Extração, micronização e estabilização de pigmentos funcionais = construção de uma unidade multipropósito para desenvolvimento de processos com fluídos pressurizados

(1)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

EXTRAÇÃO, MICRONIZAÇÃO E ESTABILIZAÇÃO DE PIGMENTOS

FUNCIONAIS: CONSTRUÇÃO DE UMA UNIDADE MULTIPROPÓSITO

PARA DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS COM FLUIDOS PRESSURIZADOS

Diego Tresinari dos Santos

Orientador: Profa. Dra. Maria Angela de Almeida Meireles.

Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas, para Obtenção do Título de Doutor em Engenharia de Alimentos.

CAMPINAS-SP Fevereiro de 2011

(2)

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FEA – UNICAMP

Título em inglês: Extraction, micronization and stabilization of functional pigments: construction of multipurpose unit for pressurized fluid process development

Palavras-chave em inglês (Keywords): Stabilization, Extraction, Pressurized Fluids, Micronization, Functional pigments

Titulação: Doutor em Engenharia de Alimentos

Banca examinadora: Maria Angela de Almeida Meireles Silvânia Regina Mendes Moreschi Carlos Raimundo Ferreira Grosso Reinaldo Camino Bazito

Juliana Martin do Prado Data da Defesa: 22/02/2011

Programa de Pós Graduação em Engenharia de Alimentos

Santos, Diego Tresinari dos

Sa59e Extração, micronização e estabilização de pigmentos funcionais: construção de uma unidade multipropósito para desenvolvimento de processos com fluidos pressurizados / Diego Tresinari dos Santos. -- Campinas, SP: [s.n], 2011.

Orientador: Maria Angela de Almeida Meireles

Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos.

1. Estabilização. 2. Extração. 3. Fluidos Pressurizados. 4. Micronização. 5. Pigmentos funcionais. I. Meireles, Maria Angela de Almeida. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.

(3)

iii Este exemplar corresponde à redação final da tese defendida em 22/02/2011 por Diego Tresinari dos Santos aprovado pela comissão julgadora em 22/02/2011.

________________________________________________ Profa. Dra. Maria Angela de Almeida Meireles

FEA / UNICAMP Orientador

________________________________________________ Profa. Dra. Silvânia Regina Mendes Moreschi

Universidade Tecnológica Federal do Paraná Membro

________________________________________________ Prof. Dr. Carlos Raimundo Ferreira Grosso

FEA / UNICAMP Membro

________________________________________________ Prof. Dr. Reinaldo Camino Bazito

IQ / USP Membro

________________________________________________ Dra. Juliana Martin do Prado

FEA / UNICAMP Membro

________________________________________________ Dra. Carmen Lucia Queiroga

CPQBA / UNICAMP Suplente

________________________________________________ Dr. Flávio Cortiñas Albuquerque

CENPES / PETROBRÁS Suplente

________________________________________________ Profa. Dra. Miriam Dupas Hubinger

FEA / UNICAMP Suplente

(4)

iv Todas as inovações eficazes são surpreendentemente simples. Na verdade, o maior elogio que uma inovação pode receber é haver quem diga:

isto é óbvio. Por que não pensei nisso antes?

(5)

v AGRADECIMENTOS

Á Deus, por tudo que me há propiciado seja profissionalmente ou pessoalmente.

À UNICAMP, por toda a sua estrutura.

Ao CNPq, pela concessão da bolsa e financiamento deste projeto de pesquisa.

À CAPES, pelo auxílio financeiro (PROEX) para participação no 10 º Congresso Brasileiro de Polímeros em Foz do Iguaçu-PR.

À Profa. Dra. Maria Angela de Almeida Meireles, pela brilhante orientação, confiança, entusiasmo e exemplo como orientadora, pesquisadora e professora, bem como aos ensinamentos de não mensurável valor transmitidos a mim de ordem profissional e pessoal.

Ao Pesquisador Ariovaldo Astini, pela amizade e valiosa contribuição de ordem técnica e intelectual durante o desenvolvimento deste projeto de pesquisa.

Aos Pesquisadores Prof. Dr. Elton Franceschi, Prof. Dr. Paulo de Tarso Vieira e Rosa e aos membros da banca examinadora, pelas sugestões e ensinamentos fundamentais para a realização deste trabalho.

Às Pesquisadoras Profa. Dra. Marisa Beppu e Dra. Carmem Queiroga, por disponibilizarem seus laboratórios para a realização de alguns experimentos referentes a este projeto de pesquisa.

