INSTITUTO DE BIOLOGIA
CAROLINE FERNANDA SANCHES DAL POZZO
EFEITO DE UMA MATRICRIPTINA DERIVADA DO COLÁGENO I NA
TROMBOSE E REMODELAMENTO VASCULAR NA AORTA DE
CAMUNDONGOS
EFFECT OF A COLLAGEN I DERIVED MATRICRYPTIN IN THROMBOSIS
AND VASCULAR REMODELING ON MICE AORTA
CAMPINAS
2018
EFEITO DE UMA MATRICRIPTINA DERIVADA DO COLÁGENO I NA
TROMBOSE E REMODELAMENTO VASCULAR NA AORTA DE
CAMUNDONGOS
EFFECT OF A COLLAGEN I DERIVED MATRICRYPTIN IN THROMBOSIS
AND VASCULAR REMODELING ON MICE AORTA
Dissertação
apresentada
ao
Instituto
de
Biologia
da
Universidade
Estadual
de
Campinas
como
parte
dos
requisitos
exigidos
para
a
obtenção do Título de Mestra em
Biologia Celular e Estrutural, na
Área de Biologia Celular.
Dissertation presented to the
Biology Institute of the University of
Campinas
as
part
of
the
requirements to obtain the degree
of Master of Science in Cellular
and Structural Biology, in the area
of cellular biology.
ORIENTADORA: PROFA. DRA. CRISTINA PONTES VICENTE
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA CAROLINE FERNANDA
SANCHES DAL POZZO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. CRISTINA
PONTES VICENTE.
CAMPINAS
2018
Profa. Dra. Cristina Pontes Vicente
Prof. Dr. Edson Rosa Pimentel
Prof. Dr. Edson Antunes
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico aos meus pais,
por todo amor, carinho e
suporte!
Eu procuro por tudo o que é meu e que em mim se esconde. Eu procuro por um saber que ainda não sei,
mas que de alguma forma já sabe de mim. Eu sou assim.
Processo constante de vir a ser. O que sou e ainda serei
são verbos que se conjugam
sob áurea de um mistério fascinante. Eu me recebo de Deus e
A Ele me devolvo. ” (Pe. Fábio de Melo)
“Quem lhe deu a verdade absoluta? Não há nada absoluto. Tudo se transforma, tudo se move, tudo revoluciona, tudo voa e vai..." (Frida Kahlo)
Agradeço...
Primeiramente a Deus, por ter me dado o dom da vida, do amor, da sabedoria e da paz, por todas as conquistas alcançadas e por estar sempre ao meu lado me iluminando e me guiando em busca dos meus sonhos.
A minha mãe, Patrícia, e ao meu pai, Roberto. Obrigada por vocês sempre acreditarem em mim e por estarem sempre ao meu lado! Eu sei que não foi fácil ser pais jovens, mas vocês nunca deixaram faltar amor e carinho em nosso lar. Obrigada por todo o suporte, pelos abraços, pelos conselhos e por me ensinarem a ser uma pessoa digna e humilde. Vocês são meus maiores exemplos de vida!
A minha irmã Giovana, meu presente de Natal. Obrigada por me acalmar e me fazer persistir nos momentos difíceis em que eu tive vontade de desistir, pelas risadas e músicas compartilhadas, pelos abraços que deixam mamãe abobada, por ser minha confidente e minha melhor amiga.
Ao meu cachorro Scooby-Doo, meu anjinho da guarda na Terra, pelo seu amor genuíno e pelo carinho infinito. Obrigada por estar comigo há 17 anos, nos momentos mais importantes de minha vida!
Aos meus avós Nando, Xuxa, Neusa e Tere, e meus bisavós, vô Zico e vó Zica, por todo carinho e pela infinidade de conhecimentos que vocês me transmitiram. Obrigada por me ensinarem com muito amor, a batalhar pelos meus sonhos e a lidar com as dificuldades que encontramos ao longo vida.
Aos meus tios e primos por todo amor, carinho e suporte!
A minha Tia Ké, pelas orações, pelos abraços e sorrisos, pelas jantinhas (que queimamos na maioria das vezes, porque ficamos conversando), pelos conselhos, pelos Body Talk e Reiki e por toda luz que você transmite em minha vida.
Ao meu namorado, João Victor, meu companheiro, meu presente de Deus, meu melhor time! Você entrou em minha vida para encher ela de luz e alegria com esse seu sorriso e esse seu jeito tão carinhoso e sincero de ser. Obrigada por todo carinho, amor, comida compartilhada, conversas, caminhadas no calçadão, séries na Netflix, palhaçadas, abraços e conselhos. Obrigada por estar do meu lado nos perrengues da vida, e por me ajudar a ser o melhor que eu posso ser sempre! Saiba que mesmo você morando longe de mim, você está presente em todos os momentos de minha vida. Com você eu sou muito mais (#teamJoCa). Te amo!
A família do João e a minha cunhada Fernanda, por todo apoio, pelas risadas e pelas aulas de funk.
por todo carinho!
As minhas amigas Sthela, Nayara, e minha prima Isa, que estão ao meu lado desde minha infância, pelas risadas, pelas conversas infinitas, pelos desabafos e choros, pelas comilanças, pelos “presentinhos”, pelas festinhas na casa da vó Merlinda e por todas as histórias que vivemos juntas ao longo desses anos.
Aos meus amigos do colegial Maisa, Pedro, Gabriel, Pônei e Caio e a minha amiga Bru Carol pelos churrascos e barzinhos, por compartilhar as vitórias na profissão que cada um escolheu e por estarem sempre ao meu lado.
Ao meu amigo Gabriel Sheilinha, por escutar meus desabafos, por me fazer companhia nos momentos de carência, por todo carinho, pelas comilanças, pelas risadas, pelas aventuras e pelos filmes emocionantes.
A Gabi e ao Ícaro, que são minha família em Campinas. Agradeço a vocês por estarem ao meu lado desde o começo da graduação, nos momentos de dificuldade, nas horas em que a saudade de casa foi grande, nas conquistas, nas alegrias, por me darem colinho enquanto eu chorava, pelas conversas empolgantes com a “Palestrinha”, por todo carinho e amor. Sou muito grata por ter vocês em minha vida!
As minhas amigas Victória e Ana Beatriz, pelos karaokês, pelos conselhos amorosos, pelas loucuras e risadas, pelos abraços e pelos rolês divertidos. Obrigada por serem tão especiais em minha vida!
Ao meu amigo Ricardo, pelos forrós que me ajudaram muito a relaxar e fortalecer minhas energias.
As minhas amigas e meu técnico de vôlei, pelos momentos descontraídos e por me acolherem tão bem neste time lindo.
As minhas gêmeas Mello, Helena e Luíz Mello, pelos momentos de dificuldade e alegria que passamos juntos e por serem como uma família para mim. Apesar de vocês estarem longe, vocês moram no meu coração!
Aos meus amigos do laboratório Giane, Michel, Luiz, Andressa, Camila, Maiara, Julinha, Toni, Neto e Micheli por terem me ajudado nos experimentos, pelos momentos vividos nestes anos, pelas festinhas e jantinhas, pelas risadas e lágrimas compartilhadas. Amo vocês!
Aos meus amigos da NC716, em especial ao Jhonne, pelas risadas, festinhas e por compartilharem todo sofrimento e alegria de fazer mestrado na Unicamp nestes dois anos.
A todos os amigos que fiz durante esses anos de Unicamp, que, de alguma forma, marcaram a minha vida.
pelos ensinamentos ao decorrer destes dois anos, pelos conselhos de vida e por ser, além de orientadora, amiga e psicóloga nos momentos mais difíceis da minha vida que passei nos últimos anos.
Ao Prof. Dr. Benedicto de Campos Vidal, por toda sabedoria transmitida com muito carinho e por toda dedicação. Quando eu ficava desacreditada na minha vocação como cientista, as nossas reuniões revigoravam meu desejo pelo saber, pelo modo empolgante e paciente como o senhor me ensinava. Toda vez que vejo as imagens de birrefringência e leio seus artigos fico fascinada com as novas descobertas transmitidas com tanto capricho e amor. Saiba que o senhor é uma inspiração para mim, não só como cientista, mas também como pessoa!
Ao Prof. Dr. Henrique Marques, pelas conversas, por todo apoio emocional, pelas dicas no meu projeto e por todas as ideias compartilhadas comigo. Debater ciência com você é incrível!
