Cultura de Células

Com a finalização dos testes biofísicos iniciais, os 3 compostos mais promissores (P11, R32 e AM-879) foram testados na cultura de células em 3 experimentos diferentes. Através deles pudemos avaliar os resultados de forma mais abrangente, pois se tratam de resultados in vivo. Apesar de não serem organismos completos, já existe a possibilidade de conclusões iniciais importantes.

As células 293T e HepG2 foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), pH 7,4, contendo 50 unidades/mL de antibiótico penicilina e estreptomicina, 3,7 mg/L de bicarbonato de sódio e 10% (v/v) de soro fetal bovino, em garrafas T75 para cultura de tecidos Tissue Culture Flask (Sarstedt). As garrafas foram então mantidas em estufa de ambiente controlado a 37 °C, 95% de ar e 5% de CO2. As células 3T3L1 foram cultivadas praticamente da mesma forma que a 293T e

HepG2, sendo a única diferença o soro utilizado, que no caso foi o soro neonatal bovino, não deixando as células ultrapassarem da confluência de 70%.

Para realização da transfecção celular, utilizada nos experimentos de transativação e EC50, foram utilizadas células aderidas 293T. E para a realização do

ensaio de qPCR foi utilizada a célula HepG2, disponíveis no LEC (Laboratório de Espectoscopia e Calorimetria) do LNBio. No ensaio de diferenciação de adipócitos foram utilizadas as células aderidas 3T3-L1, gentilmente cedidas pela Professora Dra. Ana Campa da Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas.

Transativação com Gene Repórter

O ensaio com gene repórter é um método utilizado na pesquisa e identificação de ligantes para receptores nucleares (FORMAN et al., 1995). Esse ensaio consiste na inserção de plasmídeos de expressão nas células de interesse

(transfecção), seguido do tratamento das células com os ligantes de estudo. Na presença de substâncias agonistas, o gene repórter (luciferase) terá sua produção aumentada e servirá de indicador da atividade transcricional de um determinado receptor.

Os plasmídeos utilizados para realização do ensaio foram:

 O plasmídeo repórter pGRE-LUC, contendo o elemento responsivo GRE (Gal Responsive Element) do GAL4 e o gene repórter da luciferase de vagalume, que é um gene marcador altamente sensível da expressão gênica em células e tecidos.

 O plasmídeo pBIND possuindo a sequência que transcreve o elemento regulatório, ou seja, a proteína quimera composta pelo DBD da proteína GAL4 e o LBD do PPAR, com controle exercido por um promotor forte de citomegalovírus (CMV). A ligação do ligante ao LBD ativa a proteína e seu DBD reconhece uma sequência específica no DRE (direct response elemento) que controla a expressão de luciferase. Quando a luciferase expressa através da ativação da proteína quimérica encontra moléculas de luciferina, ocorre uma reação enzimática que resulta em luminescência.

 O plasmídeo pRL-TK, é utilizado como controle do experimento. Ele produz uma sequência que transcreve constitutivamente o gene da luciferase de Renilla depois de transfectado. Dessa forma, podemos normalizar os dados e minimizar a variabilidade causada por diferenças na viabilidade celular ou eficiência da transfecção, além de diferenças causadas pela pipetagem e pelo processo de lise celular. Esse plasmídeo é proveniente do Kit Dual-Luciferase Report Assay system (Promega, Madison, WI).

 O plasmídeo pBLUE foi utilizado para controle negativo de transfecção, para que assim haja a mesma quantidade de DNA transfectado nas células e também para que possamos observar a expressão basal para normalização dos dados.

Para o ensaio de transativação, foram utilizadas células 293T, que foram tripsinizadas, ressuspendidas em DMEM e colocadas em placas de 24 poços (densidade de 1,6x105 _{células/poço). Após 24 horas, o meio DMEM foi trocado por}

meio DMEM Incompleto (sem adição de antibiótico e soro fetal bovino) e procedeu-se com a transfecção de 500 ng depGRE-LUC, 500 ng de pBind contendo o PPAR LBD/GAL4 DBD, 500 ng de pRL-TK e 500 ng de pBLUE, utilizando-se lipofectamina 2000 (invitrogen®). A relação utilizada de DNA (µg) para lipofectamina (µL) foi de

1,5:2. Após 4 horas o meio DMEM Incompleto foi trocado por meio CHARCOAL (Charcoal stripped fetal bovine serum Life Technologies), que é um meio sem lipídeos, para evitar a ligação de ácido graxo no sítio ativo do PPAR e, então, as células foram tratadas com 1 µM dos compostos em estudo e mantidas por 36 horas na estufa.

