Emprego de tecnologias emergentes no processamento de suco de laranja adicionado de frutooligossacarídeos e suco de laranja produzido via síntese enzimática

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EMPREGO DE TECNOLOGIAS EMERGENTES NO PROCESSAMENTO DE SUCO DE LARANJA ADICIONADO DE FRUTO-OLIGOSSACARÍDEOS E SUCO

PREBIÓTICO DE LARANJA PRODUZIDO VIA SÍNTESE ENZIMÁTICA

FRANCISCA DIVA LIMA ALMEIDA

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Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-graduação em Biotecnologia - Renorbio, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Biotecnologia.

Área de concentração: Biotecnologia Industrial

Ponto focal: Universidade Federal do Ceará (UFC)

Orientadora: Profª Drª Sueli Rodrigues.

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências e Tecnologia

A446e Almeida, Francisca Diva Lima.

Emprego de tecnologias emergentes no processamento de suco de laranja adicionado de fruto-oligossacarídeos e suco prebiótico de laranja produzido via síntese enzimática./ Francisca Diva Lima Almeida. – 2015.

108 f. : il. color.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (Rede Nordeste de Biotecnologia), Fortaleza, 2015.

Área de Concentração: Biotecnologia Industrial. Orientação: Profa. Dra. Sueli Rodrigues.

1. Suco de laranja. 2. Oligossacarídeos. 3. Bioteconologia. I. Título.

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Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-graduação em Biotecnologia - Renorbio, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Biotecnologia.

Aprovada em: 30/10/2015

BANCA EXAMINADORA

______________________________ Profa_{. Dr. Sueli Rodrigues (Orientadora)}

Universidade Federal do Ceará (UFC)

______________________________ Profa. Dr. Ana Lúcia Fernandes Pereira

Universidade Federal do Maranhão (UFMA) - Membro

______________________________ Profa. Dr. Luciana Rocha Barros Gonçalves Universidade Federal do Ceará (UFC) - Membro

______________________________ Dr. Edy Sousa de Brito

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)

______________________________ Dr. Elenilson de Godoy Alves Filho

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Dedico este trabalho,

ao meu anjinho particular, Heitor (in memoriam),

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caminhada. Por me conduzir sempre nos melhores caminhos, por colocar pessoas tão bondosas e cheias de luz em meu caminho.

Aos meus pais, José Eudes de Almeida e Maria de Fátima Lima Almeida, por todo amor e carinho de sempre. Por confiarem e acreditarem nas minhas escolhas. Por sempre me darem forças, pelas inúmeras vezes que me ligaram perguntando: “Como está o doutorado? E o artigo?”. Pelas orações da minha mãe, por todo cuidado e zelo. Amo vocês e, é por vocês todo o meu esforço.

À minha orientadora, Profa. Dra. Sueli Rodrigues, que me acolheu de braços abertos desde o mestrado. Obrigada pelos inúmeros ensinamentos, por todas as oportunidades, por estar sempre à disposição, por acreditar em mim, por cada ajuda e puxão de orelha. Obrigada por ser esse exemplo de profissional.

Ao Leonardo Primo, presente de Deus na minha vida. Obrigada por toda paciência durante esses anos que me acompanhou durante o doutorado. Obrigada por toda ajuda, toda torcida, por todo amor, por me fazer confiar que no final tudo daria certo. Obrigada pelo companheirismo, mesmo durante o período em que estávamos afastados fisicamente.

À Rosane, minha dupla inseparável do doutorado e da vida. Obrigada pelos agradáveis momentos que compartilhamos juntas, sorrimos juntas, choramos juntas.

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Aos amigos queridos e companheiros de laboratório e sala do DIT: Richam, Lubna, Sonal, Lu, Carmem, Shashi, NN, por toda ajuda, ensinamentos, momentos de alegrias, por me acolherem tão bem na “Ilha de Esmeralda”.

Aos amigos do LABIOTEC: Niédila, Cristiane, Cláudia, Jonas, Elenylson, Imilena, Soraya, Simone, Mariana, Nair, Lívia, às Thatis Nunes, Vidal e Cavalcante, por todo carinho, em especial ao Wesley, por todo carinho e amizade e, também, por toda ajuda na finalização deste trabalho.

Às minhas queridas irmãs, Virgínia, Clarissa e Cristiane por todo carinho e força, por sempre torcerem por mim.

Aos meus queridos “Bioamigos”, em especial, Karine Pires, André Leandro, Milena Esmeraldo, Eduardo Neves, Luís Neto, Anderson Weyne, Camila Salviano, pelos momentos prazerosos que compartilhamos durante o período de doutorado.

Aos doutores Edy Brito e Elenilson Godoy e às professoras doutoras Ana Lúcia Fernandes e Luciana Gonçalves por, gentilmente, aceitarem o convite para participar da banca examinadora.

Aos meus tios Regina e Alfredo por me acolherem durante quase todo o período do doutorado. Obrigada por todo carinho.

À CAPES peça concessão da bolsa de estudos e ao CNPQ pelo financiamento do meu projeto de pesquisa.

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processamento de suco de laranja adicionado de fruto-oligossacarídeos e suco prebiótico de laranja produzido via síntese enzimática. 2015. Tese – Programa de Pós-graduação em Biotecnologia - Renorbio. Universidade Federal do Ceará, Fortaleza.

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processamento de suco de laranja adicionado de fruto-oligossacarídeos e suco prebiótico de laranja produzido via síntese enzimática. 2015. Tese – Programa de Pós-graduação em Biotecnologia - Renorbio. Universidade Federal do Ceará, Fortaleza.

