DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO IN VITRO DE NANOEMULSÕES O/A A PARTIR DE EXTRATOS DE BROSIMUM
GAUDICHAUDII (MAMA-CADELA) COMO ALTERNATIVA
PARA O TRATAMENTO TÓPICO DE VITILIGO
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
WANESSA DE SOUZA CARDOSO QUINTÃO
DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO IN VITRO DE NANOEMULSÕES O/A A PARTIR DE EXTRATOS DE BROSIMUM
GAUDICHAUDII (MAMA-CADELA) COMO ALTERNATIVA
PARA O TRATAMENTO TÓPICO DE VITILIGO
Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do título de mestrado em Ciências da Saúde pelo programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade de Brasília.
Orientador: Prof. Dr. Guilherme Martins Gelfuso
Co-orientadora: Profª Dra. Lívia Cristina Lira de Sá Barreto
WANESSA DE SOUZA CARDOSO QUINTÃO
DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO IN VITRO DE NANOEMULSÕES O/A A PARTIR DE EXTRATOS DE BROSIMUM
GAUDICHAUDII (MAMA-CADELA) COMO ALTERNATIVA
PARA O TRATAMENTO TÓPICO DE VITILIGO
Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre pelo programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade de Brasília.
Aprovada em 28 de fevereiro de 2018.
BANCA EXAMINADORA
Orientador: Prof. Dr. Guilherme Martins Gelfuso Universidade de Brasília (UnB)
Profª. Dra. Maria de Fátima Borin Universidade de Brasília (UnB)
Profª. Dra. Juliana Lott de Carvalho Universidade Católica de Brasília (UCB)
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por todas as oportunidades que tive até aqui, pelos desafios que serviram de grandes lições, e pelas vitórias que me estimulam a buscar sempre o melhor de mim.
Agradeço de todo coração à família que amo, aos meus pais, pelo incentivo, pelo apoio, pela compreensão. À minha melhor amiga, irmã e farmacêutica mais linda, Tatyane. Ao meu amigo, companheiro e namorado Diego, agradeço por ser tão prestativo, pelo carinho, pela ajuda braçal neste trabalho, pelos mimos que salvaram meus dias cheios inúmeras vezes, e principalmente por ser minha inspiração de disposição. Com vocês compartilho toda a minha trajetória.
Dedico a vocês também meus agradecimentos aos meus amigos e aos parceiros de trabalhos e de vida, amizades dessa convivência LTMAC. Em especial um super agradecimento ao meu amigo Ricardo Nunes, irmão que ganhei nesse caminho, e que está sempre ao meu lado. Você já é parte da minha família.
Bom, tenho muito a dizer ao meu orientador. Professor Guilherme, agradeço muito pelas oportunidades que me ofereceu. Eu bem me recordo do dia em que fui à sua salinha saber se me aceitaria na iniciação científica. Eu não imaginava que dali sairia com um artigo publicado. Obrigada pela confiança, por ser acessível, por orientar. Muito além de uma orientação científica, quero que saiba que sou grata pela orientação vocacional. Honestamente, você não foi meu orientador, mas sim o guia desse caminho chamado “farmacotécnica”, que hoje quero seguir. Muito obrigada.
Agradeço à professora Lívia, por auxiliar tanto no desenvolvimento desse trabalho, por ser prestativa e por ter abraçado a causa de ser minha co-orientadora. Parte da satisfação que sinto do que aprendi ao longo desse trabalho, devo a essa doutora. Obrigada pela boa convivência, pelo material que me presenteou e pelas orientações.
Ao professor Christopher Fagg, pela disponibilidade e colaboração. Agradeço também aos técnicos do laboratório da UnB-FCE, pelo auxílio durante o trabalho, em especial ao Leo, por ser sempre solícito.
E não poderia deixar de agradecer à professora Juliana e à Thuany, que tanto auxiliaram no aprendizado em uma área que eu pouco conhecia. Muito obrigada pela ajuda e colaboração.
RESUMO
Brosimum gaudichaudii é uma planta do Cerrado brasileiro que possui furanocumarinas com potencial terapêutico para tratamento do vitiligo, com destaque ao bergapteno e psoraleno. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo desenvolver nanoemulsões, formulações capazes de incorporar ativos vegetais e modular a permeação através da pele, a partir de extratos de Brosimum gaudichaudii, para tratamento tópico do vitiligo. Os compostos bergapteno e psoraleno foram quantificados por Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (HPLC). Extratos etanólicos do pó (EXT1) e da casca da raiz (EXT2) de Brosimum gaudichaudii foram preparados e caracterizados por triagem fotoquímica. Apresentaram poucas diferenças na detecção de compostos, mas houve formação de diferentes cristais. Nanoemulsões óleo-em-água (O/A) de cada extrato foram preparadas utilizando Labrasol® e Plurol®
para incorporar o EXT1 e o EXT2, obtendo NE1 e NE2. O tamanho de gotícula, o potencial zeta, pH e teor de ativos nas nanoemulsões foram avaliados. Os efeitos dos extratos e padrões sobre a viabilidade, migração e proliferação celular foram analisados em melanócitos e queratinócitos humanos. Além disso, o potencial de irritabilidade das nanoemulsões foi avaliado por ensaio de HET-CAM. No estudo de estabilidade, as nanoemulsões apresentaram pH em torno 4,0. As nanoemulsões apresentaram tamanho de gotícula tamanho ideal, entre 50 e 200 nm. Houve aumento do tamanho de gotícula das nanoemulsões armazenadas em câmara climática, o que pode ser atribuído ao aumento da temperatura. O potencial zeta das nanoemulsões foi negativo, menor que -10 mV. Nos estudos de permeação in vitro, as nanoemulsões reduziram a permeação dos ativos bergapteno e psoraleno. Os extratos demonstraram certa citotoxicidade em melanócitos e queratinócitos, mas estimularam migração celular. As duas nanoemulsões foram classificadas como irritantes leves nos ensaios de HET-CAM e adequadas para uso tópico. As nanoemulsões desenvolvidas nesse trabalho, portanto, apresentaram-se estáveis, com aspectos físicos e características organolépticas adequadas para aplicação tópica, e foram capazes de concentrar os ativos na pele, reduzindo a permeação através da pele, o que poderia causar um impacto negativo na segurança do tratamento do vitiligo.
