PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA COORDENAÇÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS E SAÚDE
OS CONSENSOS PARA PESQUISA DE AUTOANTICORPOS EM CÉLULAS HEp-2 (FAN HEp-2): IMPLANTAÇÃO DAS DIRETRIZES NOS LABORATÓRIOS CLÍNICOS
BRASILEIROS
GLAUCIELEN GOMES DA SILVA
Goiânia 2017
GLAUCIELEN GOMES DA SILVA
OS CONSENSOS PARA PESQUISA DE AUTOANTICORPOS EM CÉLULAS HEp-2 (FAN HEp-2): IMPLANTAÇÃO DAS DIRETRIZES NOS LABORATÓRIOS CLÍNICOS
BRASILEIROS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Ambientais e Saúde da Pontifícia Universidade Católica de Goiás, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais e Saúde.
Linha de pesquisa: Sociedade, Ambiente e Saúde Orientador: Dr. Wilson de Melo Cruvinel
Goiânia 2017
S586o Silva, Glaucielen Gomes da
Os consensos para pesquisa de anticorpos em células HEp-2(FAN HEp_2)[ manuscrito]: implantação das diretrizes nos laboratórios clínicos brasileiros/ Glaucielen
Gomes da Silva.-- 2017. 75 f.; 30 cm
Texto em português com resumo em inglês Dissertação (mestrado) -- Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Ambientais e Saúde, Goiânia, 2017
Inclui referências f.47-66
1. Doenças autoimunes. 2. Imunodeficiência. 3. Testes imunológicos. 4. Autoanticorpos. I.Cruvinel, Wilson Melo. II.Pontifícia Universidade Católica de Goiás. III. Título.
DEDICATÓRIA
À Deus, que com sua imensa bondade e misericórdia tem me sustentado todos os dias.
Aos meus pais, Derson e Antonilde, que cuidaram do meu crescimento pessoal e profissional, me indicando o melhor caminho e me acompanhando por toda trajetória.
Ao meu esposo, Marcos Arnon, que nos momentos mais difíceis do curso, esteve me auxiliando e dando forças para concluir.
Aos meus irmãos, Glaucia e Kallebe, que sempre presenciaram e compartilharam conquistas.
AGRADECIMENTOS
Ao Profº Wilson de Melo Cruvinel meu orientador, por todo o tempo em que se dedicou ao meu trabalho. Meus profundos agradecimentos. Aos Conselhos Regionais e Federal de Biomedicina, pelo auxilio na divulgação da pesquisa. Aos membros do Consenso, em especial Profº Paulo Luiz Carvalho Francescantonio, pela oportunidade em participar do V Consenso, que com toda certeza foi um momento de muito aprendizado. À Controllab, por sua dedicação em nos ajudar na divulgação da pesquisa. Ao meu querido amigo, Willian Lunardi, por seu trabalho na formação dos banners de convites para pesquisa.
“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis”.
RESUMO
A pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2 tem auxiliado no diagnóstico na investigação de doenças autoimunes especialmente as reumáticas. Tal metodologia, ao longo dos últimos anos, passou por um intenso processo de aperfeiçoamento e padronização com a realização do Consenso Brasileiro. O presente trabalho teve como objetivo avaliar, 16 anos após a realização do I Consenso Brasileiro de FAN em Células HEp-2, a implantação das recomendações nos laboratórios clínicos que realizam a metodologia. Foi realizada uma pesquisa direcionada aos laboratórios entre fevereiro e outubro de 2016. Os laboratórios foram convidados a responder um questionário sobre as diretrizes do Consenso, abordando aspectos técnicos, controle de qualidade, leitura das lâminas, emissão de laudos e programas educativos. O estudo contou com a participação de 53 laboratórios que, em conjunto, realizam uma estimativa de 300.000 FAN/mês. Foi identificada uma heterogeneidade em especialidades médicas solicitantes do teste e profissionais responsáveis pelo procedimento técnico e leitura das lâminas de fluorescência. As recomendações do Consenso estão sendo seguidas em sua totalidade por 58,5% dos laboratórios. Em relação ao procedimento técnico, 83,1% dos participantes fazem triagem com diluição 1:80 e o esgotamento de título, recomendado pelo Consenso, está sendo adotado por todos os participantes. Evidenciou-se que 39,6% dos participantes utilizam mais de uma marca de kit e que 22,6% realiza a titulação do conjugado a cada nova kit, e diferentes potências de lâmpadas são utilizadas nos laboratórios com predomínio das de 100 Watts. Em relação à leitura das lâminas, 94,3% afirmam observar os quatro compartimentos celulares, 92,5% afirmam classificar a placa metafásica cromossômica em negativa ou positiva e 32,1% dos participantes não afirmaram observar as células em todas as fases do ciclo celular. Na emissão de laudos, 13,2% dos laboratórios admitiram relatar somente o nome do padrão seguido pelo título, não apresentando o laudo descritivo e 24,5% dos participantes não utilizam programas de educação e controle de qualidade. A maioria dos laboratórios foi capaz de identificar imagens representativas de grupos de padrões. Os resultados aqui apresentados demonstram consistentes avanços a partir da implantação do Consenso de FAN no Brasil, porém, evidenciam também a necessidade de ações para implementação dos programas de educação continuada.
Palavras-chave: Autoimunidade; Doenças autoimunes; FAN; HEp-2; Imunofluorescência.
ABSTRACT
The search for autoantibodies in HEp-2 cells represents a relevant tool for diagnostic assistance in the investigation of autoimmune diseases, especially rheumatic diseases. This methodology, over the last years, underwent by intense process of improvement and standardization with the accomplishment of the Brazilian Consensus. The objective of this study was to evaluate the implantation of recommendations in the clinical laboratories that perform the methodology, 16 years after the accomplishment of the I Brazilian Consensus on ANA in HEp-2 cells. A research was conducted for the laboratories between February and October 2016. The laboratories were invited to answer questions that dealt with the guidelines of the Consensus, addressing technical aspects, quality control, reading of the slides, issuance of reports and educational programs. The study counted on the participation of 53 laboratories that jointly realize an estimate of 300,000 ANA by month. It has been identified that several medical specialties request the examination, and different professionals are responsible for the technical procedure and reading of the fluorescence slides. Consensus recommendations are being followed by all laboratories, in absolute by 58.5% of the laboratories. Regarding the technical procedure, 83.1% of the participants are screening at a 1:80 dilution and the title depletion, recommended by consensus, is being adopted by all participants. It was evidenced that 39.6% of the participants use more than one brand of kit and that 22.6% performs titration of the conjugate to each new kit and different lamp powers are used in laboratories with a predominance of 100 Watts. Regarding the reading of the slides, 94.3% stated that they observed the four cell compartments, 92.5% said to classify the chromosome metaphase plate negative or positive and 32.1% of the participants did not affirm to observe the cells in all phases of the cycle. In the issue of reports, 13.2% of the laboratories admitted to reporting only the name of the standard followed by the title, not presenting the descriptive report and 24.5% of the participants do not use education and quality control programs. Most laboratories were able to identify representative images of sets of patterns. The results presented here demonstrate consistent advances from the implementation of the ANA Consensus in Brazil, but also evidence the need for actions to implement continuing education programs.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Célula de Lúpus Eritematoso (Célula LE)
Figura 2. Linha do tempo. Descoberta das Células LE em 1940, critério para diagnóstico de LES pelo CAR (Colégio Americano de Reumatologia) até 1997. Início da utilização da IFI para pesquisa de autoanticorpos em imprint de fígado de roedores em 1950. Surgimento das Células HEp-2 como substrato para pesquisa de autoanticorpos por IFI em 1980.
Figura 3. Árvore de classificação dos Padrões Nucleares/Nucleolares conforme o V Consenso Brasileiro de FAN, 2016.
Figura 4. Árvore de classificação dos Padrões Citoplasmáticos conforme o V Consenso Brasileiro de FAN, 2016.
Figura 5. Árvore de classificação dos Padrões de Aparelho Mitótico conforme o V Consenso Brasileiro de FAN, 2016.
Figura 6. Árvore de classificação dos Padrões Mistos conforme o V Consenso Brasileiro de FAN, 2016.
