Histórico dos fármacos já utilizados para o tratamento do DT2

O derivado sulfonamídico isopropiltiadiazol era utilizado para o tratamento de febre tifoide em 1944, porém os pacientes estavam indo a óbito após hipoglicemia prolongada, podendo este ser uma esperança para o tratamento do DT2, devido a diminuição da glicose no sangue. Em 1955 foi lançada a primeira sulfonilureia, baseada no fármaco anterior, que é um potencializador de secreção de insulina, e logo em seguida foram lançadas a carbutamida, a tolbutamida, clorpropamida, acetoexamida e tolazamida (TSCHIEDEL, 2013; NATHAN et al., 2006; BAILEY e TURNER 1996; BAILEY e PUAH, 1986). Com a melhora no tratamento dos pacientes, surgiu uma segunda geração de sulfonilureias, a glibenclamida, a gliclazida, a glipirida e a gliquidona, e também uma terceira geração, representada pela glimepirida.

Com indícios de resistência à insulina, surgiram as biguanidas, que atuavam através da diminuição dessa resistência, sendo dessa classe a fenformina que diminuía a glicemia, mas foi retirada do mercado após observarem que muitos pacientes tinham acidose lática concomitante ao uso (ROSENSTOCK et al., 1996; SCHADE et al., 1998). Mesmo com a desconfiança gerada pela fenformina, a metformina, também da classe das biguanidas, passou a ser cada vez mais utilizada, sendo um dos principais medicamentos utilizados para o tratamento do DT2.

A acarbose é um fármaco que retarda a absorção de carboidratos, inibindo a alfa-glicosidase e reduzindo a glicemia, porém, mesmo apresentando bons resultados, não é muito utilizada devido aos efeitos desagradáveis na área digestiva (BAILEY e PUAH, 1986).

Em 1990 surgiram as TZDs, que foram citadas no item 1.3.1. As glinidas, repaglinida e nateglinida, são da classe dos secretagogos de insulina como metformina e as sulfonilureias, mas de curta duração; elas agem estimulando a secreção de insulina pelas células β pancreáticas e estão, em princípio, indicadas para pacientes não obesos ou pacientes obesos cuja glicemia não foi controlada por mudanças do estilo de vida (Aronson, et al., 2003).

No início do século XXI surgiram os inibidores da DPP-4 (Dipeptidil Peptidase 4) e as gliptinas. O GLP-1 é um hormônio intestinal produzido nas células neuroendócrinas do intestino delgado, é um potente hormônio anti-hiperglicêmico, que induz estimulação dependente de glicose da secreção de insulina. Essas drogas aumentam esse efeito e com isso potencializam a liberação da insulina endógena, praticamente sem provocar hipoglicemia, pois têm efeito glicose-dependente (LEBOVITZ et al, 2001; ARONOFF et al., 2000; PORETSKY, 2010).

Uma grande revolução começou com os inibidores dos transportadores de sódio-glicose (i-SGLT2). Eles foram desenhados a partir da evidência de que os pacientes com DT2 absorvem mais glicose nos túbulos renais. A SGLT2, molécula expressa no rim é a responsável pela reabsorção da glicose no túbulo renal. Inibindo- se o SGLT2 aumenta-se a excreção renal de glicose, diminuindo a glicosúria, que sempre foi um parâmetro utilizado para avaliar o diabetes. Os fármacos disponíveis hoje que atuam dessa maneira são: a Dapagliflozina e a Canagliflozina (TSCHIEDEL, 2013).

A Abordagem de novos fármacos para o DT2

As Glitazonas efetivamente melhoram a sensibilidade à insulina através da alta ativação do PPAR, mas esta ativação da transcrição está associada a efeitos secundários indesejados. Assim, a identificação de agonistas que modulam parcialmente o PPAR e mantêm o potencial de redução de glicose, sem induzir os efeitos secundários já descritos, é uma abordagem promissora para o

desenvolvimento de agentes de redução da glicose com um perfil de segurança aceitável (ARGMANN et al., 2005; GRONEMEYER et al., 2004; LIU et al., 2015).

Foi assumido que Avandia® e Actos® agiam exclusivamente sobre a ativação do PPAR. Em 2010, Spiegelman e Griffin relataram uma segunda função para estes ligantes, as quais eram ignoradas até o momento (CHOI et al., 2010). Segundo eles, estas TZDs também bloqueiam um processo chamado de fosforilação, por uma molécula conhecida como CDK5 (Cell Division Protein Kinase), que modifica o PPAR de uma maneira completamente separada do agonismo. Esse mecanismo, de fato, está envolvido na sensibilização à insulina, aparentemente sem os efeitos colaterais preocupantes (AMATO et al., 2012, FINAN et al., 2012).

O trabalho desenvolvido por Choi e colaboradores em 2011, além de outros, explicam que a fosforilação do PPAR pela CDK5 não ativa, nem suprime a atividade transcricional do receptor em geral, mas muda a expressão de genes específicos como a adiponectina, por exemplo (CHOI et al., 2011). Estudos em camundongos, com dieta rica em gordura, demonstraram que a fosforilação do PPAR mediada pela CDK5 está ligada à obesidade. Vários ligantes do PPAR considerados anti-diabéticos efetivos, com ou sem propriedades de agonistas clássicos, inibem diretamente esta ação da CDK5, restaurando os padrões de expressão gênica. Além disso, a inibição desta fosforilação pelo ligante rosiglitazona, em humanos, está intimamente associada ao efeito antidiabético causado pelo fármaco (CHOI et al., 2011; BERGER et al., 2002).