Palavras-chave: nanoemulsões, Brosimum gaudichaudii, bergapteno, psoraleno, vitiligo
ABSTRACT
Brosimum gaudichaudii is a Brazilian Cerrado plant which has furanocumarinas with therapeutic potential for vitiligo treatment, like bergapteno and psoralen. Considering its therapeutic potential, this work aimed to develop nanoemulsions, which are formulations capable of incorporating plant compounds and regulate the permeation through the skin, using Brosimum gaudichaudii extracts, for topical treatment of vitiligo. Bergapteno and psoralen compounds were quantified by high efficiency liquid chromatograph (HPLC). Ethanolics extracts of the Powder (EXT1) and the root bark (EXT2) of Brosimum gaudichaudii were prepared and characterized by photochemical screening. They showed few differences in the detection of compounds, but they produced different crystals conformations. Oil-in-water nanoemulsions (O/A) of each extract were prepared using Labrasol ® and Plurol ® to incorporate EXT1 and EXT2, obtaining NE1 and NE2. The droplet size, the zeta potential, pH and contente of bergapten and psoralen in the nanoemulsions were evaluated. The effects of the extracts and standards on the viability, migration and cellular proliferation were analyzed in human melanocytes and keratinocytes. In addition, the irritability potential of the nanoemulsions was evaluated by HET-CAM assay. In the stability study, the nanoemulsions presented PH around 4.0. The nanoemulsions presented an optimal droplet size between 50 and 200 nm. There was an increase in the droplet size of the nanoemulsions stored in the climate chamber, which can be attributed to the increase in temperature. The nanoemulsions’ zeta potential was negative, less than -10 mV. In the in vitro permeation studies, nanoemulsions reduced the permeation of bergapteno and psoralen compounds. The extracts demonstrated a certain cytotoxicity in melanocytes and keratinocytes, but they stimulated cellular migration. The nanoemulsions were classified as mild irritants in the HET-CAM assay and suitable for topical use. The nanoemulsions developed in this work, therefore, were stable, with physical aspects and organoleptic characteristics suitable for topical application, and were able to concentrate the compounds on the skin, reducing the permeation through the skin, the That could cause a negative impact on the safety of vitiligo treatment.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Camadas da pele: epiderme, derme e hipoderme. Fonte: Adaptado de Alexander et al. (2012)(30). ... 3 Figura 2. Camadas da epiderme e estruturas: camada basal, camada espinhosa, camada granulosa e camada córnea. Fonte: Adaptado de http://mimvet.blogspot.com.br/2015/10/mcac-ii-fisiologia-da-pele.html ... 4 Figura 3. Esquema que representa as vias de permeação do fármaco por via intercelular e por via transcelular. Fonte: Adaptado de Barry (1987) (38). ... 5 Figura 4. Desenhos esquemáticos de melanócitos. A) Célula localizada no estrato basal e com prolongamentos no estrato espinhoso. B) Processo de melanogênese no melanócito. Fonte: Adaptado de https://tattootraining.wordpress.com/2016/01/04/ .... 6 Figura 5. Esquema simplificado da rota biossintética que conduz a formação dos dois tipos de melanina, eumelanina e feomelanina. Adaptado de Sulaimon e Kitchell (2003) (44). ... 7 Figura 6. Paciente com manchas características do vitiligo na porção anterior das duas pernas. Fonte: Huggins et al. (2005) (47). ... 8 Figura 7. Fotografias da planta Brosimum gaudichaudii: 1) A planta 2) Raiz pivotante 3) Parte aérea e frutos. 4) Semente do fruto maduro. Autoria própria. ... 12 Figura 8. Estruturas químicas do bergapteno e do psoraleno. ... 13 Figura 9. Desenhos esquemáticos das estruturas das nanoemulsões óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O)... 17 Figura 10. Preparação da pele de orelha de suínos para estudo de permeação: (A) e corte (B) dos pedaços de pele com aproximadamente 2 cm de diâmetro, após a retirada do tecido adiposo. ... 21 Figura 11. Corte transversal da raiz de Brosimum gaudichaudii mostrando a casca externa e cerne antes e após a separação das partes. ... 22 Figura 12. Ilustração do aparato para realização da técnica de microssublimação empregada para análise do pó e da casca da raiz de Brosimum gaudichaudii. ... 25 Figura 13. Célula de difusão do tipo Franz modificada, com pele de porco entre os compartimentos doador e receptor. ... 32 Figura 14. Fotografia de linhagens de (A) melanócitos e (B) queratinócitos observadas por microscopia óptica (aumento 40x). ... 33
Figura 15. Visualização da membrana cório-alantoide após remoção de parte da casca do ovo. ... 36 Figura 16. Avaliação da presença de triterpenos no extrato da droga vegetal obtida comercialmente: (A) EXT1 e (B) EXT1 após reação de Liebermann-Burchard. ... 38 Figura 17. Presença de triterpenos e esteroides na droga vegetal coletada: (A) EXT2 e (B) EXT2 após reação de Liebermann-Burchard., com coloração avermelhada indicada pela seta de cor preta; e positiva para esteroides, com coloração verde indicada pela seta de cor vermelha. ... 39 Figura 18. Avaliação da presença de alcaloides nos extratos 1 e 2 das drogas vegetais obtidas comercialmente (A) e coletada (B). Por reação de precipitação com reativos gerais: Mayer, Bouchardat e Dragendorff, da esquerda para a direita, respectivamente. ... 40 Figura 19. Fotografias ilustrativas da reação de Borntragen positiva indicando presença de antraquinonas nos extratos de Brosimum gaudichaudii: (A) Extrato do pó da raiz comercial - EXT1 e (B) Extrato da raiz coletada - EXT2. ... 41 Figura 20. Fotografias ilustrativas do desenvolvimento de fluorescência em meio alcalino e luz UV das cumarinas presentes nos extratos (A) EXT1 e (B) EXT2. Nota-se o deNota-senvolvimento de forte fluorescência amarelo esverdeada, indicado pelas setas. ... 42 Figura 21. Fotografia de cristais formados em béqueres após a secagem em estufa (60 ºC) das drogas vegetais utilizadas: A) Pó da raiz obtido comercialmente e B) Raiz coletada. ... 42 Figura 22. Análise de cristais obtidos pela técnica de microssublimação da droga vegetal em pó utilizada para o preparo do EXT1: Microscopia óptica dos cristais (A) Aumento 40x e (B) Aumento 100x. (C) Cromatograma obtido por CLAE da lâmina da técnica de microssublimação da droga vegetal em pó. Condições: Coluna C18; fase móvel H2O/ACN/MeOH 50:25:25 (v/v/v); vazão de 0,6 mL/min; temperatura do forno
a 35 ºC e λ = 340 nm. ... 43 Figura 23. Análise de cristais obtidos pela técnica de micro-sublimação da casca da raiz coletada e utilizada para o preparo do EXT2: Microscopia óptica dos cristais (A) Aumento 40x e (B) Aumento 100x. (C) Cromatograma obtido por CLAE da lâmina da técnica de micro-sublimação da casca da raiz. Condições: Coluna C18; fase móvel H2O/ACN/MeOH 50:25:25 (v/v/v); fluxo de 0,6 mL/min; temperatura do forno a 35 ºC e λ = 340 nm. ... 44
Figura 24. Espectro de absorção na região do UV/Vis de uma solução de Bergapteno e Psoraleno, em etanol absoluto a 25 μg/mL. Faixa de varredura: 200 a 500 nm. ... 46 Figura 25. Cromatogramas (CLAE) referente à injeção de soluções de: (A) Etanol absoluto; (B) Pele extraída em etanol; (C) Labrasol® e Plurol® 4:1 (v/v) diluídos em
etanol na proporção 1:50 (v/v); (D) bergapteno padrão a 5 μg/mL; (E) psoraleno padrão a 5 μg/mL; (F) EXT1; (G) EXT2. Condições: coluna C18; fase móvel Água MilliQ/Acetonitrila/Metanol 50:25:25 (v/v/v); 35 ºC; fluxo 0,6 mL/min e injeção 10 μL; λ = 340 nm. ... 48 Figura 26. Representação gráfica da curva analítica obtida para o bergapteno (a e b) e psoraleno (c e d) por CLAE. Concentrações diluídas em: (a e c) Etanol absoluto. Equações de reta: (a) y = 31516x - 3008,2 com coeficiente de correlação linear: r = 0,9998 e (c) y = 29312x - 2735,8 com coeficiente de correlação linear: r = 0,9999; (b e d) tampão fosfato (pH 7,4) com 5% de Tween® 20 (p/v). Equações de reta: (b) 23463x – 1979 com coeficiente de correlação linear: r = 1 e (d) y = 25458x - 3515,9 com coeficiente de correlação linear: r = 0,9996. ... 49 Figura 27. Diagrama de fases pseudo-ternário para obtenção de nanoemulsões O/A. Em vermelho: nanoemulsão com 50% de água, 40% de tensoativos e 10% de oleato de etila. ... 54 Figura 28. Nanoemulsões O/A: (NEC) sem extrato, (NE1) com extrato etanólico de Brosimum gaudichaudii do pó da raiz comercial e (NE2) com extrato etanólico da planta coletada. ... 55 Figura 29 - Variação de pH das formulações NEC, NE1 e NE2 nos tempos 0, 7, 15, 30 e 90 dias nas três diferentes condições de temperatura: Ambiente (25°C ± 2°C), Geladeira (4°C ± 2°C) e Câmara climática (40ºC ± 2°C). Os dados são médias de 3 repetições ± desvio padrão. ... 58 Figura 30. Variação de potencial zeta das formulações NEC, NE1 e NE2 nos tempos 0, 7, 15, 30 e 90 dias nas três diferentes condições de temperatura: Ambiente (25°C ± 2°C), Geladeira (4°C ± 2°C) e Câmara climática (40ºC ± 2°C). Os dados são médias de 3 repetições ± desvio padrão. ... 60 Figura 31. Representação gráfica da variação de tamanho de gotícula (nm) das formulações NEC, NE1 e NE2 nos tempos 0, 7, 15, 30 e 90 dias nas três diferentes condições de temperatura: Ambiente (25°C ± 2°C), Geladeira (4°C ± 2°C) e Câmara climática (40ºC ± 2°C). Os dados são médias de 3 repetições ± desvio padrão. ... 62