Figura 7. Mapa do Brasil. Destaque para os estados dos laboratórios que realizam o teste FAN/Hep-2 participantes no estudo.
Figura 1 - Resumo da Recomendações das cinco edições do Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos em Células HEp-2.
Figura 2 - Distribuição dos laboratórios brasileiros participantes de acordo com a média mensal de testes FAN/HEp-2 estimada, entre fevereiro e outubro de 2016. Figura 3 - Relação entre diluição de triagem e potência da lâmpada do microscópio utilizado para leitura das lâminas de fluorescência nos laboratórios brasileiros participantes. NI: Não souberam informar a potência da lâmpada. W: Watts.
Figura 4 - A: Apresentação de respostas quanto à realização de procedimentos técnicos que influenciam diretamente na qualidade do teste pelos laboratórios brasileiros participantes. B: Apresentação de respostas quanto à utilização de recomendações do Consenso para leitura das lâminas de fluorescência nos laboratórios brasileiros participantes.
Figura 5 A-E. Padrões apresentados aos participantes do estudo para classificação conforme o Consenso Brasileiro. A: Padrão Nuclear Homogêneo. B: Padrão Citoplasmático em Anéis e Bastões AC-23. C: Padrão Aparelho Mitótico do tipo
Centríolo AC-24. D: Padrão Nucleolar Homogêneo AC-8. E: Padrão Nuclear Pontilhado Fino Denso AC-2.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Padrões de Imunofluorescência em imprint de fígado de camundongos, antígenos envolvidos e associações clínicas.
LISTA DE SIGLAS
AC-1 – Padrão Nuclear Homogêneo
AC-2 – Padrão Nuclear Pontilhado Fino Denso AC-4 – Padrão Nuclear Pontilhado Fino
AC-4+Nu – Padrão Nuclear Pontilhado Fino associado à Nucleolar AC-8 – Padrão Nucleolar Homogêneo
AC-8+NP – Padrão Nucleolar Homogêneo associado à Nuclear Pontilhado AC-9 – Padrão Nucleolar Aglomerado
AC-10 – Padrão Nucleolar Pontilhado AC-22 – Padrão Citoplasmático Polar
AC-23 – Padrão Citoplasmático em Anéis e Bastões AC-24 – Padrão de Aparelho Mitótico tipo Centríolo AC-25/26 – Padrão de Aparelho Mitótico tipo NUMA AM – Padrão de Aparelho Mitótico
ANA – Anticorpos Antinúcleo
ANA-IFI – Pesquisa de autoanticorpos por imunofluorescência indireta AR – Artrite reumatoide
CAR – Colégio Americano de Reumatologia CBP – Cirrose biliar primária
Células LE – Células de Lúpus Eritematoso DM/PM – Dermatomiosite/Polimiosite
DMTC – Doença Mista do Tecido Conjuntivo ES – Esclerose Sistêmica
FAN – Fator Antinúcleo
FAN/HEp-2 – Pesquisa de Fator Antinúcleo em Células HEp-2
FM+CP – Padrão Misto Fuso Mitótico associado à Citoplasmático Pontilhado HCV – Vírus da Hepatite C
HEp-2 – American Type Culture Collection CCL-23 HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
ICAP – International Consensus on Antinuclear Antibody Pattern IFI – Imunofluorescência Indireta
LB – Linfócitos B
LT – Linfócito T
NP – Padrão Nuclear Pontilhado
NQH – Padrão Nuclear quasi-homogêneo Nu – Padrão Nucleolar
PAAC – Pesquisa de Anticorpos contra Antígenos Celulares PMC – Placa Metafásica Cromossômica
PMC+ - Placa Metafásica Cromossômica Positiva PMN – Polimorfonucleares
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 16
1.1. A Pesquisa de Autoanticorpos ... 16
1.2. O Consenso Brasileiro Pesquisa de Autoanticorpos em Células HEp-2 . 21 2. JUSTIFICATIVA ... 27 3. OBJETIVOS ... 28 3.1. Objetivos Gerais ... 28 3.2. Objetivos Específicos ... 28 4. METODOLOGIA ... 29 5. PUBLICAÇÃO ... 31 5.1. Artigo ... 31 RESUMO ... 32 ABSTRACT ... 33 INTRODUÇÃO ... 34 OBJETIVOS ... 37 MATERIAIS E MÉTODOS ... 37 RESULTADOS ... 38 DISCUSSÃO ... 45 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 51 6. CONCLUSÕES ... 55 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 56
8. ANEXO A – TEXTO INTRODUTÓRIO ENVIADO PARA CONVITE DOS LABORATÓRIOS ... 60
9. ANEXO B – QUESTIONÁRIO APLICADO AOS LABORATÓRIOS PARTICIPANTES ... 62
10. ANEXO C – NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DO JORNAL BRASILEIRO E PATOLOGIA E MEDICINA LABORATORIAL ... 69
16 1. INTRODUÇÃO
1.1. A Pesquisa de Autoanticorpos
Autoimunidade é um processo patológico gerado pela ativação de Linfócitos T (LT) e Linfócitos B (LB) na ausência de infecção ou causa discernível, este processo ocasionará doença autoimune, caracterizada como uma síndrome clínica originada por defeitos gerais na homeostase ou nos processos de seleção e tolerância dos linfócitos (DAVIDSON; DIAMOND, 2001).
A autoimunidade pode estar envolvida no desenvolvimento de mais de 60 doenças (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2006). Lerner et al., apresenta em seu estudo que aumento dos percentuais anuais para doenças autoimunes reumáticas, endocrinológicas, gastrointestinais e neurológicas foram de 7,1%, 6,3%, 6,2% e 3,7%, respectivamente (LERNER et al., 2015). É estimado que uma em 12 mulheres e um em 20 homens apresentarão uma patologia de natureza autoimune (CROWSON et al., 2011). Se avaliadas em conjunto, as doenças autoimunes podem corresponder à uma prevalência de 3 a 5% na população mundial (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2006). Estão entre as principais doenças reumáticas autoimunes o Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES), a Síndrome de Sjögren (SS), a Esclerose Sistêmica (ES), a Doença Mista do Tecido Conjuntivo (DMTC), a Dermatomiosite/Polimiosite (DM/PM) e a Artrite Reumatoide (AR) (SOLOMON et al., 2002; BRITO et al., 2013).
Inicialmente, o diagnóstico das doenças autoimunes baseava-se simples e exclusivamente na clínica e histórico do paciente, o que dificultava um diagnóstico preciso do quadro patológico apresentado (DELLAVANCE, et al., 2007b). No decorrer dos anos, os testes para diagnóstico das doenças autoimunes sofreram grandes alterações e melhorias (DELLAVANCE; ANDRADE, 2007; DELLAVANCE, et al., 2007b). Inicialmente realizava-se a pesquisa de células do Lúpus Eritematoso (Células LE), um teste altamente complexo e de difícil interpretação, que passou a ser substituída por técnicas para pesquisa de auto-anticorpos específicos (DELLAVANCE; ANDRADE, 2008).
Em 1948, os hematologistas americanos Malcolm Hargraves e Robert Morton visualizaram células que continham material nuclear fagocitado em amostra sanguínea de pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES), e a denominaram
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como célula do Lúpus Eritematoso - Células LE (HEPBURN, 2001; SOLOMON et al., 2002). As células LE são polimorfonucleares (PMN) que visualizados em microscópio ótico apresentam massas homogêneas derivadas de material nuclear fagocitado localizadas no centro do citoplasma e núcleos íntegros do PMN nas laterais (Figura 1). A fagocitose de corpos apoptóticos ocorre por meio da atuação de anticorpos antinucleares que, por sua vez, promovem uma opsonização do antígeno nuclear e consequentemente desencadeiam a fagocitose desempenhada por PMN (SCHMIDT-ACEVEDO et al., 2000).