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a prebiotic food. The other parameters analyzed were preserved. Thus, atmospheric cold plasma and ozone are suitable non-thermal alternatives for prebiotic orange juice treatment.

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Figura 1 - Representação da reação do aceptor ... 27 Figura 2 - Esquema de montagem experimental para sistema de plasma frio. ... 36 Figura 3 - Sistema esquemático de tratamento de ozônio. ... 38

CAPÍTULO 2

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Table 1 - Color parameters of the orange juice after direct exposure by plasma ... 64

Table 2 - Color parameters of the orange juice after indirect exposure by plasma.. ... 65

Table 3 - Color parameters of the orange juice treated by HPP.. ... 66

Table 4 - pH values in prebiotic orange juice after high pressure processing ... 67

Table 5 - pH values in prebiotic orange juice after plasma treatment. ... 67

CAPÍTULO 3 Table 1 – pH values in prebiotic orange juice after ozone processing. ... 88

Table 2 – pH values in prebiotic orange juice after plasma treatment ... 89

Table 3 _– Oligosaccharide concentration and loss after non-thermal treatment ... 94

Table 4 – Color parameters of the prebiotic orange juice after ozone processing.. ... 96

Table 5 – Color parameters of the prebiotic orange juice after plasma treatment ... 97

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– –

DPPH 2,2 – difenil1 – picrilhidrazil FOS Fruto-oligossacarídeos TLC Thin Layer Chromatography

HPLC High Performance Liquid Chromatography DP Degree of Polymerization

ACP Atmospheric Cold Plasma DBD Descarga de barreira dielétrica LAB Lactic acid bacteria

GS Glucansucrases FS Fructansucrases

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INTRODUÇÃO ... 17

CAPÍTULO 1: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 20

1.1 Alimentos funcionais: uma visão geral ... 20

1.2 Oligossacarídeos prebióticos ... 22

1.2.1 Oligossacarídeos prebióticos produzidos via síntese enzimática ... 25

1.3 Sucos de frutas como veículo de ingredientes funcionais. ... 27

1.3.1 Suco de laranja como um alimento funcional ... 28

1.4 Métodos de processamentos de alimentos: convencionais X tecnologias emergentes ... 31

1.4.1 Tecnologia de plasma na conservação de alimentos ... 34

1.4.2 Emprego do ozônio ... 37

1.4.3 Altas Pressões ... 39

REFERÊNCIAS ... 41

CHAPTER 2 - EFFECT OF ATMOSPHERIC COLD PLASMA AND HIGH PRESSURE PROCESSING ON FRUCTO-OLIGOSACCHARIDES, ORGANIC ACIDS AND ORANGE JUICE COLOR ... 50

2.1 Introduction ... 51

2.2 Materials and Methods ... 53

2.2.1 Prebiotic orange juice preparation ... 53

2.2.2 Plasma Treatment ... 53

2.2.3 High pressure processing ... 54

2.2.4 Carbohydrate analysis ... 55

2.2.4.1 Fructo-oligosaccharides degree of polymerization characterization ... 55

2.2.5 Color measurement ... 56

2.2.6 Organic acid quantification ... 57

2.2.7 Statistical analysis ... 57

2.3. Results and Discussion ... 58

2.3.1 Fructo-oligosaccharides quantification by TLC ... 58

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REFERENCES ... 72

CAPÍTULO 3: EFFECTS OF ATMOSPHERIC COLD PLASMA AND OZONE ON PREBIOTIC ORANGE JUICE ... 75

3.1. Introduction ... 76

3.2. Materials and methods ... 78

3.2.1 Orange juice ... 78

3.2.2 Dextransucrase production and enzyme activity determination ... 78

3.2.3 Prebiotic oligosaccharides synthesis in orange juice ... 79

3.2.4 Plasma treatment on prebiotic orange juice ... 79

3.2.5 Ozone treatment on prebiotic orange juice ... 81

3.2.6 Carbohydrate analysis ... 82

3.2.6.1 Oligosaccharides degree of polymerization ... 82

3.2.6.2 Sugars and oligosaccharides quantification ... 83

3.2.7 Color analysis ... 84

3.2.8 Total phenolic content ... 85

3.2.9 Antioxidant activity determination ... 85

3.2.9.1 DPPH method ... 86

3.2.9.2 ABTS method ... 86

3.2.10 Statistical analysis ... 87

3.3 Results and discussions ... 87

3.3.1 Orange juice characterization ... 87

3.3.2 Effect of plasma and ozone on the juice pH ... 88

3.3.3 Oligosaccharides characterization after plasma and ozone treatments... 89

3.3.4 Oligosaccharides quantification by HPLC after plasma and ozone treatments. ... 91

3.3.5 Color analysis ... 96

3.3.6 Total phenolic content ... 99

3.3.7 Total antioxidant activity ... 100

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INTRODUÇÃO

Um número crescente de consumidores está, cada vez mais, consciente da importância dos alimentos funcionais devido aos benefícios adicionais de saúde que estes oferecem. Diante disso, os alimentos funcionais, sendo uma das principais categorias de alimentos do mercado de saúde e bem-estar global, estão se tornando um grande foco de desenvolvimento de novos produtos na indústria de alimentos.

Dentro da categoria de alimentos funcionais, os prebióticos vêm ganhando um destaque especial. Eles são ingredientes alimentares seletivamente fermentados que permitem mudanças específicas, tanto na composição quanto na atividade da microbiota gastrintestinal, conferindo benefícios de saúde e bem-estar ao hospedeiro.