Figura 32. Representação gráfica da variação do PDI das formulações NEC, NE1 e NE2 nos tempos 0, 7, 15, 30 e 90 dias nas três diferentes condições de temperatura: Ambiente (25°C ± 2°C), Geladeira (4°C ± 2°C) e Câmara climática (40ºC ± 2°C). Os dados são médias de 3 repetições ± desvio padrão. ... 63 Figura 33. Gráficos da variação de teor (%) de (A) Bergapteno e (B) Psoraleno da formulação NE1 nos tempos 0, 7, 15, 30 e 90 dias nas três diferentes condições de temperatura: Ambiente - 25°C ± 2°C; Geladeira - 4°C ± 2°C e Câmara climática - 40ºC ± 2°C. ... 64 Figura 34. Gráficos da variação de teor (%) de (A) Bergapteno e (B) Psoraleno da formulação NE2 nos tempos 0, 7, 15, 30 e 90 dias nas três diferentes condições de temperatura: Ambiente - 25°C ± 2°C; Geladeira - 4°C ± 2°C e Câmara climática - 40ºC ± 2°C. ... 65 Figura 35. Porcentagens de bergapteno e psoraleno recuperadas após estudos de permeação de 24 horas a partir das formulações controle (50% EXT1/EXT2 e 50% água) CT1, CT2, NE1 e NE2: (A) Porcentagem recuperada da solução receptora e (B) porcentagem recuperada da pele. ... 67 Figura 36. Estruturas do processo de redução do MTT (cor amarela), com formação do produto Formazan (cor roxo). ... 70 Figura 37. Porcentagem de viabilidade celular após tratamentos com EXT1 (3,83 ± 0,06 μM de bergapteno e 10,99 ± 0,28 μM de psoraleno), EXT2 (12,79 ± 0,25 μM de bergapteno e 3,15 ± 0,01 μM de psoraleno), bergapteno a 0,02 ± 0,01 μM e psoraleno a 0,05 ± 0,03 μM em: (A) Melanócitos (B) Queratinócitos. Os dados representam médias de 3 determinações ± desvio-padrão. (*) P < 0,05. ... 71 Figura 38. Proliferação dos melanócitos tratados com psoraleno, bergapteno, EXT1 ou EXT2, após 1, 2 e 3 dias, em porcentagem. Os dados representam médias de 3 determinações ± desvio-padrão. (*) P < 0,05. ... 73 Figura 39. Proliferação dos queratinócitos tratados com psoraleno, bergapteno, EXT1 ou EXT2 após 1, 2 e 3 dias, em porcentagem. Os dados representam médias de 3 determinações ± desvio-padrão. (*) P < 0,05. ... 73 Figura 40. Ensaio de migração dos melanócitos tratados com o controle; com os extratos EXT1 e EXT2 e com os padrões bergapteno e psoraleno. Tempos: 0h, após 24h e após 48h. Contagem das células que migraram para a arranhadura pelo programa Image J. ... 75
Figura 41. Análise quantitativa dos efeitos dos extratos EXT1 e EXT2 e dos padrões bergapteno e psoraleno na migração dos melanócitos. Tempos: 0h, após 24h e após 48h. Os dados representam médias de 3 determinações ± desvio-padrão. (*) P < 0,05. ... 76 Figura 42. Migração dos queratinócitos tratados com o controle; com os extratos EXT1 e EXT2 e com os padrões bergapteno e psoraleno. Tempos: 0h e após 24h. Contagem das células que migraram para a arranhadura pelo programa Image J. ... 77 Figura 43. Análise quantitativa dos efeitos dos extratos EXT1 e EXT2 e dos padrões bergapteno e psoraleno na migração queratinócitos. Os dados representam médias de 3 determinações ± desvio-padrão. (*) P < 0,05. ... 78 Figura 44. Sequência de imagens ilustrando o efeito dos controles positivo (NAOH 1M) e negativo (NaCl 0,9%), e das nanoemulsões NE1 e NE2 na membrana após 30 segundos, 2 minutos e 5 minutos. ... 79
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Escala para teste de HET-CAM conforme efeitos observados ao longo de 5 minutos. ... 36 Tabela 2. Classificação final das formulações quanto ao seu potencial de irritabilidade no HET-CAM, de acordo com a escala cumulativa. ... 37 Tabela 3. Resultados dos ensaios fitoquímicos para os extratos etanólicos de Brosimum gaudichaudii (mama-cadela). ... 45 Tabela 4. Análise da precisão e da exatidão intracorrida e intercorrida do método de quantificação para o bergapteno diluído em etanol absoluto. ... 50 Tabela 5. Análise da precisão e da exatidão intracorrida e intercorrida do método de quantificação para o bergapteno diluído em tampão fosfato (pH 7,4) com 5% de Tween® 20 (p/v). ... 50 Tabela 6. Análise da precisão e da exatidão intracorrida e intercorrida do método de quantificação para o psoraleno diluído em etanol absoluto. ... 51 Tabela 7. Análise da precisão e da exatidão intracorrida e intercorrida do método de quantificação para o psoraleno diluído em tampão fosfato (pH 7,4) com 5% de Tween® 20 (p/v). ... 52 Tabela 8. Porcentagem de recuperação de bergapteno e psoraleno da pele utilizando etanol como solvente extrator. ... 53 Tabela 9. Características organolépticas observadas a partir das nanoemulsões NEC, NE1 e NE2 O/A obtidas. ... 55 Tabela 10. Resultados da avaliação dos parâmetros pH, tamanho de gotícula, PDI e Potencial zeta das formulações NEC, NE1 e NE2 O/A obtidas. ... 56 Tabela 11. Concentrações estimadas de bergapteno e psoraleno das formulações aplicadas, obtidas a partir de análise por CLAE dos controles CT1, CT2 e das nanoemulsões NE1 e NE2. ... 66 Tabela 12. Quantidade estimada de bergapteno e psoraleno em relação às concentrações iniciais aplicadas na pele, dos controles CT1, CT2 e das nanoemulsões NE1 e NE2, por CLAE. ... 68 Tabela 13. Concentração estimada de bergapteno e psoraleno obtida a partir de análise por CLAE dos extratos etanólicos EXT1 e EXT2. ... 71 Tabela 14. Classificação final das formulações quanto ao seu potencial de irritabilidade no HET-CAM, de acordo com a escala cumulativa. ... 80
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
A/O Água-em-óleo
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CV Coeficiente de Variação
DMSO Dimetilsulfóxido
EXT Extrato
g Grama
HPLC Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência LD Limite de detecção LQ Limite de quantificação mg Miligrama mL Mililitro MTT Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil-2)-2,5-difenil-tetrazólio µg Micrograma NB-UVB Narrow-band-UVB NE Nanoemulsão
NEC Nanoemulsão controle
NE1 Nanoemulsão do extrato do pó da raiz de Brosimum gaudichaudii
NE2 Nanoemulsão da casca da raiz coletada de Brosimum gaudichaudii
nm Nanômetro
O/A Óleo-em-água
PDI Índice de polidispersão pH Potencial hidrogeniônico
PUVA Psoralenos associado a exposição com radiação ultravioleta tipo A
UV Ultravioleta
UVA Radiação ultravioleta tipo A UVB Radiação ultravioleta tipo B
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Pele.... ... 3
1.1.1Vias de penetração epidérmica ... 5
1.2 Melanogênese ... 6 1.3 Vitiligo ... 8 1.3.1Tratamentos ... 9 1.3.2Corticoesteroides ... 10 1.3.3Tratamento cirúrgico ... 10 1.3.4Psoralenos e fototerapia ... 10
1.4 A espécie Brosimum gaudichaudii ... 11
1.4.1Toxicicidade ... 13
1.4.2Ensaios in vivo ... 14
1.4.3Produtos registrados contendo Brosimum gaudichaudii ... 15
1.5 Nanoemulsões ... 15 2 JUSTIFICATIVA ... 19 3 OBJETIVOS ... 19 3.1 Gerais ... 19 3.2 Específicos ... 19 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 20 4.1 Material ... 20 4.1.1Reagentes ... 20 4.2 MÉTODOS ... 21 4.2.1Pele de porco ... 21
4.2.2Coleta de material vegetal ... 21
4.3 Preparo dos extratos etanólicos ... 22
4.4 Prospecção dos constituintes da planta (triagem fitoquímica preliminar) ... 23
4.5.1Seletividade ... 26
4.5.2Linearidade ... 26
4.5.3Precisão e exatidão ... 27
4.5.4Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) ... 27
4.5.5Estudos de recuperação do bergapteno e do psoraleno da pele ... 28
4.6 Nanoemulsões ... 29
4.6.1Diagrama de fases pseudo-ternário... 29
4.6.2Preparo das nanoemulsões O/A com extratos etanólicos de Brosimum gaudichaudii ... 29
4.7 Caracterização das nanoemulsões... 30
4.7.1Características organolépticas ... 30
4.7.2Teste de centrifugação ... 30
