humano, apenas recente-mente ele se tornou um biomarcador atraente para o laboratório clínico e o provedor de tra-tamento de saúde como um mecanismo para determinar opções terapêuticas. Detecção da mutação do KRAS se tornou parte da investiga-ção padrão de pacientes com câncer colorretal, e aqueles tumores que abrigam uma mutação do KRAS têm mostrado não ser sensíveis a tera-pias anti-EGFR. A implementação do teste da mutação do KRAS num ambiente do laboratório clínico é examinado abaixo por 4 patologistas e
um oncologista médico de 4 instituições médi-cas líderes nos Estados Unidos.
É o teste da mutação do KRAS realizado roti-neiramente em sua instituição? Se é, para quais indicações clínicas? Se não, quais são as barreiras que estão afetando sua implementa-ção?
Arief A. Suriawinata4 : O
teste do KRAS para câncer colorretal é rotineiramen-te realizado em pacienrotineiramen-tes que estão sendo conside-rados para terapia anti- EGFR incluindo cetuximab e panitumumab em nossa instituição. Oncologistas são responsáveis por pedir a análise da muta-ção do KRAS quando eles estão considerando a terapia anti-EGFR como um tratamento de se-gunda linha em pacientes com câncer colorretal avançado. O patologista então identificará o apropriado bloco do tecido e o enviará para o Laboratório de Patologia Molecular para testes. Além disso, teste do KRAS é realizado em todos os casos de adenocarcinoma pulmonar.
William K. Funkhou-ser5: Nós realizamos
teste da mutação do KRAS em um subgrupo de casos com câncer colorretal e câncer pulmonar de células não pequenas, geral-mente de pacientes que estão sendo consi-derados para terapia com anticorpos anti-EGFR (colorretal) ou inibidores da tirosina quinase anti-EGFR (pulmonar).
Marc Ladanyi6 : Sim, nós
realizamos teste da mutação do KRAS rotineiramente em 2 cenários clínicos: adeno-carcinoma pulmonar e car-cinoma colorretal metastáti-co. No primeiro, todos os casos são testados para mu-tações do EGFR primeiro e, se negativos, vão para o tes-te do KRAS. Mutações do EGFR e do KRAS são mutuamente exclusivas no adenocarcinoma pulmonar. Nós testamos todos os adenocarcinomas pulmonares ressecados já que uma grande proporção reincidirá. Nós tes-tamos apenas carcinoma colorretal metastático já que, no total, a maioria dos carcinomas color-retais são cirurgicamente curáveis.
Jan A. Nowak7:
Atual-mente, amostras estão sendo enviadas para um laboratório de referência para teste do KRAS. Pedi-dos para teste do KRAS vêm de oncologistas que estão determinando op-ções de tratamento para pacientes com carcinoma colorretal. Nosso laboratório está em processo de validar um exame para teste do KRAS para implementação em breve.
J. Marc Pipas8 :Em nossa instituição, o Grupo
de Oncologia do GI está regularmente realizan-do teste de mutação realizan-do KRAS em torealizan-dos os paci-entes com câncer colorretal metastático nos quais a terapia anti-EGFR está sendo considera-da. Isso está em conformidade com a Sociedade Americana de Parecer Clínico Provisório de On-cologia Clínica publicado em 2009. Devido à falta de resposta aos inibidores EGFR em paci-entes com mutações dos genes do KRAS, tera-pia anti-EGFR não é apropriada nesse grupo.
Que tipos de decisões de tratamento são base-adas no status do KRAS, e as análises retros-pectivas dos tumores dos pacientes são garan-tidas?
Arief A. Suriawinata: A decisão de tratar
paci-entes com terapia anti-EGFR depende altamen-te da condição da mutação dos genes do KRAS; isto é, terapia anti-EGFR é administrada apenas em pacientes com KRAS do tipo selvagem. Esdos retrospectivos sobre características do tu-mor podem ser úteis em prever a condição da mutação do KRAS e entender as características histológicas específicas associadas com a muta-ção do KRAS; por exemplo, nosso recente estu-do estu-do câncer colorretal mostrou que a maioria dos cânceres colorretais com persistente ade-noma viloso preexistente eram mutação positi-va do KRAS.