Atualmente, a grande maioria dos alimentos contendo oligossacarídeos são produtos à base de leite. Contudo, a produção de alimentos prebióticos não lácteos é uma opção interessante e bastante promissora para a produção desse tipo de alimento a baixo custo e em escala industrial.

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Dessa forma, o desenvolvimento de alimentos funcionais vem estimulando a inovação e o desenvolvimento de novos produtos na indústria de alimentos. Entretanto a estabilização microbiológica do mesmo sem o uso de conservantes e processamento térmico representa um desafio. Os desenvolvimentos na área de processamento de alimentos são, geralmente, conduzidos de forma a combinar a inovação tecnológica com os hábitos sociais e culturais, a fim de produzir alimentos que satisfaçam as necessidades nutricionais, pessoais e sociais de todas as comunidades.

Diante disso, a tecnologia de plasma representa uma alternativa potencial aos métodos tradicionais de processamento não térmico de alimentos. Enquadra-se, ainda, entre as tecnologias avançadas não térmicas como uma abordagem alternativa para a eliminação de micro-organismos deteriorantes e patógenos. Este processo apresenta numerosas vantagens sobre os métodos convencionais, como: processo operacional de baixo custo, tempo de tratamento curto a baixas temperaturas, natureza não tóxica e aplicação para uma grande variedade de produtos (Ziuzina et al. 2013).

A aplicação da tecnologia de alta pressão (HPP), em alimentos, resulta em produtos com qualidade sensorial superior quando comparados com produtos submetidos a processamento térmico (Patras et al. 2009). O processamento utilizando altas pressões é capaz, ainda, de ativar e inibir micro-organismos, ativar e inativar enzimas a baixas temperaturas, enquanto que os compostos de baixo peso molecular, tais como vitaminas e compostos relacionado com a pigmentação e aroma, permanecem inalterados (Carnonell-Capella et al. 2013).

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alimentos, com o intuito de atender a demanda dos consumidores por produtos prontos para o consumo, que sejam frescos e seguros. O ozônio é um alótropo triatômico de oxigênio e é caracterizado por um elevado potencial de oxidação, transmitindo propriedades bactericidas e viricidas. O ozônio inativa os micro-organismos através de oxidação e o residual de ozônio decompõe-se a produtos não tóxicos (isto é, oxigênio), tornando-o um agente antimicrobiano ambientalmente amigável para utilização na indústria de alimentos (Patil et al. 2009b).

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CAPÍTULO 1: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Alimentos funcionais: uma visão geral

Os alimentos funcionais, sendo uma das principais categorias de alimentos do mercado de saúde e bem-estar global, estão se tornando um grande foco de desenvolvimento de novos produtos na indústria de alimentos (Khan et al. 2013). Esta por sua vez, tem um papel central no sentido de facilitar as práticas alimentares mais saudáveis através da prestação e promoção de alimentos que sejam saborosos, visualmente atrativos e saudáveis (Nagpal, Kumar, and Kumar 2012; Saad et al. 2013). Nesse contexto, grandes avanços vêm ocorrendo no desenvolvimento dos alimentos funcionais.

Alimentos funcionais são definidos como alimentos que afetam beneficamente a saúde de quem os consomem, além dos efeitos nutricionais adequados. Essa classe de alimentos é similar aos alimentos convencionais com relação à aparência, contudo eles vão além do papel tradicional de alimentos como provedor de nutrição. Eles fornecem função específica, proporcionando efeitos adicionais de saúde sobre o consumo sustentável (Lamsal 2012; Silva, Rabelo e Rodrigues 2012). Ingredientes alimentares funcionais estão inclusos, principalmente, os probióticos, prebióticos, vitaminas e minerais e são comumente aplicados em leites fermentados, iogurtes, bebidas esportivas, alimentos para bebês, etc (Lamsal 2012).

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variáveis, tais como: a interação desse composto com a matriz alimentar, a estabilidade ao processamento e a sua biodisponibilidade (Amigo-Benavent et al. 2013). A principal motivação dos consumidores para a compra de alimentos funcionais é o crescente desejo em prevenir doenças crônicas, como doença cardiovascular, Alzheimer e osteoporose, ou para aperfeiçoar a saúde, por exemplo, aumentando a energia, estimulando o sistema imunológico e geração de bem-estar (Bigliardi and Galati 2013; Khan et al. 2013; Nobre, Suvarov e De Weireld 2014). No desenvolvimento de alimentos funcionais é necessário compreender os impactos sensoriais de seus componentes e determinar como a sua adição aos produtos pode influenciar a preferência e aceitabilidade dos consumidores em termos de aparência, aroma, sabor e textura, a fim do desenvolvimento e formulação direta dos produtos (Pimentel, Madrona e Prudencio 2014).

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1.2 Oligossacarídeos prebióticos

O termo “Prebiótico” foi definido pela primeira vez em 1995 por Gibson e Roberfroid, como “ingredientes alimentares não digeríveis que afetam beneficamente o hospedeiro por estimularem seletivamente o crescimento e/ou atividade de um ou de um número limitado de espécies bacterianas já residentes no cólon” (Gibson and Roberfroid, 1995). No entanto, a literatura recente não restringe o cólon como único local de ação e, o termo prebiótico é atualmente definido como “um ingrediente alimentar seletivamente fermentado que permite mudanças específicas, tanto na composição quanto na atividade da microbiota gastrintestinal, conferindo benefícios de saúde e bem-estar ao hospedeiro” (Figueroa-González et al. 2011; Roberfroid, 2010; Saad et al. 2013).

