INSTITUTO DE BIOLOGIA
ALINE VILLANOVA BRIDI
CAMPINAS 2016
BUSCA DE NOVOS LIGANTES PARA O PPAR
UTILIZANDO UMA ABORDAGEM BIOFÍSICA E
CELULAR
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, na Área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ALINE VILLANOVA BRIDI E ORIENTADA ANA CAROLINA MIGLIORINI FIGUEIRA.
Orientadora: ANA CAROLINA MIGLIORINI FIGUEIRA
CAMPINAS 2016
BUSCA DE NOVOS LIGANTES PARA O PPAR
UTILIZANDO UMA ABORDAGEM BIOFÍSICA E
CELULAR
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcio Chaim Bajgelman
Prof. Dr. Marcelo Vizoná Liberato
Prof. Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
“Ricorda questa sera, perché serà l’inizio dell’eternita”
Primeiramente a Deus, por ter me dado sabedoria e paciência para a realização deste trabalho;
Aos meus pais, Roberto e Roseli, que sempre me apoiaram em todos os sentidos, sem vocês nada disso seria possível. Minha eterna gratidão, nunca serei capaz de agradecer o suficiente por tudo que fizeram por mim. Vocês são sensacionais!
Aos meus irmãos, Gustavo e Karine, que sempre me atormentaram, as melhores risadas são com vocês! E sim, eu te ajudo... Papel de irmã mais velha né... A toda minha família, que apesar de não entenderem nada do que eu falava, acreditavam mesmo assim.
Ao meu namorado Rafael, que foi extremamente importante na conclusão deste trabalho. Sem palavras para agradecer o quanto seu apoio foi fundamental. Obrigada pelo incentivo, preocupação e todo carinho! (Always...)
À minha orientadora Ana Carolina, que me mostrou o caminho da ciência! Obrigada por ter me aceitado como aluna, por ter acreditado mesmo eu nem sabendo o que era uma pipeta direito. Obrigada por tudo que aprendi nesses 5 anos, a base da minha carreira!
À minha querida amiga Juliana, meu eterno agradecimento. Obrigada por me incentivar nos momentos difíceis, pelos ensinamentos e por toda a sua presteza que é notável! Você teve papel essencial no desenvolvimento e finalização desse trabalho. E acima de tudo, obrigada pela amizade e confiança, nunca me esquecerei de você!
À minha querida amiga Jéssica, que sempre contagiou o laboratório com a sua animação, obrigada por tornar os dias difíceis mais alegres! Obrigada por sempre me mostrar um outro lado de tudo, principalmente na vida! Porque a chance foi única! Um agradecimento especial as LECas: Nathynha, pela sua delicadeza incomparável; Naty, pelo seu capricho com tudo; Tábata, pelo seu senso crítico;
A todos amigos do LNBio, que sempre tornaram os dias mais agradáveis, vocês são excepcionais!
Aos amigos que me viram crescer e até hoje me apoiam em todos os sentidos, vocês são parte da minha história.
A pesquisadora Juliana Oliveira, por ter me ajudado com os experimentos com ANS, que foram de grande importância para o desenvolvimento do pipeline.
Ao pesquisador Paulo e seu aluno José, que colaboraram com os estudos de docking do PPAR, o que ajudou muito nas conclusões finais.
A todos os pesquisadores do CNPEM, UNICAMP, USP, UFSCAR e UFSC que de alguma forma colaboraram com o desenvolvimento deste trabalho.
Ao CNPEM e LNBio, por todo apoio e infraestrutura disponível.
A todas as facilities do CNPEM as quais tive acesso e realizei experimentos recebendo a muita atenção e empenho, como o laboratório de Cristalização de Macromoléculas (Robolab), o laboratório de Espectometria de Massas, a Bioinformática e o laboratório de Espectroscopia e Calorimetria
A UNICAMP e a Pós-Graduação do Instituto de Biologia, por todos os esclarecimentos, conhecimentos e principalmente pela bolsa de estudo.
A Capes, pela bolsa de mestrado e ao Cnpq pelo financiamento do projeto. E a todos os amigos que passaram por mim e de alguma forma contribuíram para o meu crescimento, tanto profissional quanto pessoal.
O diabetes tipo 2 atinge pelo menos 15% da população mundial e 6% da população brasileira, sendo caracterizado como parte do conjunto de patologias de efeitos associados, característicos da Síndrome Metabólica. O PPAR regula a transcrição de genes relacionados ao metabolismo de lipídeos, controle de inflamação e produção de insulina, sendo um dos alvos diretos desta síndrome. Após observações de que a sensibilização à insulina é desencadeada não pela ativação direta do PPAR, mas pelo impedimento da fosforilação de um de seus resíduos, a Ser273, postulou-se que um bom modulador deste receptor seria uma molécula que apresentasse baixa ativação do receptor e impedisse a fosforilação da Ser273. Atualmente, este receptor é modulado por fármacos como a rosiglitazona e a pioglitazona, que estão disponíveis no mercado, mas que têm seu uso questionado, devido aos seus efeitos colaterais. Neste trabalho buscamos, através da utilização de um conjunto de metodologias, novos compostos que modulem de forma seletiva o receptor nuclear PPAR, proporcionando sensibilização à insulina, auxiliando no tratamento de diabetes tipo 2. Para tanto, padronizamos um conjunto de metodologias que fossem capazes de definir os efeitos desejados na busca de novos moduladores de PPAR, através de ensaios de estabilidade estrutural, ensaios celulares, testes de ativação/repressão do receptor e ensaios de afinidade a ligantes. Mais ainda, tentamos elucidar as mudanças estruturais provocadas pelos melhores compostos encontrados, por estudos de biologia estrutural. Com isso, encontramos alguns compostos promissores para o planejamento racional de fármacos no combate à diabetes, os quais, atualmente, constituem uma das classes mais procuradas para a prática médica.
Palavras chave: PPAR gama, Diabetes, Receptores Nucleares, Síndrome Metabólica, Ligantes e Rosiglitazona.
Screening of Novel PPARY Ligands by Biophysical and Celular Approaches.
Type II diabetes affects at least 15% of world population and 6% of Brazil’s population, being featured as part of the set of pathologies of associated effects, characteristic of the metabolic syndrome. The PPAR regulates the gene transcription related to the lipids metabolism, control of inflammation and insulin production, being one of the direct targets of this syndrome. After observations that the insulin sensitization is unleashed not by the direct activation of PPAR, but due to the prevention of one of its residues, phosphorylation, the Ser273, it was postulated that a good modulator of this receptor would be a molecule that present low activation of the receptor and that could keep Ser273 from phosphorylation. Currently this receptor is modulated by drugs such as rosiglitazone and pioglitazone, which are both available on the market, but which have their use questioned due to its collateral effects. In this work, by applying a set of methodologies, we look for new compounds that can selectively modulate the nuclear receptor PPAR, providing sensitization to insulin, supporting the treatment of type II diabetes. To do so, we standardized a set of methodologies that can be capable of defining the desired effects on the research of new PPAR modulators, through structural stability tests, cellular tests, activation/suppression of nuclear receptor tests and affinity to ligands. Furthermore, we try to clarify the structural changes caused by the best compounds, through protein crystallography studies and structural biology. This way, we were able to achieve promising compounds for rational drug design in order to treat diabetes, which currently, are one the medical practice most desired class.
