Universidade Estadual de Campinas
Instituto de Física ‘Gleb Wataghin’
Processamento e Funcionalização de Pontas
Para Aplicações Biológicas de Microscopia de
Força Atômica
Alberto Luís Dario Moreau
Orientadora: Profa Dra. Mônica Alonso Cotta
Banca Examinadora
Prof. Dr. Maurício Urban Kleinke (IFGW/UNICAMP) Prof. Dr. Carlos Frederico Oliveira Graeff (IF/USP-RP)
Dissertação apresentada ao Instituto de Física ‘Gleb Wataghin’ da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos à obtenção do título de Mestre em Física
Novembro de 2005
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO IFGW - UNICAMP
Moreau, Alberto Luís Dario
M813p Processamento e funcionalização de pontas para aplicações biológicas de microscopia de força atômica / Alberto Luís Dario Moreau. -- Campinas, SP : [s.n.], 2005.
Orientador: Mônica Alonso Cotta.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física “Gleb Wataghin”.
1. Microscopia de força atômica. 2. Funcionalização. 3. Sondas com nanotubos de carbono. I. Cotta, Mônica Alonso. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Física “Gleb Wataghin”. III. Título.
"O que não me mata me torna mais forte" Friedrich Nietzsche - Filósofo Alemão (1844-1900)
Agradecimentos
À Professora Mônica pela orientação, apoio, paciência e amizade.
Ao grupo de Microscopia Eletrônica do LNLS Daniel Ugarte, Denise, Paulo César, Jefferson, Sidnei e Daniela pelo ensino, sugestões e pelo ambiente de trabalho agradável com que sempre recebem a todos seus colaboradores.
Ao grupo da Professora Anete Pereira de Souza (CBMEG) pelo trabalho em conjunto À minha mãe e irmãos e à minha namorada Andrea, pela paciência e apoio
Aos colegas do laboratório: Klaus, Roberto, João Hermes, Luiz Nieto, Gabriela e João Guilherme pelas discussões e companheirismo
Ao técnico Antônio (Totó) do LPD pelas inúmeras colaborações À Márcia e à Rosa pelos serviços burocráticos
Ao IFGW pela infraestrutura necessária ao desenvolvimento deste projeto
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro deste trabalho
Resumo
Este trabalho teve como objetivo implementar a técnica de espectroscopia de força no Microscópio de Força Atômica (AFM) existente no LPD/IFGW/UNICAMP e aplicá-la ao estudo de pontas e amostras funcionalizadas com tiol (mercaptoundecanoic acid). Em particular, foi necessária uma caracterização minuciosa da ponta de AFM, utilizando imagens de microscopia eletrônica. Avaliamos a metalização da ponta com Au (necessária para a funcionalização), o raio da extremidade da ponta e as formas de aproximação da mesma em relação à amostra. Um estudo da constante de mola da alavanca onde se localiza a ponta foi realizado para obtermos valores das forças absolutas medidas.
As medidas de força foram realizadas em atmosfera de N2 para evitarmos forças capilares
embora também tenhamos realizado algumas medidas em meio ambiente. Variamos a técnica utilizada para a metalização da ponta (sputtering e deposição térmica), a concentração da solução tiol/etanol e os tempos de funcionalização das pontas e amostras.
As medidas de força de adesão do tiol nos mostraram que a rugosidade da amostra interfere significativamente na área de contato entre ponta e amostra e conseqüentemente na dispersão nas forças. Apesar disso, nossos resultados forneceram valores de força de adesão e energia livre com a mesma ordem de grandeza que a literatura na área.
Em paralelo, foram realizados testes de resistência e durabilidade com pontas de nanotubos de carbono, em colaboração com o Dr. Daniel Ugarte, além de imagens de AFM de amostras de DNA plasmídico, um possível candidato para futuros trabalhos com pontas funcionalizadas.
Abstract
In this work we have implemented the force spectroscopy technique using the Atomic Force Microscopy (AFM) equipment at the LPD/IFGW/UNICAMP; this technique was applied to the study of functionalized tips and samples with thiol (mercaptoundecanoic acid). In particular, a detailed characterization of AFM tips with Electron Microscopy was carried out. We have studied the tip metalization with Au (necessary for functionalization), the tip radius and the several modes of tip-sample approximation. We have also studied models for the cantilever spring constant in order to evaluate the absolute force values.
The force measurements were carried out in N2 atmosphere to prevent capillary forces,
though we also carried out some measurements in laboratory atmosphere. Tip metalization techniques (sputtering and thermal deposition), the thiol/ethanol solution concentration and the functionalization times of tip and samples were varied in this work.
The sample roughness can interfere in the contact area between tip and sample, and, thus on the thiol adhesion force measurements – particularly on force values dispersion. In spite of that, our measurements provided values for the thiol adhesion forces and free energies in the same order of magnitude of the literature in the area.
Parallel to this work, we have carried out resistance and durability tests with carbon nanotubes tips, in collaboration with Prof. Daniel Ugarte, as well as AFM images of plasmid DNA samples, a likely candidate for future work using funcionalized tips.
Índice
Capítulo 1 Introdução ...1
Capítulo 2 Forças de Interação ...4
2.1 – Potenciais interatômicos ... 4
2.2 – Potencial de van der Waals entre corpos macroscópicos ...5
2.3 – Interações por pontes de hidrogênio ...9
2.4 – Forças capilares...9
2.5 – Forças de adesão ...12
2.6 – Modelo DMT e JKR ... 14
Capítulo 3 Técnicas de Microscopia Utilizadas...16
A) Microscópio Eletrônico de Varredura – Field Emission Gun ... 16
B) Técnicas de Microscopia por Varredura com Ponta de Prova (SPM) ...17
3.1) Microscopia por Força Atômica (AFM)...18
3.2) Modo Contato (CM-AFM) ...19
3.3) Modo Não-Contato (NC-AFM)...20
3.4) Espectroscopia de Força Atômica ...21
3.5) Interações entre estruturas moleculares ...23
3.6) Caracterização e calibração da sonda ...25
Capítulo 4 Metodologia para implementação de AFS ...27
4.1) Preparação de pontas e amostras ...27
4.1.1) Introdução...27
4.1.2) Processos e Metalização ... 28
4.1.3) Funcionalização dos chips e amostras...30
4.2) Medidas de força ...31
4.3) Histogramas...32
4.4) Gráficos de evolução das medidas de força ...33
4.6) Determinação das constantes de mola das alavancas ...36
4.7) Pontas de AFM com nanotubos de carbono (CNTs)...39
Capítulo 5 Resultados e Análises ...42
5.1) Análise das Sondas ... 42
5.1.1) Imagens de microscopia eletrônica (FEG-SEM) e estudo da metalização dos chips de AFM ... 42
5.1.2) Pontas quebradas ou com a metalização descascada...46
5.1.3) Pontas padrão...47
5.1.4) – Pontas com nanotubo de carbono ...48
5.2) Análise da superfície da amostra...52
5.3) Normalização dos valores da força de adesão...54
5.4) Distribuição nos histogramas ...54
5.5) Fator de correção ...55
5.6) Propagação de erro ...56
5.7) Análise dos gráficos de Força vs Distância dos lotes A e F...57
5.8) Medidas de força de adesão...59
5.8.1) Pontas e amostras não funcionalizadas...59
5.8.2) Pontas e amostras funcionalizadas...67
5.9) Análise dos resultados...73
Capítulo 6 Conclusões Gerais ...76
Apêndice A Perspectivas Futuras de Aplicações ...78
A.1) Medidas de DNA com AFM ... 78
A.1.1) Aspectos Teóricos... 79
A.1.2) Procedimento Experimental...82
A.1.3) Análise das imagens de AFM das amostras de plasmídeos...83
A.2) Conclusões... 89
Bibliografia ...90
Capítulo 1
Introdução
O progresso nas técnicas de microscopia de varredura por sonda (SPM, do inglês
Scanning Probe Microscopy) tem sido substancial. Entre as técnicas SPM, a microscopia
de força atômica (AFM, do inglês Atomic Force Microscopy) mostrou-se uma técnica poderosa, que permite a caracterização em escala nanométrica de diferentes propriedades – mecânicas, elétricas e magnéticas – da amostra, além de sua topografia. O AFM também se mostrou uma ferramenta poderosa para sondar interações moleculares, pois pode resolver forças na escala de piconewton. Esta resolução pode, em princípio, ser várias ordens de grandeza maior que as forças envolvidas nas ligações químicas mais fracas [1], sugerindo a possibilidade de medida de interações moleculares individuais. Contudo, os grupos químicos específicos na ponta (sonda) que interage com a superfície são indeterminados na maioria dos casos. Além disso, a grande área de contato ponta-superfície, ou deformações na curvatura da ponta resultantes das forças superficiais podem impedir a realização da medida [2].
