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Agradecimentos
Em especial à minha orientadora, Professora Doutora Cândida Ascensão Teixeira Tomaz, pelo apoio e saber científico que me transmitiu. Pela disponibilidade, incentivo e amizade ao longo deste trabalho.
À Dr.ª Célia Peixinho agradeço a ajuda durante a execução da parte experimental, todas as sugestões e conselhos tão úteis à realização deste trabalho, e principalmente a sua amizade e optimismo manifestado nos momentos de maior desânimo.
Ao Professor Doutor António Mendonça pela amável cedência do liofilizador.
Ao Dr. Paulo Tavares do laboratório de patologia química do hospital Sousa Martins (Guarda), por fornecer a amostra obtida a partir de látex não amoniado, cedido gentilmente pelo Dr. Jonas Lidholm dos laboratórios Phadia (Suécia).
Aos meus amigos e colegas de laboratório que me proporcionaram sempre um bom ambiente de trabalho e que de algum modo me ajudaram durante a realização deste trabalho, em especial à Isabel, Sílvia, Michael e Catarina pela companhia e boa disposição.
Ao João, Pedro, José, Mónica e Samaritana por toda a sua amizade e ajuda durante estes anos.
Aos meus pais, Cidálio e Dulce, por todo o apoio, incentivo e amor que me transmitiram na realização deste trabalho e durante toda a minha vida.
Aos meus familiares e amigos por todo o carinho.
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Resumo
A alergia de proteínas de latex de borracha natural (NRL) é um problema que afecta especialmente pessoas que contactam frequentemente com as luvas de látex. De entre os grupos mais afectados, destacam-se os trabalhadores da área da saúde (TAS) e os doentes com espinha bífida (SBP). As luvas de látex possuem um grande número proteínas e péptidos, mas apenas alguns são alergénios que participam na alergia ao látex. Assim, proteínas com um alto grau de pureza são essenciais para desenvolver métodos de diagnóstico e estratégias de imunoterapia. Apesar das proteínas recombinantes poderem usadas nestas metodologias, nem todos os alergénios recombinantes foram ainda validados relativamente à sua aplicação clínica. Torna-se assim importante o estudo de novos métodos de purificação de alergénios a partir das suas fontes naturais. As características hidrofóbicas dos alergénios Hev b 1 e Hev b 3, alergénios “major” para os SBP, sugerem a possibilidade da sua purificação por cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC). Assim, o objectivo principal deste trabalho aplicar a HIC na separação de estes alergénios a partir de diferentes amostras de NRL.
Inicialmente, neste estudo foram obtidos extractos a partir de látex amoniado através de dois métodos diferentes. Os resultados da electroforese SDS-PAGE mostraram uma grande diversidade de proteínas, com diferentes pesos moleculares, entre os dois processos de extracção, nomeadamente na concentração de Hev b 3. Os extractos de latex não amoniado foram usados sem qualquer tratamento.
A HIC foi realizada usando uma coluna de epoxi-Sepharose com diferentes concentrações de sulfato de amónio no eluente. As fracções recolhidas foram analisadas por SDS-PAGE (12,5%) e por ELISA. Embora os resultados mostrem um fraccionamento de diferentes proteínas do latex amoniado, não foi observada uma separação selectiva do Hev b 1 e Hev b 3. Uma possível explicação, pode ter a ver com a baixa concentração de Hev b 3 na amostra e a complexidade dos métodos de extracção. A HIC da amostra de latex não amoniado mostrou uma separação selectiva de uma proteína com aproximadamente 14 Kilodalton (KDa) que pode corresponder ao Hev b 1, no entanto a identificação inequívoca desta proteína não foi conseguida. Os resultados obtidos, apesar de preliminares, mostram a possibilidade de aplicação da HIC num passo único na purificação de alergénios do látex a partir de látex não amoniado.
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Abstract
Allergy to natural rubber latex (NRL) proteins is a well-recognized health problem, especially among subjects contacting with protective latex gloves, such health care workers (HCW) and spina bifida patients (SBP) which undergoing multiple surgical interventions. A great number of proteins and peptides are present in latex gloves, but only a limited number are relevant allergens that play a role in latex sensitivity. Allergenic proteins with a high level of purity are thus essential to develop diagnostics and immunotherapy strategies. Recombinant proteins have been used for these purposes, but not all of them have been validated concerning the clinical significance. In this way, the development of new purification methods of latex allergens from their natural sources is actually an important challenge. The hydrophobic characteristics of Hev b 1 and Hev b 3, “major” allergens for SBP, suggested the possibility of their purification by hydrophobic interaction chromatography (HIC). Thus, the purpose of the present study was the application of HIC in the separation of those allergens from different NRL samples.