4.7.3Análise de pH ... 30
4.7.4Tamanho de gotícula, potencial zeta PDI ... 31
4.7.5Teor de bergapteno e psoraleno ... 31
4.8 Estudos de estabilidade das nanoemulsões ... 31
4.9 Estudos in vitro de permeação cutânea do bergapteno e do psoraleno a partir das formulações NE1 e NE2 e controles NC1 e NC2 ... 32
4.10 Ensaios in vitro com linhagens de melanócitos e queratinócitos ... 33
4.10.1 Avaliação da viabilidade de células - ensaio de MTT ... 34
4.10.2 Proliferação celular ... 34
4.10.3 Migração celular ... 35
4.11 Avaliação in vitro do potencial irritativo das nanoemulsões (HET-CAM) ... 35
4.12 Análises dos dados ... 37
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 38
5.1 Prospecção dos constituintes da planta (triagem fitoquímica preliminar) ... 38
• Triterpenos e esteroides ... 38
• Antraquinonas ... 40
• Cumarinas por aumento de fluorescência em meio básico e exposição à luz UV... 41
• Microssublimação e obtenção de cristais ... 42
5.2 Padronização e validação de metodologia analítica para quantificação de bergapteno e psoraleno a partir dos extratos vegetais, formulações e em experimentos de permeação cutânea ... 46
5.2.1Determinação do comprimento de onda de absorção de máxima para o bergapteno e para o psoraleno ... 46
5.2.2Seletividade ... 47
5.2.3Linearidade ... 48
5.2.4Precisão e exatidão ... 49
5.2.5Limite de detecção (LQ) e limite de quantificação (LQ) ... 52
5.2.6Recuperação do bergapteno e do psoraleno da pele ... 53
5.3 Desenvolvimento das nanoemulsões O/A e análises preliminares ... 53
5.3.1Formação das nanoemulsões O/A com extratos etanólicos de Brosimum gaudichaudii ... 53
5.3.2Características organolépticas e centrifugação ... 55
5.3.3Análise dos parâmetros iniciais das nanoemulsões ... 56
5.4 Estudos de estabilidade acelerada das nanoemulsões ... 57
5.4.1pH e potencial zeta ... 58
5.4.2Tamanho das gotículas e PDI ... 61
5.4.3Análise do teor de bergapteno e psoraleno nas nanoemulsões NE1 e NE2 64 5.5 Estudos in vitro de permeação cutânea dos marcadores a partir das nanoemulsões ... 66
5.6 Ensaios in vitro em cultura celular de melanócitos e queratinócitos com EXT1 e EXT2... ... 70
5.6.1Efeito dos extratos sobre a viabilidade celular de melanócitos e queratinócitos... ... 70
5.6.2Efeito dos extratos sobre a proliferação de melanócitos e queratinócitos .... 72
5.6.3Efeito dos extratos sobre a migração celular ... 74
5.7 Ensaio in vitro do potencial irritativo das nanoemulsões (HET-CAM) ... 78
6 CONCLUSÃO ... 81
1 INTRODUÇÃO
O vitiligo é uma hipomelanose, ou seja, uma desordem de pigmentação caracterizada por uma baixa produção de melanina, que é a substância que dá pigmento à pele. Pode ser causado por uma redução no número ou pela ausência de melanócitos, as células produtoras de melanina (1). A doença se apresenta sob a forma de manchas com ausência de cor, geralmente localizadas em uma ou mais partes do corpo, que podem se apresentar de forma uni ou bilateral (2).
Na pele humana, os melanócitos são encontrados na camada basal da epiderme e organizam-se com os queratinócitos em unidades funcionais, denominadas unidades epidermais de melanina ou melano-epidérmicas, na proporção de 1:36. O equilíbrio dessas unidades determina a regulação da divisão dos melanócitos e transferência de melanossomas para os queratinócitos (3–6).
O mecanismo da patogênese do vitiligo ainda não é bem estabelecido. Algumas teorias sugerem que a patologia possa ter origem autoimune, celular, genética ou uma combinação de fatores. Contudo, a manifestação da doença varia entre os indivíduos, de forma que estabelecer a causa torna-se um desafio (7,8).
O maior impacto causado pelo vitiligo é psicossocial, tendo em vista que o aparecimento das manchas tende a afetar a autoestima dos indivíduos. Contudo, existem estudos que correlacionam o vitiligo à incidência de doenças inflamatórias ou autoimunes, como por exemplo Lúpus Eritematoso Sistêmico, diabetes mellitus tipo 1, dermatite atópica, entre outras (9–11). O vitiligo não se caracteriza como uma doença contagiosa e também ainda não tem cura. Porém, existem diferentes alternativas para tratar a patologia, que devem ser avaliadas de acordo com observações clínicas, como a característica das manchas, número, tipo de pele do paciente, entre outras (12,13).
Com o intuito de estimular a síntese de melanina nas áreas da pele que apresentam a perda do pigmento, uma das alternativas de tratamento para o vitiligo consiste no uso de furocumarinas. Essas substâncias podem ser encontradas em diversas espécies de plantas, como por exemplo na espécie Brosimum gaudichaudii, com destaque ao bergapteno e psoraleno.
No Brasil, um medicamento fitoterápico produzido a partir dos compostos da espécie Brosimum gaudichaudii (Viticromin®) foi registrado, com comprovação
O Viticromin® estava disponível nas formas de comprimidos, solução tópica e
pomadas (14–16). Contudo, em 2009 foi publicada a Resolução - RE Nº - 2.078, de 4 de janeiro de 2009, na qual consta o cancelamento de Registro do Medicamento (17). Dessa forma, o uso seguro de extratos derivados dessa espécie requer estudos que forneçam os requisitos mínimos de eficácia, qualidade e segurança do produto final.
Apesar do registro de derivados de Brosimum gaudichaudii, não há estudos que comprovem a concentração de componentes do extrato que penetram a pele. Além disso, soluções e pomadas são formas farmacêuticas convencionais que apresentam algumas desvantagens no tratamento de manchas causadas pelo vitiligo. As soluções são formas farmacêuticas líquidas que geralmente contém água em sua composição (18), o que pode dificultar a estabilidade de ativos vegetais. Já as pomadas, são formas farmacêuticas pouco aceitas pelos pacientes, por serem associadas a um efeito gorduroso, cheiro forte e dificuldade de se lavar. Estudos também sugerem que pomadas podem ser menos eficazes que emulsões, por exemplo, na penetração de princípios ativos na pele, devido à composição basicamente lipídica (18–20).
Em contraposição às formas farmacêuticas tradicionais, a nanotecnologia apresenta inúmeras vantagens para a produção de fitoterápicos e fitocosméticos, como o aumento da solubilidade e biodisponibilidade, redução da toxicidade, melhora da atividade farmacológica, aumento da estabilidade, liberação sustentada, proteção contra degradação física e química, entre outras (21,22). Nanoemulsões por exemplo, são sistemas coloidais líquidos, transparentes e extremamente estáveis, com tamanho de gotículas em escala nanométrica (50 - 200 nm). Além disso, são adequadas para substâncias pouco solúveis em sistemas transdérmicos. Essas características fazem delas sistemas altamente desejáveis para aplicação dermatológica (23–25).
Nesse sentido, esse trabalho tem como proposta desenvolver nanoemulsões contendo extrato de Brosimum gaudichaudii para o tratamento tópico de vitiligo. Esse tipo de formulação tem como vantagens: (i) estabilidade; (ii) melhor penetração de ativos através da pele, devido ao tamanho de gotícula e composição; (iii) possibilidade de controle de permeação; (iv) a transparência característica facilita a visualização de processos de instabilidade (26). Ademais, na via tópica há um grande benefício em relação a outras vias de administração. Por essa via, não há redução da biodisponibilidade do fármaco devido ao metabolismo de primeira passagem (27).
1.1 Pele
A pele é o maior órgão do corpo humano. É formada por três camadas distintas: derme, epiderme e hipoderme (Figura 1). A hipoderme encontra-se sob a derme e consiste de tecido adiposo ou células de gordura com uma parte constituída de colágeno. A derme situa-se abaixo da epiderme e possui a função de fornecer apoio estrutural e nutricional à epiderme. Ela contém os vasos sanguíneos, nervos, folículos pilosos, glândulas sebáceas, músculo eretor de pelo e glândulas sudoríparas. Já a epiderme constitui a camada mais superficial da pele, formada por quatro camadas celulares distintas (Figura 2): basal, espinhosa, granulosa e córnea (28,29).
Figura 1. Camadas da pele: epiderme, derme e hipoderme. Fonte: Adaptado de Alexander et al. (2012)(30).
A camada basal da epiderme é a mais profunda e caracteriza-se por uma única camada de células com núcleos mitóticos. Nessa camada podem ser encontradas diferentes tipos de células, como as células produtoras de melanina, os melanócitos; e as células de Merkel, responsáveis pela resposta sensorial (31).