Para contornar essa limitação do AFM, surgiu o conceito de modificação química das pontas [3-6], para torná-las sensíveis a interações moleculares específicas. Utilizando pontas funcionalizadas quimicamente, medidas AFM podem ser usadas, por exemplo, para sondar forças entre grupos moleculares distintos e mapear a distribuição espacial de grupos funcionais específicos e seus estados de ionização. Esta nova aplicação do AFM tem sido chamada de Microscopia de Força Química (CFM, do inglês Chemical Force Microscopy) [3] ou então de Espectroscopia de Força Atômica (AFS, do inglês Atomic Force
Spectroscopy) [36].
Em AFS, a ponta do AFM é modificada com grupos químicos funcionais específicos [3]. Isto permite que a ponta gere contraste dependente das propriedades químicas da amostra [7], através por exemplo do sinal de fase no modo de tapping. Este sinal será proporcional à adesão entre a ponta e a amostra e pode ser medido simultaneamente com a topografia. Pontas funcionalizadas também tem sido empregadas em espectroscopia de força. Neste modo de operação, a varredura não é realizada; a ponta é
retraída. As forças aplicadas à ponta durante a retração são devidas a uma variedade de interações incluindo a adesão intermolecular entre grupos químicos fundamentais [3,4,6,8,50,51], o desnovelamento de proteínas [9,51], e interações antígeno-anticorpo [10,50], por exemplo. É possível medir a interação de apenas uma única molécula (uma proteína, por exemplo) ligada à ponta através de uma molécula intermediária, que interage com a superfície da amostra [52, 53].
Em geral, as pontas apresentam um grande raio de curvatura, o que dificulta controlar o número de moléculas ativas na ponta e limita significativamente a resolução lateral. Estas limitações podem ser contornadas com o uso de pontas de nanotubos de carbono (CNT) [11]. Estas pontas apresentam raio de curvatura em geral menor que as de silício, e podem ser especificamente modificadas apenas em suas extremidades. Deste modo, a funcionalização das pontas de CNT cria pontas que tem poucos sítios moleculares ativos, e com uma orientação relativamente controlada [54]. Em particular, pontas CNT com parede única (single wall) poderiam levar à resolução subnanométrica em contraste químico, permitindo o reconhecimento de sítios específicos de ligação. Por outro lado, pontas CNT em geral são bem mais delicadas, e podem ser danificadas dentro de meios líquidos, por exemplo.
O meio em que a superfície está interagindo com a ponta também é um fator fundamental para a determinação das forças medidas. Para que a interação da ponta seja determinada somente por energias livre de superfície do sólido, é necessário que as forças de adesão sejam medidas em ultra alto vácuo. As forças medidas em ambiente de laboratório são de difícil interpretação pois temos influências de forças capilares [14,15] que são da mesma ordem de magnitude que uma interação química específica. As forças capilares irão obscurecer as pequenas diferenças esperadas para as forças moleculares entre diferentes grupos funcionais da ponta e da amostra. Medidas realizadas em atmosfera de um gás inerte podem reduzir problemas relativos às forças capilares [16,17], porém ainda assim é necessário cuidado na interpretação dos resultados pois é difícil excluir a possibilidade da presença de líquido nas superfícies.
Os efeitos de capilaridade também podem ser eliminados se os experimentos forem conduzidos em meio líquido ao invés de ar [18,19]. Estudos em soluções aquosas são especialmente importantes pois o AFM está sendo cada vez mais utilizados em sistemas biológicos que necessitam de soluções para garantir a sua integridade [20,21].
Um outro ponto importante na medida de forças com o AFM reside na constante de mola da alavanca onde a ponta está montada. Na literatura, existem grupos que estudam métodos para a determinação da constante de mola da alavanca na qual se encontra a sonda. Estes estudos são importantes pois as medidas de força são diretamente proporcionais à esta constante, logo é necessário conhecer seu valor para se obter os valores absolutos das forças. Diversos métodos são relatados para a calibração experimental da constante de mola da alavanca [22-25], e para a calibração pela geometria e material [26-28].
O objetivo desta dissertação é trabalhar na implementação de técnicas de funcionalização de pontas de AFM, sistematizando os resultados de forma a poder aplicar os resultados em medidas de força entre a ponta e a amostra. Para tanto, estudamos o processamento de pontas visando a aplicação nesta técnica, bem como analisamos o efeito, sobre a ponta, das medidas realizadas. Neste aspecto, trabalhamos tanto com pontas de Si comerciais quanto com as pontas CNT fabricadas em colaboração com o Prof. Dr. Daniel Ugarte, do Laboratório Nacional de Luz Sincrotron (LNLS). Estas pontas foram montadas no LNLS utilizando o nanomanipulador construído pelo Dr. Ugarte. Nosso trabalho consistiu em caracterizar as pontas obtidas, sua resolução espacial e durabilidade [12,13], em função do procedimento adotado para a sua fabricação. Por outro lado, para verificar a possibilidade de medidas de adesão no AFM, trabalhamos com pontas de Si e amostras funcionalizadas com tiol terminados em radical COOH.
Esta dissertação está dividida da seguinte maneira. Conceitos básicos em forças de interação e adesão são apresentados no Capítulo 2, enquanto no Capítulo 3 apresentamos as técnicas utilizadas de microscopia por varredura por sonda e eletrônica. No Capítulo 4, descrevemos a metodologia de preparação de pontas, amostras, calibração de pontas e tratamento de dados.
Os resultados experimentais e análises sobre o estudo das pontas e sobre forças de adesão entre pontas e amostras funcionalizadas com tiol estão no Capítulo 5. Neste capítulo são apresentadas imagens de microscopia eletrônica das pontas além de imagens de AFM e histogramas de força. A discussão dos resultados é feita no decorrer da apresentação dos resultados experimentais, deixando para o Capítulo 6 as conclusões do trabalho e perspectivas futuras. Finalmente, o Apêndice A relata o estudo realizado para a deposição de ácido desoxirribonucléico (deoxyribonucleic acid, DNA) plasmídico em substratos, possibilitando imagens com o AFM, e viabilizando um possível sistema de interesse para
Capítulo 2
Forças de Interação
Neste capítulo, iremos fazer uma breve revisão das principais forças de interação, microscópicas e macroscópicas, que servirão como referência para a interpretação dos dados mostrados na seção experimental desta tese de mestrado. Em particular, trataremos com mais detalhe da interação esfera-plano (ou esfera-esfera), uma vez que este é um modelo que pode ser aplicado ao que ocorre na interação ponta-amostra do AFM. Consideramos também que uma das esferas está ligada a uma mola, simulando a presença da alavanca na qual está montada a ponta do AFM.
2.1 – Potenciais interatômicos
As principais forças envolvidas nas interações interatômicas surgem através de três fatores [29]: 1) interações eletrostáticas entre cargas ou distribuições de cargas, tais como monopolos, dipolos, quadripolos e combinações destas interações; 2) forças de polarização, onde uma distribuição de forças numa molécula cria um momento de dipolo numa molécula adjacente; e 3) forças provenientes de interações covalentes e repulsivas de troca, devido ao princípio de exclusão de Pauli. Verifica-se experimentalmente que estas forças repulsivas crescem abruptamente quando a distância interatômica diminui. Separando os dois átomos, a força repulsiva cai a zero a distâncias da ordem de 3Å, acima da qual a força passa a ser atrativa. A lei de potências é um possível modelo de potencial interatômico, que é dado por:
n r r w ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ = σ ) ( (2.1)
Onde σ é o raio atômico. Um modelo possível para a interação entre átomos é o potencial de Lennard Jones, que combina o potencial atrativo de van der Waals com o repulsivo atômico, resultando em:
⎥ ⎥ ⎦ ⎤ ⎢ ⎢ ⎣ ⎡ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ − ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ = 6 12 0 4 ) ( r r w r w σ σ (2.2)
Na equação acima temos o mínimo da energia em w = -wo, numa distância de
r =1,12σ, e é zero na distância de r = σ. As forças são obtidas derivando a equação
acima, obtendo: ⎥ ⎦ ⎤ ⎢ ⎣ ⎡ − = 0 76 1312 2 24 ) ( r r w r F σ σ (2.3)
2.2 – Potencial de van der Waals entre corpos macroscópicos:
Forças entre corpos macroscópicos são de grande interesse nesta dissertação de mestrado uma vez que estas descrevem as interações existentes entre a ponta de nosso microscópio e a amostra. As geometrias mais comumente encontradas na prática são duas superfícies planas ou duas superfícies esféricas interagindo entre si. Trataremos aqui do caso de uma esfera interagindo com um plano (esfera com raio de curvatura infinito), pois este é um modelo adequado para o sistema ideal ponta-amostra. Para isso calcularemos inicialmente a interação entre uma molécula e uma superfície plana e em seguida, entre uma esfera e uma superfície.