As células LE podem ser encontradas em vários fluidos corpóreos, como sangue, líquido sinovial, pleural, pericárdio e cefalorraquidiano (ALTIT et al., 2012; CARRILLO-ESPER et al., 2012). Por várias décadas a pesquisa de células LE foi utilizada como método de diagnóstico de LES. Esta pesquisa possui uma alta complexidade e é de difícil interpretação, possuindo baixa sensibilidade e pouca reprodutibilidade (DELLAVANCE; ANDRADE, 2007). O Colégio Americano de Reumatologia - CAR considerou a pesquisa de células LE como um dos critérios para diagnóstico do LES até o ano de 1997 (FELETAR et al., 2003).
Figura 1. Célula de Lúpus Eritematoso (Célula LE)
Células LE: PMN com massas homogêneas derivadas de material nuclear fagocitado localizadas no centro do citoplasma e núcleos íntegros nas laterais. Fonte: PARK et al., 2007
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Em 1949, (HASEHICK; BORTZ, 1949) pesquisadores depositaram o plasma, livre de células, de indivíduos diagnosticados com LES, em células da medula óssea de indivíduos sadios. Verificaram que o material da medula óssea destes indivíduos sadios, passou a apresentar as células LE logo após serem tratadas com o plasma de pacientes com LES. Os pesquisadores sugeriram que havia um fator no plasma dos indivíduos diagnosticados com LES, que desencadeava o aparecimento de células LE No decorrer dos anos, foi descoberto que o fator citado por Hasehick e Bortz em 1949 tratava-se de auto-anticorpos que possuíam afinidade por histonas (HEPBURN, 2001).
Na década de 1950, pesquisadores relataram uma metodologia utilizada na pesquisa de anticorpos, que utilizaria anticorpos anti-imunoglobulina G humana marcados com fluoresceína, que poderiam ser visualizados no microscópio de fluorescência, caracterizando a metodologia e imunofluorescência indireta - IFI (COONS; KAPLAN, 1950). Esta metodologia passou a ser utilizada na pesquisa dos anticorpos antinúcleo (ANA) que são importantes no desenvolvimento das doenças autoimunes. A pesquisa de ANA-IFI foi inicialmente realizada em imprint de fígado de camundongos (DELLAVANCE; ANDRADE, 2007). A pesquisa deixou de ser específica para LES, pois com os cinco padrões de fluorescência apresentados nesta metodologia (Tabela 1), outras doenças autoimunes passaram a ser diagnosticadas (DELLAVANCE, et al., 2007b).
Com o advindo da pesquisa de ANA-IFI, também comumente chamado de pesquisa de FAN (Fator Antinúcleo), houve um aumento na sensibilidade do teste, o que resultou em laudos positivos de ANA-IFI em indivíduos hígidos, ou seja, aqueles não possuem evidência clínica de doença autoimune (DELLAVANCE; ANDRADE, 2008). Em contrapartida, obteve-se uma diminuição na especificidade do teste, e consequentemente melhorias no diagnóstico de LES, assim como, de esclerose sistêmica, síndrome de Sjögren, entre outras (BRITO et al., 2013).
Um dos dados mais importantes encontrados nos testes de ANA-IFI em imprint de fígado de camundongos, é a apresentação de padrões de fluorescência (DELLAVANCE, et al., 2007b). Cinco padrões são apresentados nesta técnica, que mostram a especificidade do auto-anticorpo ao antígeno nuclear (Tabela 1). O padrão pode oferecer indicações prévias sobre quais anticorpos estão envolvidos na reação, necessitando de testes confirmatórios para detecção dos auto-anticorpos
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específicos (DELLAVANCE; ANDRADE, 2008). A pesquisa de autoanticorpos por IFI (Imunofluorescência Indireta) passou a compor os critérios do CAR para classificação e diagnóstico de LES (HOCHBERG, 1997).
Tabela 1. Padrões de Imunofluorescência em imprint de fígado de camundongos, antígenos envolvidos e associações clínicas.
Padrão ANA-IFI Possível antígeno envolvido
Possível associação clínica
Periférico e Homogêneo
DNA nativo LES, LES induzido por drogas, artrite juvenil idiopática, síndrome de Felty, esclerose sistêmica, CBP, hepatite auto-imune.
Homogêneo DNA nativo LES, LES induzido por drogas, artrite juvenil idiopática, síndrome de Felty, esclerose sistêmica, cirrose biliar primária, hepatite auto-imune.
Pontilhado fino A/Ro e/ou SS-B/La
Síndrome de Sjögren, LES, LES neonatal, LES cutâneo, AR, miosite e esclerose sistêmica, polimiosite.
Pontilhado grosso
Sm e/ou RNP LES, DMTC, esclerose sistêmica.
Nucleolar Antígenos nucleolares
Esclerose sistêmica, polimiosite/ES, polimiosite/dermatomiosite.
LES: lúpus eritematoso sistêmico; AR: artrite reumatóide; DMTC: doença mista do tecido conectivo; CBP: cirrose biliar primária.
Fonte: (DELLAVANCE; ANDRADE, 2007).
Por muito tempo utilizou-se como substrato, para a pesquisa de autoanticorpos, hepatócitos de roedores. Em meados de 1980 outra linhagem de célula passou a ser usada como substrato, era então a célula HEp-2 (American Type Culture Collection CCL-23), uma linhagem de células tumorais provenientes de carcinoma de laringe humana (DELLAVANCE, et al., 2007b) que são cultivadas sobre lâminas em monocamadas (DELLAVANCE; ANDRADE, 2008).
Há vários motivos para a utilização de células HEp-2 como substrato para a pesquisa de autoanticorpos, pois apresentam antígenos humanos específicos em maior quantidade, facilitando a identificação de autoanticorpos não identificados em hepatócitos de roedores. Estas células, por serem tumorais, apresentam uma alta velocidade na divisão celular, e, em decorrência deste fator, durante a realização do teste há uma visualização de todas as fases do crescimento celular, como a
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interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase. Células HEp-2 também apresentam uma melhor relação núcleo/citoplasma, assim como melhor definição de nucléolos e citoplasma, o que facilita a leitura da lâmina (DELLAVANCE et al., 2001). O histórico do diagnóstico das doenças autoimunes está exposto na Figura 2.
Figura 2. Linha do tempo. Descoberta das Células LE em 1940, critério para diagnóstico de LES pelo CAR (Colégio Americano de Reumatologia) até 1997. Início da utilização da IFI para pesquisa de autoanticorpos em imprint de fígado de roedores em 1950. Utilização das Células HEp-2 como substrato para pesquisa de autoanticorpos por IFI em 1980.
LES: Lúpus Eritematoso Sistêmico; Células LE: Células do Lúpus Eritematoso; SS: Síndrome de Sjögren; ES: Esclerose Sistêmica; IFI: Imunofluorescência Indireta. Histórico da evolução no diagnóstico das doenças autoimunes.
Com todos esses avanços, a pesquisa de autoanticorpos passou a apresentar maior sensibilidade, porém menor especificidade, sendo possível a visualização de mais de 20 padrões específicos para diferentes autoanticorpos e consequentemente a possibilidade em auxiliar o diagnóstico de outras doenças autoimunes (DELLAVANCE, et al., 2007a). No mês de agosto do ano 2000, pesquisadores de várias capitais brasileiras se reuniram em Goiânia para a formação de um Consenso nacional para a pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2 com o intuito de aprimorar o diagnóstico de doenças autoimunes no Brasil (DELLAVANCE et al., 2001).
21 1.2. O Consenso Brasileiro Pesquisa de Autoanticorpos em Células
HEp-2
O Consenso Brasileiro foram criados em resposta à necessidade de padronizar o teste FAN utilizado na triagem do autoanticorpos contra núcleo, nucléolo, citoplasma, placa metafásica cromossômica e aparelho mitótico, que utiliza células HEp-2 como substrato (DELLAVANCE, et al., 2007b).
O I Consenso partiu inicialmente delegando recomendações sobre diluição de triagem, lâmpadas dos microscópios e principalmente definição de leitura de lâmina (DELLAVANCE et al., 2001). Foi estabelecido um fluxograma que auxiliaria na leitura e definição dos padrões, chamada de árvore de classificação. A árvore de classificação foi aprimorada a cada edição do Consenso. As definições foram distribuídas em padrões nucleares, padrões nucleolares, padrões citoplasmáticos e padrões de aparelho mitótico. Em todos, seria avaliada a positividade ou negatividade de placa metafásica cromossômica (DELLAVANCE et al., 2001).