Na camada espinhosa, podem ser encontrados nas células os grânulos de melanina e as células de Langerhans, importantes fagócitos que auxiliam na ativação da resposta imunológica contra substâncias estranhas. Logo acima, encontra-se a camada granulosa, formada por camadas de células achatadas, com dois tipos de grânulos oriundos da desintegração do núcleo e das organelas: grânulos de
querato-hialina e lamelares. Esses grânulos são responsáveis pela formação de queratina, síntese de lipídeos e redução da perda de água (31).
A camada mais externa da epiderme é a camada córnea, também chamada de estrato córneo. É formada por células mortas queratinizadas, os corneócitos, organizados em estruturas lamelares, achatadas. Além dessas células, o estrato córneo é composto por uma matriz lipídica. Devido à estrutura e composição, essa camada é a principal barreira à penetração de fármacos pela pele (32,33).
Figura 2. Camadas da epiderme e estruturas: camada basal, camada espinhosa, camada granulosa e camada córnea. Fonte: Adaptado de http://mimvet.blogspot.com.br/2015/10/mcac-ii-fisiologia-da-pele.html
A sequência de eventos que culmina na formação de corneócitos tem início na proliferação das células na camada basal da epiderme. Ao deixar a camada basal, as células começam a se diferenciar e migrar para a parte mais externa da epiderme, através da camada espinhosa e camada granulosa. Nessa camada, as células começam a perder seus núcleos e finalmente atingem a camada córnea, na qual tornam-se achatadas, preenchidas com queratina e glicolipídeos nos espaços intercelulares (29,33).
A pele é um órgão complexo e apresenta inúmeras funções biológicas. A principal delas consiste na função barreira, pois sua estrutura impede a entrada de muitos microrganismos, diversas substâncias químicas, e também fornece proteção contra a radiação ultravioleta (UV) e a perda de água. Outras funções importantes desempenhadas pela pele são: homeostase térmica, suporte mecânico, secreção de substâncias pelas glândulas e atividade metabólica (32,34).
Dependendo da região do corpo, a pele apresenta diferenças quanto à espessura, distribuição de anexos como unhas, pelo e cabelos, conteúdo de melanina,
entre outros. Mudanças podem ser provocadas na fisiologia da pele quando há exposição a fatores externos como radiação UV, ou quando há atuação de fatores genéticos e/ou do envelhecimento. O surgimento de rugas ou manchas e perda de elasticidade estimulam a busca por tratamentos estéticos ou farmacológicos. Nesse contexto, busca-se melhorar o aspecto da pele e contribuir para a saúde e autoestima (31,35,36).
1.1.1 Vias de penetração epidérmica
Um fármaco para ter ação tanto local quanto sistêmica deve conseguir atravessar as camadas da epiderme, a começar pelo estrato córneo, principal barreira contra a entrada de substâncias na pele (33).
Na administração por via epidérmica, o fármaco deve migrar através da pele atingindo a corrente sanguínea, sem permanecer nas camadas dérmicas. Para que um fármaco possa penetrar na pele, devem ser analisadas suas propriedades químicas e físicas, o tipo de veículo da formulação e as condições da pele na qual será aplicada. Esse tipo de administração é aplicável à pele intacta, pois em pele cortada ou escoriada, o fármaco teria acesso direto à corrente sanguínea, o que descaracteriza o sistema transdérmico (28,30).
A permeação através da pele da maioria dos fármacos ocorre por três vias, a via intercelular, na qual a substância se difunde pelas camadas epidérmica imersa na matriz lipídica e contornando os corneócitos; a via transcelular, na qual o fármaco atravessa diretamente os corneócitos e a matriz lipídica; ou a via folicular, na qual o fármaco penetra através do folículo piloso (Figura 3) (30,37,38).
Figura 3. Esquema que representa as vias de permeação do fármaco por via intercelular e por via transcelular. Fonte: Adaptado de Barry (1987) (38).
1.2 Melanogênese
Os melanócitos (Figura 4) são células dendríticas que se originam na crista neural e migram para outros locais, como a epiderme, onde localizam-se entre o estrato espinhoso e o estrato basal. São responsáveis pela produção do pigmento melanina, que confere cor à pele. Quando estão desenvolvidos, distribuem-se em tecidos, órgãos e anexos cutâneos (31,39).
Os melanócitos são responsáveis pela síntese, armazenamento e transporte dos pigmentos de melanina para os queratinócitos. Na pele, estão localizados na camada basal da epiderme e organizam-se com os queratinócitos em unidades funcionais, denominadas unidades epidermais de melanina ou melano-epidérmicas, na proporção de 1:36. O equilíbrio dessas unidades determina a regulação da divisão dos melanócitos e transferência de melanossomas para os queratinócitos (3–6).
Nas unidades ocorre a síntese da melanina (polímero constituído de aminoácidos tirosina) a partir da ação enzimática da tirosinase. A enzima é sintetizada e glicosilada no retículo endoplasmático rugoso e transferida para o complexo de Golgi, onde formará vesículas denominadas melanossomas (40,41).
Após reações bioquímicas provocadas principalmente pela enzima tirosinase, que converte a tirosina em melanina, os melanossomas transportam os grânulos de melanina para a superfície nuclear dos queratinócitos (42). O transporte ocorre por ramificações dendríticas (Figura 4), formando uma barreira de pigmento que protege o núcleo dos efeitos prejudiciais da radiação solar ultravioleta (43).
Figura 4. Desenhos esquemáticos de melanócitos. A) Célula localizada no estrato basal e com prolongamentos no estrato espinhoso. B) Processo de melanogênese no melanócito. Fonte: Adaptado de https://tattootraining.wordpress.com/2016/01/04/
O tipo de melanina a ser produzido depende da disponibilidade de substratos. A melanina pode ser classificada de acordo com a rota de biossíntese em eumelanina, caracterizada por pigmentos de coloração preta e marrom, e feomelanina, que tem por característica pigmentos de cor amarela e vermelha. A enzima envolvida na produção dos dois tipos de melanina é a tirosinase. Resumidamente, a tirosinase converte a tirosina em DOPA, e a DOPA em DOPAquinona e esta é então transformada em eumelanina ou feomelanina (44,45).
A rota de biossíntese da melanina (Figura 5) inicia-se dentro dos melanossomos, com a oxidação da tirosina e conversão em DOPA, pela enzima tirosinase. Em seguida, a DOPA é convertida em dopaquinona e esta sofre reações para originar eumelanina ou feomelanina. Na ausência de tiois, como a cisteína e a glutationa, inicia-se uma série de reações que originam o DOPAcromo e este pode ser então convertido em eumelanina por duas vias. Uma delas é a reação de descarboxilação espontânea com formação de DHI (dihidroxi-5,6-indol), e conversão deste em eumelanina; e a outra consiste na tautomerização pela ação da TRP2 (Proteína relacionada à tirosinase 1 ou DOPAcromotautomerase) com formação de DHICA (dihidroxi-5,6- indol 2-carboxilato). Atuando com a tirosinase, as proteínas relacionadas à tirosinase 1 (TRP1) oxidam DHICA e dão origem à eumelanina (44,45). Já na presença de tiois, a DOPAquinona é convertida em DOPAcisteína e esta dá oritem à feomelanina.
Figura 5. Esquema simplificado da rota biossintética que conduz a formação dos dois tipos de melanina, eumelanina e feomelanina. Adaptado de Sulaimon e Kitchell (2003) (44).
1.3 Vitiligo
Vitiligo é uma doença caracterizada pela perda da melanina, pigmento natural da pele (Figura 6). A despigmentação é atribuída à redução de número ou de função dos melanócitos, células que produzem melanina (46). A desordem afeta entre 1 a 2% da população mundial, (47) e em países como a África, a prevalência é maior em adultos e em mulheres (48). As manchas características podem surgir em vários locais do corpo, como na face, na superfície das mãos, nas axilas, nariz, olhos, entre outros.
Figura 6. Paciente com manchas características do vitiligo na porção anterior das duas pernas. Fonte: Huggins et al. (2005) (47).
O vitiligo pode ser classificado clinicamente em três diferentes tipos (2,43,49,50): universal, localizado ou generalizado. O tipo universal caracteriza-se pela presença de lesões em quase todo o corpo. No tipo localizado, as manchas caracterizam o vitiligo como (i) focal, com lesões pontuais; (ii) segmentar, quando as manchas estão localizadas em um único lado do corpo; (iii) não segmentar, quando as manchas se manifestam nos dois lados do corpo; ou (iv) mucoso, quando atingem apenas as mucosas. Quanto ao tipo generalizado, as lesões podem estar presentes de forma a classificar o vitiligo em: vulgar, com distribuição simétrica das manchas em diferentes partes do corpo; acrofacial, com áreas da face ou extremidades distais despigmentadas ou misto, quando há manchas dos dois tipos (51).