- Interação Molécula-Superfície
Assumimos um potencial puramente atrativo da forma w(r) = -C/rn, (onde C é chamado de coeficiente de London [29]) para um par de átomos, e o princípio da superposição de forças, ou seja, a interação entre uma molécula e a superfície plana de um sólido será a soma das interações de todas as moléculas do sólido com a molécula (figura 2.1a). Para as moléculas de um anel de seção transversal dx.dz e raio x, o volume do anel será de 2πx.dx.dz, e o número de moléculas no anel será de 2πρx.dx.dz, onde ρ é a densidade de moléculas no sólido. A rede de interações entre a molécula numa distância D da superfície será de:
(
)
(
)(
)
∫
∫
==∞ − ∞ = = − − − = + − = x x n n z D z n n D C dx x z x dz C D w 0 2 2 2 2 3 3 2 2 ) ( π ρ π ρ para n > 3 (2.4)experimentalmente, sabe-se que para van der Waals n = 6, logo:
3 6 ) ( D C D w =−π ρ (2.5)
Desta forma temos que o potencial de interação de van der Waals de uma molécula interagindo com um plano decai com o cubo da distância entre eles, e não com a sexta potência como no caso de duas moléculas.
A
B
Figura 2.1: (A)-Molécula interagindo com um plano, integração por anéis. (B)-Esfera interagindo com um plano, integração por discos [14].
- Interação Esfera-Superfície
Podemos generalizar o problema se calcularmos a energia de interação de uma esfera de raio R e uma superfície plana (figura 2.1b). Pela simetria do problema faremos a integração por discos da esfera onde, geometricamente, podemos dizer que o raio x do disco é dado por x2 = (2R - z)z. O volume da seção circular do disco, de área πx2 e
espessura dz, é então escrita como πx2dz = (2R - z)zdz, logo o número de moléculas
contidas no disco é de ρ(2R - z)zdz, onde ρ é a densidade de moléculas na esfera. Desde que todas as moléculas do sistema estejam a uma distância (D + z) da superfície do plano, o potencial de interação, utilizando a equação 2.4, pode ser escrito como:
(
)(
)
∫
(
(
)
)
= = + − − − − − = z R z D z n dz z z R n n C D W 2 0 3 2 2 2 3 2 2 ) ( π ρ (2.6)Para R>>D, e apenas para pequenos valores de z (z ≅ D) contribuindo para a integral, nós obtemos que:
(
)(
) (
∫
)
∞ − − =− − − − − + − − − = 0 5 2 2 3 2 2 ) 5 )( 4 )( 3 )( 2 ( 4 2 3 2 2 ) ( n n D n n n n R C dz z D Rz n n C D W π ρ π ρ (2.7)Novamente, para interações de van der Waals, temos que n = 6. Desta forma o potencial acima fica:
D AR D W 6 ) ( =− (2.8)
onde A é a constante de Hamaker, definida como A = π2Cρ2. Derivando a equação acima em relação à distância D obtemos a equação da força pelo espaço:
2 3 ) ( D AR D F = (2.9)
Para o caso de uma esfera de ouro interagindo com uma superfície de ouro, temos que A ≅ 35.10-20J [30]. Desta forma a equação F(D) pode ser graficada como é mostrado
nas curvas vermelha e preta do gráfico 2.1. Escolhemos R = 50nm e R = 100nm pois os raios das pontas que utilizamos em nossos experimentos encontram-se neste intervalo. Caso consideremos que nossa esfera esteja presa na extremidade de uma mola (correspondente à alavanca do AFM) com constante de mola k entre 3 e 5 N/m (gráfico 2.1), teremos que o ponto de intersecção das duas curvas, a de van der Waals e a elástica (lei de Hooke), corresponde ao momento em que seus valores são os mesmos. Ou seja, para uma pequena diminuição da distância, a força atrativa de van der Waals será maior que a força exercida pela mola na esfera, quando plano e esfera se aproximam. Na situação em que o plano está se afastando em relação à esfera e a distância cresce a partir
do ponto de intersecção entre as curvas, a força exercida pela constante de mola será maior que a exercida pela força atrativa de van der Waals; logo a esfera irá se soltar do plano. A tabela 2.1 ilustra os valores das forças correspondentes aos pontos de intersecção para os valores de k = 3, 4 e 5 N/m.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 vdW (R = 100nm) vdW (R = 50nm) elástica (k = 3 N/m) elástica (k = 4 N/m) elástica (k = 5 N/m) F [nN] D [nm]
Gráfico 2.1: Curvas de força por distância das forças de interação de van der Waals (vermelha e preta) e da força elástica para constantes de mola k = 3 N/m, 4 N/m e 5 N/m. O ponto de intersecção entre as duas curvas mostra a distância a partir da qual a esfera é atraída para o plano ou em que a esfera se solta do plano. A região hachurada indica o intervalo em que provavelmente o nosso sistema estará atuando.
k [N/m] F intersecção R = 50nm [nN] F intersecção R = 100nm [nN] 3 3,75 4,71 4 4,52 5,72 5 5,25 6,65
Tabela 2.1: Valores de força na intersecção das curvas do gráfico 2.1.
Como mencionamos na introdução deste capítulo, esta análise, em que temos a esfera presa na extremidade de uma mola, será útil para o modelamento da técnica de microscopia de força atômica. As constantes de mola que utilizamos no nosso sistema estão no intervalo de 3 e 5 N/m enquanto o raio da extremidade de nossa ponta se encontra entre 50 e 100 nm. Logo é possível afirmar que nosso sistema estará trabalhando dentro da região hachurada da figura 2.1.
2.3) Interações por pontes de hidrogênio:
As pontes de hidrogênio são importantes interações entre moléculas que podem estar presentes no decorrer de nossas medidas de força de adesão. Moléculas polares (como a água, por exemplo) possuem regiões de carga negativa e positiva (átomo de O e H da água, respectivamente) que atraem outras moléculas polares da vizinhança (figura 2.2). Uma molécula de água pode formar até quatro pontes com as moléculas da vizinhança.
Figura 2.2: Moléculas de água interagindo entre si com pontes de hidrogênio (linha pontilhada).
As pontes de hidrogênio podem ter até cerca de 5% da força de uma ligação covalente (~µN), e possuem comprimento de aproximadamente 0,2nm [31,55]. Quando muitas pontes de hidrogênio são formadas com uma mesma molécula, a ligação pode ser suficientemente forte para ser estável.
Neste trabalho, iremos medir a força de adesão entre moléculas que possuem carboxilas (COOH) em sua extremidade, e estas interagem entre si através de pontes de hidrogênio, conforme será descrito na seção 3.5.
2.4) Forças capilares:
O meio experimental exerce um papel fundamental na determinação da força (figura 2.3). Para medirmos unicamente a energia livre da superfície, as forças de adesão devem ser medidas em ultra alto vácuo. As medições de força feitas em meio ambiente (ar) são de mais difícil interpretação devido às forças capilares [31] (vide figura 2.3) que são usualmente de 1 a 2 ordens de magnitude maiores do que uma interação química
específica. Por isso as forças capilares tornam difícil a interpretação das pequenas forças de interação entre os grupos moleculares da ponta e da amostra. Por outro lado, a capilaridade irá enfatizar o grau relativo de “molhabilidade” e pode ser a base de discriminação entre grupos hidrofóbicos e hidrofílicos quando medidos em meio ambiente [14]. O desempenho das medidas em atmosfera de um gás inerte (N2, por
exemplo) pode ser aproximado à sensibilidade química das interações moleculares, porém é necessário cuidado nas interpretações dos resultados obtidos, pois é difícil excluir ou avaliar a presença de vapor adsorvido na superfícies das amostras.