William K. Funkhouser: Dados dos testes
mos-traram que nenhum paciente com carcinoma colorretal com uma mutação de ativação do KRAS respondeu ao tratamento com anticorpos anti-EGFR. Carcinomas de pacientes não sensí-veis à terapia de primeira linha podem ser exa-minados retrospectivamente para a presença das mutações pontuais de ativação do KRAS nos códons 12, 13, e 61 pelo uso do modelo de DNA extraído dos blocos de parafina.
Marc Ladanyi: Mutações do KRAS são um
predi-tor negativo muito forte de resposta às terapi-as direcionadterapi-as ao EGFR tanto no adenocarci-noma pulmonar quanto no carciadenocarci-noma colorre-tal. Se nenhuma amostra atual estiver disponí-vel para teste, análise retrospectiva de uma amostra cirúrgica inicial de um paciente é útil, visto que as mutações do KRAS estão tipica-mente presentes no diagnóstico e são mantidas durante todo o curso da doença. É claro, a pos-sibilidade de um segundo câncer ou de câncer primário múltiplo deve ser mantida em mente.
Jan A. Nowak: Múltiplos estudos mostraram
que pacientes com tumores colorretais metas-táticos que abrigam as mutações nos códons 12 e 13 do KRAS não se beneficiam do tratamento com cetuximab ou panitumumab. Pacientes cujos tumores possuem sequências do tipo sel-vagem nos códons 12 e 13 mostram uma res-posta parcial àqueles agentes. Para pacientes que começaram com tal terapia, teste do KRAS
seria útil em determinar o potencial do uso con-tinuado daqueles agentes.
J. Marc Pipas: KRAS do
tipo selgavem é necessá-rio e não suficiente para resposta aos inibidores do EGFR em pacientes com câncer colorretal metastático. Além disso, foi mostrado que KRAS mutado [e BRAF (homó-logo do oncogene viral do sarcoma murina B1 v-raf )] está associado com uma pior sobrevivência geral. Visto que aproximadamente 40% das amostras dos tumo-res em pacientes com câncer colorretal exibe mutações do KRAS, análise da mutação do KRAS é crítica quando consideramos a terapia anti-EGFR. Pacientes com tumores que exibem mu-tações do KRAS devem ser considerados para outros tratamentos. Infelizmente, isso limita as opções terapêuticas, contudo testes clínicos estão agora abertos que especificamente abor-dam pacientes com tumores mutados pelo KRAS.
Detecção das mutações somáticas em tumores potencialmente heterogêneos pode ser pro-blemática. Como isso afeta sua interpretação desses resultados dos testes?
Arief A. Suriawinata: Enquanto nós fazemos o
melhor para selecionar uma seção que seja a mais representativa do tumor para teste do KRAS, nós percebemos que, embora raro, a he-terogeneidade do tumor pode ser um problema em cânceres colorretais grandes com poucas linhas diferentes de diferenciação. Alternativa-mente, teste do KRAS pode ser realizado numa metástase que supostamente representa o clo-ne mais agressivo se a heterogeclo-neidade do tu-mor for suspeitada. Nosso laboratório usa con-troles de 5% para cada uma das 7 mutações que consistem de oligonucleotídeos sintéticos mu-tantes e do tipo selvagem misturados em uma proporção de 95:5, respectivamente. Minha preocupação com o relato dos laboratórios so-bre a detecção de múltiplas mutações do KRAS
no mesmo tumor é que isso possa refletir al-guns desafios técnicos no desempenho do teste devido à proximidade das bases que estão tipi-camente mutadas (códons 12 e 13) contra ver-dadeira heterogeneidade do tumor.
William K. Funkhouser: Mistura rotineira do
DNA do KRAS mutante e do tipo selvagem im-plica numa necessidade de uma alta sensibili-dade para detecção das mutações pontuais nos códons 12, 13, e 61. Nós usamos controles posi-tivos incrementados de 5% e usamos piro se-quenciamento para detecção das mutações pontuais. Sequenciamento de Sanger seria me-nos sensível, e análise da curva de fusão neces-sitaria de sequenciamento confirmatório.