O II Consenso Brasileiro (2002) foi iniciado com o questionamento em relação ao nome do teste, que deixará de ser chamado de FAN pois em decorrência da grande evolução com células HEp-2, o teste passa a detectar não somente antígenos nucleares, tornando possível a detecção de antígenos nucleolares, citoplasmáticos e de aparelho mitótico, assim como proteínas de centríolo e placa metafásica cromossômica. Foi sugerida a mudança da nomenclatura para Pesquisa de anticorpos contra antígenos celulares (PAAC) e outros similares (DELLAVANCE et al., 2003).
O II Consenso possuiu como objetivos associar diferentes padrões e antígenos celulares e dessa forma estabelecer a relevância clínica de padrões mistos, assim como, relacionar autoanticorpos específicos com os padrões estabelecidos (DELLAVANCE et al., 2003). Este último, também fez parte dos objetivos apresentados no III Consenso, realizado em 2007, mostrando a preocupação com a relevância e associação clínica dos padrões (FRANCESCANTONIO et al., 2009).
Devido à grande evolução do teste, aumento da sensibilidade e melhorias nos achados de autoanticorpos, houve um aumento expressivo no número de casos positivos em pacientes hígidos, que não possuem evidência clínica de autoimunidade (DELLAVANCE, et al., 2007a). Alguns estudos mostram que há uma
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prevalência de 12,6% a 22,6% de testes FAN/HEp-2 positivos em indivíduos sem características de doenças autoimunes (SANTOS et al., 1997; FERNANDEZ et al., 2003; WATANABE et al., 2004; HILÁRIO et al., 2004). Estudos revelam os padrões que ocasionalmente estão relacionados à pacientes sem manifestações clínicas, são eles os padrões Nucleares Pontilhado Fino Denso, Pontilhado Fino e Pontilhado Grosso Reticulado (DELLAVANCE, et al., 2007a; DELLAVANCE; ANDRADE, 2007; DELLAVANCE, et al., 2007b).
É recomendado que a solicitação da pesquisa de autoanticorpos seja realizada somente na presença de sinais e sintomas relacionados à doenças autoimunes (DELLAVANCE, et al., 2007b; FRANCESCANTONIO et al., 2009). O aparecimento de alguns autoanticorpos pode estar relacionado à respostas do sistema imune, assim como infecções por vírus HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana), Epstein Barr, Citomegalovírus e vírus linfotróficos (DELLAVANCE; ANDRADE, 2008; FRANCESCANTONIO et al., 2009) ou podem surgir antes dos sintomas de doenças autoimunes (ARBUCKLE et al., 2003).
O III Consenso apresentou possíveis associações clínicas para cada padrão, melhorando o que já havia sido discutido no II Consenso (FRANCESCANTONIO et al., 2009). O Padrão Nuclear Homogêneo é apresentado na presença dos anticorpos anti-DNA nativo, anti-cromatina que são marcadores de LES (NOTMAN et al., 1975) e anti-histona, marcador de LES de origem idiopática, induzido por drogas e ainda artrite reumatoide (SOUZA et al., 2012). Os anticorpos Anti-Sm, possível marcador de LES e anticorpo Anti-RNP, relacionado à doenças de tecido conjuntivo, LES e esclerose sistêmica são apresentados no padrão Nuclear Pontilhado Grosso (NOTMAN et al., 1975).
O padrão Nuclear Pontilhado Fino está relacionado ao anticorpo Anti-SSA/Ro que, por sua vez, está presente na Síndrome de Sjögren primária, LES e Lúpus neonatal juntamente com o anticorpo Anti-SSB/La, este último, porém, também está relacionado à outras doenças como cirrose biliar primária e esclerose sistêmica (BARCELLOS et al., 2007). Da mesma forma, está presente no LES, o anticorpo Anti-PCNA (Anticorpo contra núcleo de células em proliferação) apresentado pelo padrão Nuclear Pontilhado Pleomórfico (FRANCESCANTONIO et al., 2009).
O III Consenso descreve que o padrão Nucleolar Homogêneo, é apresentado mediante a presença do anticorpo anti-To/Th, que está fortemente relacionado à
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esclerose sistêmica (TARGOFF, 1992). O padrão Citoplasmático Pontilhado Fino, por sua vez, está relacionado à participação de anticorpo Jo1 (Anti-histidil t RNA sintetase), marcador de polimiosite no adulto (TARGOFF, 1992; GHIRARDELLO et al., 2013).
Ainda na ocasião do III Consenso, foram discutidas as metodologias para controle de qualidade a serem aplicadas pelos laboratórios para a realização do FAN/HEp-2. Uma reação de Imunofluorescência Indireta (IFI), depende de vários fatores para uma boa aplicação. Entre esses fatores estão o microscópio, a lâmpada, a concentração do conjugado, os soros controles e a habilidade do observador em identificar os padrões apresentados (DELLAVANCE, et al., 2007b; FRANCESCANTONIO et al., 2009, 2013). Pensando nisso, os membros do Consenso apresentaram medidas a serem tomadas para melhorias no controle da qualidade do teste.
O principal ponto discutido foi a titulação do conjugado, medida que facilita a visualização de padrões, pois o conjugado deverá diluído na concentração ideal para a lâmpada e o microscópio utilizado no laboratório (FRANCESCANTONIO et al., 2009). Também foi recomendado a manutenção de sorotecas de amostras controles com reatividade mínima de fluorescência, para a realização da titulação do conjugado na concentração ideal (FRANCESCANTONIO et al., 2013).
Na ocasião do IV Consenso (2012), foi inserido à árvore de classificação, os padrões Nuclear quasi-homogêneo e padrão Citoplasmático em Anéis e Bastões, além de novas recomendações sobre os processos de controle da qualidade, leitura das lâminas e na formulação e interpretação de laudos (FRANCESCANTONIO et al., 2013).
No mês de Agosto de 2016, em Brasília/DF, foi realizado o V Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos em Células HEp-2 – FAN/HEp-2, que em decorrência do Consenso Internacional de FAN/HEp-2 (International Consensus on ANA Patterns – ICAP), foi necessária uma reestruturação da árvore de classificação dos padrões (Figuras 3, 4, 5 e 6) acrescentando, juntamente com os padrões classificados em ambos consensos, um código definido no ICAP para cada padrão que deverá ser apresentado no laudo. Também foi definido no V Consenso como nomenclatura única para o teste: FAN – Pesquisa de autoanticorpos anti-célula (V CONSENSO, 2016).
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O Consenso Brasileiro foi uma iniciativa pioneira com reconhecimento internacional e que despertou e motivou ações similares de padronização em diferentes países do mundo (DELLAVANCE et al., 2001). Mais recentemente, no ano de 2015, recebeu grande destaque servindo como plataforma para a implementação do ICAP (CHAN et al, 2015), o qual, quando comparado ao Consenso Brasileiro, apresenta correspondência quase que em sua totalidade. Apenas um padrão reconhecido pelo ICAP, AC-28, não é reconhecido pelo Consenso Brasileiro. Para os demais 27 padrões, de AC-1 a AC-27, há a possibilidade de classificação pelo Consenso Brasileiro que ainda reconhece padrões não classificados até o terceiro ICAP.
Figura 3. Árvore de classificação dos Padrões Nucleares/Nucleolares conforme o V Consenso Brasileiro de FAN, 2016.
25 Figura 4. Árvore de classificação dos Padrões Citoplasmáticos conforme o V Consenso Brasileiro de FAN, 2016.
Fonte: (V CONSENSO, 2016)
Figura 5. Árvore de classificação dos Padrões de Aparelho Mitótico conforme o V Consenso Brasileiro de FAN, 2016.
26 Figura 6. Árvore de classificação dos Padrões Mistos conforme o V Consenso Brasileiro de FAN, 2016.
27 2. JUSTIFICATIVA
Diante de cinco edições do Consenso Brasileiro, surgiu a proposta da presente dissertação, iniciada com intuito de avaliar o reconhecimento e aplicação das recomendações do Consenso nos laboratórios clínicos brasileiros
Ter ciência da proporção de implantação das recomendações nos laboratórios clínicos brasileiros, estimar a adesão ás diretrizes e detectar inconformidades ou aspectos a serem trabalhados é de fundamental importância para as ações de planejamento das próximas edições do Consenso Brasileiro.