A
B
C
Figura 2.3: Comparação entre forças medidas em ultra alto vácuo, em líquido e em meio ambiente (ar).(A) As condições de interação em ultra alto vácuo são determinadas pelas energias livres de superfície. (B) A magnitude da força de adesão em meio líquido é definida pela energia livre da superfície sólido-líquido. (C) Os experimentos feitos em meio ambiente refletem a molhabilidade da superfície; a interação predominante é resultado das forças capilares [31].
Figura 2.4: Desenho esquemático de esfera próxima de uma superfície plana unidos por menisco de um líquido.
Para um sistema esfera-plano, Israelachvili et al [14] calcularam, através da
equação de Kelvin (equação 2.10) e da pressão de Laplace (equação 2.11), a força de
capilaridade que irá manter a esfera no plano (figura 2.4). A pressão de Laplace [32] descreve a pressão que um filme exerce ao aumentarmos a sua área superficial e, conseqüentemente, modificarmos a sua energia livre de superfície, enquanto a equação de Kelvin trata o mesmo problema quimicamente, utilizando grandezas como a constante dos gases e o volume molar. Foi considerado o caso de um menisco simétrico (r1 = r2 = r)
e que R >> r.
(
s)
L p p RT V r r log 1 1 2 1 γ = ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + (2.10) ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = 2 1 1 1 r r P γL (2.11)onde r1 e r2 são os raios de curvatura dos meniscos, V é o volume molar, γL é a energia
livre de superfície do líquido, e p/pS é a pressão relativa de Laplace (a pressão sem a força
exercida sobre a pressão com a força exercida). A equação para a força atrativa entre a esfera e a superfície devida à presença de capilaridade é:
(
D d)
R F L + = 1 cos 4π γ θ (2.12) θConsiderando uma esfera de R = 50nm em contato com o plano (D = 0), ambos de ouro, um ângulo de contato médio θ = 45°, e γágua = 72,8 mN/m2 obtemos pela
equação 2.12 que a força capilar normalizada pelo raio será de F/R ≅ 0,5 N/m. Esta força
está próxima das forças de adesão como mostraremos no Capítulo 3.
O efeito de capilaridade pode ser eliminado realizando o experimento em meio líquido, em vácuo ou em atmosfera controlada de um gás inerte como o N2 [31]. Estudos
em soluções aquosas são especialmente importantes tendo em vista que o AFM está sendo cada vez mais usado para medições em sistemas biológicos, que dependem fortemente de forças de adesão.
2.5 – Forças de Adesão
Na interação da ponta funcionalizada do AFM com a superfície da amostra também funcionalizada, esperamos que ocorra um trabalho de adesão entre as superfícies dos meios envolvidos. Este trabalho está relacionado à mudança na energia livre do sistema. Esta mudança, no caso de superfícies em vácuo, corresponde ao trabalho (reversível) feito para separar (ou criar) duas unidades de área de dois meios em vácuo (figura 2.5-a,b). No caso de dois meios diferentes, esta energia é chamada de trabalho de
Adesão W12, enquanto que para dois meios idênticos temos o trabalho de Coesão W11.
Desde que haja atração entre estes meios em vácuo, W11 e W12 são sempre positivos.
A Energia de Superfície, γ, está relacionada com a variação na energia livre devido ao aumento de uma unidade na área do meio. O processo de criar uma unidade de área é equivalente a separar duas meias unidades de área previamente em contato (figura 2.5-c,d), por isso nós podemos escrever:
11 1 2 1 W = γ (2.13)
Se este aumento da área ocorre em ambiente gasoso, como por exemplo uma atmosfera controlada no laboratório, algumas moléculas de vapor desta atmosfera podem vir a aderir na nova superfície criada, diminuindo assim o valor real da energia da
superfície em questão. Por exemplo, quando a mica é clivada em alto vácuo temos que
γ ≅ 4500mJ/m2. Quando este processo ocorre na atmosfera do laboratório, porém, γ é
menor que 300 mJ/m2 [14].
No caso de dois líquidos imiscíveis em contato, temos que considerar a energia
interfacial. A mudança da energia livre devida à expansão de uma unidade de área de
interface é conhecida como energia interfacial γ12. As energias associadas com o
processo de expansão podem ser entendidas seguindo dois passos hipotéticos (figura 2.5-e). Inicialmente, unidades de área do meio 1 e 2 são criadas e são então trazidas em contato. A mudança da energia total de contato γ12 é:
12 2 1 12 22 11 12 2 1 2 1 W W W W + − = + − = γ γ γ (2.14)
esta equação é conhecida como Equação de Dupré.
Com esta equação, podemos desenvolver o trabalho de adesão num terceiro meio, caso que melhor descreve nosso sistema experimental (ponta interagindo com a amostra). Utilizando as equações 2.13 e 2.14 é possível encontrar uma relação para a mudança de energia livre ao separarmos dois meios, meio 1 e 2 dentro de um meio 3 (figura 2.5-f), que é dado por:
12 23 13 23 13 33 12 132 =W +W −W −W =γ +γ −γ W (2.15)
Caso o meio 3 seja o vácuo, teremos que W132 Æ W12, γ13 Æ γ1, γ23 Æ γ2, e,
A) Trabalho de Adesão 1 2 1 2 W12 unidade de área B) Trabalho de Coesão 1 W 1 11 1 1 1/2 unidade de área ½ W11 = γ1 = γ2 C) Trabalho de Coesão 1 1 1 1 W11 unidade de área ½ W11 = γ1
D) Energia Interfacial: Sólido-Líquido
1 1 1/2W11 + 1/2W22 1 1 1 1 2 2 2 -W12 γ12 = ½ W121 = ½ W11 + ½ W22 – W12
E) Energia Interfacial: Líquido-Líquido
1 2 1 2 1/2W11 + 1/2W22 -W12 γ12 = ½ W11 + ½ W22 – W12
F) Trabalho de Adesão num terceiro meio
1 2 1 3 3 W132 3 2 W132 = W12 + W33 - W13 – W23
Figura 2.2: Desenhos esquemáticos representando os trabalhos de adesão/coesão e as energias interfaciais.
2.6) Modelo DMT e JKR:
O cálculo de γ através de medidas de força de adesão envolve a normalização das
medidas de força pela área de contato para obtermos o trabalho de adesão (WA). As
dificuldades para medir diretamente a área de contato pelas medidas de AFM são contornadas aplicando modelos teóricos de mecânica de contato. Os modelos desenvolvidos por Derjaguin-Muller-Toporov (modelo DMT) para pontas pequenas e duras interagindo com amostras planas e duras [50] e por Johnson-Kendall-Roberts (modelo JKR) para pontas moles e grandes interagindo com superfícies de alta energia [51], são os mais utilizados para a análise de energia livre de superfície [36, 52]. De acordo com estes dois modelos, a correlação entre a medida de força de adesão F e o trabalho de adesão (WA) é:
A
RW x
F = π (2.16)
onde a constante x é igual a 2 para o modelo DMT e 1,5 para o modelo JKR, e R é o raio de curvatura da extremidade da ponta. O trabalho de adesão (WA = W132) para três meios
diferentes é definido pela equação de Dupré, como foi mostrado na equação 2.15.
Na realidade, nenhuma superfície é perfeita, e a representação da verdadeira área de contato entre a ponta e a superfície por um dos modelos é muito difícil. Irregularidades das superfícies podem aumentar ou diminuir a área de interação entre as superfícies causando dispersão nas medidas.
Na literatura, não existe um consenso sobre qual modelo descreve melhor o nosso sistema ponta-amostra [53]. Maugis [54] propôs um parâmetro no qual determina qual é o modelo mais apropriado. Os dois casos limites, modelo JKR e DMT, e a transição entre eles, podem ser descritos por um parâmetro de transição adimensional chamado parâmetro de Tabor, µ [55], e parâmetro de Maugis, λ [54]. Para o caso de dois materiais iguais em contato, os parâmetros são escritos como:
3 / 1 3 0 2 2 9 64 157 , 1 ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎜ ⎝ ⎛ = = z K Rγ µ λ (2.17)
Onde z0 é a distância de equilíbrio entre átomos, γ é a energia de superfície do
material e K é o módulo reduzido de Young, que é dado por:
(
) (
)
1 2 2 2 1 2 1 1 1 3 4 − ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ − + − = E E K ν ν (2.18)Onde ν1 e ν2 são razões de Poisson e E1 e E2 são os módulos de Young para as
duas esferas em contato. De acordo com Maugis, a teoria DMT é válida quando µ < 0,1 e
a JKR quando µ > 5.