Marc Ladanyi: Em nossa experiência, principais
alterações genéticas iniciais do condutor tais como mutações do KRAS (ou mutações do EGFR) raramente, se alguma vez, mostram he-terogeneidade intratumoral genuína. É provável que a maioria das situações com aparente hete-rogeneidade intratumoral para mutações do KRAS de fato representem o teste de áreas de conteúdo tumoral diferente, algumas das quais podem estar abaixo do nível de sensibilidade do método do teste (tipicamente sequenciamento de Sanger). Outros exemplos de heterogenei-dade para as mutações do KRAS podem repre-sentar cores primárias separadas. Nós temos visto vários pacientes com múltiplos adenocar-cinomas pulmonares primários, cada um con-tendo uma diferente mutação (EGFR ou KRAS).
Jan A. Nowak: Eu não estou ciente de que
al-guém tenha sistematicamente abordado a questão da potencial heterogeneidade tumoral com relação à mutação do KRAS nos tumores colorretais. Até que existam bons dados, isso permanecerá um problema hipotético. Nós sa-bemos, entretanto, cerca de 30%–40% dos tu-mores de cólon terão mutações do KRAS e que esses tumores provavelmente não responderão aos agentes anti-EGFR observados acima. Tes-tes que são semelhanTes-tes no design e metodolo-gia devem ser tão preditivos quanto aqueles usados para estabelecer a observação KRAS– EGFR. Esses são os testes que os laboratórios
estão atualmente realizando. Se a micro-heterogeneidade tumoral mostrar ser um fator, então a interpretação dos resultados dos testes do KRAS terão que levar isso em conta. Se os tumores que mostram significativa heteroge-neidade do KRAS responderão diferentemente às terapias anti-EGFR também é desconhecido.
J. Marc Pipas: Em nossa instituição, nós temos
experiência com teste in-house para mutações somáticas do KRAS através do uso de PCR de tempo real e de químicas da sonda TaqMan. Nós temos mostrado que esse é um método robusto, fácil de usar, e confiável que pode ser usado para testes de baixo volume usando amostras de tecido misturadas com parafina assim como material de amostras de aspiração com agulha fina preservado em fixadores à base de álcool. Nós acreditamos que essa abordagem seja razoável para teste clínico generalizado.
Você acha que o teste da mutação do KRAS será estendido para outros tipos de tumores? Arief A. Suriawinata: Teste de outros tipos de
tumores somente ocorreria se a terapêutica puder atingir essa via de transdução de sinal nesses outros tipos de tumores. Visto que EGFR também desempenha um papel significativo em outros tumores, esse cenário é altamente pro-vável.
William K. Funkhouser: Teste de mutação do
KRAS deveria ser considerado para qualquer malignidade na qual o tratamento de quinases upstream com anticorpos ou inibidores da tiro-sina quinase está sendo considerado. Teste da mutação do BRAF também deveria ser conside-rado, já que ativar as mutações do BRAF tam-bém poderia impedir resposta à terapia anti-EGFR.
Marc Ladanyi: Atualmente, mutações do KRAS
são usadas como preditores negativos de res-posta às terapias direcionadas ao EGFR, portan-to os tipos de tumores testados são aqueles onde as terapias direcionadas ao EGFR já estão em uso generalizado, isto é, adenocarcinoma pulmonar e carcinoma colorretal. Entretanto, abordagens direcionadas aos próprios cânceres mutantes do KRAS estão em vários estágios do
desenvolvimento clínico e provavelmente guia-rão a expansão do teste do KRAS através de uma gama maior de histologias dos tumores.
Jan A. Nowak: É provável. Mutações do KRAS
são ativadores downstream da via de sinal do EGFR, supostamente o mecanismo pelo qual aquelas mutações contornam a eficácia dos an-tagonistas do EGFR. No câncer pulmonar das células não pequenas, as mutações do KRAS e as mutações do EGFR são declaradamente mu-tuamente exclusivas. É provável que o teste da mutação do KRAS seja parte do algoritmo para avaliação da via do EGFR no câncer pulmonar das células não pequenas.