Figura 1. Organização estrutural dos receptores nucleares ... 22
Figura 2. Heterodímero PPAR-RXR. ... 25
Figura 3. Regulação positiva da transcrição gênica, ou transativação dependente do ligante ... 26
Figura 4. Mecanismos de regulação negativa da expressão gênica ... 27
Figura 5. Isoformas do PPAR. ... 28
Figura 6. Efeitos conhecidos da ativação do PPAR ... 29
Figura 7. Estrutura do PPAR LBD mostrando suas hélices e ligante comercial Rosiglitazona. ... 39
Figura 8. Construção LBD do PPAR ... 44
Figura 9. SDS-PAGE da Purificação por afinidade do PPAR LBD. ... 62
Figura 10. Cromatograma da purificação por gel filtração do PPAR LBD. .... 63
Figura 11. SDS-PAGE da gel filtração do PPAR LBD ... 64
Figura 12. Gel Nativo do PPAR LBD ... 65
Figura 13. Espectro de CD do PPAR LBD ... 66
Figura 14. Desenovelamento térmico do PPAR LBD por CD ... 66
Figura 15. Metodologias para busca de ligantes para o PPAR ... 67
Figura 16. Compostos testados no TSA ... 70
Figura 17. Espectros de CD do PPAR LBD com os 20 compostos selecionados no TSA ... 72
Figura 18. Desenovelamento térmico do PPAR LBD complexado com os 20 compostos por CD ... 72
Figura 19. Comparação entre as Tms obtidas nos experimentos de TSA e CD dos 20 compostos. ... 73
Figura 20. Espectros de fluorescência do PPAR LBD com os 10 compostos que mostraram atividade ... 76
Figura 21. Estrutura dos ligantes de PPAR ... 77
Figura 22. Curva de ligação dos compostos ao sítio do PPAR ... 78
Figura 27. Quantificação da transcrição gênica ... 85
Figura 28. Western blot com anticorpo anti–Ser273P e anti - PPAR apresentando a fosforilação do PPAR LBD (ensaio 1). ... 86
Figura 29. Western blot com anticorpo anti–Ser273P e anti-PPAR apresentando a fosforilação do PPAR LBD (ensaio 2). ... 87
Figura 30. Curvas de recrutamento de coativador. ... 89
Figura 31. Legenda de contatos do composto. ... 90
Figura 32. Docking PPAR LBD e composto AM-879. ... 91
Figura 33. Docking PPAR LBD e o composto P11 ... 92
Figura 34. Docking do PPAR LBD com o composto R32 ... 94
Tabela 1. Dados de DLS do PPAR LBD ... 64
Tabela 2. Tms dos 20 compostos selecionados por TSA ... 71
Tabela 3. Tabela com as Tms calculadas para os 20 ligantes ... 73
Tabela 4. Constante de afinidade aparente ... 77
3p25 - Região no cromossomo 3 que codifica o PPAR AF-1 - função de ativação 1
AF-2 - função de ativação 2 AFR - África
AG - ácido graxo
AGGTCA - Hexanucleotídeo (Adenina, Guanina, Guanina, Timina, Citosina, Adenina)
Akt - Oncogene viral de timona murino V-akt
ANS - Ácido 8-anilino-1-naftalenosulfônico AP-1 - Proteína Ativadora 1
ATP - Trifosfato de Adenosina
CD - Dicroísmo Circular
CDK5 - Quinase dependente de ciclina 5
CEBPA - do ingês Enhancer-Binding Protein Alpha CV - Volume de Coluna
DBD - domínio de ligação ao DNA DLS - Espalhamento de Luz Dinâmico
DMEM - do inglês Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido Desoxirribonucleico DPP-4 - Dipeptidil Peptidase 4
DR-1 - Repetições diretas da sequência consenso AGGTCA separadas por um único nucleotídeo
DRE - do inglês Direct response element DT1 - Diabetes Tipo I
DT2 - Diabetes Tipo II EUR - Europa
FABP4 - Proteína ligadora de ácido graxo 4
GLUT2 - Transportador de Glicose 2 Glut-4 - Transportador de Glicose 4
GR - Receptor de Glucocorticóides GRE - Elemento responsivo da Gal
GWAS - Estudos de Associação do Genoma HDAC - Desacetilases de Histonas
HDL - Lipoproteína de densidade alta HMGA-1 - do inglês AT-hook 1
HNF-1b - do inglês Hepatocyte Nuclear Factor 1 Homeobox B HNF-1α - do inglês Hepatocyte Nuclear Factor 1 Homeobox α HRE - Elementos Responsivos a Hormônios
IDF - do inglês International Diabetes Federation IPF-1 - do inglês Insulin Promoter Factor 1
IRS - Substrato do Receptor da Insulina Irs1 - do inglês Insulin receptor substrate 1 i-SGLT2 - Inibidor do transportador de sódio-glicose JNK1 - do inglês Kinase/c-Jun N-terminal 1 LB - Lysogeny Broth
LBD - domínio de ligação ao ligante LDL - Lipoproteína de densidade baixa LPL - Lipoproteína Lipase
LQPN - Laboratório de Química e Produtos Naturais LXR - Receptor X de Fígado
MENA - Oriente Médio e Norte da África
MODY - do inglês Maturity Onset Diabetes of the Young MR - Receptor de Mineralocorticóides
NAC - América do Norte e Caribe
NCor - Correpressor de Receptores Nucleares
[(human)]
OMS - Organização Mundial da Saúde
ON - Over Night
pBIND - Plasmídeo da proteína quimera composta pelo DBD da proteína GAL4 e o LBD do PPAR
PBP - Proteína de Ligação ao PPAR
PBS - Tampão Fosfato-salino
PCR - Reação em cadeia da polimerase
Pdx-1 - do inglês Pancreatic and Duodenal Homeobox 1 pGRE-LUC - Plasmídeo Reporter
PI3K - Fosfatidilinositol-3-quinase
PPAR - Receptor Ativador de Proliferação de Peroxissomos PPRE - Elemento Responsivo ao PPAR
RCF - Força relative de centrifugação ou Força-G RI - Receptor Transmembranar de Insulina RMSD - do inglês Root-Mean-Square Deviation RN - Receptores Nucleares
RNA - Ácido Ribonucleico
RNS - Espécie Reativa de Nitrogênio ROS - Espécie Reativa de Oxigênio RPM - Rotações por minuto
RXR - Receptor de Retinóide X SACA - América do Sul e Central SDS - Dodecil Sulfato de Sódio SEA - Sudeste Asiático
Ser - Serina
SM - Síndrome Metabólica
SMTR - Mediador do silenciamento de receptor retinóide X e receptor de hormônio tireoidiano
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral-α
TR - Receptor de Hormônios Tireoidianos TSA - Termo Estabilidade
TZD - Tiazolidinediona
Wnt - Via de sinalização Wnt WP - Pacífico Ocidental
1. INTRODUÇÃO ... 20
1.1. Aspectos gerais associados à síndrome metabólica e questões de saúde pública ... 20
1.2. Receptores nucleares podem ser utilizados como alvos terapêuticos no tratamento da SM ... 21
Envolvimento do receptor ativador de proliferação de peroxissomos – PPAR com a SM ... 23
1.3. Mecanismos de ação dos PPARs ... 24
Quando a ativação é dependente de um ligante ... 25
Quando a regulação transcricional pode ser negativa ... 26
1.4. O protagonista PPAR Gama ... 27
Como o PPAR está envolvido com o DT2, uma das patologias da SM29 1.5. Um breve histórico sobre o Diabetes ... 31
Porque o DT2 é tão grave e merece atenção ... 31
A situação do diabetes atualmente ... 34
Outro fator importante no tratamento do DT2, a resistência à insulina ..35
1.6. Histórico dos fármacos já utilizados para o tratamento do DT2 ... 36
A Abordagem de novos fármacos para o DT2 ... 37
Envolvimento da fosforilação e o tratamento do DT2 ... 40
2. JUSTIFICATIVA ... 41
3. OBJETIVOS ... 42
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 43
3.1. Procedência dos Clones e Ligantes ... 43
3.2. Expressão do domínio LBD do PPAR ... 43
3.3. Purificação do LBD do PPAR... 44
3.4. Purificação por Gel Filtração ... 45
3.5. Estocagem das Proteínas ... 45
3.6. Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS - Dynamic Light Scattering) ... 45
3.7. Eletroforese Nativa ... 46
3.8. Controle para Triagem de Ligantes ... 47
3.11. Supressão de Fluorescência do ANS ... 50
3.12. Cultura de Células ... 51
Transativação com Gene Repórter ... 51
Cálculo de EC50 ... 53
Diferenciação de Adipócitos ... 53
Coloração por Óleo Vermelho O® ... 54
3.13. Ensaio de Fosforilação ... 55
Western Blot ... 55
3.14. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR) ... 56
3.15. Recrutamento de Coativador ... 59
3.16. Docking dos Ligantes ... 59
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 61
4.1. Produção de Proteína ... 61
4.2. Caracterização do PPAR LBD ... 64
4.3. Metodologias para Busca de Ligantes ... 67
4.4. Testes com os Compostos ... 68
Estabilidade Térmica ... 69
4.5. Supressão de Fluorescência do ANS ... 74
4.6. Ensaios Celulares ... 79 Ativação Celular ... 79 Cálculo de EC50 ... 80 Diferenciação de Adipócitos ... 82 4.7. Transcrição Gênica - qPCR ... 84 4.8. Ensaio de Fosforilação ... 86 4.9. Recrutamento de Coativadores ... 88
4.10. Docking dos Ligantes ... 89
5. CONCLUSÃO ... 98
6. REFERÊNCIAS ... 100
1.1. Aspectos gerais associados à síndrome metabólica e questões de saúde pública
A síndrome metabólica (SM) é considerada uma epidemia de proporções mundiais, e representa um espectro de desordens que continua crescendo através do mundo industrializado, sendo caracterizada por um conjunto de anormalidades como diabetes tipo II (DT2), hipertensão arterial, obesidade intra-abdominal, esteatose, dislipidemia, hiperglicemia, trombose, inflamação, entre outros (LORENZO et al., 2007; ALBERTI et al., 2005; KLEIN et al., 2007; ECKEL et al., 2005; ZIMMET et al., 2005).