Para o caso de uma esfera de Au interagindo com uma superfície de Au, temos
que γAu = 1,37 J/m2 [52], E = 117 Gpa, ν = 0,42 [52], e z0 = 0,28 nm. Supondo
R = 50nm e 100nm, temos, pela equação 2.17 que o valor do parâmetro de Tabor é 1,3 e 1,6 respectivamente, indicando que para os nossos experimentos podemos utilizar
qualquer um dos modelos. Deste modo, utilizaremos para os nossos cálculos no capítulo 5 a teoria JKR, pois é mais comum de ser encontrada na literatura.
Capítulo 3
Técnicas de microscopia utilizadas
A) Microscópio Eletrônico de Varredura – Field Emission Gun:
O funcionamento de um microscópio eletrônico de varredura (Scanning Electron
Microscopy - SEM) consiste na focalização de um feixe eletrônico sobre a superfície de
uma amostra e a gravação da corrente emitida em função da posição.
O SEM possui três partes principais: uma coluna eletro-óptica que gera e colima o feixe eletrônico (em vácuo), um sistema de ultra alto vácuo incluindo a câmara onde fica a amostra e a parte de detecção do sinal, e o sistema de geração de imagem.
No caso particular de um SEM, o princípio de operação baseia-se fundamentalmente na quantificação dos elétrons secundários e retro-espalhados emitidos por uma amostra como resposta a uma excitação eletrônica incidente. Esta medida de elétrons secundários (ES) e retro-espalhados permitem uma definição qualitativa da morfologia e topografia da amostra.
O feixe de elétrons se origina em um catodo, geralmente um filamento de LaB6 com
uma ponta muito pequena (raio < 1µm) [33], onde é aplicado um campo elétrico da ordem de kV, suficiente para fazer os elétrons tunelarem a barreira de potencial do filamento para o vácuo. Os elétrons emitidos são acelerados a partir do cátodo através de uma grade até um anodo aterrado. Este sistema de eletrodos é chamado de Canhão de Elétrons por
Emissão de Campo (FEG).
Posteriormente, um sistema de lentes magnéticas reduz o diâmetro do feixe de elétrons a aproximadamente 10nm. A redução é realizada usando duas ou mais lentes magnéticas em série, cada uma capaz de reduzir o diâmetro do feixe de elétrons por um fator de 20 a 100 vezes [34]. Uma corrente ajustável, é aplicada a uma bobina de deflexão para mover o feixe de elétrons através da amostra.
Quando os elétrons primários alcançam a amostra, sua interação com os átomos do material dá origem a elétrons secundários. O número de elétrons secundários emitidos varia de acordo com a geometria e outras propriedades da amostra. Os elétrons secundários são
coletados por um detector, produzindo imagem. Os elétrons retro-espalhados e fótons emitidos pela amostra pela ação do feixe de elétrons podem também ser usados para produzir imagens.
O modo ES de operação é o mais importante porque os elétrons são coletados facilmente através da grade coletora polarizada positivamente ao lado da amostra, mesmo no caso de correntes muito pequenas.
B) Técnicas de Microscopia por Varredura com Ponta de Prova (SPM)
A microscopia por varredura consiste em realizar medidas seqüenciais sobre diversos pontos de uma determinada área, com o objetivo final de formar uma imagem de sua morfologia unindo todos os pontos adquiridos. Na microscopia por varredura com ponta de prova, a análise da amostra é realizada com o auxílio da contração ou expansão mecânica de cerâmicas piezo-elétricas que compensam as variações de topografia detectadas pela ponta. Geralmente em forma de tubos, as cerâmicas piezo-elétricas podem efetuar movimentos tridimensionais quando aplicamos potenciais elétricos através de eletrodos conectados no tubo. Dependendo do tamanho deste, as áreas varridas podem chegar até ~150µm de lado e a resolução pode ser sub-atômica. Este sistema de movimentação chamado de scanner pode ser instalado tanto na ponta quanto na amostra. Para a aquisição de propriedades físicas de superfícies ou sub-superfícies são utilizadas pontas com características particulares para cada necessidade envolvida. A ponta ideal para aquisição de topografias possui razão de aspecto (altura/largura) alta, enquanto que para medidas de condutância é interessante que a ponta possua a maior condutividade possível. Entretanto, essas condições não são encontradas na natureza e pontas com razão de aspecto não ideal podem gerar imagens que não correspondem ao perfil real da amostra. Com a convolução resultante, as estruturas medidas pela ponta não ideal podem ter seu tamanho aumentado (no caso de ilhas) ou diminuído (no caso de depressões).
3.1) Microscopia por Força Atômica (AFM)
A microscopia por força atômica consiste em analisar a superfície de uma amostra com uma ponta de prova. A ponta é montada sobre uma alavanca com constante de mola conhecida. Quando a ponta está próxima da superfície da amostra, forças de interação defletem a alavanca. Esta deflexão é medida por um sistema de detecção de posição; o sinal de erro gerado é enviado para o circuito de realimentação do microscópio. A distância ponta-amostra é então ajustada pela mudança na posição de um scanner piezoelétrico, de modo a manter constante a força medida pela alavanca. Estas variações de posição são calibradas com padrões de altura; deste modo, o mapa destas variações nos fornece a topografia da superfície. A gama de amostras que podem ser analisadas com AFM é muito ampla, na qual podemos destacar: amostras isolantes, células biológicas, medidas in situ no modo eletroquímico, etc.
Força repulsiva Força atrativa Potencial da força interatômica Distância (ponta-amostra) Modo não-contato Modo contato Modo contato intermitente 0
Figura 3.1: Comportamento qualitativo da dependência do potencial da força interatômica com a distância entre a ponta de prova e a superfície da amostra. Dependendo do regime de forças escolhido existem três modos de operação: contato, não-contato e contato-intermitente.
A deflexão da alavanca pode ser causada por muitas forças de interação entre a ponta e a superfície da amostra, sendo um problema bastante complicado do ponto de vista teórico. Os modelos mais simples utilizados consideram a força devido ao potencial de Lennard-Jones [29, 35], conforme foi citado na seção 2.1. Na Figura 3.1 temos a
dependência qualitativa do potencial da força interatômica com a distância entre a ponta e a amostra. Dependendo do regime de forças escolhido, existem três modos de operação para a microscopia por força atômica. No modo contato a força entre ponta-amostra é repulsiva, no modo não-contato o regime é de forças atrativas e no modo contato-intermitente ocorre uma inversão no tempo entre forças atrativas e repulsivas. A seguir apresentaremos somente os detalhes dos dois primeiros modos, operando em ar.
3.2) Modo Contato (CM-AFM)
Neste modo de operação, a ponta do AFM exerce um contato físico com a superfície da amostra. A intensidade da força envolvida é suficientemente baixa para que não ocorram deformações permanentes numa amostra não-macia ou na ponta, impedindo a reprodutibilidade e prejudicando a qualidade dos resultados. Em ambientes expostos ao ar existe, freqüentemente, uma fina camada adsorvida (água, por exemplo) [35] sobre a superfície da amostra, que adiciona a força de capilaridade ao problema. A intensidade da força de capilaridade depende da distância entre a ponta e a amostra, mas em geral é da ordem de 10nN. Em ar e com forças repulsivas da ordem de 10nN, a ponta do AFM não penetra na fina camada de água sobre a superfície, mas no intervalo típico de operação do modo contato de 0,1 até 1µN a ponta exerce o contato físico com a superfície da amostra, depois de “perfurar” esta camada de água.
Feedback Imagem Diodo Laser PSPD Scanner PZT Alavanca Ponta Amostra Espelho XYZ
Figura 3.2: Esquema geral da montagem e funcionamento da microscopia por força atômica em modo contato. O feixe de laser incide sobre a alavanca, sua reflexão é detectada por um fotodetector sensível à posição (PSPD), onde é obtida a deflexão da alavanca devido às forças de interação entre ponta-amostra.