As ações que contribuem para a padronização do teste de triagem de autoanticorpos - FAN/HEp-2 – beneficiam coletivamente os profissionais de laboratório que realizam o exame, os clínicos que interpretam e consequentemente os pacientes.
28 3. OBJETIVOS
3.1. ObjetivosGerais
Avaliar a implementação das diretrizes do Consenso Brasileiro nos laboratórios clínicos que realizam a pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2.
3.2. Objetivos Específicos
3.2.1. Avaliar a adesão dos laboratórios brasileiros às recomendações do Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2;
3.2.2. Identificar o perfil de formação dos profissionais que realizam o exame e as especialidades médicas que mais solicitam;
3.2.3. Avaliar a adesão às recomendações técnicas do Consenso Brasileiro no âmbito da realização do teste, classificação do padrão e emissão do laudo;
29 4. METODOLOGIA
O trabalho ocorreu em plataforma virtual, por meio do acesso ao site http:www.hep-2.com.br. No site, o laboratório era direcionado ao questionário, disponível em forma online na página do Consenso por todo o período da pesquisa, fevereiro a outubro de 2016. Ao aceitar a participação, o responsável técnico pelo laboratório poderia pausar a resposta quantas vezes fosse necessário, e retomá-la mediante utilização do código de acesso formulado no momento do cadastro. Após o envio e confirmação das respostas o laboratório não teve acesso às respostas confirmadas.
Foi enviado aos laboratórios um convite via e-mail (ANEXO A) para participação da pesquisa, o endereço utilizado para direcionamento dos convites foi [email protected]. Os endereços eletrônicos dos laboratórios convidados foram adquiridos mediante solicitações de auxílio na divulgação da pesquisa à órgãos responsáveis e membros do Consenso Brasileiro. Foi solicitado apoio para divulgação aos Conselhos Regionais e Federal de Biomedicina, Conselhos Regionais de Farmácias e redes de divulgação. O estudo foi divulgado em eventos científicos como o 50o Congresso Brasileiro de Patologia Clínica e Medicina Laboratorial e no XV Congresso Brasileiro de Biomedicina. A pesquisa foi ainda divulgada via web pela REDELAB, Diagnóstico Clínico, S.A., pela Controllab e pelos Conselhos Regionais e Federal de Biomedicina, estes também enviaram convites via e-mail para os laboratórios registrados em seus serviços.
A participação foi voluntária e antes de responder ao questionário o laboratório participante realizou um cadastro no sistema. No momento do cadastro os participantes inseriram informações referentes à localização e e-mail do responsável técnico do laboratório participante. Após o cadastro, foi gerado um código de acesso servindo como identificação dos participantes.
O sistema foi desenvolvido mediante utilização de linguagem HTML5, CSS3, JQuery e PHP 5, em banco de dados MySQL hospedado em servidor com Sistema Operacional Linux e servidor web Apache 2.2. O questionário foi composto por 25 questões direcionadas à realização da técnica, controle de qualidade, leitura de lâminas e composição de laudos (ANEXO B). Permitindo um mapeamento da execução do teste pelos laboratórios habilitados. Foram excluídos aqueles laboratórios que realizam o teste por terceirização.
30
O estudo contou com a participação de 53 laboratórios, destes, um não informou o Estado a qual pertence, os demais eram provenientes de 13 Estados Brasileiros e Distrito Federal. Foram dois da Bahia, 13 de São Paulo, três do Rio de Janeiro, seis do Paraná, nove de Minas Gerais, sete do Rio Grande do Sul, três do Distrito Federal, dois do Pará, dois do Goiás, um do Espírito Santo, um do Ceará, um do Pernambuco, um da Paraíba e um de Santa Catarina (Figura 7).
Para a análise dos dados foi utilizado método simples de porcentagem pela utilização do programa Microsoft® Excel 2016 e GraphPad Software © 2016..
Figura 7: Mapa do Brasil. Destaque para os estados dos laboratórios que realizam o teste FAN/Hep-2 participantes no estudo.
31 5. PUBLICAÇÃO
5.1. Artigo
IMPLANTAÇÃO DAS DIRETRIZES DO CONSENSO BRASILEIRO DE FAN/HEp-2 NOS LABORATÓRIOS CLÍNICOS DO BRASIL.
Autores:
Glaucielen Gomes da SilvaA,B Clayson Moura GomesB Paulo Luiz FrancescantonioB Alessandra DellavanceC
Luís Eduardo Coelho AndradeC,D Wilson de Melo CruvinelB
A
Faculdade dos Carajás, Marabá, PA, Brasil B
Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC Goiás), Goiânia, GO, Brasil C
Setor de Pesquisa e Desenvolvimento, Grupo Fleury D
Disciplina de Reumatologia, Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP, São Paulo, SP, Brasil
Autor para correspondência: Wilson de Melo Cruvinel [email protected]
Pontifícia Universidade Católica de Goiás - Escola de Ciências Médicas, Farmacêuticas e Biomédicas
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RESUMO
A pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2 representa uma relevante ferramenta para auxílio diagnóstico na investigação de doenças autoimunes especialmente as reumáticas. Objetivo: Avaliar, 16 anos após a realização do I Consenso Brasileiro de FAN/HEp-2, a implantação das recomendações nos laboratórios que realizam o ensaio. Metodologia: Preenchimento de formulário em plataforma virtual direcionada aos laboratórios clínicos que realizam a metodologia. Os participantes responderam um questionário sobre a adoção das diretrizes do Consenso Brasileiro detalhando os aspectos técnicos, o controle de qualidade, a leitura de lâminas e a emissão de laudos. Resultados: Participaram do estudo 53 laboratórios responsáveis por mais de 300.000 testes de FAN/mês sendo que mais da metade (58,5%) informaram adotar integralmente as recomendações do Consenso. A maioria (83,1%) utiliza a diluição 1:80 para triagem e 75,5% dos laboratórios utilizam programas de educação e controle de qualidade. Foi identificado no estudo que apenas 39,6% utilizam mais de uma marca de kit para a realização do teste e 32,1% não afirmaram observar todas as fases do ciclo celular na leitura da lâmina. O estudo detectou ainda moderada heterogeneidade entre participantes na identificação de padrões. Conclusão: Os resultados evidenciam a adoção das recomendações do Consenso de forma absoluta pela maioria dos laboratórios participantes, bem como a necessidade de aperfeiçoamento dos laboratórios brasileiros em alguns aspectos o que repercutirá em maior qualidade.
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ABSTRACT
The screening for autoantibodies in HEp-2 cells represents a relevant tool for the diagnosis of autoimmune diseases, especially in systemic autoimmune rheumatic diseases. Along the past 16 years the Brazilian ANA/HEp-2 Consensus Group actively disseminated recommendations for performance and interpretation of the assay, as well as how to report the results. Objective: To evaluate the adherence rate of the recommendations in the clinical laboratories that perform the test.
Methodology: A structured questionnaire form was sent for in a virtual platform to
clinical laboratories that carry out the ANA/HEp-2 test across the country. The participants answered 25 questions referent to the recommendations of the Brazilian Consensus detailing the technical principles, quality control, the strategy for reading of slides and how results are reported. Results: Fifty-three laboratories returned a completely filled form, and these are responsible for over 300,000 ANA/HEp-2 tests a month. Half (58.5%) of these laboratories reported full compliance to the recommendations of the Consensus. Most (83.1%) use a 1:80 dilution for screening and 75.5% of laboratories use education and quality control programs. Only 39.6% used more than one brand of HEp-2 slide in the routine and 32.1% reported not observing all phases of the cell cycle in reading the slide. The study also detected moderate heterogeneity among participants in pattern identification. Conclusion: These results show the adherence to the recommendations by the majority of the participating laboratories, however they also point out the need to improve the Brazilian laboratories in some aspects in order to achieve a higher quality in autoimmunity testing.