O maior impacto do vitiligo na qualidade de vida dos pacientes está atrelado à visibilidade estética, à falta de conhecimento da natureza da doença e ao desafio de um tratamento seguro e eficaz, tendo em vista a cronicidade da patologia. Apesar de não ser contagiosa, a doença pode afetar o bem-estar psicológico e a capacidade de adaptação social. Nesse sentido, os pacientes tendem a apresentar sintomas de baixa
autoestima, discriminação, ansiedade, sentimento de rejeição e depressão (11,52– 54).
Diferentes hipóteses têm sido estudadas na tentativa de compreender o processo de despigmentação característico da doença, como mecanismos autoimunes, genéticos, emocionais, entre outros (55,56). Três teorias destacam-se: autoimunidade, autocitoxicidade e hipótese neural. Contudo, a etiologia e a patogênese do vitiligo variam de indivíduo para indivíduo e, por isso, ainda não são bem estabelecidas (43). Sabe-se que a doença pode afetar membros de uma mesma família, o que também sugere a existência de um componente genético (7,57).
A teoria de autoimunidade considera o envolvimento da imunidade celular e humoral e tem suporte associado na presença de anticorpos contra os melanócitos, detectados em níveis séricos e nas manchas (58–60). Além disso, há uma relação de prevalência de comorbidades autoimunes, como por exemplo psoríase (61), doenças relacionadas a tireoide (58,62), alopécia areata (62), dermatite atópica (10), síndrome de Sjögren (63), entre outras.
Na teoria bioquímica, considera-se que os melanócitos sofrem destruição por substâncias autotóxicas liberadas durante o processo de síntese de melanina (50). Já de acordo com a hipótese neural, os melanócitos possuem a mesma linhagem embriológica que o sistema nervoso, ou seja, derivam da crista neural. Dessa forma, qualquer processo que cause destruição dessas células também pode afetar outras células do sistema nervoso (1,39,64).
1.3.1 Tratamentos
As manchas características do vitiligo já eram alvo de terapias muito antes da doença ser descoberta. Até o século XIX, ainda não havia conhecimento a respeito da doença e tampouco do tratamento adequado (65). Ainda hoje, século XXI, o tratamento do vitiligo é um desafio, visto que diferentes teorias tentam explicar a etiologia da doença, que se apresenta com grande variabilidade entre os indivíduos. Contudo, o foco principal do tratamento consiste em estimular a síntese de melanina nas áreas da pele que apresentam a perda do pigmento. Nesse contexto, terapias medicamentosas e associações com terapias alternativas têm sido propostas.
1.3.2 Corticoesteroides
O uso de corticosteroides tópicos é uma opção eficaz para evitar a progressão do vitiligo (66,67). Podem ser utilizados em monoterapia, em combinação com fototerapia ou com outros medicamentos tópicos, como calcipotriol (68,69). As vantagens dessa terapia consistem basicamente em baixo custo e fácil aplicação.
Kwinter et al. (66) avaliaram os efeitos clínicos e a segurança do tratamento com corticosteroides tópicos em crianças. Os autores observaram que 64% dos 70 pacientes apresentaram repigmentação das lesões, 11% tiveram piora do estado e em 25% observou-se algum efeito colateral, como atrofia, estria e telangiectasia.
Quanto ao uso sistêmico de corticoides, prioriza-se o tratamento com os medicamentos por via oral devido à associação da etiologia da doença com a ação de anticorpos contra os melanócitos. No entanto, o tratamento pode acarretar em efeitos colaterais significativos, como aumento de peso, acne, insônia, ou hipertricose (70). Com o intuito de reduzir esses efeitos e retardar a progressão da doença, o uso de terapia oral com minipulso de betametasona ou dexametasona surge como uma alternativa mais eficaz (67).
1.3.3 Tratamento cirúrgico
Nos casos de pacientes que dificilmente respondem ao tratamento clínico, seja terapia oral seja fototerapia, geralmente a cirurgia é indicada. Pacientes que apresentam vitiligo estável tendem a responder melhor à intervenção cirúrgica (71). O tratamento cirúrgico inclui enxertos finos, enxerto de pele parcial, enxertos com punchs, enxertia epidérmica por bolhas de sucção, transplante de melanócitos. Contudo, um pré-requisito importante para a indicação de terapia cirúrgica é a estabilização da despigmentação característica da doença (72–74).
1.3.4 Psoralenos e fototerapia
Os psoralenos são furocumarinas encontrados em muitas espécies de plantas. Essas substâncias quando estimuladas pela radiação UV são capazes de iniciar reações fotoquímicas na pele, pela ligação às bases pirimidínicas do DNA das células. Os psoralenos utilizados com fins terapêuticos mais conhecidos são: 5-metoxipsoraleno (5-MOP, bergapteno), 8-Metoxipsoraleno (8-MOP, metoxaleno) e 4,5,8-trimetoxipsoraleno (trioxaleno) (75,76). Pelas características de ligação às
bases de DNA, os psoralenos têm sido estudados como inibidores de células cancerígenas em modelos animais com câncer de mama (77).
Uma alternativa bastante empregada na terapêutica do vitiligo é a fototerapia para estimular a melanogênese. A radiação ultravioleta tipo B (UVB), o UVB narrow-band (NB-UVB), a luz excimer e laser excimer, e o uso de psoralenos associado a exposição com radiação ultravioleta tipo A (PUVA) são os principais tipos (47). Este último consiste na combinação de psoraleno administrado de forma oral ou tópico com exposição à radiação ultravioleta tipo A (UVA). O tempo de tratamento varia conforme a técnica utilizada, o tipo de vitiligo, o número de manchas, entre outros fatores.
A terapia com PUVA e o NB-UVB são as principais escolhas para o tratamento do vitiligo (78–81). Inicialmente, PUVA era um tratamento que consistia na aplicação tópica ou ingestão de extratos brutos de plantas (ex.: Psoralea corylifolia e Ammi majus) contendo psoralenos, compostos da família das furocumarinas, seguida de exposição à luz solar. Entretanto, os efeitos adversos eram graves e muitas vezes levavam à morte (13). Por isso, outros estudos surgiram na tentativa de isolar os compostos ativos das plantas e realizar testes clínicos.
El-Mofty na década de 1940 conseguiu isolar furocumarinas da planta Ammi majus Linnaes, como o 8-MOP, o TMP, e o bergapteno, substância também encontrada em espécies de Brosimum (1,82).
Recente metanálise demonstrou que a fototerapia NB-UVB ou PUVA deve ser indicada por um período mínimo de seis meses para aumentar a resposta ao tratamento. Contudo, é preciso avaliar as limitações de cada tipo, como por exemplo efeitos fototóxicos, náusea, dor ou eritema. O tratamento com PUVA apresenta mais limitações que NB-UVB, contudo, mostra-se eficaz em casos de vitiligo generalizado ou universal (83). Além disso, o tratamento com PUVA tem se mostrado bastante promissor em pacientes com outras patologias, principalmente a psoríase (76).
1.4 A espécie Brosimum gaudichaudii
Brosimum gaudichaudii (Figura 7) é uma espécie de planta da família Moraceae (84). Dependendo da localização, a espécie Brosimum gaudichaudii pode ser conhecida popularmente como mama-cadela, algodão, algodãozinho, inharé, mamica-de-cadela, manacá, manacá-do-campo, entre outros (85–91).
Figura 7. Fotografias da planta Brosimum gaudichaudii: 1) A planta 2) Raiz pivotante 3) Parte aérea e frutos. 4) Semente do fruto maduro. Autoria própria.
A mama-cadela é uma planta considerada dominante na flora do Cerrado (84). Segundo levantamento de espécies lenhosas do Cerrado, realizado por Ratter et al. (92), a espécie Brosimum gaudichaudii se apresenta amplamente distribuída e está entre as 38 plantas com maior distribuição nesse bioma. Distribui-se no Cerrado sensu scrictu, Cerradão, também sendo encontrada em Campo Sujo, Mata Atlântica, Caatinga e Floresta decídua. Pode ser encontrada nos Estados do Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Amazonas, São Paulo, Pará, Goiás, Maranhão e ainda nos países Paraguai e Bolívia (92,93).
O uso da espécie na medicina popular é atribuído ao potencial terapêutico para tratamento de vitiligo (94). O extrato produzido pela decocção das cascas do caule e raízes ou infusão e folhas da espécie e o extrato alcoólico são utilizados também para o tratamento de outras doenças de pele, como psoríase (95–97). Contudo, o contato com a espécie da planta pode causar fitodermatites, e por isso, o uso deve ser supervisionado (98).