A detecção da deflexão da alavanca pode ser feita por vários métodos [29], sendo que os mais utilizados são os sistemas de deflexão ótica. No nosso microscópio de força atômica (modelo Auto Probe CP da Park Scientific Instruments, atualmente Thermo
Microscopes – Veeco), a medida da deflexão da alavanca é realizada conforme mostra a
Figura 3.2. Um feixe laser incide sobre a alavanca, na parte oposta onde está montada a ponta, e atinge um fotodetector sensível à posição (PSPD). Quando a alavanca sofre uma deflexão ocorre a mudança da posição do feixe laser, refletido pela alavanca, no fotodetector. Variações menores que 1Å podem ser obtidas dependendo do fator de amplificação do sistema ótico, que é proporcional à razão do caminho ótico entre a alavanca e o detector e o comprimento da alavanca. O sistema de movimentação tridimensional, scanner na Figura 3.2, permite que a amostra realize varreduras nas direções x e y. Durante estas varreduras, a topografia da amostra é medida adquirindo as variações z (direção vertical) do scanner, produzidas pelo sistema de realimentação para manter a força constante, conforme mostra a figura 3.2. Imagens topográficas de alta resolução são adquiridas mantendo fixa a posição vertical (modo altura constante) do
scanner e medindo somente as deflexões da alavanca, para o caso de superfícies
atomicamente planas.
3.3) Modo Não-Contato (NC-AFM)
O regime de forças repulsivas do modo não-contato, que geralmente é em torno de 0,01nN [29], pode ser visto na Figura 3.1. Em modo não-contato, um oscilador bimorfo faz a alavanca vibrar numa freqüência (fo+) um pouco maior que uma de suas freqüências de
ressonância, fo (tipicamente de 50 até 400kHz – em todos os casos, muito maior que a freqüência de realimentação da topografia, < 5kHz), com uma amplitude de dezenas de nanômetros. A amplitude do sinal medido pelo fotodetector, na freqüência selecionada, é enviada ao sistema de realimentação do microscópio, conforme vemos na Figura 3.3. Na presença do gradiente de força na região próxima à superfície da amostra, a nova freqüência de ressonância f′o é menor que fo [29] e, portanto, ocorre diminuição na
amplitude de vibração da alavanca. O sistema de realimentação trabalha mantendo fixa uma certa diminuição nessa amplitude e com isso a distância (média) entre ponta-amostra é
mantida constante. A camada adsorvida de água sobre as amostras analisadas em ar [35], não é “perfurada” nesse modo de operação do AFM, pois a força envolvida é muito menor que a necessária para tal. Caso a espessura desta camada não seja homogênea sobre toda a área varrida, a imagem topográfica não irá corresponder à superfície real da amostra. Contudo, por apresentar pequenas forças de interação (<< nN), que diminuem a pressão na superfície analisada, este modo é bastante utilizado em amostras com superfície muito macias, viabilizando sua utilização no ramo da biologia.
Feedback Imagem Diodo Laser PSPD Scanner PZT Alavanca Ponta Amostra Espelho XYZ Oscilador f0(Bimorph) +
Figura 3.3: Esquema geral da montagem e funcionamento da microscopia por força atômica em modo não contato. Variações na amplitude da oscilação da alavanca permitem que sejam adquiridas imagens topográficas com forças repulsivas da ordem de 0,01 nN [29].
3.4) Espectroscopia de Força Atômica
O microscópio de força atômica é uma poderosa ferramenta para medição de forças intermoleculares pois tem resolução de força da ordem de piconewton e resolução espacial da ordem de nanometros. A resolução de força do AFM é várias ordens de grandeza maior que a mais fraca ligação química. Isto sugere que é possível medir interações moleculares individuais. A funcionalização da ponta do AFM com, por exemplo, monocamadas orgânicas (ligações covalentes) que tem terminações em grupos funcionais bem definidos, permite a identificação de grupos moleculares. Esta aplicação do AFM é chamada na
literatura de Espectroscopia de Força Atômica (AFS – Atomic Force Spectroscopy) ou também de Microscopia de Força Química (CFM – Chemical Force Microscopy) [31, 36].
Mesmo sendo possível medir interações químicas individuais, devido ao raio de curvatura da ponta, um grupo químico específico da ponta interagindo com a superfície da amostra não terá interações moleculares completamente definidas ocasionando a dispersão dos resultados. Por isso é necessária uma grande quantidade de medidas para obter uma boa estatística da força de interação.
Utilizando pontas quimicamente funcionalizadas, o microscópio de força atômica pode ser utilizado para medir forças de diferentes grupos moleculares.
Diodo Laser PSPD Scanner PZT Espelho XYZ CH3CH3CH3CH 3 CH3 CH3 Ponta O COH OCOH OCOH OCOH OCOH Amostra Deslocamento da alavanca
Figura 3.4: Desenho esquemático do funcionamento de um AFS. A amostra é fixada em um scanner piezo -elétrico que se desloca em z. Um feixe laser reflete na alavanca e depois chega a um fotodetector no qual será detectado o movimento em z da alavanca. Quando a amostra se aproxima e encosta na ponta, haverá uma deflexão da alavanca que irá movimentar o laser e ser detectado pelo fotodetector. No destaque temos a interação entre uma ponta e uma amostra funcionalizados com tiol com terminação em CH3 e COOH
respectivamente.
Em princípio o AFM pode medir tanto interações moleculares fracas, como a força de van der Waals (~ > pN), quanto ligações covalentes fortes (~ 0,1µN) [31]. Na prática temos que a resolução da força é limitada pelos ruídos eletrônicos do sistema ótico do microscópio e pela excitação térmica da vibração da alavanca.
A magnitude das interações intermoleculares pode ser obtida diretamente por medição de adesão (Figura 3.4). A interação adesiva entre diferentes grupos funcionais é determinada pela curva de força versus distância da ponta da amostra. Durante a medição, a deflexão da alavanca é monitorada durante o ciclo de aproximação e afastamento da amostra em relação à ponta. Conhecendo a constante de mola da alavanca, é possível calcular esta força. O salto no valor da força causado quando a alavanca é liberada da
amostra, corresponde à força de adesão entre os grupos funcionais da ponta e os da superfície da amostra.
Repulsiva
Atrativa
Figura 3.5: Curva da força pela distância da amostra. Em grandes distâncias, não são observadas forças entre a alavanca e a amostra. A uma pequena distância, a ponta é atraída abruptamente para a amostra devido à forças de van der Waals; subseqüentemente a alavanca acompanha o movimento linear da amostra. Existe uma pequena histerese na ida e na volta da alavanca quando ela está no regime linear. É necessária uma força finita para soltar a ponta da amostra; esta força corresponde à força de adesão dos grupos funcionais da ponta e da amostra. O gráfico mostra medidas realizadas neste trabalho de mestrado.
3.5) Interações entre estruturas moleculares:
• Modificação da ponta e amostra com grupos funcionais:
Para medirmos interações entre grupos funcionais, a ponta tem que ser funcionalizada com grupos moleculares bem definidos. Um método bem caracterizado na literatura envolve monocamadas auto-organizadas (SAMs - self-assembly of monolayers) de tióis orgânicos em superfícies de Au. Esta superfície de Au pode ser obtida de diferentes maneiras; um exemplo é o de pontas de AFM de Si metalizadas com Cr (ou Pt) e Au (vide figura 3.6). Analogamente este processo de funcionalização pode ser feito com as amostras, depositando uma camada de Cr (ou Pt) seguida de Au em um substrato semicondutor. A função do Cr (ou Pt) é a de proporcionar boa adesão do filme de Au ao semicondutor.
Figura 3.6: Esquema de uma funcionalização química de ponta e amostra. A ponta e o substrato são inicialmente cobertos por uma camada de Cr ou Pt (~20nm) e, posteriormente, por uma camada de Au (~20nm). Feito isso, imergimos a ponta e o substrato em uma solução de tiol orgânico e uma monocamada densa de moléculas irá se formar em cima da superfície do Au. Em destaque temos a interação por ponte de hidrogênio dos radicais idênticos de COOH.
• Adesão entre diferentes grupos funcionais:
Forças adesivas entre pontas e substratos funcionalizados com SAMs terminados em grupos CF3, CH3, OCH3, CH2Br, OH, COOH, COCH3, CONH2, e NH2 foram medidas em
atmosferas de gás inerte seco e analisadas pelo grupo de Lieber et al [31]. Alguns resultados são mostrados na tabela 3.1. Nota-se que as forças adesivas entre ponta e amostra funcionalizadas com grupos funcionais hidrofóbicos são muito pequenas ou indetectáveis na resolução de nosso experimento. Em particular, as forças são pequenas (~0,1 nN [31]) quando uma das terminações das superfícies funcionalizadas tem terminação em grupos hidrofóbicos e outra em grupos polares. Em contraste, uma força adesiva mais significativa é observada quando a ponta e a superfície funcionalizada terminam em grupos de ligação de hidrogênio (tabela 3.1). As magnitudes relativas das forças adesivas mostradas na Tabela 3.1 confirmam a relação para a força de ligação esperada que é COOH/NH2 > COOH/COOH > NH2/NH2. Convém mencionar que uma atmosfera de gás
seco não evita completamente que as superfícies funcionalizadas apresentem um filme de água adsorvida; estudos feitos em atmosfera de ultra alto vácuo podem esclarecer melhor esta relação entre interações moleculares.