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INTRODUÇÃO
As doenças reumáticas autoimunes têm se apresentado relativamente comuns na população geral. Estima-se que aproximadamente uma em 12 mulheres e um em 20 homens desenvolverá uma enfermidade dessa natureza ao longo da vida (1). Nas últimas décadas, em decorrência dos avanços metodológicos, grandes foram as mudanças nas técnicas utilizadas para o diagnóstico das doenças autoimunes (2). A pesquisa de células do Lúpus Eritematoso, desenvolvida por Malcolm Hargraves e Robert Morton em 1948 foi considerada como critério para diagnóstico de Lúpus Eritematoso Sistêmico pelo Colégio Americano de Reumatologia - CAR (American College of Rheumatology) até 1997 (3,4).
Em 1950 foi desenvolvida a técnica de pesquisa de anticorpos por Imunofluorescência Indireta - IFI (5), que passou a ser utilizada para pesquisa de autoanticorpos em imprint de fígado de roedores com apresentação de cinco padrões clássicos de fluorescência (2), usados como auxílio diagnóstico de doenças reumáticas autoimunes (2,6). Tal metodologia foi gradativamente substituída a partir de 1980 pela linhagem de células derivadas de tumor da laringe humana, denominadas células HEp-2 (American Type Culture Collection CCL-23) (2), que possuía algumas vantagens como a apresentação de antígenos humanos específicos e geralmente em alta concentração, expressos nas diferentes fases do ciclo celular (interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase), uma melhor relação núcleo/citoplasma em favor do núcleo, exuberância dos nucléolos e das organelas citoplasmáticas (7).
Com a mudança de substrato, para células HEp-2, foi possível o progressivo reconhecimento de outros padrões de fluorescência, que hoje superam duas dezenas (6), o que despertou a necessidade de treinamento, de padronização dos procedimentos metodológicos e de harmonização da nomenclatura até então muito heterogênea no âmbito nacional e internacional (7,8). Sensível à esta demanda, o Brasil foi pioneiro no processo da padronização de uma nomenclatura para a designação de padrões de fluorescência de autoanticorpos, realizando em agosto do ano 2000, em Goiânia (GO), o I Consenso Brasileiro de FAN, com o intuito de harmonizar a nomenclatura, metodologia e critérios de interpretação do teste, contribuindo assim para aprimorar o diagnóstico de doenças autoimunes no País (7). Alguns anos depois, esta iniciativa serviu de referência para a realização do
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Consenso Mundial de FAN, denominado International Consensus on ANA Patterns - ICAP (8).
O I Consenso foi motivado principalmente pela ausência de parâmetros de leitura da lâmina, pela ausência de organização dos padrões em grupos de classificação e pela inexistência de padronização na nomenclatura dos padrões (7). Várias recomendações foram sugeridas de modo a buscar soluções para tais problemas, conforme demonstrado na Figura 1 (7).
O II Consenso - 2002 (9), contemplou avanços, como a criação do grupo de padrões mistos e a apresentação das principais relevâncias clínicas apresentadas por padrão (9). No III Consenso - 2007, surgiu necessidade para adequações na terminologia dos padrões mistos e padrão nuclear homogêneo e da atualização das relevâncias clínicas, resultando na criação de diretrizes para o controle da qualidade do ensaio. Foram ainda apresentadas proposições de realização de estudos para incorporação de novos padrões (10).
Em setembro de 2012 foi realizado o IV Consenso, que disponibilizou para a comunidade científica 10 novas recomendações relacionadas à caracterização de padrões, procedimento técnico, controle de qualidade, utilização de métodos alternativos e organização do laudo (11). Em 2016, sob influência do Consenso Internacional de Padrões de FAN (International Consensus on Ana Patterns - ICAP), foi realizado o V Consenso com o propósito de harmonizar as diretrizes do Consenso Brasileiro com as Recomendações Internacionais (8,12). Na Figura 1 estão resumidas as principais recomendações do Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2que deliberou diversas recomendações que contemplam desde os aspectos técnicos da realização do ensaio, o controle de qualidade, a emissão dos laudos, a interpretação dos resultados e as relevâncias clínicas dos diversos padrões (7,9–12).
Ao longo dos anos, observamos, embora de forma não sistemática, que as recomendações do Consenso vinham sendo assimiladas por diversos laboratórios clínicos e até mesmo pelos clínicos envolvidos na lida dos pacientes com enfermidades associadas aos anticorpos antinúcleo. No entanto, não havia uma análise sistematizada e objetiva do grau de aderência dos laboratórios às recomendações do Consenso e muito menos do seu impacto.
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RECOMENDAÇÕES / REFERÊNCIA
I CONSENSO (2000) Goiânia-GO
- Diluição de 1/40 com microscópios de menor poder de resolução; - Diluição de 1/160 como critério de diagnóstico clínico;
- Definição de título do ensaio: última diluição com fluorescência discernível; - Critérios para leitura da lâmina: Observação do nucleoplasma na interfase, aspecto da célula nas diversas fases da mitose: prófase, metáfase, anáfase e telófase, observação do nucléolo e do citoplasma;
- Divisão dos padrões em subgrupos: nucleares, nucleolares, citoplasmáticos e de aparelho mitótico.
(7)
II CONSENSO (2002) Goiânia-GO
- Novas recomendações para o teste; - Implantação dos laudos descritivos;
- Padrões citoplasmáticos considerados positivos; - Criação do grupo de Padrões Mistos;
- Apresentação das principais relevâncias clínicas.
(9)
III CONSENSO (2007) Goiânia-GO
- Adequação do laudo descritivo do padrão Nuclear Homogêneo; - Adequação da classificação dos Padrões Mistos;
- Nota de orientação para padrões não caracterizados ou com características novas;
- Orientação sobre programas de controle de qualidade; - Orientação sobre programas educativos;
- Recomendação da titulação do conjugado para ajuste do sistema de leitura. (10)
IV CONSENSO (2012) Vitória-ES
- Inclusão do padrão citoplasmáticos anéis e bastões; - Inclusão do padrão nuclear quasi-homogêneo; - Inclusão do padrão misto CENP-F;
- Nota sobre a identificação do Padrão Misto do tipo anti-DNA topoisomerase; - Recomendação de diluição para triagem em 1/80 e esgotamento do soro até, pelo menos, 1/640 podendo ser liberado como > 640;
- Alerta quanto a reprodutibilidade dos diversos padrões nas diferentes marcas comerciais;
- Alerta quanto a utilização de metodologias alternativas à Imunofluorescência indireta e quanto a escolha dos métodos de detecção de autoanticorpos específicos
- Sugestão de que as informações “Padrão” e “Título”, no corpo do laudo, sejam apresentadas como primeira informação.
(11)
V CONSENSO (2016) Brasília-DF
- Recomendação de definição única para o nome do ensaio: FAN-Pesquisa de autoanticorpos anticélula;
- Recomendação da adoção das diretrizes internacionais (International
Consensus on Ana Patterns - ICAP);
- Apresentação no laudo, sempre que disponível, do código correspondente à classificação internacional do padrão.
(12) Figura 1 - Resumo da Recomendações das cinco edições do Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos em Células HEp-2.
37
OBJETIVOS
Após 16 anos da realização do processo de padronização nacional, o presente estudo teve como objetivo avaliar o grau de aderência às diretrizes do Consenso Brasileiro pelos laboratórios clínicos brasileiros. Tais informações possibilitarão a realização de ações proativas que ampliem a aderência das diretrizes nacionais nos serviços de patologia clínica brasileiros permitindo também aos laboratórios aprimorar ações no nível técnico.
MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo consistiu em uma pesquisa em formulário direcionada à responsáveis técnicos dos laboratórios clínicos que realizam a avaliação de autoanticorpos em células HEp-2. Foi elaborada uma plataforma virtual, hospedada no site oficial do Consenso Brasileiro (www.hep-2.com.br), que dava acesso ao questionário online. Os laboratórios foram convidados a participarem da pesquisa via e-mail, os endereços eletrônicos foram adquiridos mediante pedidos de auxílio na divulgação da pesquisa à órgãos responsáveis e membros do Consenso Brasileiro.