A sequência primária de aminoácidos do PPAR contêm um local consenso para a fosforilação pela CDK5, a Serina 273 (Ser273). A CDK5 não é regulada por ciclinas, mas em vez disso é ativada por p35/25, que são alvos de numerosas citocinas pró-inflamatórias. Choi e seus colaboradores realizaram uma mutação da Ser273 para uma alanina, bloqueando assim a fosforilação pela CDK5, e os resultados indicaram que não há outras regiões do PPAR que sejam fosforiladas pela CDK5 (CHOI et al., 2011).

Com isso, verificou-se que a inibição da fosforilação da Ser273 do PPAR está intimamente associada com seus efeitos anti-diabéticos. Observaram que um pequeno grau de agonismo, ou seja, um ligante que se acomode no sítio, mas não recrute coativadores, não fechando a hélice 12 (Figura 7), mas mudando sua conformação, escondendo a Ser273, irá bloquear a fosforilação mediada pela CDK5,

Estrutura do PPAR evidenciando suas hélices

sensibilizando à insulina. O que também irá diminuir os efeitos deletérios, causados pela ativação, recrutamento de coativadores, incluindo o ganho de peso e a retenção de fluidos, que podem ocorrer por meio de ações de agonistas clássicos. Em termos gerais, a capacidade dos "agonistas parciais" para bloquear a fosforilação é válida, permitindo a identificação de novas drogas. As quais não se liguem com muita afinidade ao receptor, diminuindo assim os efeitos secundários, mas estabilizando o receptor e bloqueando a fosforilação, causando assim, sensibilização a insulina (CHOI et al., 2011; LIU et al., 2015).

Figura 7. Estrutura do PPAR LBD mostrando suas hélices e ligante comercial Rosiglitazona.

A Hélice 12 é um interruptor regulado por ligantes para a atividade de transcrição do receptor nuclear. O ligante é mostrado em esferas (CPK), com a hélice 12 fechada na cor púrpura, hélice 12 aberta na cor azul, as folhas β na cor amarela e um peptídeo coativador ligado na cor de laranja. O ligante encontrado no sítio é a rosiglitazona (PDB 2PRG). Adaptado de NETTLES (2008, v. 15, n. 9, p 1).

Essas pesquisas sugeriram que é possível desenvolver novas drogas contra DT2 a partir de uma nova abordagem. Esta se basearia no desenvolvimento de moléculas que induzissem o bloqueio da fosforilação da Ser273 contida no LBD do PPAR. Com essas descobertas, ficou comprovado que alguns efeitos colaterais causados pela administração das glitazonas são provenientes da alta ativação do receptor, argumentando que uma melhor modulação do PPAR para a sensibilização

à insulina seria importante para a ativação de uma nova via de sinalização, na qual a fosforilação do resíduo Ser273 dele estaria envolvida (CHOI et al., 2011; AHMADIAN et al., 2013; ECKEL et al., 2005).

Envolvimento da fosforilação e o tratamento do DT2

Os efeitos colaterais causados pela ativação do PPAR, geraram muitas discussões sobre como deviriam ser realizadas modulações no receptor, para que ele fosse eficaz no tratamento de DT2, sem os efeitos colaterais causados pela rosiglitazona. Os dados publicados por Choi e colaboradores mostraram que a regulação da fosforilação da Ser273 do PPAR foi o principal responsável pelos efeitos da sensibilização insulina, e os conceitos clássicos sobre a modulação deste receptor mudaram (CHOI, et al; 2010). Curiosamente, os ligantes antidiabéticos do PPAR que foram anteriormente estudados, agiam ativando o PPAR e essa ativação também inibia a fosforilação mediada pela CDK5, provavelmente através da indução de uma alteração conformacional no receptor. Com esta nova abordagem, os autores propuseram que para buscar novos ligandos para o PPAR, a potência deve ser separada do agonismo, pois se tem observado que o agonismo completo é responsável pelos efeitos secundários indesejáveis, enquanto o bloqueio da fosforilação da Ser273 pela CDK5, deve ser a melhor estratégia para melhorar a sensibilização à insulina (KNOUFF, C. & AUWERX, J. 2004; HOUTKOOPER, R.H. & JOHAN, A., 2010; JONES, D., 2010).

Seguindo essa premissa, as estratégias para a busca de novos ligantes para PPAR também mudaram. Agora, é necessário encontrar um composto capaz de se ligar PPAR, não o ativando, mas preservando as capacidades de não diferenciar adipócitos e prevenir a fosforilação. Aqui propomos um conjunto de metodologias que permite visualizar esses efeitos e, também, apresentamos uma triagem de 102 compostos utilizando esta abordagem. Nossos resultados mostram três moléculas que podem ser candidatos de sucesso para esta nova modulação do PPAR.

Devido ao aumento global e alarmante na incidência de obesidade e DT2, há uma necessidade urgente de desenvolver tratamentos mais eficazes e estratégias de prevenção. Além das intervenções no estilo de vida, tornando-a mais saudável, a aplicação de medicamentos seguros pode ajudar no tratamento da atual epidemia da SM e ajudar na resistência à insulina, que induz o DT2. O PPAR desempenha um papel central na regulação da diferenciação dos adipócitos, no metabolismo dos lipídeos, na homeostase da glicose e sensibilização à insulina; portanto, a modulação farmacológica deste receptor nuclear é uma estratégia estabelecida para tratar a resistência à insulina e as dislipidemias causadas pela SM (WILLSON et al., 2001).

Nesse sentido, este projeto teve como principal alvo a busca de novos agonistas parciais, ou ligantes seletivos para o receptor PPAR, utilizando um conjunto de metodologias para a triagem de compostos sintéticos e derivados de substâncias naturais, que foram testados em ensaios biofísicos e celulares, afim de selecionar aqueles que diminuem a ativação do receptor e principalmente impedem a fosforilação da Ser273.