À minha amiga, parceira de dança, investidora, “marida” e Pesquisadora Ms. Juliana Queiroz Albarelli, pelas inúmeras “trocas de idéias” sobre o desenvolvimento desta tese e de outros trabalhos que desenvolvemos em parceria, bem como por ter contribuído

(6)

vi

significativamente no desenvolvimento dos experimentos relacionados à estabilização dos extratos antociânicos.

Aos colegas de trabalho Priscilla Veggi, Rodrigo Cavalcanti, Helmut Navarro e Carolina Albuquerque, pelo ânimo e disponibilidade de desenvolvermos alguns trabalhos em paralelo que resultaram e ainda resultarão em algumas publicações.

Aos Pesquisadores e amigos Prof. Dr. Silvio Silvério da Silva, Prof. Dr. Attílio Converti, Prof. Dr. Victor Haber Pérez, Dr. Boutros Fouad Sarrouh, Profa. Dra. Lilian Masson, Prof. Dr. Michael Oelgemöller e Profa. Dra. Maria José Cocero, que com seus valiosos ensinamentos e conselhos contribuíram para a construção do profissional que me tornei.

À minha Mãe, por ter sempre se preocupado prioritariamente com a minha educação e formação, as quais foram os alicerces para a chegada no patamar que estou, bem como pelo amor incondicional.

Ao meu Pai, à minha Vó, Tio Fernando, Tia Maria, Tia Flor e a todos os familiares que, mesmo de longe, participaram me apoiando e incentivando em todos os momentos.

(7)

vii ÍNDICE

RESUMO ... XVII ABSTRACT ... XIX

CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ... 1

1.1 Introdução ... 1

1.2 Objetivos da Pesquisa ... 3

1.2.1 Geral ... 3

1.2.2 Específicos ... 3

1.3 Estrutura da Tese de Doutorado ... 4

CAPÍTULO 2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 9

2.1. Pigmentos Funcionais ... 9

2.1.1 Flavonóides ... 10

2.1.2 Carotenóides ... 13

2.2. Métodos de Extração ... 15

2.2.1 Extração com Fluidos Pressurizados ... 17

2.2.1.1 Extração com Líquidos Pressurizados ... 18

2.2.1.2 Extração com CO2 supercrítico ... 19

2.2.2 Métodos de Extração Assistida ... 20

2.2.2.1. Com ultrassom ... 20

2.2.2.2. Com CO2 a alta pressão ... 21

2.3. Formação de Partículas ... 22

2.4.1 Para Extração ... 23

2.4.1.1 Para Extração com Líquidos Pressurizados ... 25

2.4.1.2 Para Extração com CO2 Supercrítico ... 25

2.4.1.3 Para Extração assistida com ultrassom ... 26

2.4.1.4 Para Extração assistida com CO2 a alta pressão ... 27

2.4.2 Para Formação de Partículas ... 28

2.4.2.1 Para Formação de Partículas Via SAS ... 28

2.4.2.2 Para Formação de Partículas Via RESS ... 29

Referências ... 29

CAPÍTULO 3 - DETALHAMENTO DA CONSTRUÇÃO E FUNCIONAMENTO DA UNIDADE MULTIPROPÓSITO ... 37

CAPÍTULO 4 - ANTIOXIDANT PIGMENT EXTRACTION USING A HOME-MADE PRESSURIZED SOLVENT EXTRACTION SYSTEM ... 43

Key words ... 44

(8)

viii

4.1 Introduction ... 44

4.2 Materials and methods ... 47

4.2.1 Plant Material ... 47

4.2.1 Annatto seeds ... 47

4.2.2 Jabuticaba skins ... 47

4.2.2 Extraction Procedures ... 48

4.2.3 Extract Characterization ... 51

4.2.3.1 From Jabuticaba skins ... 51

4.2.3.1.1 Anthocyanin content ... 51

4.2.3.1.2 Thin-Layer Chromatography (TLC) ... 52

4.2.4 Statistical Analysis ... 52

4.3 Results and discussion ... 53

4.3.1 Obtaining Annatto seed extracts ... 53

4.3.2 Obtaining Jabuticaba skin extracts ... 56

4.4 Conclusions ... 59

Acknowledgements ... 59

References ... 59

CAPÍTULO 5 - PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION OF PHENOLIC COMPOUNDS FROM JABUTICABA SKINS: OPTIMIZATION STUDY ... 61