Com exceção da inulina, que é uma mistura de fruto-oligossacarídeos e polissacarídeos, os prebióticos são misturas de oligossacarídeos não digeríveis, que consistem de 3-10 monômeros de carboidratos (Saad et al. 2013). Dentre estes, podem ser citados os fruto-oligossacarídeos, glico-oligossacarídeos, isomalto-oligossacarídeos (IMOS), galacto-oligossacarídeos, oligossacarídeos de soja, etc (Patel e Goyal 2010). Estes oligossacarídeos são encontrados em diferentes fontes alimentares, tais como: leite, mel, cana de açúcar, soja, alho, beterraba (Mussatto e Mancilha 2007).

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quais atuam na melhoria da saúde, além de minimizar o crescimento de bactérias patogênicas (Srinivasjois, Rao e Patole 2013).

As mudanças entre as colônias de espécies microbianas no intestino humano produz uma ampla gama de efeitos positivos, incluindo o aumento da saciedade e da absorção de cálcio da dieta, regulação da motilidade intestinal, produção de ácidos graxos de cadeia curta, prevenção de diarreia e constipação (Johnson et al. 2013; Pimentel et al. 2014). Além disso, o consumo regular de prebióticos alivia os sintomas de constipação, estimula o sistema imunológico (Lee and Mazmanian 2010), pode diminuir o risco de câncer de cólon e os fatores de risco associados à obesidade e síndrome metabólica (Johnson et al. 2013).

Contudo, para que os prebióticos possam atuar como ingredientes funcionais, eles devem ser quimicamente estáveis às etapas de processamento de alimentos, como calor, baixo pH e condições da reação de Maillard (Huebner et al. 2008). Esses ingredientes devem, ainda, apresentar alguns critérios importantes: serem resistentes à ação de enzimas salivares e intestinais e estimular o crescimento de bactérias benéficas no intestino (Lamsal 2012).

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2014). O consume de 200 mL de suco prebiótico de laranja corresponde a uma ingestão de 14 g de FOS.

A European Food Standard Agency define os valores de referência para fibra dietética a 25 g por dia para adultos de 18 anos de idade ou mais, para sustentar a função normal do intestino (European Food Safety Authority, 2010). No entanto, não existem recomendações oficiais com relação ao consumo de prebióticos. Enquanto isso, muitos investigadores têm oferecido algumas sugestões: 10 g por dia de FOS (Bouhnik et al. 1999) e 7 g por dia de galato-oligosacarídeos (Silk et al. 2009).

Diversos estudos envolvendo a adição de ingredientes prebióticos em alimentos têm relatado efeitos positivos, uma vez que esses ingredientes apresentam a capacidade de favorecer o crescimento de micro-organismos probióticos (Tako et al. 2014), bem como melhorias nos atributos físico-químicos, reológicos e sensoriais dos produtos (Cruz et al. 2013; Liu et al. 2014; Freitas, Amancio e Morais 2012; Tako et al. 2014).

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1.2.1 Oligossacarídeos prebióticos produzidos via síntese enzimática

Nas últimas décadas, muitos estudos têm investigado a produção de prebióticos como ingredientes alimentares capazes de promover um estado de bem-estar e saúde aos consumidores. A maioria dos ingredientes prebióticos identificados atualmente são obtidos por extração direta a partir de fontes naturais, ou produzidos por meio de processos químicos que hidrolisam polissacarídeos, ou ainda, pela síntese química através de reações de transglicosilação de carboidratos de baixo grau de polimerização e síntese enzimática de dissacarídeos (Charalampopoulos e Rastall 2012; Figueroa-González et al. 2011; Saad et al. 2013).

Diversos trabalhos têm demonstrado a obtenção de ingredientes prebióticos por diferentes vias. Sangwan et al. (2014) estudaram a produção de

galacto-oligossacarídeos (GOS) a partir da síntese de β-galactosidase, produzida pelo

Streptococcus thermophilus. Silva et al. (2013b) investigaram a produção de

fruto-oligossacarídeos (FOS), em meio aquoso, a partir da atividade enzimática da inulase imobilizada. Praznik et al. (2013) avaliaram a estrutura de fruto-oligossacarídeos obtidos de folhas e caules da cultivar Agave tequilana. Silva, Rabelo and Rodrigues (2012) produziram oligossacarídeos prebióticos por processo enzimático, através da adição da enzima dextranasacarase em suco de caju clarificado.

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oligossacarídeos. Elas são responsáveis em catalisar a transferência de unidades de glicose, a partir de uma molécula doadora, para um receptor específico (Rabelo, Fontes, and Rodrigues 2009a; Rodrigues, Lona, and Franco 2005, 2006; Saad et al. 2013).

Bactérias ácido-lácticas apresentam a capacidade de produzir uma ampla variedade de um grupo particular de glicosiltransferases, as quais são utilizadas para a produção de oligossacarídeos (Rabelo, Honorato, e Rodrigues 2009b). Lactobacillus spp. e Leuconostoc spp. estão envolvidos na síntese de importantes produtos para a saúde humana, devido suas propriedades prebióticas e atividade imunomoduladora (Bivolarski et al. 2013). Quando a estirpe Leuconostoc mesenteroides NRRL B512 é cultivado em meio contendo sacarose como fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e minerais, ele fermenta os açúcares do meio produzindo a enzima dextranasacarase (Rodrigues, Lona, and Franco 2003).

Dextranasacarase é uma enzima bacteriana extracelular que catalisa a formação de dextrana quando o meio contém sacarose como único substrato. Contudo, em um meio contendo um aceptor como substrato (frutose, glicose, maltose, etc.), além da sacarose como segundo substrato, a enzima apresenta a capacidade de produzir oligossacarídeos prebióticos. Esta reação é conhecida como reação do aceptor e a proporção sacarose: aceptor está diretamente relacionado com o rendimento e grau de polimerização da dextrana e oligossacarídeos formados (Rodrigues, Lona and Franco 2006).