Pode-se dizer que a SM se tornou um dos maiores desafios da saúde pública no mundo, onde, por exemplo, 22,9% dos adultos nos Estados Unidos são acometidos pela SM, de acordo com o relatório Facts and Figures Endocrine da The Endocrine Society. Um adulto com SM tem custos totais médicos de US$ 40.873, em média, por um período de 10 anos, em comparação aos custos médicos gerais de um adulto, que é em média US$ 33.010, durante o mesmo período (ERVIN, 2009; PARK, 2015; ENDOCRINE SOCIETY, 2015; LOHR E GINGERY, 2015).
A SM é bem conhecida como fator de risco para doenças cardiovasculares e aumento da gordura visceral, que está associado ao aumento da resistência à insulina, o que aumenta os riscos de DT2 e aterosclerose, como pode ser observado no trabalho de Sakashita e colaboradores (2015).
As patologias que caracterizam a SM estão relacionadas principalmente a disfunções de receptores nucleares (RNs), como TR (Receptor de Hormônios Tireoidianos), PPAR (Receptor Ativador de Proliferação de Peroxissomos), GR (Receptor de Glucocorticóides), MR (Receptor de Mineralocorticóides), LXR (Receptor X de Fígado), FXR (Receptor de Farnesóides), dentre outros (SONODA et al., 2008; AHMADIAN et al., 2013). Esses RNs estão intimamente ligados a essas patologias e, por isso, têm sido considerados “alvos” para novas terapias. Os grupos de agonistas e antagonistas que atuam nestes receptores constituem uma das classes de fármacos
mais procuradas para a prática médica, sendo, portanto, alvos importantes para o desenvolvimento de medicamentos (GRONEMEYER et al., 2004; CHOI et al., 2011).
1.2. Receptores nucleares podem ser utilizados como alvos terapêuticos no tratamento da SM
Os RNs constituem uma superfamília de diferentes fatores de transcrição ativados por ligantes, que atuam diretamente na iniciação e regulação de programas de expressão gênica (EGEA et al., 2001; LAZAR et al., 2003). Estão relacionados à manutenção da homeostase, metabolismo em geral e de lipídeos, desenvolvimento embrionário e sexual, entre outras funções. Seus ligantes, moléculas sinalizadoras pequenas e hidrofóbicas, penetram nas células alvo, ligando-se a seus receptores e regulando a produção de diversas proteínas (LAUDET e GRONEMEYER, 2002).
A superfamília dos receptores nucleares compreende 48 genes que codificam 75 proteínas diferentes, cuja atividade é regulada pela ligação direta dos esteroides, vitaminas, lipídios, metabólitos e xenobióticos (CHAW et al., 2001b). Essas proteínas atuam ligando-se em sequências específicas no DNA, denominadas elementos responsivos a hormônios (HRE). Os HREs geralmente estão localizados na região promotora dos genes alvos, são específicos para cada receptor e possuem duas cópias de um hexanucleotídeo (AGGTCA), que podem estar arranjadas em diversas orientações, com espaçamento e sequências flanqueadoras diferentes. Os receptores nucleares podem se ligar aos HREs como monômeros, homodímeros ou heterodímeros (ISSEMAN et al., 1990, FATTORI et al., 2014).
Todos os membros desta superfamília são proteínas modulares, com três domínios principais (Figura 1) (KUMAR E THOMPSON, 1999; KLINGE, 2000). O domínio amino-terminal (A/B), que não é conservado entre os membros da superfamília, desempenha uma função de transativação independente de ligantes, pois contêm um domínio de ativação independente do ligante, denominado função de ativação 1 (AF-1), e seu comprimento é altamente variável entre os diversos RN. O outro domínio (C), representado pela região DBD (DNA Binding Domain), possui cerca de 70 – 80 aminoácidos e é a região mais conservada nos RN, onde se determina a ligação ao DNA em sequências específicas, apresentando motivos estruturais conhecidos como “dedos de zinco”. Foi constatado que este domínio é o responsável tanto pela ligação específica do receptor à sequência de DNA alvo, assim como pela
fraca capacidade de dimerização (KUMAR E THOMPSON, 1999). O domínio D, entre o DBD e o LBD, é uma região menos conservada, que se comporta como uma dobradiça e confere flexibilidade estrutural ao receptor, o que permite que sua dimerização com outro RN e ligação ao DNA ocorram simultaneamente. Já o quarto domínio (E), a região carboxi-terminal, com aproximadamente 250 resíduos de aminoácidos, é denominado de LBD (Ligand Binding Domain), tendo sua sequência de aminoácidos moderadamente conservada entre os membros da família, e é responsável pela ligação do receptor ao ligante, função de ativação 2 (AF-2), além de ser responsável direto pela homo- e/ou heterodimerização entre os receptores. Este domínio também é essencial para associação dos receptores com proteínas correguladoras, correpressores e coativadores, respectivamente associados à repressão ou ativação de genes essenciais. Além disso, o LBD é o domínio responsável pela ativação do receptor de forma dependente de ligante (RASTINEJAD, 2001; GRESCHIK et al., 2002; MORAS e GRONEMEYER, 1998; BOURGUET et al., 2000).
Figura 1. Organização estrutural dos receptores nucleares. Esquema geral da estrutura de um receptor nuclear (1D), destacando os domínios: N-terminal (A/B) em vermelho, o domínio de ligação ao DNA (C) em roxo, a região de dobradiça ou Hinge (D) em rosa, o domínio de ligação ao ligante (E) em verde e o domínio C-terminal (F) em laranja. Abaixo tem-se estruturas terciárias (3D) do DBD ligado ao DNA e do LBD ligado ao hormônio, sendo que o N-terminal, hinge e C-terminal estão representados por linhas tracejadas em vermelho, rosa e laranja, respectivamente, por serem móveis e não terem estrutura resolvida experimentalmente (Adaptado de: Nuclear Receptor Structure.png).
Alguns RNs contêm também um domínio na extremidade carboxi-terminal, conhecido como domínio F, com estrutura e função não conhecidas (EGEA et al., 2001, SONODA et al., 2008, ROBINSON-RECHAVI et al., 2003, OLEFSKY et al., 2001; AMATO, 2008). Podemos observar na Figura 1, um esquema simplificado dos domínios dos RN, acima citados.
Envolvimento do receptor ativador de proliferação de peroxissomos – PPAR com a SM
Dentre os RNs estão os receptores ativadores da proliferação de peroxissomos (PPARs) (EVANS et al., 2004). Eles foram identificados em 1990 através da clonagem de um receptor órfão de murino, o qual era ativado por compostos que auxiliam na proliferação de peroxissomos (como os fibratos) em anfíbios, por isso esse nome (ISSEMAN et al., 1990). Eles surgiram provavelmente durante a evolução dos metazoários (MICHALIK et al., 2002)
Os PPARs são fatores de transcrição presentes no núcleo da célula e são ativados por ligantes naturais ou sintéticos. Os ligantes naturais do PPAR, são os ácidos graxos (AG) e seus metabólitos, considerados sensores lipídicos capazes de modular processos críticos para a homeostase energética. Exercem suas funções na forma de heterodímeros com o receptor de retinóide X (RXR) (MUELLER, et al., 1998, AHMADIAN et al., 2013). Assim, os PPARs podem influenciar a expressão gênica direta ou indiretamente, através da competição com outros fatores de transcrição (CUNARD et al., 2004), entretanto, podem também modular a atividade de genes envolvidos na regulação de energia e processos inflamatórios (AHMADIAN et al., 2013).
Foram identificados três isotipos de PPARs em mamíferos, os isotipos α, β e , cada um codificado por um gene diferente (MICHALIK et al., 2002, AHMADIAN et al., 2013).
O isotipo alfa (α), a primeira forma encontrada, é altamente expressa no fígado, coração, tecido adiposo marrom, sendo associada principalmente ao aumento de respostas inflamatórias, redução de triglicerídeos e aumento da lipoproteína de alta densidade (High density lipoprotein - HDL) (EVANS et al., 2004; POULSEN et al., 2012).