A Profa. Dra. Valéria Quitete e aos meus amigos que fiz em seu laboratório, em especial a Larissa, o Fábio e a Celina, por me ensinarem os primeiros passos na minha jornada como pesquisadora, pelos conselhos e por todo carinho.
A todos os professores, mestres da sabedoria, que tive o prazer de conhecer, por todos os ensinamentos transmitidos que serviram como base para minha formação profissional e pessoal.
A Universidade Estadual de Campinas, ao Instituto de Biologia e ao curso de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural, pela estrutura e recursos fornecidos para o desenvolvimento deste trabalho.
A CNPq pela concessão da bolsa de mestrado.
As matricriptinas são fragmentos proteicos derivados da quebra proteolítica da matriz extracelular (MEC) com atividade biológica e que podem regular diversos processos envolvidos no remodelamento da MEC. Lindsey et al. (2015) descreveram uma matricriptina derivada da quebra do colágeno I (peptídeo p1158/59) que apresentou um efeito positivo no remodelamento da MEC cardíaca pós-infarto. O objetivo de nosso estudo foi analisar o efeito do peptídeo p1158/59 na trombose, formação da neoíntima e remodelamento da MEC vascular da aorta abdominal de camundongos C57BL/6. Para tal, utilizamos uma lesão química mediada por cloreto férrico para induzir a lesão vascular e analisamos os seguintes grupos: controle (sem lesão), 2 dias após a lesão, 14 dias após a lesão, 2 dias e 14 dias após a lesão + tratamento com o peptídeo. Nos grupos tratados, aplicamos intravenosamente 24 µg/animal/dia do peptídeo diluído em água MiliQ. Depois, foram analisados o tamanho do trombo, a formação de neoíntima, a presença de ICAM-1, LY6G e elastina por imunofluorescência, a atividade das gelatinases por zimografia in situ e a organização das fibras colágenas na parede da aorta por microscopia de polarização. Também analisamos, in vitro, o efeito de p1158/59 na agregação plaquetária no plasma humano e investigamos o papel do peptídeo no tempo de formação do trombo, medido por uma sonda Doppler na artéria carótida lesionada, e na coagulação, através dos testes de TTPa e TP ex vivo, utilizando o plasma destes animais. A proliferação das células musculares lisas (SMCs) vasculares foi analisada por MTT. O tratamento com p1158/59 aumentou o tamanho do trombo e a atividade das gelatinases 2 dias após a lesão vascular, mas não alterou os demais parâmetros avaliados neste trabalho, quando comparado ao grupo 2 dias após a lesão sem tratamento. Além disso, o peptídeo aumentou o tamanho da neoíntima e a birrefringência do colágeno, diminuindo a atividade das gelatinases 14 dias após a lesão, provavelmente por induzir a migração das SMCs e aumentar a deposição e organização do colágeno. Assim, concluímos que o peptídeo p1158/59 induziu um remodelamento vascular negativo da MEC, induzindo a formação de neoíntima, diferente dos resultados benéficos observados por Lindsey et al. (2015) no remodelamento cardíaco. Portanto, a atividade desta molécula como agente remodelador da MEC no sistema cardiovascular pode variar de acordo com o tecido, método de aplicação e finalidade do seu uso.
Matricryptins are protein fragments proteolytically released from extracellular matrix (ECM) with biological activity that can regulate several processes involved on ECM remodeling. Lindsey et al. (2015) described a collagen I matricryptin (called peptide p1158/59) that showed a positive effect on cardiac ECM remodeling post-infarct. The aim of this study was to analyze the effect of p1158/59 on thrombosis, neointimal formation and vascular remodeling of C57BL/6 mice abdominal aorta ECM. We induced chemical vascular injury using ferric chloride and analyzed the following groups: control (no lesion), 2 days after injury, 14 days after injury, 2 days and 14 days after injury + treatment. In the treated groups, we applied 24 µg/animal/day of peptide diluted in MiliQ water. We analyzed thrombus size, the formation of neoíntima, the presence of ICAM-1, LY6G and elastin by immunofluorescence, the activity of gelatinases by zimography in
situ, and collagen fibers organization on the aorta wall using polarization microscopy.
We also analyzed in vitro the effect of p1158/59 on platelet aggregation in human plasma and we investigated the role of the peptide on thrombus time formation, measured by a Doppler probe in the injured carotid artery, and in the coagulation, using TTPa and TP
ex vivo (using the plasma of these animals). The vascular smooth muscle cells (SMCs)
proliferation was analyzed by MTT. The treatment with p1158/59 increased the thrombus size and gelatinases activity 2 days after vascular lesion, but it did not alter the other parameters evaluated on this work when compared to group 2 days after injury. Moreover, the peptide increased neointima size and collagen birefringence and decreased the activity of gelatinases 14 days after injury, probably by inducing the migration of SMCs and improving collagen deposition and organization. Thus, we conclude that the peptide p1158/59 induced a negative vascular ECM remodeling, promoting neointimal formation, different of the beneficial results observed by Lindsey et al. (2015) on cardiac remodeling. Therefore, the use of this molecule as an ECM remodeling agent in the cardiovascular system may vary according to the tissue, method of application and purpose of its use.
1- INTRODUÇÃO ... 14
1.1- Trombose ... 14
1.2- A cascata de coagulação e a formação do coágulo ... 18
1.3- A trombose na aorta ... 20
1.4- A trombose e inflamação ... 22
1.5- Remodelamento vascular e as metaloproteinases ... 25
1.6- Reestenose e neoíntima ... 29
1.7- A matriz extracelular e organização da parede do vaso ... 30
1.8- Fibras elásticas e elastina ... 33
1.9- Colágeno ... 35
1.10- Sítios matricrípticos e as matricriptinas ... 37
1.11- O peptídeo p1158/59 ... 39 2- OBJETIVOS ... 43 2.1- Objetivos gerais ... 43 2.2- Objetivos específicos ... 43 3- MATERIAIS E MÉTODOS ... 44 3.1- Animais ... 44 3.2- Peptídeo p1158/59 ... 45
3.3- Lesão na aorta abdominal com FeCl3 ... 45
3.4- Análise histológica- área de trombo e neoíntima ... 48
3.5- Lesão arterial da carótida e análise do tempo de oclusão total da luz do vaso ... 48
3.6- Tempo de Protrombina (TP) e Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)... 50
3.7- Agregação plaquetária ... 50
3.8- Ensaio da proliferação das células musculares lisas por MTT ... 51
3.9- Imunofluorescência para LY6G, ICAM-1 e Elastina ... 51
3.10- Zimografia in situ ... 52
4- RESULTADOS... 56
4.1- Efeito do peptídeo na formação do trombo ... 56
4.2- Efeito do peptídeo no tempo de formação do trombo ... 57
4.3- Impacto do peptídeo na agregação plaquetária ... 58
4.4- Efeito do peptídeo na cascata de coagulação sanguínea medidos pelo Tempo de Protrombina (TP) e de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPa) ... 59
4.5- Análise do papel do peptídeo no remodelamento vascular (formação de neoíntima) 60 4.6- Ação do peptídeo na proliferação das células musculares lisas (MTT) ... 62
4.7- Efeito do peptídeo no processo inflamatório... 63
4.7.1- Presença de ICAM ... 63
4.7.2- Quantificação do número de célula inflamatórias no lúmen do vaso (LY6G) ... 66
4.8- Efeito do peptídeo na quantidade de elastina na parede do vaso ... 69
4.9- Papel do peptídeo na atividade gelatinolítica ... 72
4.10- Efeito do peptídeo na quantidade e organização do colágeno (Birrefringência)... 75
4.10.1- Grupo controle (não lesionado) ... 76
4.10.2- Grupo lesionado 2 dias ... 79
4.10.3- Grupo lesionado e tratado com peptídeo 2 dias... 81
4.10.4- Grupo lesionado 14 dias ... 83
4.10.5- Grupo lesionado e tratado com peptídeo 14 dias ... 85
5- DISCUSSÃO E CONCLUSÕES ... 87
6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 103
1- INTRODUÇÃO
As doenças cardiovasculares são as principais causas de morte nos Estados Unidos e no mundo (Lopez et al., 2006; Heidenreich et al., 2011). Assim, estima-se que cerca de 17 milhões de pessoas morram ao ano devido a estas doenças, principalmente por ataques cardíacos e derrame (Dixit & Katare, 2015). Estima-se que estas doenças irão se tornar o problema de saúde dominante em todo o mundo em 2020 (Murray & Lopez, 1997). Somente nos Estados Unidos projeta-se que, em 2030, as doenças do sistema cardiovascular afetem mais de 40% da população americana, custando ao estado cerca de US$ 1 trilhão, com gastos diretos e indiretos (Thom et al., 2006; Heidenreich et al., 2011).