Fitoquimicamente, as espécies do gênero Brosimum dividem-se em dois grupos, caracterizados pela presença predominante de piranocumarinas ou de furanocumarinas. A espécie Brosimum gaudichaudii apresenta os compostos bergapteno e psoraleno (Figura 8), que pertencem ao grupo das furanocumarinas
(82). Esses compostos podem ser encontrados na casca do tronco e nas raízes e são os principais princípios ativos utilizados para o tratamento do vitiligo (91,99).
Figura 8. Estruturas químicas do bergapteno e do psoraleno.
Monteiro et al. (100) analisaram as cascas das raízes de Brosimum gaudichaudii e identificaram três novos derivados dos ácidos cinâmico e diidrocinâmico: ácido (7-metoxi-2,2-dimetil-2H-6-cromenil)-(E)-propanoico, ácido 3-(7-metoxi-2,2-dimetil-2H-6-cromenil) propanoico e ácido propanoico 3-(6-metoxibenzo[b]furan-5-il); cumarinas e piranocumarinas, como o psoraleno, gaudichaudina, xantiletina e luvangetina; a chalcona 2',4','-triidroxi-3',3-diprenilchalcona; os esteroides β-sitosterol e 3-O-β-D-glicopiranosil-β-sitosterol; e o triterpeno β-amirina.
Neves et al. (101) analisaram extratos da casca e do caule de Brosimum gaudichaudii para detecção de bergapteno através da produção de melanina em actinomicetos. Os autores demonstraram que etanol foi o melhor solvente para extração de compostos furocumarínicos e que o extrato da casca teve maior quantidade desses compostos que o do caule. Além disso, o estudo mostrou que houve indução de pigmentação nas cepas de actinomicetos (22).
1.4.1 Toxicicidade
Pozetti et al. (102) analisaram o efeito da administração em ratos de extrato etanólico seco do córtex da raiz de Brosimum gaudichaudii a 50 mg/mL, diluído em solução fisiológica isotônica, para avaliação da atividade hepatotóxica. Os resultados foram comparados com um grupo controle e foi verificado que os animais que receberam o extrato apresentaram lesão hepática.
Varanda et al. (103) analisaram efeitos genotóxicos de extratos metanólicos (0,4 a 1,2 mg/mL) e aquoso das raízes Brosimum gaudichaudii em Salmonella typhimurium e em culturas de células ovarianas de hamster chinês (CHO). Os autores
observaram que o extrato metanólico, que apresentou cerca de 60% de bergapteno e psoraleno em sua composição, exibiu maior efeito mutagênico do que o extrato aquoso. Isso ocorreu provavelmente pela baixa concentração de furanocumarinas no extrato aquoso (3%). De acordo com o estudo, a capacidade genotóxica da espécie sugere que o uso dessa planta para o tratamento de vitiligo deve ser restrito, tendo em vista a segurança do paciente. Assim, a via tópica dermatológica, em que a absorção sistêmica é mínima, surge como a rota preferível para a administração do extrato natural de Brosimum gaudichaudii.
A reação dos psoralenos com o DNA das células começa por um processo de intercalação do composto químico entre as bases do DNA. Na ausência de luz, nenhuma ligação covalente é formada. Porém, a absorção de luz UV (320/400 nm) permite a reação de bergapteno com a base pirimidina (como timina) na fita de DNA, produzindo monoadutos. Além disso, a absorção de luz permite a reação de alguns monoadutos formados com outras bases pirimidinas localizadas em posição adjacente à fita oposta de DNA, formando ligações cruzadas entre as fitas (104).
1.4.2 Ensaios in vivo
A partir de soluções alcoólicas de psoraleno e bergapteno a 0,25% (p/v) e 0,01% (p/v), foram realizadas provas de fotossensibilização dérmica com doze voluntários, sendo 6 homens e 6 mulheres. Todos foram expostos à irradiação com luz fluorescente por 15, 30, 45 e 60 minutos. Após 60 minutos de exposição à irradiação com luz fluorescente, houve observação de hiperpigmentação mais consistente com o psoraleno do que com o bergapteno na maioria dos voluntários (102).
Foi encontrado também na literatura um relato de caso de tratamento de hipocromia pós-uso de laser CO2 fracionado, utilizando Brosimum gaudichaudii por
via oral e tópica, em uma mulher de 21 anos. Segundo o documento, foram prescritas formulações de cápsulas de 400 mg da espécie para serem administradas por via oral, duas vezes ao dia, e uma formulação tópica roll-on a 5% para ser aplicada 1 hora e 30 minutos antes da exposição à luz do dia. O tratamento foi acompanhado durante um ano, e após esse período, a paciente não apresentou mais hipocromia (105).
1.4.3 Produtos registrados contendo Brosimum gaudichaudii
O medicamento Viticromin® da indústria SAUAD Farmacêutica (15) foi
registrado no Ministério da Saúde nas formas farmacêuticas: comprimidos para administração por via oral - 400mg (nº de Registro: 1.0590.0017.001-1); solução tópica - 0,2 g.mL-1, frasco de 60mL (nº de Registro: 1.0590.0017.002-0); e pomada
dermatológica - 0,2 g.g-1 (nº de Registro: 1.0590.0017.003-0). Contudo, em 2009 foi
publicada a Resolução - RE Nº - 2.078, de 4 de janeiro de 2009, na qual consta o cancelamento de Registro do Medicamento (17).
Esse fitoterápico era elaborado a partir de cascas da porção inferior do caule e das raízes de mamacadela (B. gaudichaudii), que são colhidas, dessecadas, descascadas, trituradas e preparadas em formas farmacêuticas para uso interno (comprimidos) e externo (pomada e loção) (106).
Alves et al. (2000) observaram atividade fungicida e atividade parcial contra Staphylococcus aureus do extrato em diclorometano a 5,7% das raízes de Brosimum gaudichaudii. O extrato da espécie foi considerado ativo no teste de avaliação antimicrobiana, inibindo esporos de Cladosporium sphaerospermum e parcialmente ativo no teste de difusão em ágar, inibindo o crescimento de Staphylococcus aureus (107).
Os extratos etanólicos e hexânicos do córtex da raiz apresentaram atividade anti-helmíntica contra desenvolvimento larvar de Strongyloides stercoralis e Ancilostomideos. Em ensaios de culturas puras com extratos benzênicos e hidroalcólicos, não foi comprovada atividade antimicrobiana contra Salmonella typhimurium (102).
1.5 Nanoemulsões
Formulações e sistemas que utilizam nanotecnologia apresentam inúmeras vantagens em relação às formas farmacêuticas convencionais, para a produção de fitoterápicos e fitocosméticos. Nanopartículas poliméricas e nanocápsulas, lipossomas, Nanoemulsões, entre outras, são tecnologias inovadoras capazes de promover o aumento da solubilidade e biodisponibilidade, redução da toxicidade, melhora da atividade farmacológica, aumento da estabilidade, liberação sustentada, proteção contra degradação física e química, entre outras (21,22,108).
Devido ao tamanho reduzido de gotículas, as nanoemulsões são formulações que apresentam excelente estabilidade e que permitem a distribuição de ativos de
forma uniforme na pele (24,25). A incorporação de fármacos ou compostos bioativos em nanoemulsões, requer estudos que comprovem a concentração de componentes do extrato que penetram a pele, além da estabilidade da formulação e ensaios de toxicidade. Esses critérios permitem avaliar o local de ação dos compostos e a segurança no uso da formulação (109).
As emulsões são dispersões macroscópicas opacas formadas pela mistura, normalmente por meio de agitação, de dois líquidos imiscíveis, sendo um de natureza hidrofílica e outro lipofílica, e de agentes emulsionantes que irão conferir estabilidade a esta dispersão. Elas podem ser classificadas de acordo com a característica da fase interna (dispersa ou descontínua) e da fase externa (dispersante ou contínua). Dessa forma, quando a fase interna é hidrofílica e a fase externa é lipofílica, a emulsão é denominada água-em-óleo (A/O). Do contrário, é classificada como óleo-em-água (O/A) (Figura 9). As emulsões podem ainda ser preparadas na forma de sistemas de fases múltiplas, do tipo O/A/O ou A/O/A (110–113).
Embora apresentem características de composição semelhantes às emulsões, as nanomulsões são sistemas coloidais líquidos, transparentes e translúcidos devido ao tamanho de gotículas estarem em escala nanométrica (normalmente entre 20 e 200 nm). Esses sistemas possuem maior estabilidade em relação às emulsões convencionais, quanto à sedimentação e cremeação das fases, são transparentes e podem ter a espalhabilidade bastante aumentada devido à baixa tensão interfacial que existe entre as fases. Todas essas características fazem delas sistemas altamente desejáveis para aplicação tópica (114,115).