J. Marc Pipas:Teste do KRAS, assim como teste
de outros componentes da via de transdução de sinal do EGFR–MAPK (tais como BRAF), conti-nuarão a ser avaliados em outros tipos de tu-mores e cenários clínicos. Além disso, à medida que outros componentes das vias metabólicas dos tumores forem descobertos, esses certa-mente serão perseguidos como possíveis fato-res prognósticos e preditivos numa variedade de outros cânceres.
Agradecimentos
Contribuições dos Autores: Todos os autores
confirmaram que eles contribuíram para o con-teúdo intelectual desse paper e satisfizeram os 3 seguintes requisitos: (a) contribuições signifi-cantes para a concepção e design, aquisição de dados, ou análise e interpretação dos dados; (b) rascunhando ou revisando o artigo para conte-údo intelectual; e (c) aprovação final do artigo publicado.
Revelações dos Autores de Potenciais Conflitos de Interesse: Nenhum autor declarou qualquer
potencial conflito de interesse.
Papel do Patrocinador: As organizações
patro-cinadoras não desempenharam papel algum no design do estudo, escolha dos pacientes inscri-tos, revisão e interpretação dos dados, ou pre-paração ou aprovação do manuscrito.
Notas de Rodapé
1 Joel A. Lefferts, Pós-doutorado, Patologia Molecular e Programa de Pesquisa
Translacio-nal, Departamento de Patologia, Dartmouth Medical School, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, Lebanon, NH.
2 Gregory J. Tsongalis, Diretor de Patologia Mo-lecular e do Programa de Pesquisa Translacio-nal, Departamento de Patologia, Dartmouth Medical School, Dartmouth-Hitchcock Medical Center and Norris Cotton Cancer Center, Leba-non, NH.
3 Genes humanos: ERBB2, v-erb-b2 homólogo do oncogene viral da leucemia eritroblástica 2, homólogo (aviário) do oncogene derivado do neuro/glioblastoma; KRAS, homólogo do onco-gene viral do sarcoma de rato v-Ki-ras2 Kirsten ; BRAF, homólogo do oncogene viral do sarcoma murina B1 v-raf.
4 Arief Suriawinata, Chefe da Seção de Patolo-gia Anatômica, Professor Adjunto de PatoloPatolo-gia, Departamento de Patoligia, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, Lebanon, NH.
5 William K. Funkhouser, Professor, Departa-mento de Patologia e Medicina Laboratorial, Diretor de Patologia Anatômica e Cirúrgica, UNC Hospitals, University of North Carolina, Chapel Hill, NC.
6 Marc Ladanyi, Patologista Assistente e Chefe do Serviço de Diagnóstico Molecular, Departa-mento de Patologia, Membro, Programa de Pa-togênese e Oncologia Humana, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY.
7 Jan A. Nowak, Diretor do Laboratório de Diag-nóstico Molecular, Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial, Evanston Hospital Nor-thShore University HealthSystem, Evanston, IL. 8 J. Marc Pipas, Professor Adjunto, Departa-mento de Medicina, Diretor do Programa de Oncologia do GI, Dartmouth Medical School and Norris Cotton Cancer Center, Lebanon, NH.
“This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. The views presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2010; 56 no. 5 698-701, by permission of AACC. Original copyright © 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article, please refer to the original English publication source in the journal, Clinical Chemistry.”
“Este artigo foi traduzido com a permissão da AACC. AACC não é responsável pela acurácia da tradução. Os pontos de vista apresenta-dos são aqueles apresenta-dos autores e não necessariamente os da AACC ou do Jornal. Reimpresso da ClinChem, 2010; 56 no. 5 698-701, por permissão da AACC. Cópia original © 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc. Quando citar este artigo, por favor refira-se à fonte de publicação original em inglês na revista,Clinical Chemistry.”