A doença vascular oclusiva é um importante contribuinte na mortalidade e morbidade do mundo ocidental. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) (2016), a trombose é um dos problemas cardiovasculares que mais matam no mundo, sendo que uma em cada 4 mortes no mundo está relacionada a ela. A trombose é a doença subjacente mais comum dos três principais distúrbios cardiovasculares: doença cardíaca isquêmica (síndrome coronariana aguda), acidente vascular cerebral e tromboembolismo venoso (ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day, 2014). Nos Estados Unidos, calcula-se que cerca de 900.000 pessoas serão afetadas por coágulos sanguíneos a cada ano (Beckman et al., 2010). Em torno de 100.000 destas pessoas morrerão em decorrência de complicações causadas pelo trombo, o que é maior do que o número total de pessoas que perdem suas vidas a cada ano por causa da AIDS, câncer de mama e acidentes causados por veículos de transporte (Beckman et al., 2010).
1.1- Trombose
A trombose é um grupo de condições em que a cascata de coagulação é ativada dentro do lúmen dos vasos sanguíneos, levando a formação do coágulo (neste caso, denominado de trombo) que dificulta e/ou impede a passagem do fluxo sanguíneo. A trombose severa pode bloquear o fluxo de sangue para um determinado tecido levando à isquemia e morte tecidual (Smith et al., 2015).
Os termos “trombose” e “embolia” foram cunhados pelo médico alemão Rudolf Virchow, que foi o primeiro a demonstrar a relação mecânica entre o trombo e a embolia pulmonar (Virchow, 1856). Mais tarde, Virchow também descreveu 3 grupos de fatores trombogênicos: a hipercoagulabilidade do sangue, alterações no fluxo sanguíneo (estase e turbulência) e disfunção endotelial (Virchow, 1856; Wolberg et al., 2012), que ficaram conhecidos como a Tríade de Virchow (Bagot & Arya, 2008).
Embora os coágulos hemostáticos e trombóticos sejam estruturalmente semelhantes (contêm vários componentes iguais), eles são formados em diferentes circunstâncias (Wolberg et al., 2015). Assim sendo, os coágulos hemostáticos se formam rapidamente após a transecção ou lesão do vaso para evitar perda excessiva de sangue. Em contraste, os coágulos trombóticos podem se formam dentro do vaso sanguíneo em um endotélio praticamente intacto e se desenvolvem ao longo de vários dias a semanas (Wolberg et al., 2015). Uma combinação de fatores de risco parece agir em conjunto para desencadear a formação do trombo.
Tradicionalmente, os trombos venosos e arteriais possuem patofisiologia diferentes. Enquanto que no trombo venoso as células vermelhas do sangue e a fibrina são os principais componentes do coágulo (denominado de “coágulo vermelho”), no trombo arterial o coágulo é feito principalmente de plaquetas agregadas, o chamado “coágulo branco” (Aksu et al., 2012). Também, a trombose venosa tem sido associada com hipercoagulabilidade e/ou redução do fluxo sanguíneo, ao passo que, a trombose arterial é relacionada com a aterosclerose e a ativação plaquetária (Aksu et al., 2012). Contudo, essa divisão clássica desses tipos de trombose tem sido questionada, já que pacientes com trombose arterial possuem um risco maior de desenvolver trombose venosa (Poredos & Jezovnik, 2007; Di Minno et al., 2012), além do envolvimento da inflamação e ativação plaquetária também na patogênese do trombo venoso (Poredos & Jezovnik, 2007; Lacut et al., 2008).
Estudos epidemiológicos demonstraram que ambos os fatores de risco genéticos (por exemplo, a mutação do fator V de Leiden) e adquiridos (como cirurgias) contribuem para o tromboembolismo (Wolberg et al., 2015). Assim sendo, deficiências em anticoagulantes e/ou aumentos nos pró-coagulantes podem produzir um estado de hipercoagulabilidade (Grant et al., 2012; Wolberg et al., 2015). Ainda, os estados de hipercoagulabilidade podem ser causados por malignidades, administração oral de hormônios femininos usados para contracepção e terapia de reposição hormonal (Reitsma et al., 2012). Estes fatores induzem a ativação aberrante ou excessiva da cascata de coagulação dentro dos vasos, o que leva à geração de trombina, deposição de fibrina intravascular e formação de trombos, que prejudicam o fluxo sanguíneo (Wolberg et al., 2015). De fato, o aumento da geração de trombina plasmática é um fator de risco para trombose primária e recorrente (Dargaud et al., 2006; Hron et al., 2006; Brandts et al., 2007; Tripodi et al., 2007; Eichinger et al., 2008; Besser et al., 2008; Tripodi et al., 2008; Wichers et al., 2009).
As disfunções no endotélio também estão relacionadas com o aumento de risco de trombose. Sob condições patológicas, o endotélio, que normalmente é uma superfície anticoagulante e fibrinolítica, é convertido para uma superfície pró-coagulante
e anti-fibrinolítica, devido a injúrias e/ou alteração na expressão de proteínas induzida por hipóxia, inflamação e/ou fluxo sanguíneo alterado (Wolberg et al., 2015). É importante ressaltar que combinações de fatores de risco parecem ser necessárias para a iniciação do trombo (Mackman, 2012).
Com relação ao trombo arterial, o gatilho primário para a trombose arterial, na maioria das vezes, é a ruptura de uma placa aterosclerótica, que se desenvolve através do acúmulo de depósitos lipídicos e macrófagos carregados de lipídios (células espumosas) na parede da artéria (Mackman, 2008). Os trombos que se formam nas placas rompidas são ricos em plaquetas, que são células anucleadas pequenas (cerca de 1 μm de diâmetro) produzidas por megacariócitos na medula óssea (Hartwig & Italiano, 2003). Essas células em forma de disco circulam no sangue como sentinelas da integridade vascular e rapidamente formam um tampão hemostático primário em locais de lesão vascular (Ruggeri & Mendolicchio, 2007). A maioria dos eventos oclusivos arteriais ocorre quando a placa aterosclerótica atua como um substrato iniciador para trombose, uma vez que a trombose não é susceptível de ocorrer na parede vascular normal (Libby, 1998).
A associação entre as placas e trombose levou ao uso do termo aterotrombose, que enfatiza a importância da placa na formação do trombo e vice-versa. A probabilidade do desenvolvimento de trombose aumenta muito com a ruptura da placa e/ou fissura e ruptura do cap fibroso que a envolve, já que estes eventos levam a exposição do interior trombogênico da placa ao sangue circulante (Libby, 1998).
A probabilidade de ruptura da placa é determinada pelo equilíbrio entre a força do cap fibroso e a força física do material que ele envolve. A inflamação influencia a composição do cap atuando, deste modo, na probabilidade de ruptura da placa. Isto se deve ao fato de que as células inflamatórias presentes nas placas secretam metaloproteinases e mediadores que ativam estas enzimas que atuam degradando o cap, tornando-o mais susceptível a ruptura (Libby, 1998).
Quando uma placa aterosclerótica se rompe, as plaquetas são rapidamente recrutadas para o local, através da interação de receptores específicos de superfície celular de plaqueta com colágeno e o fator von Willebrand (Denis & Wagner, 2007). Após essa adesão à parede do vaso, a ligação de plaquetas adicionais, mediada pelos receptores presentes na própria superfície das plaquetas (a denominada agregação plaquetária), resulta em crescimento rápido do trombo. As plaquetas também são ativadas nesse estágio. Uma das principais vias de ativação plaquetária envolve a clivagem e, consequentemente, a ativação do receptor plaquetário PAR-1 (receptor ativado por protease 1; também conhecido como receptor de trombina) pela trombina
protease (também conhecida como fator II) (Coughlin, 2005), que é ativada pela cascata de coagulação sanguínea que foi desencadeada pela exposição do fator tecidual ao fluxo sanguíneo (Mackman, 2008). As plaquetas ativadas liberam o conteúdo dos grânulos, o que promove ainda mais o recrutamento, adesão, agregação e ativação das plaquetas.