Abstract ... 62

5.2 Material and methods ... 65

5.2.1 Plant Material ... 65

5.3.1 Effects of process variables on the extraction yield ... 70

5.3.2 Effects of process variables on the recovery of anthocyanins ... 71

5.3.3 Effects of process variables on the recovery of phenolic compounds ... 74

5.3.4 Optimization of the extraction process ... 77

(9)

ix CAPÍTULO 6 - OPTIMIZATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS EXTRACTION FROM JABUTICABA (MYRCIARIA CAULIFLORA) SKINS ASSISTED BY HIGH

PRESSURE CO2 ... 87

Abstract ... 88

6.2 Material and methods ... 91

6.2.1 Plant material ... 91

6.2.2 High Pressure Carbon Dioxide Assisted-Extraction (HPCDAE) system ... 91

6.2.5 Statistical analysis ... 97

6.2.6 Determination of experimental extraction kinetics curves and parameters ... 97

6.3.1 Effects of process variables on recovery of anthocyanins ... 97

6.3.2 Effects of process variables on recovery of phenolic compounds ... 101

6.3.3 Optimization of the extraction process ... 105

6.3.4 Experimental extraction kinetics curves using optimum conditions ... 108

CAPÍTULO 7 - MICRONIZATION AND ENCAPSULATION OF FUNCTIONAL PIGMENTS USING SUPERCRITICAL CARBON DIOXIDE ... 117

Key words ... 118

Abstract ... 118

7.2 Materials and methods ... 121

7.2.1 Materials ... 121

7.2.2 Micronization process via SAS ... 124

7.2.3 Encapsulation process via SAS ... 127

7.2.4 Encapsulation process via RESS ... 128

7.2.5 Characterization and Analysis ... 130

7.2.5.1.1 Determination of Precipitation Yield - PY (%) ... 131

7.2.5.1.2 Determination of Encapsulation Efficiency (EE (%)) ... 131

7.3.1 Micronization process via SAS ... 132

(10)

x

7.3.3 Encapsulation process via RESS ... 142

CAPÍTULO 8 - STABILIZATION OF ANTHOCYANIN EXTRACT FROM JABUTICABA SKINS BY ENCAPSULATION USING SUPERCRITICAL CO2 AS SOLVENT ... 153

Key words ... 154

Abstract ... 154

8.2.2 Anthocyanin Extraction ... 156

8.2.3 Encapsulation of Anthocyanin Extract ... 156

8.2.3.1 By Rapid Expansion of Supercritical Solution (RESS) process ... 156

8.2.3.1.1 Evaluation of the antioxidant activity of the encapsulated anthocyanin extract after RESS process ... 161

8.2.3.2 By conventional method ... 161

8.2.4 Anthocyanin Stabilization Studies ... 162

8.2.4.1 Free and encapsulated extract degradation studies ... 162

8.2.4.2 Thermal analysis of free and encapsulated extracts ... 164

8.2.5 Anthocyanin Extract Release Studies ... 164

8.3.1 Encapsulation of anthocyanin extract by RESS process ... 165

8.3.2 Encapsulation of anthocyanin extract by conventional method ... 169

8.3.3 Anthocyanin stabilization by encapsulation ... 170

8.3.4 Release studies ... 173

CAPÍTULO 9 - CONCLUSÕES GERAIS ... 181

SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 185

MEMÓRIA DO PERÍODO DO DOUTORADO ... 187

PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA ... 189

APÊNDICE I - ARTIGO DE REVISÃO - JABUTICABA AS A SOURCE OF FUNCTIONAL PIGMENTS ... 193

(11)

xi APÊNDICE II – DETALHAMENTO DO PROCEDIMENTO DE CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DE ANTOCIANINAS E FENÓIS ... 201 APÊNDICE III - ARTIGO DE REVISÃO - CAROTENOID PIGMENTS ENCAPSULATION: FUNDAMENTALS, TECHNIQUES AND RECENT TRENDS ... 207 APÊNDICE IV - MANUAL DE OPERAÇÃO DA UNIDADE MULTIPROPÓSITO ... 219