O isotipo beta/delta (β/δ) é o menos conhecido destes receptores, sendo expresso em tecido adiposo, pele e fígado. Está ligado à proliferação de adipócitos, redução nos níveis da lipoproteína de baixa densidade (Low density lipoprotein - LDL) e triglicerídeos, termogênese e redução de peso, também está diretamente ligado à oxidação de ácidos graxos (BARISH et al., 2006, POULSEN et al., 2012).
Por fim, o isotipo gama (), alvo desta dissertação, é expresso em tecido adiposo branco, fígado e lesões ateroscleróticas, estando diretamente relacionado à diabetes por promover a sensibilização à insulina.
O PPAR tem como ligantes sintéticos as tiazolidinedionas (TZDs), utilizadas como sensibilizadores insulínicos no tratamento da diabetes tipo 2 (DT2), o que aumentou o interesse por esses receptores como potenciais alvos farmacológicos para o tratamento de doenças metabólicas humanas (TONTONOZ et al., 2008, KUNG et al., 2012; EVANS et al., 2004).
1.3. Mecanismos de ação dos PPARs
Existem várias moléculas sinalizadoras, como proteínas, aminoácidos, esteróides, retinóides, nucleotídeos e outros, que ativam os RNs na sinalização celular. Os PPARs são encontrados no núcleo das células, ligados a correpressores, que recrutam histonas desacetilazes e mantém a cromatina condensada, o que reprime a transcrição gênica (YU, 2007). Na presença de agonistas, o PPAR recruta coativadores, causando uma mudança conformacional no receptor, dissociando o complexo correpressor (GRONEMEYER, et al., 2004; GUSMÃO, 2008, AMATO, et al., 2012).
O PPAR heterodimeriza com o RXR, ativando a expressão gênica (SONODA et al., 2008), sendo que este complexo se forma mesmo na ausência de um ligante (FEIGE et al., 2005). Ele se liga a sequências específicas de DNA, localizadas na região regulatória ou promotora dos genes-alvo, os elementos responsivos ao PPAR (PPREs), e estimula a transcrição gênica quando ativado por agonistas (ROSEN et al., 2001).
Os PPREs são repetições diretas de dois “meios sítios”, cuja a sequência consenso é AGGTCA separadas por um único nucleotídeo espaçador, denominado Direct Reapeat-1 (DR-1) (Figura 2) (ROSEN et al., 2001; BATISTA, 2012). Estão presentes em uma ou várias cópias nos promotores de genes alvo gerando a
sequência consenso: 5’ – AACT AGGNCA N AGGTCA – 3’, essa sequência específica promove a ligação seletiva do PPAR-RXR aos “meios-sítio” 5’ e 3’ do elemento responsivo, respectivamente (FEIGE et al., 2005; JEANNIN et al., 1997).
Figura 2. Heterodímero PPAR-RXR. Eles se ligam a sequências específicas de DNA no promotor
de genes-alvo. Essas sequências, denominadas DR-1, são constituídas de repetições diretas da sequência consenso AGGTCA separadas por um único nucleotídeo espaçador (n) (GLASS et al., 2006)
Não se tem definido quais são as regiões regulatórias alvo, específicas de cada isotipo de PPAR, visto que muitas células expressam um ou mais dos 3 tipos de PPAR, e o PPRE é comum a eles (MICHALIK et al., 2006).
Quando a ativação é dependente de um ligante
Quando o heterodímero PPAR-RXR não está ligado a ligantes, a transcrição é reprimida, pois ocorre a associação a proteínas correpressoras, tais como o correpressor de RN (NCor) e o mediador do silenciamento de RXR e receptor de hormônio tireoidiano (SMRT); e as desacetilases de histonas (HDAC) são recrutadas por correpressores. Com a cromatina enovelada, não há o recrutamento da maquinaria de transcrição, o que chamamos de repressão basal (YU et al., 2005; ROSENFELD et al., 2006; FATTORI et al., 2014).
Quando o PPAR-RXR está na presença de substâncias agonistas, ocorre o desligamento dos correpressores e o recrutamento de coativadores, tais como o coativador de receptor de esteroide (SRC) – 1, 2 e 3 e a proteína de ligação ao PPAR (PBP). Ocorre então, a acetilação das histonas e modificações na estrutura da
Heterodímero PPAR-RXR
PPAR RXR
cromatina, causando o desenovelamento do DNA, o que permite o recrutamento da maquinaria de transcrição nos promotores do genes-alvo e, assim, inicia-se a transcrição gênica, como mostrado na Figura 3 (RICOTE et al., 2007; CHAWLA et al., 2001; BERGER et al., 2002; FATTORI et al., 2014).
Figura 3. Regulação positiva da transcrição gênica, ou transativação dependente do ligante.
Na ausência do ligante (a), o heterodímero PPAR-RXR é capaz de se ligar aos elementos responsivos no DNA (RE), recrutar proteínas do complexo correpressor e, assim, reprimir a transcrição de genes-alvo. A alteração conformacional do receptor promovida pela ligação do ligante (b) determina a dissociação de proteínas correpressoras, recrutamento de coativadores e interação com a maquinaria de transcrição basal da célula, levando assim, a ativação da transcrição de genes regulados positivamente pelo PPAR ativado (GLASS et al., 2006).
A ligação de agonistas totais, resulta na modificação do estado de repressão basal para a ativação transcricional (DOWELL et al., 1999). Os agonistas parciais, tem uma interação menor com o heterodímero PPAR-RXR, causando uma ativação transcricional menos eficaz. Já os antagonistas bloqueiam os receptores, podendo diminuir ou até anular o efeito do agonista (BERGER et al., 2002).
Quando a regulação transcricional pode ser negativa
A expressão gênica também pode ser regulada negativamente através da transrepressão. Esse mecanismo não envolve a ligação do receptor ao PPRE no DNA (PASCUAL e GLASS, 2006). Ainda não se tem muitos detalhes sobre essa
Regulação Positiva da Transcrição Gênica Dependente do Ligante a
Complexo
Correpressor
bComplexo
Coativador
PPAR RXR PPAR RXRPPRE TATA PPRE TATA
atividade, acredita-se que o PPAR ativado interaja com outros fatores de transcrição, impedindo a ligação com os elementos responsivos, a competição por coativadores, repressão da atividade transcricional e bloqueio da depuração de complexos corepressores (Figura 4) (DOWELL et al., 1999; RICOTE et al., 1998; RICOTE E GLASS, 2007).
Figura 4. Mecanismos de regulação negativa da expressão gênica. a. Repressão transcricional
ativa na ausência do ligante. b. Transrepressão dependente ligante, caracterizada pela atividade antagonista do PPARγ ativado sobre a estimulação da expressão gênica por outros fatores de transcrição, como o fator nuclear kapa B (NF-kB) (GLASS et al., 2006). A ação de fatores de crescimento com atividade pró-inflamatória como NF-kB e proteína ativadora 1 (AP-1) é regulada pela transrepressão do PPAR, por exemplo (RICOTE e GLASS, 2007; AMATO, 2008).
1.4. O protagonista PPAR Gama
O PPAR foi mapeado no cromossomo 3 em humanos (GREENE, et al., 1995), na região 3p25, e por processamento alternativo origina três RNAs mensageiros: PPAR1, PPAR2 e PPAR3, que são diferenciados apenas pela região amino-terminal, na extremidade 5’, como pode-se observar na Figura 5.
O PPAR1 e o PPAR3 codificam a mesma proteína, sendo expressos em diversos tecidos, incluindo coração, cólon, intestino delgado e grosso, rins, pâncreas e baço (FAJAS et al., 1997, FAJAS et al., 1998). O PPAR2, conhecido como isoforma canônica, contêm 28 aminoácidos a mais que o PPAR1/3 na sua região N-terminal,
Mecanismos de Regulação Negativa da Expressão Gênica a
Complexo
Correpressor
b PPAR PPAR RXR NF-kB p50 p65PPRE TATA TATA
sendo altamente expresso no tecido adiposo (TONTONOZ et al., 1994a e 1994b, TAVARES et al., 2007).
Figura 5. Isoformas do PPAR. As isoformas de PPAR, com AF-1, DBD e LBD destacados, além
dos sítios de fosforilação (p). Estrutura do LBD do PPAR com o ligante (AF-2 em marrom). Adaptado de BROCK, 2015.