Além da ruptura da placa aterosclerótica, lesões no endotélio, como as ocasionadas pela colocação de stents, também podem levar a formação de trombos arteriais. O stent é uma espécie de “mola” que é inserida no lúmen de vasos obstruídos por placas de ateromas, sendo uma das técnicas cirúrgicas mais utilizadas para desobstrução do lúmen do vaso. No entanto, esta técnica pode causar uma injúria mecânica na parede do vaso, expondo a matriz subendotelial, levando a ativação da cascata de coagulação e formação do trombo, além de desencadear uma resposta inflamatória local que estimula a proliferação das SMCs e a deposição de componentes da MEC, resultando na formação e espessamento da neoíntima e reestenose (Mackman, 2008).
Figura 01: Formação do trombo arterial após ruptura da placa aterosclerótica. A trombose arterial
envolve a formação de "coágulos brancos" ricos em plaquetas que se formam após a ruptura de placas ateroscleróticas e exposição de material pró-coagulante, como as células espumosas ricas em lipídios, colágeno e fator tecidual. A ruptura da camada endotelial com exposição da matriz subendotelial também leva a formação do trombo. Abreviaturas: TM, trombomodulina; II, protrombina; IIa, trombina; Fgn, fibrinogênio; TF, fator tecidual. (Adaptado de Wolberg et al., 2012).
Uma das principais técnicas utilizadas para o estudo da trombose in vivo é a indução da lesão arterial mediada por cloreto férrico (FeCl3) (Kurz et al., 1990). O FeCl3
é um reagente químico de caráter ácido e coloração castanho escuro bastante utilizado para investigação de mecanismos trombóticos em camundongos (Day et al., 2004).
Embora o modelo de injúria por FeCl3 seja amplamente usado, pela facilidade
de implementação e formação robusta do trombo, o mecanismo pelo qual o FeCl3 induz
a formação do trombo ainda não está totalmente estabelecido. Assim sendo, o início da formação do trombo neste modelo é historicamente atribuído à denudação das células endoteliais provocada pelos íons de ferro livre e subsequente exposição da camada subendotelial pró-trombótica que desencadeia a adesão e agregação plaquetária, ativando a cascata de coagulação (Westrick et al., 2007).
1.2- A cascata de coagulação e a formação do coágulo
O sistema de coagulação do plasma consiste em uma reação em cascata envolvendo ativação de enzimas e de proteínas (por ação de serino-proteases) que culmina com a ativação da trombina, transformação de fibrinogênio em fibrina, polimerização de fibrina, ativação plaquetária e formação do coágulo (Smith et al., 2015).
A cascata de coagulação pode ser didaticamente subdividida em três vias: a via extrínseca (também conhecida como via do fator tecidual), que é a principal ativadora da cascata; a via intrínseca (fator XIIa, fator XIa, fator IXa e fator VIIIa), que amplifica a cascata; e a via comum (fator Xa, fator Va e trombina), que gera trombina e fibrina (Mackman, 2008).
A via do fator tecidual tem esse nome devido a proteína iniciadora da cascata, o fator tecidual (TF) (Morrissey & Broze, 2013). Essa via também é conhecida como via extrínseca da coagulação, porque ela requer que o plasma entre em contato com algo extrínseco (isto é, com o TF) para desencadeá-la. A via do fator tecidual é a principal via que leva a formação do coágulo na hemostase normal e em vários tipos de trombose em que ocorre a exposição do TF (Smith et al., 2015).
Na via extrínseca, a formação de trombina é iniciada pela interação entre TF e o fator circulante VII, resultando na ativação do fator VIIa (que é uma serino-protease). O complexo FT-VIIa gera o fator Xa que, em conjunto com quantidades traço de seu cofator Va, converte protrombina em trombina. O passo final da cascata de coagulação é a conversão de fibrinogênio em fibrina, catalisado pela trombina (Kalz et al., 2014).
Para assegurar uma geração adequada de trombina e da rede de fibrina, há um
feedback positivo pela ativação do fator XI, bem como a ativação dos cofatores V e VIII.
A trombina também estimula a ativação do fator XIII que transforma a rede de fibrina solúvel em um coágulo de fibrina insolúvel (Kalz et al., 2014).
Na trombose, a associação da coagulação com o sistema imune e inflamação, induz um estado de hipercoagulação, resultando no aumento da geração de trombina por modificar o balanço entre os fatores pró e anticoagulantes (Kalz et al., 2014).
A via intrínseca da coagulação ou a via de contato não depende da exposição de TF (Smith et al., 2015). Esta via é ativada quando o plasma entra em contato com certos tipos de superfícies pró-trombóticas como vidro, argila, diatomáceas, entre outros (Nossel, 1967). Esta via não contribui para a hemostase normal, somente para doenças trombóticas (Smith et al., 2015).
A via intrínseca é iniciada pela ativação do fator XII. O sangue, ao entrar em contato com superfícies artificiais, leva a mudanças conformacionais do fator XII, resultando na geração de uma pequena quantia de fator XII ativado (XIIa) (Silverberg et al., 1980; Tankersley & Finlayson, 1984). Então, o fator XIIa, que é uma serino-protease, converte o pré-Kallikrein plasmático (PK) na sua forma ativa, o Kallikrein. A ativação recíproca do fator XII pelo Kallikrein e de PK pelo fator XIIa resulta em um feedback positivo que sustenta a cascata de coagulação (Müller et al., 2011). Então, o fator XIIa é gerado e este ativa seu substrato, o fator XI. A proteólise limitada do fator IX a IXa, mediada pelo fator XIa, permite a formação do complexo fator IXa-VIIa que, por sua vez, ativa o fator X (Smith et al., 2015). As últimas etapas em comum entre a via intrínseca e extrínseca levam a geração de trombina e a formação da rede de fibrina e, consequentemente, do coágulo sanguíneo.
Figura 02: Visão geral da cascata de coagulação sanguínea. O sistema de coagulação do plasma pode
ser iniciado por dois mecanismos distintos: a via do fator tecidual (TF) e a via de contato. A via do TF é desencadeada quando o complexo da superfície celular formado por TF e fVIIa (TF:VIIa) ativa o fator IX e/ou X por proteólise limitada. A via de contato é acionada quando o sangue entra em contato com uma superfície pró-trombótica. Isso resulta na ativação recíproca de fXII para fXIIa, por ação da kallikrein, e PK em kallikrein, mediada por fXIIa. A geração resultante de fXIIa ativa o fXI para fXIa, que então converte o fIX em fIXa. Ambas as vias convergem para a produção de fXa. Este caminho final comum resulta na geração de trombina, que, por sua vez, converte o fibrinogênio em fibrina e ativa as plaquetas. (Adaptado de Smith et al., 2015).
1.3- A trombose na aorta
As doenças da aorta são um grupo heterogêneo de distúrbios, incluindo condições aterotrombóticas como ateroma aórtico, síndrome de embolização do colesterol, trombo mural aórtico, trombo associado ao aneurisma aórtico e vasculite de grandes vasos (Caron & Anand, 2017).
Os trombos aderentes à parede da aorta geralmente estão associados a aterosclerose subjacente ou doença aneurismática (Tsilimparis et al., 2011; Fayad et al., 2013). O trombo mural aórtico primário é uma condição rara, algumas vezes relacionada com doenças pró-trombóticas ou inflamatórias sistêmica (Caron & Anand, 2017).
A aterosclerose aórtica envolve mecanismos similares a aterosclerose coronária, embora o diâmetro da aorta e o intenso fluxo sanguíneo que passa por ela permitem o desenvolvimento de placas maiores dentro do lúmen da artéria antes de ocluí-la (Libby, 2013). O tromboembolismo resultante da ruptura destas placas pode levar a obstrução de artérias distais por desprendimento de material trombótico, ocasionando manifestações clínicas como derrame, ataque isquêmico transitório, infarto renal ou intestinal e isquemia aguda dos membros (Amarenco et al., 1994; Russo et al., 2009). Em adição, a aterotrombose no arco aórtico é fortemente associada com doenças cerebrovasculares, dada sua proximidade com os vasos cerebrais (Caron & Anand, 2017).