Figura 9. Desenhos esquemáticos das estruturas das nanoemulsões óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O)
Vários processos podem ser aplicados para a formação de nanoemulsões. Apesar de serem cineticamente estáveis, esses sistemas nem sempre são termodinamicamente estáveis e por isso, podem necessitar de energia para a sua formação. Os principais processos utilizados são o de alta energia e o de baixa energia de emulsificação, dependendo da natureza e concentração dos componentes da nanoemulsão. O método de alta energia consiste em utilizar homogeneizadores de alta pressão ou ultrassom para promover cisalhamento e redução do tamanho das gotículas. Esse método costuma ser empregado em nível industrial, e requer um investimento mais elevado, além de técnicas mais complexas de preparo. Por outro lado, quando se utiliza o processo de baixa energia para formação de nanoemulsões, tem-se como principais vantagens o custo mais baixo, fácil técnica de execução e ainda o uso de equipamentos mais simples (116).
Para produção em pequena escala, o método de baixa energia apresenta-se mais atrativo. Ele permite a formação de nanoemulsões em temperatura ambiente sem a necessidade de se utilizar solventes orgânicos. Basicamente, consiste na adição da fase aquosa a uma solução anidra composta pela fase oleosa, tensoativos e o fármaco de interesse, sob condições de agitação e temperatura constantes (111).
O processo pode ser sistematizado por meio de construção de um diagrama de fases pseudo-ternário, método que permite identificar a melhor combinação de componentes da formulação bem como suas quantidades, para obtenção de um sistema estável (26,117).
As nanoemulsões apresentam diversas potencialidades como sistemas de liberação e permeação de fármacos, em especial para aqueles que apresentam maior lipossolubilidade. Esses sistemas são descritos em diversos estudos como alternativa para reduzir a toxicicidade, aumentar a liberação de fármacos para a pele, melhorando a biodisponibilidade e também direcionar a ação farmacológica. O uso de nanoemulsões como sistemas carreadores de fármacos tem sido apresentado como vantajoso não apenas para tratamento tópico, como também para administração por via oral, parenteral, intranasal, oftálmica, pulmonar (117–121).
Uma grande preocupação a respeito de nanoemulsões e formulações cosméticas em geral é a estabilidade do produto final, caracterizada por uma baixa coalescência da fase interna, ausência de separação de fases e manutenção das características físicas e organolépticas, como aparência, cor, odor, sensação ao tato, entre outras. Além disso, deve haver uniformidade de tamanho e distribuição entre as gotículas (122,123).
Neste trabalho, as nanoemulsões serão utilizadas para incorporar extratos de Brosimum gaudichaudii, que contém os compostos bioativos bergapteno e psoraleno (102,124). As formulações serão caracterizadas quanto às características físicas e organolépticas, teor, estabilidade e toxicidade in vitro. Além disso, espera-se que as nanoemulsões permitam melhor penetração dos compostos, avaliada por meio de estudos de permeação, a fim de oferecer uma alternativa terapêutica para o tratamento tópico de vitiligo.
2 OBJETIVOS 2.1 Gerais
Desenvolver nanoemulsões contendo furocumarinas presentes na raiz de Brosimum gaudichaudii, de modo a se obter uma alternativa terapêutica mais atrativa, segura e eficaz no tratamento tópico do vitiligo.
.
2.2 Específicos
O objetivo geral do trabalho foi alcançado seguindo-se as seguintes metas: • Obter dois extratos etanólicos de Brosimum gaudichaudii e caracterizá-los em ensaios de prospecção fitoquímica;
• Padronizar e validar de um método analítico seletivo e confiável para análise dos marcadores bergapteno e psoraleno de extrato da espécie Brosimum gaudichaudii;
• Obter nanoemulsões contendo os extratos de Brosimum gaudichaudii e caracterizá-las quanto ao tamanho de gotículas, índice de polidispersão, potencial zeta e pH;
• Avaliar a estabilidade das nanoemulsões em condições ambiente, geladeira e câmara climática durante 90 dias;
• Estudar in vitro a permeação cutânea de ativos dos extratos de Brosimum gaudichaudii a partir das nanoemulsões desenvolvidas;
• Avaliar in vitro a viabilidade, migração e proliferação celular dos extratos em linhagens primárias de melanócitos e queratinócitos;
• Estudar a toxicidade das formulações por avaliação in vitro do potencial irritativo (HET-CAM).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
3.1.1 Reagentes
Os padrões analíticos de bergapteno e o psoraleno utilizados neste trabalho foram obtidos da FLUKA (Sigma-Aldrich); a droga vegetal em pó da raiz de Brosimum gaudichaudii foi obtida de Cactus Comércio de Alimentos Ervanaria e Conveniências LTDA (Goiás, Brasil); solventes como metanol e acetonitrila grau HPLC foram obtidos da J.T. Baker (EUA). Para preparação do tampão fosfato foram utilizados fosfato de sódio nas formas monobásica e dibásica (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil) e cloreto de sódio (Serva, Rio de Janeiro, Brasil) e correções de pH foram realizadas com hidróxido de sódio (Dinâmica Química Contemporânea Ltda. São Paulo, Brasil). Álcool etílico absoluto grau UV/HPLC e dimetilsulfóxido (DMSO) foram obtidos de Dinâmica Química Contemporânea Ltda (São Paulo, Brasil). Oleato de etila foi obtido de Merck (Alemanha). Para preparo das nanoemulsões, foram utilizados os tensoativos Labrasol® e Plurol® oleique gentilmente cedidos pela Gattefossé (França). Tween® 20
P.A. foi comprado de Dinâmica Química Contemporânea Ltda. (São Paulo, Brasil). Filtros pré-limpos, de diâmetro 25 mm e poro 0,45 μm hidrofóbicos foram comprados de Analítica (Brasil). Todas as análises foram realizadas com água tipo Milli-Q (Millipore, França).
Para os testes in vitro com linhagens de células, MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil-2)-2,5-difenil-tetrazólio) foi obtido de Sigma Chemicals (Co., St. Louis, EUA); melanócitos de linhagem imortalizada, obtida no Banco de Células do Rio de Janeiro (2017); linhagens de queratinócitos foram obtidas a partir de pacientes saudáveis de 35-55 anos de idade, com autorização do comitê de ética: UFMG ETIC344/07. Iodeto de propídeo e placa de 96 poços TPP foram obtidos de Sigma-Aldrich. Os meios de cultura: Meio livre de soro de queratinócitos (KSFM), meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e Soro fetal bovino foram obtidos de Thermo Fisher Scientific (Estados Unidos).
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Pele de porco
As orelhas de porco utilizadas para remoção da pele foram cedidas pelo Frigorífico Bonasa (Brasília, Brasil). Os fragmentos de pele foram retirados da cartilagem, limpos e foram cortados em círculos de aproximadamente 1cm2.
Foram utilizadas orelhas de porco obtidas logo após o abate do animal e antes do processo de escalda. A pele inteira foi removida da região externa da orelha com auxílio de um bisturi, separada de sua camada adiposa adjacente com o auxílio de uma tesoura, cortada em círculos de aproximadamente 2 cm de diâmetro (Figura 10) e armazenada a -4ºC por um período máximo de 2 meses antes do uso.
Figura 10. Preparação da pele de orelha de suínos para estudo de permeação: (A) e corte (B) dos pedaços de pele com aproximadamente 2 cm de diâmetro, após a retirada do tecido adiposo.
3.2.2 Coleta de material vegetal
Para realização do trabalho, além do pó da raiz obtido do fornecedor Cactus (GO), foi coletada a raiz de Brosimum gaudichaudii em uma propriedade localizada na Rodovia DF 330, Quinhão 8, área Fazenda Velha, Sobradinho, Brasília-DF. A área pertence ao bioma Cerrado e tem a seguinte localização: 15º 43´ 47.1´´ S, 47º 42´ 14.4´´ O. A coleta foi realizada no dia 30 de abril de 2017 às 10 horas da manhã. Foi depositado um voucher para estudos farmacológicos no herbário da Universidade de Brasília (Brasil), de nº 1, sob o nome de Sá Barreto, L C L.
A planta coletada consistia em um arbusto com cerca de 3m de altura, sem flores ou frutos no dia da coleta. As folhas mediam entre 3 a 10 cm, com nervuras bem visíveis, glabra na superfície superior e pubescente na inferior. Foi observada a presença de látex de coloração branca leitosa exudante da planta ao provocar lesões no caule, na raiz e ao retirar suas folhas. A raiz era profunda, pivotante, com cerca de