Inicialmente, o PPAR foi caracterizado como fator de transcrição que regula a expressão gênica na adipogênese, induz a diferenciação dos pré-adipócitos, sendo envolvido na homeostasia da glicose e sensibilização à insulina (RICOTE et al., 1998; TONTONOZ e SPIEGELMAN, 2008). Além disso, atua também em outros processos fisiológicos, como pode ser observado na Figura 6. A ativação do PPAR pode causar efeitos benéficos no organismo, tais como: aumento da gliconeogênese no fígado, estimulo na secreção de insulina no pâncreas, causa a sensibilização a insulina no músculo esquelético e aumenta o metabolismo de lipídeos; ou efeitos maléficos como: a retenção de líquidos, a descalcificação óssea, crescimento do coração, diminuição da osteoblastogeneses e aumento da osteoclastogeneses,
Isoformas do PPAR
AF-1
acúmulo de lipídeos no fígado e coração e causando aumento da adipogênese, gerando ganho de peso (AHMADIAN et al., 2013).
Figura 6. Efeitos conhecidos da ativação do PPAR. As flechas verdes apontam os efeitos benéficos da ativação do PPAR como, por exemplo, a sensibilização a insulina e o aumento do metabolismo de lipídeos, já as setas vermelhas apontam para os seus efeitos deletérios, como, por exemplo, o aumento do coração, o aumento dos níveis de sódio nos rins, a retenção de líquidos e a adipogênese. Retirado de AHMADIAN et al. (2013, p 561)
Como o PPAR está envolvido com o DT2, uma das patologias da SM A importância do PPAR no metabolismo humano passou a chamar atenção em 1995, quando este foi identificado como um receptor para um grupo de fármacos, conhecidos como tiazolidinedionas (TZDs), caracterizados por aumentar a sensibilidade à insulina (LEHMANN, 1995). Assim, o PPAR passou a ser o receptor funcional para as TZDs, como a rosiglitazona (Avandia®) e pioglitazona (Actos®), que eram considerados medicamentos muito eficazes no tratamento de DT2, sendo bem tolerados pela maior parte dos pacientes (AHMADIAN et al., 2013).
As TZDs atuam como sensibilizadores da insulina in vivo, estão entre os antidiabéticos orais mais potentes (YKI-JARVINEN et al., 2004; YKI-JARVINEN et al., 2005) e se ligam ao PPAR com alta afinidade (LEHMANN et al.,1995; AHMADIAN et al., 2013). Elas aumentam, entre outras coisas, o número de transportadores Glut-4 e enzimas importantes na sinalização da insulina, levando a uma redução dos níveis de glicose no sangue. As principais funções das TZDs são diminuir a concentração plasmática dos ácidos graxos e da hiperglicemia de jejum, através da sensibilização à insulina. As TZDs possuem outras funções importantes no tratamento da DT2, auxiliando, por exemplo, na diminuição da hipertensão e redução do risco de aterosclerose (LEHMANN et al., 1995).
A pioglitazona e rosiglitazona, são TZDs consideradas agonistas seletivas do PPAR (LEHMANN et al., 1995) utilizadas no tratamento de DT2, devido a sua pontencial sensibilização a insulina (SAKAMOTO et al., 2000; HALL et al., 2007; HEIKKINEN et al., 2007). Devido aos efeitos colaterais advindos da ativação do PPAR, o FDA (Food and Drug Administration) retirou o fármaco do mercado e restringiu seu uso, sendo este apenas permitido sob avaliação médica (CHOI et al., 2011; EUROPEAN MEDICINES AGENCY. 2010; JONES, 2005). Os efeitos colaterais mais comuns das TZDs, são: retenção hídrica, ganho ponderal e adipogênese, inflamação nos tecidos cardiovasculares, perda de massa óssea e arterosclerose (NISSEN et al., 2007; SEMPLE et al., 2006; RUBENSTRUNK et al., 2007; GREY, 2008; GREY et al., 2007).
A alta potência que as glitazonas apresentam na ligação com o PPAR é responsável por ativar seus efeitos indesejáveis. Baseados nisto, alguns estudos propõem a busca de agonistas seletivos que possam ativar somente funções benéficas e combinar os efeitos positivos da ativação do receptor, podendo assim, substituir as glitazonas (NISSEN et al., 2007; GRAHAM et al., 2010; CHOI et al., 2010; AHMADIAN et al., 2013). Existem evidências, que sugerem que os efeitos benéficos das TZDs sejam mediados por mecanismos que não dependam da ativação do PPAR (KIM et al., 2006; LECKA-CZERNIK et al., 2002) como por exemplo a fosforilação (CHOI et al., 2011).
1.5. Um breve histórico sobre o Diabetes
No século XIX, o marco na história do diabetes foi a descrição das ilhotas pancreáticas por Paul Langerhans (LANGERHANS, 1869), o que contribuiu muito para a descoberta da insulina em 1921, pelos pesquisadores Banting e Best (BANTING e BEST, 1922). Até o século seguinte (XXI) não se tinha muita informação sobre alterações patológicas das ilhotas no DT2, diferente do DT1 (Diabetes Tipo I), no qual os pacientes sofriam de insulite, que é caracterizada pela perda de células β do pâncreas, a infiltração de linfócitos, causando inflamação nas células β, resultando em sua destruição, e consequentemente, diminuição da produção de insulina (IN'T VELD et al., 2007; YAGIHASHI et al., 2016).
Com a disponibilidade de medições precisas de glicose no sangue (YALOW E BERSON, 1961) e radioimunoensaios de insulina, o DT2 foi caracterizado pela hiperglicemia e baixa secreção de insulina. Assim o DT2 foi definido como uma doença hiperglicêmica crônica causada pela deficiência da ação insulínica, sem antecedentes patológicos distintos, tal clínica foi fornecida até ao final do século 20 (YAGIHASHI et al., 2016).
Até então, o que se era sabido, era que o DT2 era uma condição crônica que ocorria quando o corpo não produzia insulina suficiente ou não conseguia utilizar a insulina, sendo diagnosticada pelos elevados níveis de glicose no sangue (EVANS et al., 2000).
Com o avanço da tecnologia, fora possível distinguir os tipos de diabetes, no qual observaram que a DT1 consiste de uma etiologia auto-imune e a DT2 inclui um grupo heterógeno de desordens metabólicas caracterizadas pela incapacidade das células β pancreáticas aumentarem a secreção de insulina, a fim de compensar a resistência à insulina (STUMVOLL et al., 2005).
Porque o DT2 é tão grave e merece atenção
O DT2 é tipicamente diagnosticado na idade adulta, geralmente, por volta dos 40 anos, sendo a forma mais comum de diabetes, correspondendo a 90% dos casos no mundo (STUMVOLL et al., 2005; IDF DIABETES ATLAS, 2015). O número de casos de DT2 está crescendo com uma taxa de aumento global de 3% ao ano (IDF DIABETES ATLAS, 2015).
O desenvolvimento de DT2 resulta da interação entre fatores ambientais e componentes genéticos (LANGE et al., 2008). Os fatores ambientais incluem obesidade, sedentarismo, aumento de peso e estresse (ADEGHATE et al., 2006) e influenciam em seu desenvolvimento, mas não todos da mesma forma, destacando o papel que a genética desempenha na etiologia e na manifestação do DT2. Seguem alguns exemplos, de estudos sobre o DT2.
As formas monogênicas do DT2 representam entre 5 a 10% dos casos de diabetes, sendo que uma única mutação em um gene transmitido de forma autossômica-dominante pode causar a doença. Exemplos dessa forma monogênica de DT2 são representadas pelo MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young), por mutações no gene e no receptor da insulina (KULKARNI et al., 1999; WITHERS et al., 1998; REIS e VELHO, 2002).
O MODY é a forma monogênica mais frequente de DT2, sendo caracterizado por hiperglicemia crônica de origem não auto-imune e anomalia primária na secreção da insulina. Existem seis genes monogênicos implicados no desenvolvimento do DT2. Uma mutação no gene codificador da enzima glicoquinase causa o MODY2. As outras formas de MODY são causadas por mutações secundárias em fatores de transcrição expressos nas células β-pancreáticas: HNF-1α (MODY3), IPF-1 (MODY4), HNF-1b (MODY5) e NEUROD1 (MODY6) (YAMAGATA et al., 1996; FROGUEL et al., 1993; STOFFERS et al., 1997; HORIKAWA et al., 1997; MALECKI et al., 1999). Existindo genes ainda não identificados chamados de MODY-X (REIS e VELHO, 2002).