Também, o aneurisma aórtico abdominal é frequentemente revestido por uma camada de trombo intraluminal. Este trombo pode desempenhar tanto efeitos benéficos como maléficos na progressão da doença aneurismática. Assim sendo, alguns estudos demonstraram que a presença do trombo reduz o estresse na parede do vaso aneurismático em até 38%, diminuindo potencialmente as chances de ruptura (Wang et al., 2002). Entretanto, outros estudos demonstraram uma associação entre o trombo e a evolução do aneurisma, já que o trombo pode aumentar o processo proteolítico na parede aórtica (Fontaine et al., 2002).
Já o trombo mural aórtico primário, que ocorre na ausência de aterosclerose ou aneurisma aórtico, tem sido reportado em uma série de casos (Reber et al., 1999; Hassan et al., 2001; Morris et al., 2011; Verma et al., 2014) e, na maioria das vezes, está associado a condições sistêmicas como trombocitopenia induzida por heparina (Chan & Millward, 1998; Tomescot & Ilie, 2012), síndrome de antifosfolipídios (Soubrier et al, 1995; Messiaen et al., 1996), malignidades subjacentes (Poirée et al., 2004; Mosquera et al., 2009; Yoshikawa et al., 2014), quimioterapia (Hahn et al., 2011; Chin et al., 2010), neoplasmas mieloproliferativos (Fayad et al., 2013) e/ou trombofilias (Onwuanyi et al., 2001; Hazirolan et al., 2004; Yoshikawa et al., 2014).
Em um estudo com 88 pacientes com isquemia aguda dos membros, em 19 pacientes foram encontrados trombos murais aórticos subjacentes (Verma et al., 2014). Os sítios mais frequentes dos trombos nesses casos foram o arco aórtico distal e a aorta torácica descendente, seguidos da aorta abdominal e aorta ascendente (Caron & Anand, 2017). Ainda, em pacientes com isquemia aguda dos membros inferiores, 78% dos casos de embolia tiveram origem cardíaca e não-cardíaca (Klonaris et al., 2007). Estima-se que 10% da embolia de origem não-cardíaca teve origem na aorta, metade decorrente de doenças aneurismáticas e a outra metade de aterotrombose (Mills & Porter, 1991).
Com relação ao tratamento dos trombos na parede da aorta, alguns autores sugerem que a administração de anticoagulantes é o suficiente para levar a completa resolução do trombo (Hahn et al., 1999; Bowdish et al., 2002), enquanto que outros estudos reportaram o risco de recorrência e sugerem a abordagem cirúrgica como melhor tratamento para pacientes jovens com trombo relativamente móveis localizados na aorta (Tsilimparis et al., 2011). Portanto, estudos sobre os mecanismos envolvidos na trombose e recuperação da aorta após lesão podem auxiliar no desenvolvimento de novas terapias que promovam a recuperação do endotélio da aorta.
1.4- A trombose e inflamação
A relação entre inflamação e trombose é complexa e dual, visto que a inflamação pode ativar a cascata de coagulação e induzir a formação de trombo, enquanto que a ativação das plaquetas e dos fatores de coagulação, por suas vezes, podem aumentar a inflamação (Aksu et al., 2012).
De fato, sabe-que, na artéria, a inflamação crônica está claramente associada ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Lind et al., 2001). Nas veias, embora a inflamação crônica aparentemente não esteja associada com a trombose venosa (Tsai et al., 2002), a inflamação aguda contribui para o desenvolvimento do trombo e embolia pulmonar (Smeeth et al., 2006).
Pode-se dizer que o principal fator que conecta a inflamação crônica com a trombose é a lesão endotelial (Westerweel & Verhaar, 2009). Quando há um dano à estrutura do vaso, vários mediadores pró-inflamatórios, como IL-1, TNF-α, CD40L e INF- γ, são secretados pelos macrófagos (Libby, 1998; Aksu et al., 2012) e por outras células e ativam as células endoteliais, os leucócitos e as plaquetas induzindo a expressão de moléculas de adesão na superfície destes tipos celulares. Essas moléculas de adesão incluem as integrinas, selectinas e membros da superfamília das imunoglobulinas (Gawaz et al., 2005; Martinelli et al., 2010) como ICAM-1 (Miller et al., 1995; Morrell et al., 2007; May et al., 2008), VCAM-1 (Vlassar et al., 1995; Luu et al., 2000) e P-selectina (Lorant et al., 1995; Norman et al., 1995), que contribuem para as interações complexas entre essas células.
Além de promover a ativação das células, a inflamação influencia diretamente as vias de coagulação e fibrinólise. A atividade pró-coagulante normalmente é regulada por três vias anticoagulantes importantes: anti-trombina III (AT-III), sistema da proteína C e o inibidor da via do fator tecidual (TFPI) (Aksu et al., 2012).
Na inflamação, a síntese de AT-III é prejudicada. Além disso, neutrófilos ativados secretam elastase que degrada AT-III. Assim, a associação desses fatores leva a uma
diminuição dos níveis de AT- III e a criação de um ambiente pró-trombótico (Aksu et al., 2012).
O sistema da proteína C também é afetado negativamente durante a inflamação. Os níveis plasmáticos dos zimógenos da proteína C são reduzidos por causa de sua síntese prejudicada, do aumento no seu consumo e degradação por enzimas proteolíticas como as elastases secretadas pelos neutrófilos. Além disso, mediadores inflamatórios, como TNF-α e o IL-1, regulam negativamente a trombomodulina e moléculas semelhantes à heparina, resultando na diminuição da ativação da proteína C e contribuindo ainda mais para a criação de um estado pró-coagulante (Aksu et al., 2012).
Durante a inflamação, tanto os inibidores como os ativadores de plasminogênio podem ser afetados por IL-1 e TNF-α (Steinhubl et al., 2007). Estas citocinas aumentam a liberação do ativador de plasminogênio tecidual (tPA) e do ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA) dos locais de armazenamento nas células endoteliais vasculares, que estão envolvidos na ativação do plasminogênio, principal mediador do sistema fibrinolítico que é responsável pela resolução dos coágulos sanguíneos (Aksu et al., 2012). No entanto, estes efeitos são contrariados por um aumento sustentado no inibidor do ativador de plasminogênio do tipo 1 (PAI-1) (Neumann et al., 1999), que é um inibidor rápido do ativador de plasminogênio. Níveis elevados de PAI-1 induzidos por citocinas inflamatórias suprimem a proteólise do coágulo por prevenirem a ativação do plasminogênio. Por consequência, o efeito líquido da inflamação sobre a fibrinólise é a inibição, causando a remoção inadequada de fibrina e, deste modo, contribuindo para a trombose microvascular (Aksu et al., 2012).
Outro fator na interface trombo-inflamação é a ativação plaquetária. Quando ativadas, as plaquetas secretam vários mediadores imunológicos e interagem com as células endoteliais e leucocitárias, incluindo monócitos e macrófagos. Assim sendo, as plaquetas ativadas secretam fatores de crescimento e várias quimiocinas que possuem efeitos importantes na inflamação vascular, contribuindo para o desenvolvimento de trombose (Schiemann et al., 2006). As plaquetas também secretam quimiocinas, como IL-1α e lL-1β, que atuam na proliferação das células musculares lisas e na expressão de moléculas de adesão na superfície endotelial, contribuindo para a patogênese tanto da aterosclerose quanto da trombose (Gasparyan et al., 2011).
Ainda, as plaquetas ativadas interagem com as células endoteliais e leucócitos através de receptores, desencadeiam a expressão de TF na superfície destas células, causando alterações pró-trombóticas na superfície das células endoteliais (Shi & Morrell, 2011; Nurden, 2011) e provocando a ativação da cascata de coagulação (Celi et al., 1994; Steinhubl et al., 2007). Deste modo, a inflamação desencadeia a ativação
das plaquetas, células endoteliais e leucócitos, levando a expressão de TF que, por sua vez, age como um feedback positivo recrutando e ativando mais células envolvidas na inflamação e na trombose (Aksu et al., 2012).
Assim sendo, em situações de dano ao vaso e inflamação, o fenótipo endotelial normal (isto é, fibrinolítico e anticoagulante) é alterado para um estado pró-trombótico e anti-fibrinolítico. Essa transformação é acompanhada pela expressão de moléculas de adesão, levando a um acúmulo de monócitos/macrófagos e plaquetas na parede vascular (Garlanda & Dejana, 1997; Ross, 1999; van Hinsbergh, 2012). As interações entre o endotélio, plaquetas e leucócitos, bem como o efeito dos mediadores pró-inflamatórios resultam em num aumento da expressão endotelial de TF.