O estudo foi divulgado em eventos científicos como o 50o Congresso Brasileiro de Patologia Clínica e Medicina Laboratorial e no XV Congresso Brasileiro de Biomedicina. A pesquisa foi ainda divulgada via web pela REDELAB, Diagnóstico Clínico, S.A., pela Controllab e pelos Conselhos Regionais e Federal de Biomedicina. A participação foi voluntária sendo permitidas as respostas de somente um técnico por laboratório cadastrado, sendo que o profissional foi identificado nos formulários da pesquisa.
O sistema de pesquisa foi desenvolvido utilizando as linguagens HTML5, CSS3, JQuery e PHP 5, banco de dados MySQL, hospedado em servidor com
Sistema Operacional Linux e servidor web Apache 2.2. O questionário foi composto
por 25 questões direcionadas à realização da técnica, ao controle de qualidade, ao procedimento de leitura das lâminas e à redação dos laudos. Foram excluídos aqueles laboratórios que realizam o teste por terceirização.
Foi realizada a análise descritiva dos resultados, bem como a elaboração de tabelas e gráficos, utilizando-se os programas Microsoft® Excel 2016 e GraphPad Software © 2016.
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RESULTADOS
Participaram do estudo 53 laboratórios, provenientes de 12 Estados Brasileiros e Distrito Federal (apenas um laboratório não informou o Estado de procedência). Foram dois da Bahia, 13 de São Paulo, três do Rio de Janeiro, seis do Paraná, nove de Minas Gerais, sete do Rio Grande do Sul, três do Distrito Federal, dois do Pará, dois de Goiás, um do Espírito Santo, um do Ceará, um de Pernambuco, um da Paraíba e um de Santa Catarina.
Os participantes foram divididos em seis grupos de acordo com a média mensal de testes de FAN/HEp-2 declarada no formulário: 1) G0:laboratórios que não informaram uma média de exames realizados por mês (n=2 3,8%); 2) G1: laboratórios que realizam até 99/mês (n=5, 9,4%); 3) G2: laboratórios realizam entre 100 e 499 testes/mês (n=23 43,4%); 4) G3: laboratórios que realizam entre 500 e 1.000 testes/mês (n=3 5,7%); 5) G4: laboratórios que informaram média entre 1.000 e 9.999 testes/mês (n=14 26,4%); 6) G5: ( laboratórios que estimaram rotina média maior que 10.000 testes/mês (n=6 11,3%). Baseado nas informações dos 53 laboratórios participantes é possível estimar que os mesmos são responsáveis por mais de 300.000 testes FAN/HEp-2 mensais (Figura 2).
Os laboratórios foram questionados quanto às especialidades médicas que mais solicitam a pesquisa de FAN/HEp-2, além da Reumatologia. Foram informados como solicitantes a Clínica Médica (20,1%), Dermatologia (13,4%). Ginecologia (9,4%), Endocrinologia (7,4%), Gastrenterologia (6,0%), Infectologia (5,4%), Hematologia (5,4%) e Ortopedia (5,4%), Cardiologia (4,7%), Neurologia (4,0%),
39
Pediatria (4,0%), Nefrologia (3,4%), Oftalmologia (3,4%), Oncologia (2,0%), Hepatologia (1,3%), Obstetrícia (1,3%), Pneumologia (1,3%), Geriatria (0,7%), Imunologia (0,7%) e Otorrinolaringologia (0,7%).
Com relação à utilização das recomendações do Consenso, 31 (58,5%) laboratórios afirmaram utilizar integralmente todas as recomendações, destes, 38,7% compõe o grupo G2 e 32,2% estão no grupo G4. Os demais laboratórios (41,5%) afirmaram utilizar as recomendações de forma parcial, e destes, a metade, encontra-se no grupo G2. Outros 5 laboratórios que compões oG5 afirmaram utilizar as recomendações em sua totalidade.
Quanto à formação acadêmica do profissional responsável pela leitura das lâminas, os participantes relataram diferentes formações. Profissionais bioquímicos/farmacêuticos foram os mais citados, correspondendo a 38,4%, seguidos por biomédicos e biólogos, 22,2% e 17,2%, respectivamente. Outros profissionais foram citados, incluindo o médico patologista (8,6%), médico reumatologista (6,2%) e profissional de nível técnico (7,4%).
Quanto à terminologia utilizada para o ensaio diante das seis opções apresentadas no III Consenso26,4% dos laboratórios relatou adotar a opção FAN-HEp2 e 22,6% informou utilizar Pesquisa de autoanticorpos contra antígenos celulares – FAN outros 20,8% utilizam FAN – Pesquisa de autoanticorpo, 7,6% informou FAN – Pesquisa de anticorpos contra componentes do núcleo, nucléolo, citoplasma e aparelho mitótico e 20,8% optou por FAN – Fator Antinúcleo. Um participante (1,8%) não informou a respeito da nomenclatura utilizada.
Questionados sobre a diluição de triagem, 83,1% dos laboratórios afirmaram realizar a diluição 1:80, sendo que sete serviços (13,3%) relataram utilizar a diluição 1:160 e um único laboratório (1,8%) afirmou utilizar 1:40. Quando questionados quanto à potência da lâmpada utilizada, 33 (62,3%)laboratórios participantes, afirmaram utilizar lâmpada de 100 Watts de potência. Os demais participantes relataram utilizar lâmpadas de 20 Watts (3,8%), 30 Watts (1,8%), 50 Watts (5,7%), 120 Watts (1,8%) e 200 Watts (3,8%) e outros 11 laboratórios (20,8%) não souberam informar.
No presente estudo, realizamos uma análise entre a diluição de triagem realizada e a lâmpada de fluorescência utilizada, apresentada na Figura 3, sendo
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que, 27 (51,0%) laboratórios utilizam lâmpada de 100 Watts com diluição de triagem 1:80.
Em relação à diluição para esgotamento de título das amostras positivas, 25 (47,3%) laboratórios dos laboratórios participantes afirmaram diluir as amostras positivas até 1:640, sendo, nestes casos, o teste liberado como título ≥640. Para 18,8% dos laboratórios a diluição máxima realizada é de 1:1280 e 17,0% informaram realizar a diluição máxima em 1:2560, sendo o resultado liberado como ≥1280 e ≥2560, respectivamente. Oito participantes (15,1%) afirmaram que o soro é diluído até o último título com fluorescência discernível. Um participante (1,8%) não respondeu quanto às diluições de triagem e de esgotamento de título utilizadas.
Os participantes responderam questões relacionadas aos procedimentos técnicos como a titulação do conjugado, disponibilidade de mais de uma marca de kit, manutenção de soroteca para avaliação da capacidade do kit em discriminar diferentes diluições e padrões e sobre a utilização de soro controle com fluorescência mínima. Os resultados deste tópico estão apresentados na Figura 4A.
Questionados sobre a leitura de lâminas com objetiva de 40X, 100X ou ambas, os resultados demonstram que41 (77,4%) laboratórios realizam a leitura das
41
lâminas utilizando somente a objetiva de 40X, enquanto que 3 (5,7%) utilizam somente objetiva de 100X e 8 (15,1%) realizam a leitura com ambas. Um participante (1,8%) não informou a objetiva utilizada na leitura das lâminas.
Considerando-se as perguntas sobre os critérios de leitura da lâmina, resultados apresentados na Figura 4B, 50 (94,3%) participantes relataram observar a fluorescência nos diferentes compartimentos celulares (núcleo, nucléolo, citoplasma e aparelho mitótico). Um total de 36 (67,9%) laboratórios afirmaram observar as células em todas as fases do desenvolvimento (interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase) e 49 (92,5%) informaram classificar a placa metafásica cromossômica (PMC) em positiva ou negativa
Os laboratórios também foram questionados sobre a elaboração dos laudos,43 (81,1%) laboratórios afirmaram que, ao redigir o laudo, relata o padrão seguido pelo título e classificação da positividade dos compartimentos celulares, enquanto que 7 (13,2%) participantes afirmaram relatar somente o nome do padrão e título. Outros três laboratórios (5,7%) não informaram. Foi ainda identificado que 67,9% consideram os padrões citoplasmáticos como teste positivo. Em casos de padrões mistos, somente 75,5% dão o título máximo apresentado em cada um dos compartimentos celulares.