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desviadas da cadeia de dextrana para a formação do produto do aceptor (Rabelo et al. 2006). Como as unidades de glicose são incorporadas na cadeia de oligossacarídeos, o grau de polimerização dos mesmos tende a aumentar. Graus de polimerização com até 10 unidades de glicose, com as mesmas sendo incorporadas por síntese enzimática,

através de ligações do tipo α-1,6, são conhecidos como oligossacarídeos prebióticos

(Silva, and Rodrigues 2012). A figura a seguir representa um esquema da reação do aceptor:

Figura 1 – Representação da reação do aceptor. Fonte: Silva (2013a)

1.3 Sucos de frutas como veículo de ingredientes funcionais.

Atualmente, a grande maioria dos alimentos contendo oligossacarídeos prebióticos são produtos à base de leite (Cruz et al. 2013). Entretanto, alguns consumidores evitam o consumo destes produtos devido a problemas de alergia ao leite, intolerância a lactose ou vegetarianismos (Araújo et al. 2014). Dessa forma, a produção de alimentos prebióticos em escala industrial vem enfrentando grandes desafios. A produção de oligossacarídeos não lácteos é uma opção interessante e

Dextranasacarase

Dextranasacarase Sacarose

Sacarose + Aceptor

Dextrana + Frutose

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bastante promissora para a produção de alimentos prebióticos a baixo custo e em escala industrial (Figueroa-González et al. 2011).

Nesse contexto, sucos de frutas são considerados substratos adequados para veicular esses ingredientes funcionais, uma vez que são alimentos ricos em nutrientes, como vitaminas, fibras, minerais e antioxidantes. Além disso, eles possuem perfis de sabor agradável e são alimentos consumidos com regularidade por todas as faixas etárias, devido seu sabor refrescante e seu status de alimento saudável (Pereira 2013; Pimentel et al. 2014). Vários trabalhos têm reportado o uso de suco de frutas como substrato para a incorporação de ingredientes prebióticos.

Araújo et al. (2014) e Coelho (2013) desenvolveram um novo produto funcional a partir da desidratação, em leito de jorro, de suco de acerola e limão, respectivamente contendo oligossacarídeos prebióticos, produzidos a partir da reação de aceptor da dextranasacarase.

Silva (2013a) utilizou diferentes tipos de sucos de frutas: cajá, jambo e siriguela para sintetizar oligossacarídeos prebióticos como forma de elaboração de novos produtos funcionais. Silva, Rabelo and Rodrigues (2012) produziram oligossacarídeos prebióticos por processo enzimático, adicionando a enzima dextranasacarase em suco de caju clarificado.

1.3.1 Suco de laranja como um alimento funcional

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2014). O suco de laranja fresco é um dos sucos mais consumidos mundialmente, com uma participação de 35% do mercado de bebidas de frutas e, isso é devido ao seu rico conteúdo em vitamina C e valor nutritivo (Agcam, Akyıldız, e Evrendilek 2014; Ferreira et al. 2013), além da perfeita combinação dos seus atributos sensoriais, tais como a cor, sabor e aroma (Vervoort et al. 2011). Ele é uma importante fonte de compostos bioativos, como ácidos orgânicos, compostos fenólicos, carotenoides, os quais têm mostrado serem bons contribuidores para a capacidade antioxidante total (Carbonell-Capella et al. 2013; Zulueta et al. 2013).

Devido à riqueza nutricional que o suco de laranja apresenta, ele tem sido considerado um substrato promissor para a elaboração de novos produtos com propriedades funcionais.

Diante disso, diversos estudos têm demonstrado a potencialidade do suco de laranja e de seus subprodutos como veículo para a entrega de ingredientes funcionais. Nesse contexto, Manderson et al. (2005) avaliaram as propriedades prebióticas de oligossacarídeos extraídos da casca de subprodutos da fabricação de suco de laranja, bem como estudaram uma forma mais eficaz em termos de custos para a produção desses oligossacarídeos.

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Com relação à aceitação sensorial dos sucos contendo ingredientes funcionais, diferentes estudos têm sido realizados com essa finalidade e os resultados ainda apresentam algumas contradições. Luckow e Delahunty (2004) estudaram o impacto sensorial de ingredientes funcionais probióticos no sabor e aroma de suco de laranja. Os resultados desse estudo mostraram que sucos de laranja contendo propriedades funcionais são associados a um sabor não característico do suco. Os consumidores preferiram as características sensoriais do suco de laranja convencional ao suco funcional.

Por outro lado, Coelho (2009) realizou um estudo envolvendo a aceitação sensorial de suco de laranja probiótico e adoçado. Os resultados mostraram uma aceitação global de 84% dos consumidores. A autora relata que a adição de açúcar pode ser uma estratégia utilizada para melhorar a aceitação do suco de laranja fermentado. Contudo, a informação ao consumidor acerca dos benefícios que esses alimentos promovem à saúde, leva a uma melhoria da aceitação do produto.

Apesar do seu baixo pH, a estabilidade do suco de laranja é bastante limitada durante a estocagem, devido um importante número de reações de deterioração, como por exemplo, a degradação do ácido ascórbico, deterioração microbiana, ação de enzimas, desenvolvimento de off-flavour, alterações na cor, textura e aparência (Zulueta et al. 2013).

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nutritivas irreversíveis, que afeta a qualidade do suco e, muitas vezes, a aceitação do produto (Demirdöven and Baysal 2014; Vervoort et al. 2011).