As células β são sensores altamente sofisticados para a concentração de glicose sistémica, capazes de liberar insulina de acordo com a variação de glicose no sangue. Dentro das células β, a glicose é internalizada pelo transportador de glicose 2 (GLUT2) e fosforilada pela glicose-6-fosfato quinase que, posteriormente, é metabolizada na mitocôndria para produzir ATP (Trifosfato de Adenosina). O aumento na concentração de ATP leva ao fechamento dos canais de potássio (K+) dependentes
de ATP. Isso aumenta a concentração de K+ intracelular, que por sua vez provoca a
abertura dos canais de cálcio (Ca2+) e o afluxo culmina na liberação de vesículas
secretoras de insulina (HABER et al., 2001; FIUME, et al., 2012).
O PPAR é um regulador da transcrição, que atua nestes eventos das células β. Após a ligação ao seu ligante, este receptor se heterodimeriza com o
receptor de retinóide X (RXR), e liga-se aos elementos responsivos (PPREs) dos genes alvo. Estes incluem genes que regulam as funções de secreção das células β pancreáticas, preservação e redução da apoptose (TAVARES et al., 2007). Os PPREs estão presentes em 5 regiões importantes dos genes GLUT2, glicoquinase, Pdx-1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1), Irs1 (Insulin receptor substrate 1), e insulina (GUPTA et al., 2010).
Vários genes de risco para o DT2 foram identificados utilizando gene candidato e estudos baseados em ligação, nos quais a frequência de diferentes alelos de um determinado gene candidato é comparada entre um grupo de casos e um grupo-controle. Mais recentemente, outros genes foram identificados por estudos de associação do genoma (GWAS), que utiliza milhares de polimorfismos de base única (SNPs) como marcadores genéticos, pois, estão espalhados no genoma todo e em grande quantidade (NTZANI E KAVVOURA, 2012; MORAN et al., 2015).
Mais de 20 varreduras do genoma já foram realizadas com portadores da DT2, mostrando diversas formas poligênicas do DT2, sendo que os resultados de um grupo específico mostraram uma forte co-segregação do DT2 com a região telomérica do cromossomo 2q (HANIS et al., 1996), que foi chamado de NIDDM1 (Non-Insulin- Dependent Diabetes Mellitus (Common, Type 2) 1). Outro estudo também sugeriu associação entre o DT2 e o cromossomo 12q (MAHTANI et al., 1996), mas apenas em famílias com deficiência na produção de insulina, recebendo o nome de NIDDM2 (Non-Insulin-Dependent Diabetes Mellitus (Common, Type 2) 2 [(human)]). Outras análises demonstraram associações do DT2 com loci nos cromossomos 11q23-25, 1q21-1q23, 10q e 20 em várias outras populações (REIS e VELHO, 2002).
Vários genes têm sido testados para a predisposição ao DT2. No entanto, os resultados positivos não são reprodutíveis em análises de populações diferentes. Isso pode ocorrer pelo caráter multigênico secundário da doença, em que a susceptibilidade genética desfavorável é diferente em cada grupo (REIS e VELHO, 2002). Um estudo muito recente, publicado por Yeinmy Moran e colaboradores identificou o TCF7L2 que afeta a secreção de insulina (REIS e VELHO, 2002; MORAN et al., 2015).
O TCF7L2 (Transcription Factor 7-Like 2) está entre os genes altamente replicados mostrando forte associação com DT2 (SLADEK et al., 2007; CRUZ et al., 2010). O gene TCF7L2 abrange um grupo de proteínas que atuam como fatores de transcrição, envolvidas na via de sinalização Wnt (DUVAL et al., 2000). A via Wnt tem
um papel importante no metabolismo da glicose e lipídeos, proliferação de ilhotas pancreáticas, regeneração e função, e na produção de GLP-1 (Glucagon-like peptide- 1) (YI et al., 2005; SHU et al., 2008; SHU et al., 2012; MORAN et al., 2015). Portanto, alterações nesta via podem causar a redução de secreção de GLP-1, que afetam a secreção de insulina, entre outros efeitos, e subsequentemente prejudicando homeostase da glicose no sangue (MORAN et al., 2015).
A situação do diabetes atualmente
O diabetes é um dos maiores problemas de saúde emergênciais do século XXI. A Organização Mundial da Saúde estima que, globalmente, a glicemia elevada é o terceiro maior fator de mortalidade prematura, depois de pressão arterial elevada e uso de tabaco (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009; IDF DIABETES ATLAS, 2015). Muitos estudos mostraram que uma proporção substancial de pessoas com diabetes, ainda não tenham sido diagnosticadas. Muitas pessoas permanecem sem diagnóstico, devido baixo nível de sintomas durante os primeiros anos de DT2 (DALL et al., 2014).
Em países de renda alta, de 87% a 91% de todas as pessoas com diabetes, são acometidos pela DT2, 7% a 12% DT1 e de 1% a 3% de tem outros tipos de diabetes (EVANS et al, 2000; BOYLE et al, 1999; BRUNO et al, 2005; HOLMAN et al, 2013). Na maior parte dos países, a DT2 aumentou juntamente com as rápidas mudanças culturais e sociais: o envelhecimento da população, a urbanização crescente, redução da atividade física, aumento da ingestão de açúcar e o baixo consumo de frutas e vegetais (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002).
Em todo o mundo, 415 milhões de pessoas, ou seja, 8,8% dos adultos com idades entre 20-79, estão diagnosticados com diabetes. Se as tendências continuarem, em 2040 serão 642 milhões de pessoas, ou um em dez adultos, terá diabetes. E com relação a mortalidade, a cada 6 segundos uma pessoa morre de diabetes, totalizando 5 milhões de mortes por ano (IDF DIABETES ATLAS, 2015). O que torna evidente a necessidade de novos tratamentos para o diabetes, principalmente porque o Brasil está em quarto lugar entre os 10 países com o maior número de diabéticos. Além disso, é o pais que tem o maior gasto com a doença na América do Sul e Central, cerca de 14,3 [12,9-15,8 ‡] milhões de euros, além de possuir mais da metade das mortes dessa região (IDF DIABETES ATLAS, 2015).
Outro fator importante no tratamento do DT2, a resistência à insulina A resistência à insulina é um fenômeno que desempenha um significativo papel na progressão e desenvolvimento de doenças metabólicas associadas com a neurodegeneração e obesidade, levando a casos de DT2. É caracterizada pela incapacidade de resposta dos tecidos periféricos à insulina, comprometendo o controle da glicose e do metabolismo de lipídeos, causando uma diminuição da captação de glicose pelo músculo esquelético, aumentando a produção de glicose hepática o que causa hiperglicemia pós-prandial (NEWSHOLME et al., 2014).
A alteração na homeostase da glicose coloca um aumento dos encargos sobre células β pancreáticas, que produzem e secretam mais insulina a fim de restaurar os níveis arteriais normais de carboidratos. Embora este mecanismo de compensação possa aliviar os níveis de glicose no início ou no pré-diabetes, a resistência à insulina continua. Com isso, a supra ativação das células β, em resposta ao excesso de glicose e lipídios no sangue, acaba promovendo sua disfunção e subsequente morte, culminando em diabetes (VERDILE et al., 2015).
Uma vez liberada a insulina na circulação, em resposta aos elevados níveis de glicose no sangue, ela provoca efeitos anabolizantes em associação com o receptor transmembranar de insulina (RI) em tecidos-alvo. A interação com a insulina induz autofosforilação do receptor, recrutamento de coativadores e consequente fosforilação do receptor da insulina (IRS) ativando as cascatas de sinalização associadas, por exemplo, de PI3K (Fosfatidilinositol-3-quinase) e Akt (V-akt murine thymoma viral oncogene) (WHITE, 2003; VERDILE et al., 2015).
A resistência à insulina pode ocorrer devido a interferências na cascata de sinalização, devido a mutações genéticas ou modificações estruturais na via de sinalização da insulina. Mutações na serina dos RI associadas a hiperfosforilação, tem sido correlacionadas ao desenvolvimento de resistência à insulina, que pode estar ligada a diminuição da interação com PI3K (SAINI, 2010; VERDILE et al., 2015).
A modificação estrutural por hiperfosforilação de serinas nos resíduos Ser302, Ser307, Ser612, Ser632 nos IRS1, sugere ser um elemento responsável pelo aumento da resistência à insulina. De fato, a expressão excessiva de citocinas pró- inflamatórias e proteínas de sinalização, tais como fator de necrose tumoral-α (TNF- α) e kinase/c-Jun N-terminal 1 (JNK1), que podem ser derivados da expansão do tecido adiposo, induzi a hiperfosforilação das serinas de IRS1, particularmente no
resíduo Ser636. No entanto, não é inteiramente claro que os resíduos ou a combinação de resíduos hiperfosforilados promovam o fenótipo de resistência à insulina (KUBOTA et al., 2000; VERDILE et al., 2015).