Extracts from ammoniated latex were obtained by two different extraction methods. SDS-PAGE results showed a great diversity of proteins with different molecular weight, and differing between both extraction processes, namely the Hev b 3 contents. Non-ammoniated latex extracts were used without any treatment. HIC was performed using an epoxi-Sepharose column with different ammonium sulphate concentrations in the eluent. The fractions were analysed by SDS-PAGE and by ELISA. Although the results showed a fractionation of different proteins from ammoniated latex, a selective separation of Hev b 1 and Hev b 3 was not obtained. A possible explanation for this was related to the low concentration of Hev b 3 in the samples and to the complexity of extraction methods. The HIC of non ammoniated samples showed a selective separation of a protein with approximately 14 kda, suggesting Hev b 1, however the inequivocal identification of this allergen was not achieved. Despite these preliminary results, HIC seems to be a promising technique to purify latex allergens from non ammoniated latex by one step method.
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Palavras-chave / Keywords
Alergénios de látex / Latex allergens
Cromatografia de interacção hidrofóbica / Hydrophobic Interaction Chromatography
Electroforese SDS-PAGE / SDS-PAGE Electrophoresis
ELISA / ELISA
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Abreviaturas
ACETIL CoA – Acetil Coenzima A;
ELISA – “Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay”; DEAE – Dietilaminoetil;
FPLC – “Fast Protein Liquid Chromatography”; FPP – Pirofosfato de farnasilo;
GGPP – Pirofosfato de geranilo geranilo; GPP – Pirofosfato de geranilo;
HIC – Cromatografia de interacção hidrofóbica; HMG-CoA – β-hidroxi-β-metilglutaril-CoA; IgE – Imunoglobulina E;
IPP-isomerase – Isopentenil Pirofosfato;
IUIS – “International Union of Immunological Societies”; kDa – Kilodalton;
min – minutos; MVA – Mevalonato;
NMWL – Limite nominal máximo de exclusão molecular; NRL – Látex de borracha natural;
PBS – Tampão fosfato salino; pI – Ponto isoeléctrico; PSA – Persulfato de amónio; RPM – Rotações por minuto; SPT – Teste cutâneo por picada;
SDS-PAGE – “Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis”; TAS – Trabalhadores da área da saúde;
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ÍNDICE GERAL
Páginas Agradecimentos ……….. I Resumo ……… II Abstract ………... III Palavras-chave/Keywords ……….. IV Abreviaturas ………... V Índice geral ……….. VI 1. INTRODUÇÃO --- 1 1.1 Aspectos gerais ……….. 2 1.2 Extracção do látex ………..…………... 31.3 Síntese e composição do látex ..……….………… 4
1.4 Proteínas das fracções do látex ……...………. 8
1.5 Características das proteínas alergénicas do látex ...…. 10
1.6 Alergénios recombinantes …... 18
1.7 Diagnóstico da alergia ao látex ……… 19
1.8 Processos de purificação de alergénios ………...……… 22
1.8.1 Purificação dos alergénios hidrofóbicos Hev b 1 e Hev b 3 ... 25
1.9 Cromatografia de interacção hidrofóbica ... 26
2. HIPÓTESE --- 29
3. OBJECTIVO ---
31
4. MATERIAL E MÉTODOS --- 33
4.1 Métodos ... 33
4.1.1 Extracção dos alergénios hidrofóbicos do látex de borracha natural 33 4.1.1.1 Extracção do soro C ... 33
4.1.1.2 Extracção pelo método de Durauer ... 33
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4.1.2 Caracterização dos alergénios do látex de borracha natural .
38
4.1.2.1 Determinação da concentração de proteína ...
38
4.1.2.2 Preparação dos suportes cromatográficos ... 38
4.1.2.3 Cromatografia de interacção hidrofóbica ... 39
4.1.2.4 Electroforese SDS-PAGE ... 39
4.1.2.5 Quantificação dos Alergénios do Látex por ELISA Fitkit® 40
4.2 Material e Equipamento ... 41
4.2.1 – Extracção das proteínas do látex de borracha natural ... 41
4.2.2 – Caracterização dos alergénios do látex de borracha natural 42
4.2.2.1 – Determinação da concentração de proteína ...
42
4.2.2.2 – Cromatografia de interacção hidrofóbica ... 42
4.2.2.3 – Electroforese SDS-PAGE ...
42
4.2.2.4 – Equipamento diverso ………...
43
4.2.2.5 – Reagentes ...
43
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO --- 48
5.1 Análise do Látex amoniado por ultracentrifugação ... 48
5.2 Separação dos alergénios hidrofóbicos Hev b 1 e Hev b 3 a partir de látex amoniado ... 53
5.2.1 Extracção pelo método de Durauer ... 53
5.2.1.1 Cromatografia de Interacção Hidrofóbica ... 54
5.2.1.2 Quantificação do alergénio Hev b 3 por ELISA ... 57
5.2.2 Extracção pelo método de Wititsuwannakul ... 59
5.2.2.1 Cromatografia de Interacção Hidrofóbica ... 63
5.2.2.2 Quantificação do alergénio Hev b 3 por ELISA ... 66
5.3 Separação dos alergénios hidrofóbicos de uma amostra obtida a partir de látex não amoniado ... 67
5.3.1Cromatografia de Interacção Hidrofóbica ………... 67
5.3 Quantificação de alergénios por ELISA ... 71
6 CONCLUSÕES --- 73
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