1.4 Métodos de processamentos de alimentos: convencionais X tecnologias emergentes

Sob o ponto de vista tecnológico, os principais objetivos dos processos de preservação e conservação consistem em prolongar a vida útil dos produtos alimentícios, oferecendo aos consumidores produtos que não somente apresentem boa qualidade nutritiva e sensorial, mas também, alimentos seguros, isentos de micro-organismos e suas toxinas. A escolha do método de conservação adequado irá depender da origem do alimento, seu estado físico (sólido, líquido, emulsionante), o tempo de conservação necessário e o destino final do produto (Fellows 2006).

Dentre os inúmeros métodos de conservação disponíveis, o tratamento térmico continua sendo um dos métodos mais importantes empregados no processamento e conservação dos alimentos, principalmente pelos efeitos de conservação através da inativação de enzimas e micro-organismos. Contudo, a aplicação do calor pode resultar em alterações dos componentes dos alimentos, responsáveis por suas características sensoriais, bem como em alterações do conteúdo nutritivos dos mesmos (Demirdöven e Baysal 2014).

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qualidade dos sucos de frutas. No entanto, conseguir a estabilização microbiológica desses alimentos sem o uso de conservantes e aplicação de um processamento térmico ainda é um grande desafio (Damasceno et al. 2008).

Vários trabalhos têm avaliado os efeitos do tratamento térmico convencional na qualidade de sucos de frutas e alguns autores comparam seus impactos com a de um processamento não térmico. Nesse contexto, Vervoort et al. (2011) compararam o impacto do processamento térmico, tecnologia de altas pressões e o processo de campo elétrico pulsado nos parâmetros de qualidade químico e bioquímico do suco de laranja. Com relação aos parâmetros de qualidade investigados (açúcares, ácidos orgânicos, vitamina C, furfural, carotenoides e HMF), não houve impacto significativamente diferente das três técnicas utilizadas.

Cortés, Esteve e Frígola (2008) estudando o efeito da estocagem refrigerada no conteúdo de ácido ascórbico de suco de laranja submetido aos tratamentos de pasteurização térmica e campo elétrico pulsado, relataram que, em temperatura de estocagem a 2 ºC, a qualidade nutricional do suco de laranja (ácido ascórbico) foi mantida por mais tempo no suco tratado por campo elétrico pulsado (277 dias de vida de prateleira), enquanto que no suco tratado por pasteurização térmica convencional a vida de prateleira só chegou até 90 dias. Patil et al. (2009a) e Tarazona-Díaz e Aguayo (2013) avaliaram o efeito da pasteurização térmica em sucos de frutas e concluíram que esse processo ocasionou degradação da cor dos produtos e redução dos compostos bioativos, resultando na redução da qualidade sensorial e nutricional do suco.

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al. (2009), Klewicki (2007) e Huebner et al. (2008) estudaram a estabilidade de ingredientes funcionais durante a pasteurização a baixos valores de pH, e concluíram que os FOS são altamente susceptíveis à hidrólise nas condições de pasteurização de sucos de frutas, dentre outras bebidas. A quantidade hidrolisada desses ingredientes é maior quanto menor for o pH e mais longo for o tempo de pasteurização.

Diante disso, os prebióticos serão funcionalmente estáveis se a sua atividade prebiótica, antes e após as condições de processamento de alimentos, aumentar ou permanecer inalterada (Huebner et al. 2008). Dessa forma, um cuidado especial deve ser observado durante a aplicação de um processo para a conservação e aumento da vida útil de um produto com propriedades funcionais, visto que, o tratamento e suas condições podem afetar as características do produto em questão.

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1.4.1 Tecnologia de plasma na conservação de alimentos

Plasma é um gás ionizado que pode ser produzido a partir da aplicação de uma descarga elétrica a um gás inicialmente neutro. O processo pode ocorrer à temperatura ambiente e pressão atmosférica, com um fluxo brilhoso composto de espécies químicas com características antimicrobianas e bastante reativas: fótons UV, partículas carregadas, superóxido, radicais hidroxila, óxido nítrico e ozônio (Bermúdez-Aguirre et al. 2013; Rød et al. 2012).

Nesse contexto, quando o plasma é produzido sob as condições acima citadas, é frequentemente chamado de “descargas luminescentes à pressão atmosférica” ou

ainda, “plasma de atmosfera fria (Atmosferic Cold Plasma – ACP)” para enfatizar o fato

de que as temperaturas dos gases estão próximas à temperatura ambiente (30- 60 °C) (Fernández and Thompson 2012). Contudo, dependendo dos níveis relativos de energia dos elétrons e espécies constituintes, os plasmas são classificados em plasmas térmicos e não térmicos (Jiang et al. 2014).

(37)

seladas, o que elimina o risco de contaminação pós-processamento (Misra et al. 2014a).

O uso da tecnologia de plasma para a conservação de alimentos embalados tem sido bem documentado (Pankaj et al. 2014a). Misra et al. (2014a) demonstraram, recentemente, a aplicação de plasma frio na conservação de morangos embalados, sem comprometer a qualidade dos mesmos. Pankaj et al. (2013), por sua vez, avaliaram a cinética de inativação da enzima peroxidase na conservação de tomates embalados.

A temperatura do plasma frio varia em torno de 30–60 ºC, e esta temperatura é desejada pela indústria de alimentos, uma vez que baixa energia é requerida para a formação do plasma, além de não afetar os compostos sensíveis a altas temperaturas (Bermúdez-Aguirre et al. 2013).