O fenótipo de resistência à insulina pode ser uma consequência de um mecanismo mais direto que promova a diminuição da expressão de IR ou dessensibilização à insulina. Especula-se que a hiperglicemia crônica e hiperinsulinemia prolongada, juntamente com o aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS e RNS) podem causar a disfunção da expressão de IR na transcrição de fatores como grupo de alta mobilidade AT-hook 1 (HMGA-1) (FOTI et al., 2005) ou pode induzir a dessensibilização de IR, que, em condições normais, é um processo controlado por feedback negativo (GARVEY et al., 1986). Cronicamente, hiperinsulinemia é a principal característica de resistência à insulina (VERDILE et al., 2015).
1.6. Histórico dos fármacos já utilizados para o tratamento do DT2
O derivado sulfonamídico isopropiltiadiazol era utilizado para o tratamento de febre tifoide em 1944, porém os pacientes estavam indo a óbito após hipoglicemia prolongada, podendo este ser uma esperança para o tratamento do DT2, devido a diminuição da glicose no sangue. Em 1955 foi lançada a primeira sulfonilureia, baseada no fármaco anterior, que é um potencializador de secreção de insulina, e logo em seguida foram lançadas a carbutamida, a tolbutamida, clorpropamida, acetoexamida e tolazamida (TSCHIEDEL, 2013; NATHAN et al., 2006; BAILEY e TURNER 1996; BAILEY e PUAH, 1986). Com a melhora no tratamento dos pacientes, surgiu uma segunda geração de sulfonilureias, a glibenclamida, a gliclazida, a glipirida e a gliquidona, e também uma terceira geração, representada pela glimepirida.
Com indícios de resistência à insulina, surgiram as biguanidas, que atuavam através da diminuição dessa resistência, sendo dessa classe a fenformina que diminuía a glicemia, mas foi retirada do mercado após observarem que muitos pacientes tinham acidose lática concomitante ao uso (ROSENSTOCK et al., 1996; SCHADE et al., 1998). Mesmo com a desconfiança gerada pela fenformina, a metformina, também da classe das biguanidas, passou a ser cada vez mais utilizada, sendo um dos principais medicamentos utilizados para o tratamento do DT2.
A acarbose é um fármaco que retarda a absorção de carboidratos, inibindo a alfa-glicosidase e reduzindo a glicemia, porém, mesmo apresentando bons resultados, não é muito utilizada devido aos efeitos desagradáveis na área digestiva (BAILEY e PUAH, 1986).
Em 1990 surgiram as TZDs, que foram citadas no item 1.3.1. As glinidas, repaglinida e nateglinida, são da classe dos secretagogos de insulina como metformina e as sulfonilureias, mas de curta duração; elas agem estimulando a secreção de insulina pelas células β pancreáticas e estão, em princípio, indicadas para pacientes não obesos ou pacientes obesos cuja glicemia não foi controlada por mudanças do estilo de vida (Aronson, et al., 2003).
No início do século XXI surgiram os inibidores da DPP-4 (Dipeptidil Peptidase 4) e as gliptinas. O GLP-1 é um hormônio intestinal produzido nas células neuroendócrinas do intestino delgado, é um potente hormônio anti-hiperglicêmico, que induz estimulação dependente de glicose da secreção de insulina. Essas drogas aumentam esse efeito e com isso potencializam a liberação da insulina endógena, praticamente sem provocar hipoglicemia, pois têm efeito glicose-dependente (LEBOVITZ et al, 2001; ARONOFF et al., 2000; PORETSKY, 2010).
Uma grande revolução começou com os inibidores dos transportadores de sódio-glicose (i-SGLT2). Eles foram desenhados a partir da evidência de que os pacientes com DT2 absorvem mais glicose nos túbulos renais. A SGLT2, molécula expressa no rim é a responsável pela reabsorção da glicose no túbulo renal. Inibindo- se o SGLT2 aumenta-se a excreção renal de glicose, diminuindo a glicosúria, que sempre foi um parâmetro utilizado para avaliar o diabetes. Os fármacos disponíveis hoje que atuam dessa maneira são: a Dapagliflozina e a Canagliflozina (TSCHIEDEL, 2013).
A Abordagem de novos fármacos para o DT2
As Glitazonas efetivamente melhoram a sensibilidade à insulina através da alta ativação do PPAR, mas esta ativação da transcrição está associada a efeitos secundários indesejados. Assim, a identificação de agonistas que modulam parcialmente o PPAR e mantêm o potencial de redução de glicose, sem induzir os efeitos secundários já descritos, é uma abordagem promissora para o
desenvolvimento de agentes de redução da glicose com um perfil de segurança aceitável (ARGMANN et al., 2005; GRONEMEYER et al., 2004; LIU et al., 2015).
Foi assumido que Avandia® e Actos® agiam exclusivamente sobre a ativação do PPAR. Em 2010, Spiegelman e Griffin relataram uma segunda função para estes ligantes, as quais eram ignoradas até o momento (CHOI et al., 2010). Segundo eles, estas TZDs também bloqueiam um processo chamado de fosforilação, por uma molécula conhecida como CDK5 (Cell Division Protein Kinase), que modifica o PPAR de uma maneira completamente separada do agonismo. Esse mecanismo, de fato, está envolvido na sensibilização à insulina, aparentemente sem os efeitos colaterais preocupantes (AMATO et al., 2012, FINAN et al., 2012).
O trabalho desenvolvido por Choi e colaboradores em 2011, além de outros, explicam que a fosforilação do PPAR pela CDK5 não ativa, nem suprime a atividade transcricional do receptor em geral, mas muda a expressão de genes específicos como a adiponectina, por exemplo (CHOI et al., 2011). Estudos em camundongos, com dieta rica em gordura, demonstraram que a fosforilação do PPAR mediada pela CDK5 está ligada à obesidade. Vários ligantes do PPAR considerados anti-diabéticos efetivos, com ou sem propriedades de agonistas clássicos, inibem diretamente esta ação da CDK5, restaurando os padrões de expressão gênica. Além disso, a inibição desta fosforilação pelo ligante rosiglitazona, em humanos, está intimamente associada ao efeito antidiabético causado pelo fármaco (CHOI et al., 2011; BERGER et al., 2002).
A sequência primária de aminoácidos do PPAR contêm um local consenso para a fosforilação pela CDK5, a Serina 273 (Ser273). A CDK5 não é regulada por ciclinas, mas em vez disso é ativada por p35/25, que são alvos de numerosas citocinas pró-inflamatórias. Choi e seus colaboradores realizaram uma mutação da Ser273 para uma alanina, bloqueando assim a fosforilação pela CDK5, e os resultados indicaram que não há outras regiões do PPAR que sejam fosforiladas pela CDK5 (CHOI et al., 2011).
Com isso, verificou-se que a inibição da fosforilação da Ser273 do PPAR está intimamente associada com seus efeitos anti-diabéticos. Observaram que um pequeno grau de agonismo, ou seja, um ligante que se acomode no sítio, mas não recrute coativadores, não fechando a hélice 12 (Figura 7), mas mudando sua conformação, escondendo a Ser273, irá bloquear a fosforilação mediada pela CDK5,
Estrutura do PPAR evidenciando suas hélices
sensibilizando à insulina. O que também irá diminuir os efeitos deletérios, causados pela ativação, recrutamento de coativadores, incluindo o ganho de peso e a retenção de fluidos, que podem ocorrer por meio de ações de agonistas clássicos. Em termos gerais, a capacidade dos "agonistas parciais" para bloquear a fosforilação é válida, permitindo a identificação de novas drogas. As quais não se liguem com muita afinidade ao receptor, diminuindo assim os efeitos secundários, mas estabilizando o receptor e bloqueando a fosforilação, causando assim, sensibilização a insulina (CHOI et al., 2011; LIU et al., 2015).
Figura 7. Estrutura do PPAR LBD mostrando suas hélices e ligante comercial Rosiglitazona.
A Hélice 12 é um interruptor regulado por ligantes para a atividade de transcrição do receptor nuclear. O ligante é mostrado em esferas (CPK), com a hélice 12 fechada na cor púrpura, hélice 12 aberta na cor azul, as folhas β na cor amarela e um peptídeo coativador ligado na cor de laranja. O ligante encontrado no sítio é a rosiglitazona (PDB 2PRG). Adaptado de NETTLES (2008, v. 15, n. 9, p 1).