Grupo Funcional (Ponta-Superfície) Monolayer Comprimento da Cadeia Meio Adesão (N/m) Raio da Ponta (nm)
NH2-COOH Tiol SAM, C11 N2 Seco 4,3 ± 0,4 100-200
COOH-COOH Tiol SAM, C11 N2 Seco 1,4 ± 0,3 100-200
NH2-NH2 Tiol SAM, C11 N2 Seco 0,7 ± 0,2 100-200
CH3-CH3 Tiol SAM, C11 N2 Seco 0,4 ± 0,2 100-200
3.6) Caracterização e calibração da sonda:
Para obtermos o valor absoluto da força é necessário o conhecimento da constante de mola da alavanca e da geometria da ponta. Existem vários métodos experimentais de calibração da constante de mola da alavanca, kz [22]. Em nosso caso em particular, o Cr e o
Au que cobrem a alavanca (necessários para a preparação das SAMs) mudam a sua constante de mola sendo assim necessária a recalibração dos parâmetros de controle do AFM para obter o valor correto da força.
• Determinação da constante de mola das alavancas
O chip que utilizamos neste trabalho apresenta alavanca em formato de V. Esta alavanca pode ser aproximada por duas alavancas retangulares [22]; isto faz com que a dinâmica que descreve o sistema massa-alavanca fique bastante simplificada.
A constante de mola de uma alavanca com seção transversal retangular é dada por:
3 3 4l w Et k = (3.1)
onde E é o módulo elástico do material, t é a espessura, w é a largura, e l o comprimento. Será considerado w = 2w’, onde w’ é a base real da alavanca retangular, dentro da aproximação considerada [4]. Podemos aproximar esta alavanca para um sistema massa-mola com constante de massa-mola k e massa efetiva m* = Me.mb ≅ 0,2427mb [25], onde mb = (ρSitSi + ρAu tAu + ρPt tPt)wl é a massa da barra. Me é a massa de normalização efetiva, que
permitirá tratarmos o nosso sistema como um sistema massa-mola. Este fator depende apenas das dimensões da base e do comprimento da alavanca, de forma que Me será o
mesmo para uma alavanca com e sem metalização pois está irá influenciar apenas na massa adicionada, na espessura e no stress da alavanca, parâmetros dos quais Me não apresenta
dependência.
Podemos estimar a constante de mola utilizando a freqüência de ressonância de nossas alavancas para um sistema massa-mola:
* 2 1 2 m k π π ω ν = = (3.2)
Cleveland et al. [22] desenvolveu um método que, através da adição de massas na
alavanca (utilizando microesferas de tungstênio), permite determinar não somente a constante de mola como também a massa efetiva das alavancas. Isto é feito observando a mudança da freqüência de ressonância das alavancas.
Com uma massa M adicionada na alavanca, a equação 3.2 é escrita como:
* 2 1 2 M m k + = = π π ω ν (3.3)
Caso tenhamos M = 0, ou seja, a freqüência de ressonância da alavanca sem carga, a
equação acima pode ser escrita em termos das propriedades fundamentais do material através da equação 3.2:
(
)
(
Si Si Au Au Pt Pt)
T Pt Pt Au Au Si Si T t t t E t l t t t E t l ρ ρ ρ π ρ ρ ρ π ν + + ≈ + + ≈ 2 3 2 3 0 2 1 2427 , 0 4 1 (3.4) onde tT = tSi + tAu + tPt..A equação 3.3 pode ser reescrita como:
* ) 2 ( 2 m k M = − πν (3.5)
A equação 3.5 mostra que, se várias massas conhecidas forem adicionadas no final das alavancas e suas freqüências de ressonância forem medidas, podemos fazer uma curva das massas adicionadas por (2πν)-2, obtendo uma reta [22]. O coeficiente angular deste ajuste nos dará a constante de mola enquanto o coeficiente linear nos dará a massa efetiva. Embora não tenhamos realizado medições deste tipo, utilizaremos as equações desenvolvidas acima para a determinação das constantes de mola das alavancas, como mostrado no capítulo 4.
Capítulo 4
Metodologia para implementação de AFS:
Neste capítulo, apresentamos a metodologia desenvolvida neste trabalho de mestrado para a implementação da técnica de AFS. O sistema modelo escolhido como teste foi o de pontas/amostras funcionalizadas com tióis. Para obter esta funcionalização, etapas intermediárias de metalização de pontas e substratos semicondutores foram realizadas. Apesar de processos de metalização em semicondutores serem atividade de rotina no LPD/IFGW, notamos a necessidade de um estudo mais aprofundado no caso da metalização das pontas. Por este motivo descrevemos aqui os vários tipos de processamento de pontas e amostras empregados ao longo do trabalho.
4.1) Preparação de pontas e amostras:
4.1.1) Introdução
Para medidas de adesão, devemos usar alavancas com constantes de mola baixas, de modo a não restringir o intervalo de forças a ser medido. Nossa primeira opção neste sentido foi trabalhar com pontas de Si3N4, pois são as que apresentam menor constante de
mola, não só dentro das disponíveis no laboratório, como também em catálogos comerciais. Como, porém, a metalização era uma etapa necessária do nosso trabalho, não obtivemos êxito na utilização destas pontas. Isto se deve ao stress dos filmes de Cr e Pt utilizados associados à baixa constante de mola da alavanca, < 0,1N/m - as alavancas se envergaram muito inutilizando as pontas para a medição. Por isso escolhemos alavancas de silício (chips UL06) para realizar as metalizações visto que estes possuem constantes de mola maior e por isso sofrem menos a influência do stress.
Desenvolvemos inicialmente pontas metalizadas por evaporação térmica para medidas em meio ambiente e atmosfera de N2. Utilizamos diversos tempos e
ser extraídas destes lotes de pontas/amostras, as medidas de força de adesão não se comportaram como o previsto devido à não uniformidade e reprodutibilidade dos filmes de Au. Optamos então por usar a metalização por sputtering das pontas, que fornece filmes mais uniformes e reprodutíveis. Além disso, o filme de Pt utilizado apresenta um menor grau de stress que o de Cr no caso anterior. Com relação à funcionalização, notamos que tempos menores que 15h e concentrações menores que 0,5mM não eram eficientes para a formação de SAMs, ou para medidas de forças que evidenciassem processos de adesão. Vimos também que uma aproximação mais cuidadosa da sonda era necessária para garantir a sua integridade. Este estudo mais detalhado da metalização, funcionalização e aproximação da sonda será apresentado no capítulo 5.
4.1.2) Processos de metalização
A seguir, iremos apresentar resultados de 4 lotes, A1 e A2, metalizados por evaporação térmica e os lotes F1 e F2, metalizados por sputtering. Utilizamos chips de Si
UL06 da Thermomicroscopes.
• Lotes A1 e A2
Estes foram os dois primeiros lotes que foram medidos e serviram para os testes nos processos de metalização, funcionalização e aproximação ponta-amostra. Foram utilizadas as alavancas A e B dos chips UL06.
Utilizamos uma evaporadora térmica convencional, ligada à uma difusora e uma bomba primária. Fizemos vácuo de 10-6 Torr e passamos uma corrente entre 2 e 3A para a evaporação dos metais. Não foi feita uma prévia limpeza das pontas, apenas para as amostras, as quais passaram por banhos de acetona, metanol e álcool respectivamente.
No primeiro lote (A1) depositamos por evaporação térmica uma camada de 20nm de Cr e outra de 20nm de Au na face do chip onde se encontram as pontas (vide figura 4.1). Tivemos a preocupação de não fazer um filme muito espesso, pois isto iria aumentar o diâmetro da ponta, o que diminuiria a sua resolução espacial. Esta técnica de metalização já havia sido utilizada em nosso grupo, apresentando bons resultados para
medidas de condutância elétrica, apesar da grande granulação do filme de Au [37]. Devido ao stress do filme metálico as alavancas envergaram levemente para o lado em que o filme foi depositado, o que dificultou as medidas com estas pontas. A presença do filme de Cr não pode ser evitada, uma vez que o Au não apresenta boa adesão ao Si, e o Cr melhora significativamente este aspecto.