Esta tecnologia apresenta numerosas vantagens sobre os métodos convencionais, uma vez que apresenta custos operacionais de processo reduzido, utiliza tempo de tratamento reduzido a baixas temperaturas, apresenta natureza não tóxica e é aplicado a uma grande variedade de produtos (Ziuzina et al. 2013).

(38)

Figura 2 – Esquema de montagem experimental para sistema de plasma frio. Adaptação de Pankaj et al. (2013)

Diversos estudos têm reportado sobre a aplicação da tecnologia de plasma frio na conservação de alimentos, por meio da inativação de micro-organismos e, estes estudos têm mostrado resultados efetivos de inativação (Fernández et al. 2013; Misra et al. 2015; Patil et al. 2014; Ziuzina et al. 2014). As condições de tratamento aplicadas no presente estudo foram baseadas nesses trabalhos.

(39)

1.4.2 Emprego do ozônio

O uso do ozônio tem se destacado como um método alternativo aos processos térmicos, e é empregado na conservação de sucos de frutas e outros alimentos, com o intuito de atender a demanda dos consumidores por produtos prontos para o consumo, que sejam frescos e seguros (Patil et al. 2009a).

O ozônio é um alótropo tri-atômico do oxigênio e é um agente antimicrobiano capaz de inativar micro-organismos em geral, como fungos, vírus, protozoários, esporos fúngicos e bactérias. Isso é possível graças ao potencial altamente oxidante que o ozônio apresenta, resultando nessas propriedades bactericidas e viricidas que ele transmite. Os resíduos de ozônio se decompõem em produtos não tóxicos, sendo considerado, dessa forma, um agente antimicrobiano ambientalmente adequado para o uso na indústria de alimentos (Patil et al. 2009b). As reações de oxidação são causadas pelo ozônio molecular dissolvido ou pelas espécies de radicais livres formados durante a decomposição do ozônio (Patil et al. 2010a). A figura 3 apresenta uma representação do sistema de tratamento com ozônio.

Em 1997, a Food and Drug Administration (FDA) dos EUA, declarou o ozônio como um ingrediente “Geralmente Reconhecido como Seguro” (GRAS) para o uso no

(40)

Figura 3: Sistema esquemático de tratamento de ozônio. Fonte: Tiwari et al. (2008a)

Tradicionalmente, o processamento por ozônio dentro da indústria de alimentos tem se concentrado em alimentos sólidos, pela aplicação de qualquer tratamento gasoso, ou ainda, pela lavagem de frutas e vegetais com água ozonizada. No entanto, com a aprovação do ozônio como um aditivo direto à alimentação, surgiu a possibilidade de aplicação do mesmo em alimentos líquidos (Patil et al. 2010a).

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conservação de sucos de frutas com propriedades prebióticas. Portanto, um dos objetivos do atual trabalho de tese foi avaliar os efeitos do tratamento de ozônio nas características funcionais de suco de laranja, além de avaliar as características sensoriais e de qualidade do produto tratado.

1.4.3 Altas Pressões

O processamento de alta pressão (HPP) pode ser uma ferramenta útil para a obtenção de produtos alimentícios mais saudáveis e seguros (Carnonell-Capella et al. 2013). Diante disso, esta tecnologia foi adaptada às necessidades específicas da indústria de alimentos e, atualmente, uma gama de produtos tratados por pressão, incluindo sucos de frutas e vegetais, molho de abacate, cozidos de presunto embalado, arroz cozido e carne de frango marinado, já foram introduzidos na União Europeia e no mercado americano (Patras et al. 2009).

No que diz respeito à qualidade de ingestão do produto acabado, a aplicação da tecnologia de altas pressões pode apresentar vantagens sobre os processamentos térmicos. Isso ocorre porque as moléculas pequenas, tais como compostos voláteis de aroma e pigmentos relacionados com a qualidade sensorial dos alimentos não são afetados pelo processamento de alta pressão (Patras et al. 2009).

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(52)

CHAPTER 2 - EFFECT OF ATMOSPHERIC COLD PLASMA AND HIGH PRESSURE PROCESSING ON FRUCTO-OLIGOSACCHARIDES, ORGANIC ACIDS AND

ORANGE JUICE COLOR

Abstract

In this study, the effect of atmospheric pressure cold plasma (ACP) and high pressure processing on the prebiotic orange juice processing were evaluated. Orange juice containing 7% (w/v) of commercial fructo-oligosaccharides (FOS) was directly and indirectly exposed to plasma discharge at 70 kV for 15, 30, 45 and 60 seconds.For high pressure processing, the juice containing the same concentration of FOS was treatedat 450 bars for 5 minutes. After the treatments, the fructo-oligosaccharides were qualified and quantified by Thin Layer Chromatography (TLC). The organic acids, color and pH values were also evaluated. Both processes did not degrade the FOS, making them suitable for the processing of functional foods containing FOS. The organic acids and the color of the treated samples were also well preserved. Therefore, ACP and high pressure processing can be used as non-thermal alternatives for the production of prebiotic orange juice.

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2.1 Introduction

A growing number of consumers are aware of the importance of functional foods due to their health benefits. Prebiotic oligosaccharides are among the functional compounds that added to foods grant to them the desired functionality. Prebiotics are

defined as “non-digestible food ingredients that beneficially affects host by selectively

stimulating the growth and the activity of one or a limited number of bacteria in the

colon” (Hernandez-Hernandez et al. 2012). The beneficial health effects attributed to the

intake of prebiotic have been previously reported as well (Hess et al. 2011; Wichienchot et al. 2010; Vergara et al. 2010).