Essas pesquisas sugeriram que é possível desenvolver novas drogas contra DT2 a partir de uma nova abordagem. Esta se basearia no desenvolvimento de moléculas que induzissem o bloqueio da fosforilação da Ser273 contida no LBD do PPAR. Com essas descobertas, ficou comprovado que alguns efeitos colaterais causados pela administração das glitazonas são provenientes da alta ativação do receptor, argumentando que uma melhor modulação do PPAR para a sensibilização
à insulina seria importante para a ativação de uma nova via de sinalização, na qual a fosforilação do resíduo Ser273 dele estaria envolvida (CHOI et al., 2011; AHMADIAN et al., 2013; ECKEL et al., 2005).
Envolvimento da fosforilação e o tratamento do DT2
Os efeitos colaterais causados pela ativação do PPAR, geraram muitas discussões sobre como deviriam ser realizadas modulações no receptor, para que ele fosse eficaz no tratamento de DT2, sem os efeitos colaterais causados pela rosiglitazona. Os dados publicados por Choi e colaboradores mostraram que a regulação da fosforilação da Ser273 do PPAR foi o principal responsável pelos efeitos da sensibilização insulina, e os conceitos clássicos sobre a modulação deste receptor mudaram (CHOI, et al; 2010). Curiosamente, os ligantes antidiabéticos do PPAR que foram anteriormente estudados, agiam ativando o PPAR e essa ativação também inibia a fosforilação mediada pela CDK5, provavelmente através da indução de uma alteração conformacional no receptor. Com esta nova abordagem, os autores propuseram que para buscar novos ligandos para o PPAR, a potência deve ser separada do agonismo, pois se tem observado que o agonismo completo é responsável pelos efeitos secundários indesejáveis, enquanto o bloqueio da fosforilação da Ser273 pela CDK5, deve ser a melhor estratégia para melhorar a sensibilização à insulina (KNOUFF, C. & AUWERX, J. 2004; HOUTKOOPER, R.H. & JOHAN, A., 2010; JONES, D., 2010).
Seguindo essa premissa, as estratégias para a busca de novos ligantes para PPAR também mudaram. Agora, é necessário encontrar um composto capaz de se ligar PPAR, não o ativando, mas preservando as capacidades de não diferenciar adipócitos e prevenir a fosforilação. Aqui propomos um conjunto de metodologias que permite visualizar esses efeitos e, também, apresentamos uma triagem de 102 compostos utilizando esta abordagem. Nossos resultados mostram três moléculas que podem ser candidatos de sucesso para esta nova modulação do PPAR.
Devido ao aumento global e alarmante na incidência de obesidade e DT2, há uma necessidade urgente de desenvolver tratamentos mais eficazes e estratégias de prevenção. Além das intervenções no estilo de vida, tornando-a mais saudável, a aplicação de medicamentos seguros pode ajudar no tratamento da atual epidemia da SM e ajudar na resistência à insulina, que induz o DT2. O PPAR desempenha um papel central na regulação da diferenciação dos adipócitos, no metabolismo dos lipídeos, na homeostase da glicose e sensibilização à insulina; portanto, a modulação farmacológica deste receptor nuclear é uma estratégia estabelecida para tratar a resistência à insulina e as dislipidemias causadas pela SM (WILLSON et al., 2001).
Nesse sentido, este projeto teve como principal alvo a busca de novos agonistas parciais, ou ligantes seletivos para o receptor PPAR, utilizando um conjunto de metodologias para a triagem de compostos sintéticos e derivados de substâncias naturais, que foram testados em ensaios biofísicos e celulares, afim de selecionar aqueles que diminuem a ativação do receptor e principalmente impedem a fosforilação da Ser273.
Este trabalho consistiu no desenvolvimento de um conjunto de metodologias (pipeline) para uma busca racional de ligantes para o receptor nuclear PPAR, visando encontrar um “hit” antidiabético para o tratamento da SM.
Os objetivos específicos deste projeto foram:
1. Reunião de compostos de origem sintética e de produtos naturais. 2. Realização de estudos de estabilização das estruturas secundária e terciária do PPAR; confirmação da ligação dos compostos que estabilizam o sítio do PPAR por ensaios biofísicos; e estudos celulares de ativação do PPAR pelos compostos selecionados.
3. Verificação, em células, de efeitos deletérios causados pelos compostos selecionados através de ensaios de diferenciação de adipócitos; análise da expressão gênica mediante o tratamento com ligantes selecionados; e estudos de inibição de fosforilação do receptor também mediante tratamento com os ligantes selecionados.
4. Estudos estruturais e biofísicos de interação proteína/ligante.
3.1. Procedência dos Clones e Ligantes
Para os experimentos em células 293T foi utilizado o plasmídeo repórter pGRE-LUC, contendo o elemento responsivo GRE (Gal Responsive Element) do GAL4 upstream do gene repórter da luciferase de vagalume e o plasmídeo pBIND, que possui a sequência que transcreve o elemento regulatório, ou seja, a proteína quimera composta pelo DBD da proteína GAL4 e o LBD do PPAR, com controle exercido por um promotor forte de citomegalovírus (CMV). Os plasmídeos utilizados foram cedidos pelo Dr. Paul Webb (The Methodist Hospital Research Institute, Houston, EUA)
O plasmídeo utilizado para a expressão heteróloga do LBD-PPAR (aa 207-476) com cauda de histidina foi o pET28a, existente no Laboratório de Espectroscopia e Calorimetria da Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira.
Dos compostos testados, 71 foram gentilmente cedidos pelo grupo dos professores Dr. Ricardo José Nunes e Dr. Rosendo Augusto Yunes, do Laboratório de Estrutura e Atividade da Universidade Federal de Santa Catarina; 18 ligantes, pela EMBRAPA. Outros 6 compostos foram doados pelo Prof. Dr. Ronaldo Aloise Pilli do Instituto de Química da UNICAMP, 6 compostos pelo Prof. Dr. Alessandro Silva Nasciment da USP e 1 composto pelo grupo LQPN (Laboratório de Química e Produtos Naturais) do CNPEM. Todos estes totalizaram 102 compostos para realização dos testes propostos no projeto, sendo que parte deles foram pré- selecionados no laboratório de nossos colaboradores e apresentaram alguma atividade antidiabética em camundongos.
3.2. Expressão do domínio LBD do PPAR
Para a expressão do domínio LBD do PPAR, foi utilizado meio LB com kanamicina na concentração de 50 μg/mL para inocular as bactérias E. coli BL21(DE3), que foram previamente transformadas com o vetor pET28a possuindo o gene relativo à construção LBD, representada a seguir:
Figura 8. Construção LBD do PPAR. Sequenciamento do receptor utilizado nos experimentos.
O crescimento da pré-cultura foi realizado a 37 °C por 12 horas, a qual foi posteriormente diluída 100x em meio 2xYT com 50 μg/mL de kanamicina. O cultivo foi mantido na temperatura de 22 °C sob vigorosa agitação (200 rpm) por 16 horas, sendo induzido com 1 mM de IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo) por 8 horas. Após as 8 horas de indução, a cultura foi sedimentada em uma centrífuga Avanti J26xPT (Beckman Coulter) a 8000 rcf por 20 min à 4 °C, separando o sobrenadante da fração sólida (pellet bacteriano). Ao final do processo a proteína foi purificada a partir do sobrenadante do lisado celular.
3.3. Purificação do LBD do PPAR
O pellet bacteriano foi ressuspendido em tampão contendo 300 mM de NaCl, 50 mM de Tris pH 8,0, 5% de Glicerol e 2 mM de β-Mercaptoetanol em uma proporção de 30 mL de tampão para cada litro de cultura expressa. Após a ressuspensão foi feita a lise das bactérias com a adição de 80 µg/mL de lisozima, por 40 min, a 4 °C. Em seguida, o extrato foi sonicado no Vibra Cell (Sonics), 25 vezes com pulsos de 10 segundos intercalados por 10 segundos de descanso, em uma amplitude de 35%. A fração solúvel foi separada por centrifugação a 15000 rcf por 40 minutos à 4 °C na centrifuga Allegra X-30R Centrifuge (Beckman Coulter).
A purificação foi feita por cromatografia de afinidade, pois a proteína alvo apresenta uma cauda de histidina, conferida pelo vetor pET28a. A fração solúvel foi
Cronstução LBD do PPAR Cauda de Histidina Sítio de Clivagem da Trombina MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKT TDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEY AKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLR KPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQAL ELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKD LY