Assim como a inflamação é capaz de desencadear a cascata de coagulação e a formação de trombos, a trombose também influencia o processo inflamatório. Isto posto, o mecanismo principal pelo qual a coagulação modula a inflamação é a ligação da trombina e alguns outros fatores de coagulação a receptores ativados por proteases (PARs) (Aksu et al., 2012). Esses receptores estão localizados nas células endoteliais, mononucleares, plaquetas, fibroblastos e musculares lisas (Coughlin, 2000) e são capazes de se ligar com a trombina, complexo TF-fator VIIa e fator Xa (Aksu et al., 2012). A ligação da trombina e de fatores da cascata de coagulação aos receptores induz a produção de fatores de crescimento e citocinas, levando a suprarregulação da resposta inflamatória (van der Poll et al., 2001). Ainda, a trombina atua como uma molécula quimiotaxia para leucócitos (Coughlin, 2000; van der Poll et al., 2001).
Também, o fibrinogênio e a fibrina podem estimular diretamente as células mononucleares a produzir e secretar citocinas e quimiocinas, como TNF-α, IL-1β e MCP-1, potencializando a resposta inflamatória (Szaba & Smiley, 2002).
Além da modulação mediada pela trombina, as plaquetas também estimulam a inflamação através da ativação das células dendríticas, pela expressão de CD40L. Através da atividade co-estimulatória das células dendríticas, as plaquetas regulam indiretamente as respostas imunes envolvendo células T e B (Aksu et al., 2012). Ainda, as plaquetas e as micropartículas derivadas de plaquetas ativam a cascata do sistema complemento, possivelmente através da expressão de receptores C1q e P-selectina na sua superfície (Peerschke et al., 2008). As quimiocinas secretadas pelas plaquetas tem papel importante na resposta imune inata (Levi & van der Poll, 2010; Faioni & Cattaneo, 2011).
Deste modo, a trombose age como um feedback positivo no recrutamento e ativação de células inflamatórias que, por suas vezes, atuam estimulando a cascata de coagulação e promovendo a ativação plaquetária e disfunção endotelial.
1.5- Remodelamento vascular e as metaloproteinases
As artérias in vivo estão sujeitas a diferentes tipos de estresses mecânicos aos quais elas devem se adaptar, como a força de cisalhamento do fluxo sanguíneo no lúmen do vaso, pressão, atrito com o tecido circundante e os movimentos corporais (Wang et al., 2017). Assim sendo, sabe-se que alterações no fluxo sanguíneo, pressão e o alongamento axial do vaso levam ao remodelamento da parede arterial (Han et al., 2003; Bell et al., 2016).
O remodelamento vascular é caracterizado por alterações estruturais como o aumento do tamanho da luz do vaso, na espessura da parede arterial, na deposição dos componentes da MEC, proliferação celular e na expressão de metaloproteinases (MMPs) bem como na adaptação do formato e alinhamento das células endoteliais (Han et al., 2003; Gleason et al., 2004; Lee et al., 2008; Kim et al., 2009; Chiu & Chien, 2011).
As células vasculares remodelam a parede do vaso para alterar o diâmetro interno, o comprimento e/ou a espessura, trazendo as tensões de volta aos níveis fisiológicos. Isto é feito através da alteração do conteúdo da MEC da parede vascular. O colágeno é a molécula da MEC que contribui para a maioria das mudanças geométricas na parede do vaso, visto que ele tem um módulo elástico incremental maior do que a elastina, de forma que o aumento na quantidade de colágeno leva a um incremento na rigidez do vaso. O aumento na deposição de colágeno é uma característica comum no remodelamento vascular e cardíaco (Wagenseil & Mecham, 2009).
A regulação do remodelamento da MEC é essencial para a manutenção dos processos fisiológicos normais como desenvolvimento e cicatrização (Larsen et al., 2006; Lu et al., 2011; Cox & Erler, 2011; Ponticos & Barbara, 2014). Contudo, uma desregulação neste processo pode afetar a homeostasia, levando ao desenvolvimento de condições patológicas (Lee et al., 2015). Em várias doenças cardiovasculares, além da inflamação com o recrutamento e infiltração de células e a ativação das SMCs, uma das características marcantes nestas doenças é o remodelamento da MEC (Strauss et al., 1994; Raines, 2000; Intengan & Schiffrin, 2001; Jacob, 2003; Ponticos & Barbara, 2014). As alterações na MEC podem impactar a arquitetura vascular e o comportamento das células, modificando-os (Boudreau & Jones, 1999; Zhang et al., 1999; Yamada et al., 2003). Uma das alterações mais comuns observadas na MEC após a injúria vascular é o aumento na deposição de colágeno tipo I (Strauss et al., 1994; Coats et al., 1996; Sluijter et al., 2004), que altera a razão colágeno/elastina, levando a mudanças na mecânica do vaso e aumentando a rigidez da parede arterial (Libby & Lee, 2000; Ng et al., 2011). Ainda, o colágeno é capaz de se ligar a receptores de superfície celular como
integrinas e receptores de domínio discoidina (DDRs), afetando o crescimento e migração das células endoteliais e das SMCs (Lu et al., 2011; Vaiyapuri et al., 2012; Wang et al., 2014).
O processo inflamatório é essencial para iniciação e progressão do remodelamento vascular, implicando na degradação e reorganização da MEC da parede do vaso (Libby, 2002; Trexler et al., 2003; Siasos et al., 2007; Kampoli et al., 2009; Siasos et al., 2011). Além da inflamação, a injúria vascular, o estresse oxidativo e a hemodinâmica são processos importantes que dirigem o remodelamento vascular e que também estão envolvidos na regulação e atividade das metaloproteinases (Siasos et al., 2012). A proteólise e degradação da MEC desempenham um papel importante em vários processos fisiológicos e patofisiológicos como remodelação tecidual, desenvolvimento de órgãos, cicatrização, remodelamento vascular e reestenose, suporte tecidual, aterosclerose, câncer, artrite e doenças inflamatórias crônicas (Birkedal-Hansen, 1995).
A matriz extracelular é degradada por dois sistemas proteolíticos: o fibrinolítico (plasminogênio/plasmina) e, principalmente, pelo sistema das metaloproteinases. As metaloproteinases (MMPs) são um grupo de endopeptidases capazes de clivar vários componentes da MEC como colágeno, elastina, gelatinas, caseína, etc (Page-McCaw et al., 2007). Além de agirem como degradantes de componentes da matriz extracelular, as MMPs também atuam indiretamente como reservatório de moléculas com atividade biológica, visto que a degradação da matriz pode liberar fatores que estavam aprisionados nela e/ou gerar fragmentos biologicamente ativos (Siasos et al., 2012). Ainda, essas enzimas estão envolvidas na clivagem de receptores da superfície celular e contribuem para ativação e inativação de citocinas (Van Lint & Libert, 2007). Também, elas podem alterar o comportamento e fenótipo celular contribuindo para a proliferação, migração, diferenciação e apoptose celular, no processo de angiogênese e na resposta imunológica (Visse & Nagase, 2003).
As MMPs podem ser divididas em grupos de acordo com a especificidade do substrato e, em parte, devido à localização celular destas enzimas. Assim, as MMPs são divididas em colagenases, gelatinases, estromelisinas, matrelisinas e MMPs de membrana (MT-MMPs) (Garcia-Touchard et al., 2005).
As gelatinases consistem na MMP-2 (gelatinase A, 72 kDa) e MMP-9 (gelatinase B, 92 kDa) e são as principais enzimas responsáveis pela degradação do colágeno tipo IV e dos colágenos denaturados (gelatinas) (Bäck et al., 2010). Elas também degradam um grande número de diferentes substratos da matriz incluindo colágeno tipo I (espécie-específico), V, VII, X, XI (Senior et al., 1991; Pourmotabbed, 1994), elastina (Senior et al., 1991), fibrobronectina e laminina (Morodomi et al., 1992). Também,
as gelatinases clivam diferentes moléculas bioativas, como fatores de crescimento e citocinas, o que contribui para modulação da resposta inflamatória. Outro aspecto importante destas enzimas é a habilidade delas clivarem e controlarem suas próprias atividades e de outras MMPs. Tanto a MMP-2 quanto a MMP-9 são capazes de clivar pró-MMPs e ativá-las (Bäck et al., 2010).