Após esse período, a monocamada celular foi ressuspendida em tampão de lise (Kit Dual-Luciferase Report Assay System (Promega). As atividades da luciferase de vagalume e de Renilla, presentes no lisado celular, foram determinadas usando o kit Dual-Luciferase Report Assay System, conforme indicado pelo fabricante, sendo as medidas realizadas no luminômetro Glomax (Promega).

Os dados gerados a partir dessa leitura de luminescência foram graficados e tratados no Microsoft Excel 2013, obtendo assim a ativação do receptor com cada molécula de tratamento.

Cálculo de EC50

A concentração do fármaco que induz metade do efeito máximo (EC50), é

usada normalmente como medida da potência de uma droga, sendo que uma curva de dose-resposta graduada representa a concentração do composto para qual 50% do efeito é observado (GRAPHPAD SOFTWARE, 2016; LEFERS, 2004).

Para o cálculo dos valores de EC50 dos 3 compostos, estes foram

adicionados a cultura de células em diferentes concentrações, de forma a traçar uma curva entre a capacidade de ativação do respectivo ligante e sua concentração.

As células 293T, foram transfectadas da mesma forma como descrito no item 3.13.1. e então, as células foram tratadas com 7 concentrações diferentes (0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM e 100 µM) dos compostos em estudo e mantidas por 36 horas na estufa para transcrição dos genes.

Os dados obtidos através da leitura de luminescência foram tratados no Microsoft Excel 2013, normalizados e depois as curvas foram submetidas a um ajuste sigmoidal no OriginPro 9.0 utilizando a equação de dose-resposta.

Diferenciação de Adipócitos

O processo de adipogênese é avaliado com o estudo de alguns tipos celulares que podem ser induzidos, a diferenciar-se em adipócitos em cultura. O primeiro e melhor modelo já caracterizado de adipogênese é a linhagem celular

3T3L1, uma subcepa da linhagem 3T3 do camundongo Swiss, comprometida com a diferenciação adipocitária (GREEN e KEHINDE, 1975). As células 3T3-L1 têm uma morfologia do tipo fibroblasto e, em condições adequadas, as células se diferenciam em adipócitos. Com o acúmulo de lipídeos as células adquirem um formato arredondado. Estas células também são sensíveis aos hormônios e drogas adipogênicas e lipolíticas, incluindo epinefrina, isoproterenol e insulina (GREEN e KEHINDE, 1975; SPIEGELMAN, 1998).

As células 3T3L1 foram utilizadas para avaliarmos o processo da adipogênese e observar quais dos 3 compostos (P11, R32 e AM-879) diminuiria a taxa de acúmulo de lipídeos dentro das células, quando comparadas com as células tratadas com rosiglitazona, que provoca o ganho de peso como efeito colateral.

As células foram cultivadas como descrito no item 4.13. e ao atingirem a confluência de 70%, estas foram tripsinizadas, contadas e adicionadas em placas de 6 poços (Corning®) em uma densidade de 2,8x105 _{células/poço até atingirem}

novamente a confluência de 70%. Após aguardar 48 horas, as células foram tratadas com 1 µM de dexametasona, adicionado ao meio de cultura e 1 µM dos compostos selecionados, sendo o DMSO utilizado como controle negativo e a rosiglitazona como controle positivo. A cada 48 horas o meio de cultura foi trocado e novamente feita a adição dos compostos e dos controles. Esse processo foi repetido por 6 dias, e ao final da diferenciação as células 3T3L1 foram fotografadas.

Coloração por Óleo Vermelho O®

Após a diferenciação completa, as células 3T3-L1 foram lavadas com tampão fosfato-salino (PBS), fixadas com formalina 10% (v/v) em tampão PBS durante 1 hora, e então coradas com solução de óleo vermelho (Oil Red O) (0,3% em isopropanol 60%) durante 20 minutos. Após a coloração, foram lavadas com PBS e fotografadas em um microscópio Nikon MTS em um aumento de 40x.

Após a visualização das células nas condições obtidas na diferenciação de adipócitos, elas foram lisadas em 200 µL de igepal 4% em isopropanol e coletadas em microtubos de centrífuga para a leitura da absorbância. A absorbância das amostras foi medida em uma cubeta de quartzo 10 mm no comprimento de onda de 520 nm, no Espectrofotômetro da Jasco V-530. Este procedimento foi realizado para avaliarmos quais condições tiveram mais acúmulo de lipídeos. Com a leitura da absorbância,

quantificamos o oil red presente em cada condição. Após a leitura da absorbância os valores foram graficados.