Na elaboração dos laudos, 10 (18,9%) laboratórios afirmaram fornecer informações sobre os possíveis autoanticorpos associados ao padrão apresentado e possíveis quadros clínicos compatíveis com os achados.
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Quando questionados sobre a utilização de programas educativos e de controle de qualidade, 75,5% (n=40) afirmaram utilizá-los, enquanto que 24,5% (n=13) não utilizam programas de controle de qualidade ou educativos.
Conforme pode ser observado na Figura 5 A-E, foram solicitados aos laboratórios participantes a análise de cinco figuras provenientes de cinco padrões, sendo Nuclear Homogêneo (AC-1), Citoplasmático em Anéis e Bastões - Rings and Rods 23), Aparelho Mitótico tipo Centríolo 24), Nucleolar Homogêneo (AC-8) e Nuclear Pontilhado Fino Denso (AC-2).
A primeira imagem, com padrão AC-1, obteve respostas corretas por 49 (92,5%) participantes, um laboratório (1,8%) classificou como padrão Nuclear quasi-homogêneo (NQH), e outro como padrão Nuclear Pontilhado Fino (AC-4). Outros dois não responderam.
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A segunda imagem exibiu o padrão AC-23.que foi citado por 47 (88,6%) laboratórios. Outros 3 (5,7%) participantes consideraram o padrão como negativo, um deles informou que o kit utilizado na rotina de seu laboratório não identifica este padrão. Um laboratório (1,8%) classificou como padrão Citoplasmático Polar (AC-22) e dois não responderam.
O padrão AC-24 apresentado na terceira imagem, foi citado por 46 (87,1%) participantes, um laboratório (1,8%) avaliou como padrão Numa (AC-25/26), outro (1,8%) considerou negativo e um (1,8%) sugeriu padrão Misto Fuso Mitótico + Citoplasmático Pontilhado (FM+CP). Um laboratório (1,8%) classificou somente como padrão do Aparelho Mitótico e outros três não responderam.
A quarta imagem apresentava o padrão AC-8, citado por 31 (58,4%) laboratórios, 17 (32,0%) informaram padrão Nucleolar (Nu) e o padrão misto Nuclear Pontilhado Fino associado à Nucleolar foi citado por dois laboratórios e padrão misto AC-8+Nuclear Pontilhado (NP) apontado por um participante. Outros dois não informaram.
A imagem cinco apresentava o padrão AC-2, onde 37 (69,8%) participantes classificaram como tal. Outros sete participantes (13,1%) sugeriram padrão NQH. Dois (3,9%) sugeriram os padrões AC-4 e outros dois sugeriram o padrão AC-1. Um participante definiu como padrão misto AC-1+AC-4. Quatro participantes não responderam.
45 Figura 5 A-E. Padrões apresentados aos participantes do estudo para classificação conforme o Consenso Brasileiro. A - Padrão Nuclear Homogêneo. B- Padrão Citoplasmático em Anéis e Bastões AC-23. C- Padrão Aparelho Mitótico do tipo Centríolo AC-24. D- Padrão Nucleolar Homogêneo AC-8. E- Padrão Nuclear Pontilhado Fino Denso AC-2.
A) AC-1: Nuclear Homogêneo;; AC-4: Nuclear Pontilhado Fino; NQH: Nuclear quasi-homogêneo; NI: Não Informou.
B) AC-23: Citoplasmático em Anéis e Bastões; AC-22: Citoplasmático Polar; NEG: Resultados Negativos; NI: Não Informou.
C) AC-24: Aparelho Mitótico tipo Centríolo; AC-25/26: Fuso mitótico tipo NUMA; AM: Aparelho Mitótico; FM+CP: Misto Fuso Mitótico + Citoplasmático Pontilhado;; NEG: Resultados Negativos; NI: Não Informou.
D) Nu: Nucleolar; AC-8: Nucleolar Homogêneo; AC-8+NP: Misto Nucleolar Homogêneo + Nuclear Pontilhado; AC-4+Nu: Nuclear Pontilhado Fino + Nucleolar;; NI: Não Informou. E) AC-2: Nuclear Pontilhado Fino Denso; NQH: Nuclear quasi-homogêneo; AC-4: Nuclear Pontilhado Fino; AC-1: Nuclear Homogêneo;; AC-1+AC-4: Misto Nuclear Homogêneo + Nuclear Pontilhado Fino Denso; NI: Não Informou.
DISCUSSÃO
Participaram do presente estudo 53 laboratórios provenientes de 12 estados brasileiros e distrito federal, que em conjunto, realizam uma média de 300.000 testes/mês. As melhorias metodológicas no teste de FAN em células HEp-2 induziram um aumento na sensibilidade e consequente diminuição da especificidade do teste, o que se evidencia na proporção encontrada de resultados positivos em indivíduos sem enfermidade aparente, definida como Síndrome do Anticorpo Antinúcleo Idiopático (6,10,15). A grande diversidade de especialidades dos médicos que solicitam o exame, como demonstrado em nossos resultados, favorece ainda mais a geração desses falso-positivos, contrapondo-se à recomendação de que a solicitação de teste seja realizada somente na presença de evidência clínicas convincentes de autoimunidade sistêmica (10,11). Em estudos com indivíduos hígidos (597 trabalhadores no Japão e 500 doadores de sangue em São Paulo), obteve-se uma frequência de autoanticorpos de 20,0% e 22,6% respectivamente (17,18), o que reforça a necessidade de cautela na solicitação do exame por parte da comunidade médica. Pois, a pesquisa de anticorpos em células HEp-2 é um teste com demanda crescente, com avanços significativos sob o ponto de vista
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metodológico, mas com melhorias que podem ser implementadas pelos laboratórios clínicos brasileiros.
Quase 60% dos participantes do estudo afirmou utilizar integralmente as recomendações do Consenso Brasileiro, demonstrando que uma proporção significativa dos testes é realizada conforme as diretrizes do Consenso.
O Consenso Brasileiro tem cumprido seu papel educativo e fomentando, ao longo de 5 edições a elaboração de vasto material didático na forma de atlas físicos, digitais e website (7, 9-12). No presente estudo, evidenciou-se que diferentes categorias profissionais realizam o ensaio, reforçando a necessidade de discussão desses conteúdos no âmbito dos diferentes cursos de graduação que atuam tecnicamente na Patologia Clínica e Medicina Laboratorial.
Foi evidenciado no presente estudo que não há Consenso em relação à definição adotada para nominar o ensaio o que motivou o estabelecimento pelo V Consenso de terminologia única para o teste a ser adotada por todos serviços que realizam o exame, ficando definida como nomenclatura única: FAN – Pesquisa de Autoanticorpos Anticélula (12).
Outro aspecto abordado foram as diluições de triagem que podem influenciar diretamente os resultados em falso-positivos ou falso-negativos (10,13,19), servindo como ponto de corte para resultados positivos e negativos, sabendo que uma baixa diluição pode resultar em aumento de falso-positivos, assim como uma alta diluição resultará em falsos-negativos (19). O IV Consenso recomendou a diluição de 1:80 como diluição de triagem (11). Em nossa pesquisa, 83,1% dos laboratórios afirmaram seguir essa recomendação e 13,3% realizam a triagem com diluição em 1:160. A diluição de triagem possui grande valor na definição de resultados, pois um em três indivíduos hígidos terão FAN positivo se realizada triagem em diluição 1:40, porém a positividade será de um em 20 se realizada a diluição de 1:160 (20). Da mesma forma, ainda que seja utilizada a diluição de 1:80, a positividade do FAN pode ser de 12,9% em pacientes hígidos (16). Brito, et al. afirmaram que a diluição de triagem ideal é 1:160, pois a mesma produziu uma redução de 53,0% no número de resultados falso-positivos (19). Pacientes hígidos tendem a apresentar título baixos e pacientes que possuem autoimunidade apresentam títulos de moderado à elevado (16). É sabido que na diluição 1:80 os resultados considerados como importantes são aqueles com título superior a 160 (11,16,21). É sugerido que