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.2.1.1 - Constantes críticas de alguns fluidos com interesse em extração (MENDES et al., 2003) ... 17 Table 4.3.1.1 - Percentage of Residual Extract (%) deposited in the exit tubing line when using different SFE systems/configurations. ... 55 Table 5.2.2.1 - The experimental design of phenolic compound extraction from jabuticaba skins ... 66 Table 5.3.4.1 - Optimum PLE conditions for the extraction yields, anthocyanins and total phenols from jabuticaba skins ... 77 Table 5.3.4.2 - Predicted and experimental values of responses under optimum PLE conditions (50 bar, temperature of 80 °C and static extraction time of 9 min) and experimental values responses obtained by Conventional Low Pressure Liquid Extraction (LPLE) ... 79 Table 6.3.1.1 - 23_{full factorial design for HPCD Assisted-Extraction from jabuticaba skins} and the total anthocyanin and phenolic contents of the extracts ... 99 Table 6.3.1.2 - Regression coefficients of the model for the response variables ... 101 Table 6.3.3.1 - Predicted and experimental values of response variables under optimum HPCDAE conditions (at 117 bar, temperature of 80 °C, of 20 % and 20 minutes of extraction) and experimental values of response variables obtained by control HPCDAE experiment (at atmospheric pressure, temperature of 80 ºC and 20 minutes of extraction) and by PLE experiment (at 117 bar, temperature of 80 ºC, 20 minutes of extraction and flow rate of 1 mL of acidified water/min) ... 108 Table 6.3.4.1 - Experimental values of the steady-state extraction Y*, the time t* to reach the Y* and the mass transfer rate M* for the recovery of anthocyanins and phenolic compounds ... 111

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1.1.1 - Estrutura base dos flavonóides. ... 11 Figura 2.1.1.2 - Cascas de jabuticaba. ... 12

(12)

xii Figura 2.1.2.1 - Estrutura do β-caroteno ... 13 Figura 2.1.2.2 - Sementes de urucum. ... 15 Figura 2.2.1.2.1 - Diagrama de fase pressão-temperatura do dióxido de carbono ... 20 Figura 2.4.1.1.1 - Equipamento comercial para extração com líquidos pressurizados. a) ASE® 150; b) ASE® 350 (DIONEX, 2010) ... 24 Figura 2.4.1.1.2 - Equipamento comercial para extração com líquidos pressurizados (FLUID MANAGEMENT SYSTEMS, 2010) ... 24 Figura 2.4.1.2.1 - Equipamento comercial para extração com CO2 supercrítico (APPLIED SEPARATIONS, 2010) ... 26 Figura 2.4.1.3.1 - Equipamento comercial para extração assistida com ultrassom (HIELSCHER, 2010) ... 27 Figura 2.4.2.1.1 - Equipamento comercial para formação de partículas via SAS (THAR TECHNOLOGIES, 2010) ... 28 Figura 2.4.2.2.1 - Fluxograma da unidade experimental comercial da Thar Technologies RESS-100. 1 - Reator; 2 - Agitador; 3 – Termostato; 4, 7 e 8 - válvulas; 5 -Medidor de fluxo; 6 - Bomba de alta pressão; 9 - Dispositivo de expansão; 10 - Trocador de calor para aquecimento; 11 - Câmara de expansão; 12 - Trocador de calor para resfriamento; 13 - Computador (GIL’MUTDINOV et al., 2009). ... 29 Figura 3.1 - Foto da parte estrutural da unidade. ... 38 Figura 3.2 - Fotos da unidade multipropósito. A - Vista de frente da unidade; B - Sistema ultrassônico quando acoplado à unidade; C - Vista do sistema de aquecimento do vasos de pressão menor: D - Vista lateral da unidade. ... 40 Figura 3.3 - Foto da serpentina imersa no banho termostatizado de resfriamento. ... 42 Figure 4.2.2.1 - Schematic diagram of the home-made pressurized solvent extraction system. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 Manometers; 4 Valves; 5 Thermostatic bath; 6 CO2 Pump; 7 Back pressure regulator; 8 HPLC pump; 9 Solvent resevoir; 10 Extraction cell; 11 Micrometric valve with a heating system; 12 Temperature controller; 13 Sampling bottle. 48 Figure 4.2.2.2 - Schematic diagram of the home-made pressurized solvent extraction system. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 Manometers; 4 Valves; 5 Thermostatic bath; 6 CO2 Pump; 7 Back pressure regulator; 8 HPLC pump; 9 Solvent reservoir; 10 Extraction cell; 11 Ultrasound bath; 12 Heating bath; 13 Micrometric valve with a heating system; 14 Temperature controller; 15 Sampling bottle. ... 50 Figure 4.3.1.1 - Recovery of pigments from Annatto seeds as a function of time using different SFE systems/configurations: ■ Commercial SFE; □ Home-made SFE using electric heating; ● Home-made Ultrasound Assisted SFE; ○ Home-made SFE using water bath heating. ... 54 Figure 4.3.1.2 - Extraction yields (%) (after 240 min) using different SFE systems/configurations. ... 55