A MMP-2 é constitutivamente expressa em diferentes tecidos, incluindo a parede vascular. Em vasos sanguíneos normais, ela é expressa pelas SMCs e células endoteliais (Hanemaaijer et al., 1993; Galis et al., 1994; Bäck et al., 2010). Já a MMP-9 é mais comumente expressa por células derivadas da medula óssea como leucócitos e seus precursores (Janowska-Wieczorek et al., 1999; Bäck et al., 2010).
A atividade da MMP-2 é altamente regulada a nível pós-transcricional (Overall et al., 1991; Bäck et al., 2010). Ela é sintetizada na sua forma inativa e estável de pró-enzima, em condições fisiológicas. Assim que ela é secretada, a pró-MMP2 se liga ao seu inibidor TIMP-2. Várias vias podem levar a ativação da pró-enzima (Bergmann et al., 1995; Strongin et al., 1995; Bäck et al., 2010), incluindo a clivagem enzimática mediada por ela mesma e por outras MMPs, como a MMP-9.
A MMP-9 também é sintetizada na forma de pró-enzima e se liga ao TIMP-1 assim que secretada (Murphy et al., 1989; Bäck et al., 2010). Contudo, no citosol da célula, essa enzima pode ser estocada tanto na forma latente como na ativa, em contraste com a MMP-2 que só é estocada na forma latente (Nguyen et al., 2001). A sua ativação é um processo complexo e regulado pela interação com as TIMPs e outras MMPs (Kolkenbrock et al., 1996; Bäck et al., 2010). A expressão da MMP-9 pode ser induzida por várias moléculas como fatores de crescimento, citocinas, outros mediadores solúveis, moléculas da superfície celular, lipoproteínas e proteínas derivadas da MEC (Martin et al., 2001; Kong et al., 2005; Otero-Vinas et al., 2007; Wagsater et al., 2009). Em contraste com a MMP-2 que é secretada constitutivamente, a atividade da MMP-9 é regulada a nível de expressão e secreção.
A MMP-9 é uma gelatinase que regula vários processos envolvidos no remodelamento vascular, incluindo angiogênese induzida por isquemia, desenvolvimento de aneurisma aórtico e ruptura da placa aterosclerótica (Longo et al., 2002; Johnson et al., 2004; Gough et al., 2006). A expressão e atividade da MMP-9 estão aumentadas durante a resolução do trombo in vivo (Dahi et al., 2005; Deatrick et al., 2005). Esta gelatinase desempenha um papel essencial na migração de macrófagos (Gong et al., 2008) que são as principais células envolvidas na resolução do trombo (Varma et al., 2003).
Os níveis destas enzimas aumentam na inflamação e trombose. As MMPs e outras proteases são produzidas por células inflamatórias e macrófagos (Galis et al.,
1994). As células inflamatórias também secretam várias moléculas e citocinas, como o TNF-α, que regulam e aumentam a expressão de MMPs na parede vascular (Siasos et al., 2012). Também, vários hormônios, fatores de crescimento, mediadores pró inflamatórios e interleucinas supra regulam a expressão das MMPs (Galis et al., 1994; Libby & Galis, 1995; Siasos et al., 2012). Em adição, a trombina também leva a um aumento na atividade da MMP-2, por estimular a transcrição dessa MMP (Duhamel-Clerin et al., 1997; Siasos et al., 2012). Ainda, a expressão de CD40L nos linfócitos T promove a expressão de MMP-2 e MMP-9 pelas SMCs, sugerindo que a resposta imune modula diretamente a expressão das gelatinanes (Schonbeck et al., 1997; Bäck et al., 2010).
A injúria vascular também estimula atividade das MMPs na parede arterial. Em modelos experimentais de lesão arterial induzida por balão, o aumento na proliferação e migração das células musculares lisas após a lesão é mediado, pelo menos em parte, pelo aumento na expressão de MMPs, enquanto que a inibição de MMPs diminui a migração destas células in vitro e in situ (Bendeck et al., 1994; Zempo et al., 1994; Forough et al., 1996; Southgate et al., 1996; Siasos et al., 2012).
Além desta supra regulação mediada pela inflamação, a trombina e a plasmina também modulam positivamente a atividade das metaloproteinases por serem capazes de ativar as pró-enzimas (Carmeliet et al., 1997; Galis et al., 1997). Assim, a trombose e fibrinólise também contribuem para o remodelamento da MEC (Siasos et al., 2012).
As MMPs estão diretamente envolvidas no remodelamento arterial, desempenhando um papel essencial na degradação e alteração da MEC da parede vascular. Sendo assim, a regulação dessas enzimas é fundamental para o processo de remodelamento vascular. Um desbalanço entre a atividade das MMPs e seus inibidores teciduais (TIMPs) pode aumentar ou diminuir a degradação da MEC levando a alterações patológicas na estrutura da parede do vaso o que contribui para patogênese de diversas doenças cardiovasculares como aterosclerose, remodelamento vascular e progressão da insuficiência cardíaca (Creemers et al., 2001; Plutzky, 2003). Como os vasos sanguíneos são circundados pela MEC, a desregulação das MMPs pode levar a remodelação vascular crônica e ao desenvolvimento de doenças vasculares (Plutzky, 2003). Como resultado, os vasos tornam-se mais fracos no desempenho de suas funções fisiológicas normais, como a manutenção da pressão arterial.
Além do remodelamento da MEC da parede vascular, se não houver a resolução completa do trombo, isto é, a remoção da massa trombótica por atividade proteolítica (Singh et al., 2003), o trombo passa por fases de maturação e remodelamento nas quais, incialmente, ocorre a infiltração de células inflamatórias e células mesenquimais na rede de fibrina, levando a um espessamento gradual das fibras de fibrina existentes ou a
substituição por outras proteínas estruturais, incluindo o colágeno (Dewyer et al., 2007; Henke et al., 2007; Deatrick et al., 2011). Este remodelamento e substituição dos componentes estruturais do trombo alteram suas propriedades biomecânicas (Sood et al., 2010).
1.6- Reestenose e neoíntima
As principais complicações clínicas associadas com a aterotrombose são o infarto do miocárdio (Carol et al., 2014), acidente vascular cerebral (Reeves et al., 2008) e doenças arteriais periféricas (Bendermacher et al., 2005). Em pacientes com doenças cardiovasculares isquêmicas e lesões ateroscleróticas, o tratamento mais comum para desobstrução do lúmen do vaso é a angioplastia mediada por balão, com ou sem a colocação de stents (Jeremy & Thomas, 2010; Zhang et al., 2014). Apesar da eficiência desse procedimento, o espessamento da camada neoíntima e reestenose após a angioplastia ocorrem em cerca de 50% dos pacientes, entre 1 a 10 anos após o procedimento, sendo muitas vezes, necessário uma reintervenção cirúrgica (Waller et al., 1991; Varty et al., 1993; Levine et al., 1995; Favaloro, 1998; Motwani & Topol, 1998; Jackson et al., 2000; Jeremy & Thomas, 2010; Zhang et al., 2014).
A reestenose é resultado de um processo de cicatrização excessivo em resposta a lesões graves na parede vascular envolvendo extravasamento de líquido e resposta inflamatória profusa. Ela é definida como a obstrução de 75% ou mais da área do lúmen por tecido neointimal constituído por SMCs e uma matriz extracelular proteoglicana-colagenosa (Chaabane et al., 2013). Além da formação da neoíntima (migração de SMCs e síntese de MEC), a reestenose pode incluir a formação e deposição de trombos, recuo elástico, remodelamento negativo do vaso, infiltração de células inflamatórias e possivelmente disfunção das células endoteliais (Thomas & Campbel, 2004).
A formação de neoíntima, a principal causa de reobstrução da luz do vaso, requer migração de SMCs da parede do vaso para o lúmen e deposição de MEC. Isto ocorre após lesão do vaso envolvendo disrupção da camada endotelial com influxo de células inflamatórias, como macrófagos e células T, que secretam, em conjunto com as células endoteliais e plaquetas ativadas, citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento (Owens et al., 2004), que alteram o fenótipo das SMCs e promovem a migração e infiltração destas células no espaço subendotelial, resultando na formação da neoíntima (O’Brien et al., 2011).