Prebiotic compounds have been used in several food products. Fruits and fruit juices can be used as vehicles for these compounds. Renuka et al. (2009) studied the fortification of selected fruit juice beverages with fructo-oligosaccharides (FOS), a low caloric prebiotic.

According to ANVISA (National Health Surveillance Agency, Brazil), the recommended daily intake (RDI) for foods containing prebiotic compounds should provide at least 3 g of FOS in solid foods or 1.5 g in liquid foods. Besides, the FOS consumption should not exceed 30 g per day in products ready for consumption. The consumption of 200 mL of the prebiotic orange juice corresponds to the intake of 14 g of FOS.

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juice can cause off-flavors and the degradation of the product's quality due to non-enzymatic browning (Patil et al. 2009).

Nowadays, the consumers are looking for safe food products with high quality retention. The preservation of the nutraceutical properties of functional foods, of non-thermal innovative technologies to produce foods with a minimum of nutritional, physicochemical, and organoleptic changes and without degradation of the prebiotic compounds (Esteve and Frígola 2007).

Among these technologies, atmospheric cold plasma (ACP) and high pressure technologies have been reported as a good non-thermal food processing that guarantees food preservation at safe standards maintaining, as much as possible, the fresh-like characteristics of foods (Ramos et al. 2013). Studies involving the application of atmospheric cold plasma and high pressure on fruits and vegetables reported a positive effect on pathogens and enzyme inactivation (Misra et al. 2014; Ziuzina et al. 2013; Patterson et al. 2005).

However, there is no published data showing the advantages and limitations of these technologies, when applied to fructo-oligosaccharides (FOS), the most studied and used functional carbohydrate in food industry. The evaluation of a non-thermal treatment for fruit juice processing containing FOS is important because a previous study showed thermal degradation of FOS due to thermal treatment (Matusek et al. 2009; Klewicki 2007). Orange juice is largely consumed due to its vitamin C content.

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orange juice. The influence of ACP and HPP processing on the organic acid profile and on the juice color was also evaluated.

2.2 Materials and Methods

2.2.1 Prebiotic orange juice preparation

Orange juice (Squeez©, Fruit Juices Ltd, Ireland) was purchased from a local supermarket (Dunnes, Dublin - Ireland). Orange juice containing prebiotic ingredients was prepared by adding of 7% (w/v) of commercial fructo-oligosaccharide (ORAFTI© P95, Beneo GmbH, Mann, Germany) in a liter of the juice. The pH of the juice was determined by direct measurement in a 420A pHmeter, (Orion research Inc, Beverly, MA. US). The pHmeter was calibrated before use with buffer solutions of pH 4.0, 7.0 and 10.0.

2.2.2 Plasma Treatment

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was 22 mm and equal to the height of the container. Voltage was monitored using an InfiniVision 2000 X-Series Oscilloscope (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). All experiments were performed at 70 kV peak to peak at ambient air and atmospheric pressure conditions.

A volume of 20 mL of orange juice samples containing 7% (w/v) of fructo-oligosaccharide was transferred to an open Petri dish, which was placed in a polypropylene box, sealed with a polymeric film of 50 µm thickness (Cryovac BB3050). This film served as an additional layer of dielectric barrier (Pankaj et al. 2014). Then, samples were treated with atmospheric cold plasma (ACP) with processing times of 15, 30, 45 and 60 seconds and different exposure kinds: direct plasma field (in) and indirect plasma field (out). These treatment times were selected based on a previous study carried for pathogens inactivation in orange juice (Ziuzina et al. 2013). These authors achieved a complete bacterial inactivation after 20 s of direct and 45 s of indirect plasma treatment. Treated samples of prebiotic orange juice were stored at room temperature (25 ºC) for 24 h before opening the container. A control sample, containing the same concentration of FOS dissolved in water was prepared and packed and treated in the same way that the prebiotic orange juice

2.2.3 High pressure processing

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pressure processing. A control sample, containing the same concentration of FOS dissolved in water was prepared and packed and treated in the same way that the prebiotic orange juice. The processing was done at the industrial conditions: 5 minutes at 450 bars as recommended by HPP Toolings Business (Dublin, Ireland) for fruit juices. The juice processing in industrial equipment is a differential of this study because almost all published studies on fruit juice processing by HPP are done in small equipment with small volumes. After the treatment, quality analyses were carried out on the final product.

2.2.4 Carbohydrate analysis

2.2.4.1 Fructo-oligosaccharides degree of polymerization characterization

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composed of n-butanol/2-propanol/H2O (10:5:4 [vol/vol/vol]) mixture (Shiomi, Onodera and Sakai 1997). The TLC plate was irrigated by the solvent systems three times. To visualize the separated carbohydrates in the plates, a fine spray containing 1-butanol/water (80% w/w) as solvent, phosphoric acid (6.78 mL), urea (3 g) and ethanol (8 mL) in 100 mL was used. The plates were oven heated at 120 °C for 10 min. For the quantification of the oligosaccharides, a TLC scanner CAMAG 4 20x20 cm densitometer was used, using the Planar winCATS Chromatografy Manager software. The wavelength used was 450 nm. The analyses were performed in triplicate.

2.2.5 Color measurement

The color of the samples was measured using a colorimeter (Color Quest XE Hunter Lab, Northants, UK). The instrument operates on CIELAB (L*, a* and b*) and it was calibrated using white (L*= 93.97, a*= 0.88 and b*= 1.21) standard. The L, a, b parameters were used to calculate the chromaticity, the hue angle and the ∆E according to equations 1, 2 and 3, respectively:

Chroma = (1)

Hue = tan-1 (2)

∆E= {(∆L2_{) + (∆a}2_{) + (∆b}2

)}1/2 (3)