Chip Alavancas Alavancas Ponta C Ponta D Ponta A Ponta B
Figura 4.1: Chip de Si do AFM, onde as alavancas tem diferentes dimensões, porém 0.6 µm de espessura (Ultralevers 06 Veeco). As constantes de mola nominais das alavancas – fornecidas pelo fabricante - são: A = 0,26N/m; B = 0,40N/m; C = 1,6N/m e D = 2,1N/m.
No segundo lote (A2) depositamos também uma camada de 20nm de Cr na face do chip oposta à ponta. Esta segunda camada de Cr serviu para compensar o envergamento causado pelo stress da camada depositada na face da ponta.
Nas amostras dos lotes A1 e A2, foram utilizados como amostra substratos de InP metalizados com filmes de 20nm de Cr e 100nm de Au por evaporação térmica. Neste caso utilizamos uma maior espessura de Au para garantir o recobrimento da superfície.
• Lotes F1 e F2
As pontas do lote F1 (onze chips) são chips UL06 (alavancas C e D) que foram metalizadas com um filme de Pt de 20nm e um filme de Au de 40nm por sputtering, em colaboração com Carlos Sales Lambert (IFGW-Unicamp). O vácuo inicial do sistema era de 10-6Torr, e a pressão de Argônio de 2.10-2Torr. Num potencial de 2kV, depositamos Pt durante 2min e Au durante 4 min. Novamente, para esta técnica realizamos limpeza com solventes apenas para as amostras.
com um filme de Au de 20nm (2min). A estas cinco novas pontas chamamos de lote F2. Pela técnica de sputtering, não observamos envergamento significativo da alavanca devido ao stress do filme. Apenas para estes lotes de chips F1 e F2 foi feito um estudo detalhado da integridade dos filmes e pontas após as medidas de AFS através do microscópio eletrônica FEG, como será descrito no próximo capítulo.
Nas amostras dos lotes F1 e F2, foram utilizados substratos de Si que foram metalizados com filmes de 20nm de Cr e 100nm de Au por evaporação térmica.
4.1.3) Funcionalização dos chips e amostras:
Utilizamos para a funcionalização, tanto do chip quanto da amostra o tiol
mercaptoundecanoic acid (SH(CH2)10COOH), que apresenta um radical com dez CH2 e
uma extremidade terminando em COOH. Este material nos foi fornecido pela Doutora Daniela Zanchet (LNLS). Um modelo de recipiente que pudesse ser selado foi desenvolvido especificamente para a funcionalização, de modo que se pudesse manter a concentração da solução de tiol, uma vez que o etanol é muito volátil. Além disso, o recipiente serviu para que ponta e amostra, após a funcionalização, fossem expostos somente à atmosferas controladas, evitando assim contaminação com a atmosfera do laboratório. A Fig. 4.2 mostra o esquema e a foto do recipiente, executado em teflon.
A B
Figura 4.2: (A)-Desenho em corte do recipiente selado feito com programa AutoCad. (B)-Foto de um dos recipientes executados.
Para a funcionalização das pontas e amostras, variamos a concentração do tiol diluído em etanol (pureza 99,9%), de 0,5 a 1,5 mM. Os tempos de funcionalização foram variados de 5s até 5,5h para o lote A enquanto para o lote F o tempo mínimo foi de 15h.
O recipiente selado permitiu deixar as amostras e chips com as pontas metalizadas em contato com a solução durante o tempo necessário sem que houvesse variação significativa da concentração da solução de tiol devido à grande volatilidade do etanol.
4.2) Medidas de força:
Para as medidas de força de adesão, utilizamos o AutoProbe CP da
ThermoMicroscopes na configuração de hardware para topografias em modo não contato
(NCM), com um scanner piezo elétrico com amplitude de 5 µm em x e y, e 1,2 µm em z. Uma caixa de acrílico que envolve a cabeça do AFM permitiu criar uma atmosfera de N2 (AirLiquide, 99%) para o controle da umidade. Através de um higrômetro,
verificamos que a umidade relativa da atmosfera de N2 era menor do que 10%RH, o que
minimizou a presença de forças capilares. Convém mencionar aqui que, como observado na literatura [4,51,52], as medidas de adesão são mais freqüentemente realizadas em meio líquido. Com o AutoProbe porém, não conseguimos realizar imagens em meio líquido (com a alavanca imersa no líquido), por causa da configuração da medida ótica da deflexão da alavanca.
O controle dos parâmetros de movimento para a aproximação ponta-amostra no AFM mostrou-se um aspecto importante para a realização das medidas de força com maior confiabilidade, como é mostrado na seção 5.1.1. Nos testes realizados, foram usados passos do motor de 0.4 e 0.1µm.
Na figura 4.3 temos uma curva típica de força (F) versus distância (H) entre ponta e amostra onde a seta azul mede a força no momento em que a ponta se solta da superfície da amostra e vai para o seu estado estacionário.
0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 F [nN ] H [normalizado]
Força vs Distância - Chip A3 (COOH) com Amostra 7 (COOH)
∆F = 2.65 nN
Figura 4.3: Curva típica de força versus distância entre ponta e amostra. A distância está normalizada e varia de –1 a 1, representando neste caso um deslocamento total do scanner de – 0,6µm a 0,6µm. A seta azul indica o momento em que a ponta se solta da superfície da amostra e vai para o seu estado estacionário.
As medidas foram realizadas usando o software ProScan 1.5 do AutoProbe CP, auxiliado pelo ClickAcquisition, escrito em Delphi pelo aluno de doutorado de nosso grupo, Klaus O.Vicaro, para automatizar a tomada de dados.
Usando o programa Mathematica, escrevemos uma rotina que identifica automaticamente a variação de força nos gráficos adquiridos, deixando os valores disponíveis numa tabela que pode ser exportada para o programa Origin. Este, por sua vez, foi usado para graficar os histogramas e as curvas de força pelo número da aquisição.
Medimos cerca de 12 regiões por amostra, dentro da área de 25µm2
em que o
scanner conseguia se deslocar, e cada região foi medida de 10 a 50 vezes.
Ao realizarmos uma imagem de AFM, existe o risco da ponta ser danificada devido ao contato mecânico desta com a superfície da amostra. Por isso, não foram feitas imagens da superfície com as pontas funcionalizadas, a fim de se preservar a ponta e o seu filme metálico.
4.3) Histogramas:
Para o estudo da força de adesão, analisamos o histograma de força de todas as medidas e ajustamos uma ou mais gaussianas para identificar os valores de força mais prováveis, conforme mostrado no capítulo 5. Apesar das medidas de força de interação serem consideradas no caso do afastamento entre ponta a amostra, analisamos os dois
casos, de aproximação e afastamento no sentido de comparar e validar os resultados obtidos.
Em geral, na aproximação, as medidas exibem interações de van der Waals, enquanto no afastamento também puderam ser observadas forças de adesão devidas aos grupos de COOH e forças capilares devidas à umidade no ambiente. Para as forças encontradas, foram aplicados os fatores de correção e normalização que serão descritos com detalhe no capítulo 5.
4.4) Gráficos de evolução das medidas de força:
Para verificarmos a origem da dispersão dos resultados, mostramos a evolução das medidas através de gráficos da força em função do número de aquisição. Assim conseguimos analisar o histórico de medidas da ponta em diferentes regiões da amostra.
Nestes gráficos, tanto para a aproximação quanto no afastamento da ponta, foram observados diversos “platôs” de valores de força representando as diferentes regiões medidas, como mostrado nos círculos pretos da figura 4.4. Cada platô é formado por pontos de uma região específica da amostra, que mudam na medida que mudamos esta região. Estes platôs podem estar presentes tanto no afastamento quanto na aproximação da ponta, e não necessariamente possuem a mesma força, como sugere a linha tracejada da figura 4.4. Com isso podemos visualizar de melhor forma a não uniformidade das medidas de força na superfície da amostra – como ilustrada na figura 4.4. Os trechos no gráfico em que não há pontos, figura 4.4 círculos verdes, são devido à existência de um nível de ruído que não permitiu a aquisição dos dados nestes pontos.