A modificação do fenótipo das SMCs é a marca da fase de remodelamento tecidual após a lesão vascular. Além dos fatores secretados pelos diversos tipos celulares envolvidos na resposta a lesão, as forças de compressão geradas na parede
do vaso e a baixa tensão de cisalhamento devido a alterações no fluxo sanguíneo, mediadas pela colocação do stent, também modificam as SMCs (Chaabane et al., 2013). Assim, as SMCs passam de um fenótipo contrátil para um sintético e migram da camada média para a íntima (Ross, 1999; Campbell & Campbell, 2012). Além da migração, estas células proliferam, contribuindo para a hiperplasia da neoíntima. As SMCs também sintetizam e depositam componentes da MEC (Campbell & Campbell, 2012), como ácido hialurônico e proteoglicanos (especialmente versican) que estabilizam a MEC enriquecida com fibrina depositada durante a formação do coágulo. As células inflamatórias entremeadas na MEC, secretam metaloproteinases que digerem o ácido hialurônico para que a produção e deposição de colágeno tipo I e III na matriz possam ocorrer, levando a eventual fibrose (Chaabane et al., 2013).
Além dos fatores e da mudança de fenótipo, para ocorrer a proliferação das SMCs da camada média para a neoíntima é necessário o remodelamento da MEC por proteases extracelulares, incluindo ativador de plasminogênio, heparanase e MMPs, visto que, in situ, as SMCs estão cercadas por MEC que atuam inibindo a proliferação e migração destas células. Assim sendo, a ação das proteases é necessária para “dissolver” a MEC, permitindo a migração das SMCs para a camada íntima e neoíntima (Newby, 2005).
A secreção da MEC pelas SMCs contribui para o espessamento da neoíntima. A MEC modula eventos importantes durante a evolução do processo de reestenose, incluindo proliferação celular, migração, expressão de fatores de crescimento e remodelamento (Chaabane et al., 2013). A MEC da íntima difere da MEC da parede do vaso subjacente que contém principalmente colágeno fibrilar I e III, proteoglicanos e fibras grossas de elastina (Adiguzel et al., 2009). A MEC da íntima é constituída principalmente por proteoglicanos (versican, biglican e decorin), hialuronano e colágeno fragmentado (tipos I e III). As SMCs da íntima tem capacidade de remodelar a MEC circundante através da secreção de MMPs (Chaabane et al., 2013).
Além das SMCs, outros tipos celulares estão envolvidos na formação da neoíntima incluindo os fibrócitos circulantes (Werner & Nickenig, 2006; Caplice et al., 2007), células progenitoras circulantes derivadas da medula óssea (Tanaka et al., 2008; Strieter et al., 2009) e células de transição endotelial-mesenquimal (Arciniegas et al., 2007).
1.7- A matriz extracelular e organização da parede do vaso
A habilidade do sistema vascular humano, especialmente das artérias, de aguentar a passagem de 150 milhões de litros de sangue impulsionados por 2 bilhões
de pulsações de pressão arterial, com mínima deterioração, depende da organização única dos componentes que compõem a parede vascular (Osidak et al., 2015). Isto posto, a matriz extracelular (MEC) constitui mais de 50% da massa de veias e artérias (Xu & Shi, 2014), sendo sua estrutura extremamente importante para o desempenho das funções do vaso.
Os principais componentes da MEC vascular são o colágeno e a elastina, além de outros constituintes como fibronectina, microfibrilas, proteoglicanos amorfos ou solúveis, e glicoproteínas ricas em leucina (Xu & Shi, 2014). Estas moléculas são sintetizadas pelos diferentes tipos celulares encontrados na parede do vaso e são capazes de interagem entre si para formar uma rede emaranhada e reticulada que, em parte, regula as propriedades biomecânicas do vaso e os fenótipos das células vasculares (Briones et al., 2010).
Os componentes da MEC apresentam uma distribuição diferenciada ao longo das túnicas que compõem a parede do vaso arterial. Assim, a parede vascular normalmente apresenta diferentes tipos de matrizes incluindo a membrana basal subendotelial e as matrizes íntima, média, adventícia e intersticial (Xu & Shi, 2014).
Isto posto, a túnica íntima é composta por uma camada de células endoteliais ancoradas na membrana basal, que é uma estrutura fina constituída principalmente por laminina, colágenos tipo IV, XV e XVIII, nidógeno, perlecan, fibronectina, entre outras moléculas (Moulton et al., 2004; Hallmann et al., 2005; Yurchenco, 2011). Além destes componentes, um constituinte característico da membrana basal é o fator de von Willebrand (Eble & Niland, 2009). A membrana basal é impermeável a células e constitui a base histológica de compartimentalização de tecidos.
A membrana basal é seguida pela matriz da túnica íntima que separa as células endoteliais da lâmina elástica interna. Esta matriz é composta por material amorfo e filamentos de “ancoragem e conexão” que consistem em fibrilinas associadas a microfibrilas e fibras de colágeno (Gerrity & Cliff, 1972; Schwartz & Benditt, 1972; Davis, 1993; Wagenseil & Mecham, 2009), sintetizados pelas células endoteliais. Em adição, as células endoteliais também possuem habilidade de produzir elastina, sugerindo que elas contribuem para a formação da lâmina elástica interna (Carnes et al., 1979; Cantor et al., 1980; Damiano et al., 1984; Wagenseil & Mecham, 2009), possivelmente em reposta a sinais produzidos pelas células da túnica média (Mecham et al., 1983; Wagenseil & Mecham, 2009).
A camada média, que se inicia na lâmina elástica interna e termina na lâmina elástica externa, é composta principalmente por células musculares lisas, elastina e colágeno, que formam uma unidade estrutural básica chamada de unidade lamelar, que se repete ao longo desta camada (Clark et al., 2015). Dentro destas unidades, a
estrutura da elastina é caracterizada por uma folha lamelar, composta por fibras grossas, grandes e circunferenciais que suportam a maior parte da carga, e fibras elásticas interlamelares, que emergem da lamela, formando uma estrutura tridimensional semelhante a “gaiolas” em torno das células musculares lisas (Clark & Glagov, 1985; Dingemans et al., 2000; O’Connell et al., 2008). As unidades lamelares concêntricas são separadas por uma matriz interlaminar formada por colágeno, microfibrilas, proteoglicanos e glicoproteínas (Wagenseil & Mecham, 2009).
A composição predominante de elastina e colágeno da matriz média (aproximadamente 50% do peso seco do vaso) (O’Connell et al., 2008) é a principal responsável por conferir as propriedades mecânicas estáticas das artérias elásticas, já que a eliminação da função contrátil das células musculares lisas não altera estas propriedades (Berry et al., 1975; Wagenseil & Mecham, 2009). Assim sendo, as lâminas elásticas, compostas principalmente por elastina que é uma molécula distensível e que possui uma força de tensão pequena, possuem a função primária de reservatório de energia elástica (dada sua capacidade de deformação) e de distribuir o estresse uniformemente ao longo da parede vascular e para as fibras de colágeno (Berry et al., 1972; Gerrity & Cliff, 1975; Wagenseil & Mecham, 2009). O colágeno, por sua vez, fornece robustez e evita ruptura da parede vascular (Wagenseil & Mecham, 2009).
O colágeno e a elastina da camada média são produzidos principalmente pelas células musculares lisas desta túnica. Ainda, as SMCs desta camada também secretam microfibrilas que, em conjunto com as fibrilas de colágeno I e III em formação, formam uma rede em torno destas células (Dingemans et al., 2000).
A matriz da túnica adventícia, que se estende da lâmina elástica externa até a matriz intersticial, é constituída por um tecido conectivo fibroelástico composto por colágeno fibrilar tipo I e III, condroitin sulfato, dermatan sulfato, proteoglicanos como versican, biglican e decorin, fibronectina e outros componentes (Eble & Niland, 2009; Xu & Shi, 2014). Esta matriz rica em colágeno, é sintetizada e secretada por uma população heterogênea de miofibroblastos (Stenmark et al., 2006). A grande quantidade de colágeno presente na adventícia ajuda a prevenir a ruptura da parede do vaso sob condições de pressão alta (Wagenseil & Mecham, 2009). Os proteoglicanos, devido a sua capacidade de inchar em ambiente aquoso, contribuem para a compressibilidade da parede do vaso (Eble & Niland, 2009). A matriz intersticial é um gel hidratado e enriquecido com sais, fluídos, polissacarídeos e colágenos fibrilares que preenchem o espaço intersticial entre as células. Esta matriz age como um amortecedor contra o estresse exercido sobre a MEC (Xu & Shi, 2014).
A matriz extracelular dos vasos desempenha funções que vão muito além do suporte mecânico. Ela é uma estrutura dinâmica que exerce um papel fundamental na