(13)

xiii Figure 4.3.2.1 - Thin-layer chromatography (TLC) plates (1 - Extract obtained at 30 MPa/333 K run 1; 2 – Extract obtained at 30 MPa/333 K run 2; a) Revealed using DPPH reagent on visible light; b) Revealed using Natural products (NP) reagent on light (365 nm); c) Revealed using anisaldehide-sulphuric acid reagent on visible light; d) Revealed using anisaldehide-sulphuric acid reagent on ultraviolet light (365 nm). ... 58 Figure 5.2.2.1 - Pressurized liquid extraction set-up. ... 66 Figure 5.3.1 - Three-dimensional response surfaces of the influence of extraction temperature and static extraction time on the extraction yield. ... 70 Figure 5.3.2.1 - Effect (p<0.05) of extraction variables on the recovery of anthocyanins: a) at 50-100 bar, 40-80 ºC and 3-9 min; b) at 80-120 ºC and 9-15 min at a fixed extraction pressure of 50 bar (1, pressure; 2, temperature; 3, static time)... 72 Figure 5.3.2.2 - Three-dimensional response surfaces of the influence of temperature and static extraction time on recovery of anthocyanins ... 73 Figure 5.3.3.1 - Effect (p<0.05) of extraction variables on the recovery of total phenolic compounds: a) at 50-100 bar, 40-80 ºC and 3-9 min; b) at 80-120 ºC and 9-15 min at a fixed extraction pressure of 50 bar (1, pressure; 2, temperature; 3, static time). ... 75 Figure 5.3.3.2 - Three-dimensional response surfaces of the influence of temperature and static extraction time on recovery of total phenolic compounds. ... 76 Figure 5.3.4.1 - Kinetics curves: a) overall extraction yield; b) recovery of anthocyanins; c) recovery of total phenolic compounds under optimum PLE conditions (50 bar, temperature of 80 °C and 9 min of static extraction time). ... 81 Figure 6.2.1 - Diagram of High Pressure Carbon Dioxide Assisted-Extraction (HPCDAE) system. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 Manometers; 4 Valves; 5 Thermostatic bath; 6 Pump; 7 Back pressure regulator; 8 Heating bath; 9 High pressure vessel; 10 Thermocouple; 11 Temperature controllers; 12 Micrometric valve with a heating system. 92 Figure 6.3.1.1 - Three-dimensional response surfaces of the influence of extraction pressure and temperature on recovery of anthocyanins. ... 100 Figure 6.3.1.2 - Two-dimensional response surfaces of the influence of extraction pressure and temperature on recovery of anthocyanins. ... 100 Figure 6.3.2.1 - Three-dimensional response surfaces of the influence of extraction pressure and temperature on the recovery of phenolic compounds. ... 103 Figure 6.3.2.2 - Two-dimensional response surfaces of the influence of extraction pressure and temperature on the recovery of phenolic compounds. ... 104 Figure 6.3.3.1 - Three-dimensional response surfaces of the influence of the extraction variables on the desirability. ... 106 Figure 6.3.3.2 - Profiles of the predicted values and desirability of the extraction variables. ... 106

(14)

xiv Figure 6.3.4.1 - Kinetics curves for the recovery of anthocyanins a) under optimum HPCDAE conditions (117 bar, temperature of 80 °C and of 20 %; b) obtained by control HPCDAE experiment (at atmospheric pressure, temperature of 80 ºC and 20 minutes of extraction) and c) PLE experiment (at 117 bar, temperature of 80 ºC, 20 minutes of

extraction and flow rate of 1 mL/min of acidified water/min). ... 109

Figure 6.3.4.2 - Kinetics curves for the recovery of phenolic compounds a) under optimum HPCDAE conditions (117 bar, temperature of 80 °C and of 20 %; b) obtained by control HPCDAE experiment (at atmospheric pressure, temperature of 80 ºC and 20 minutes of extraction) and c) PLE experiment (at 117 bar, temperature of 80 ºC, 20 minutes of extraction and flow rate of 1 mL/min of acidified water/min). ... 110

Figure 7.2.1.1 - SEM micrograph of unprocessed quercetin sample. ... 122

Figure 7.2.1.2 - SEM micrograph of unprocessed β-carotene sample. ... 122

Figure 7.2.1.3 - SEM micrograph of unprocessed rutin sample. ... 124

Figure 7.2.2.1 - Schematic diagram of the SAS apparatus. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 manometers; 4 valves; 5 thermostatic bath; 6 CO2 pump; 7 back pressure regulator; 8 solution reservoir; 9 solution pump; 10 thermocouple; 11 precipitation vessel; 12 heating bath; 13 temperature controllers; 14 micrometric valve with a heating system; 15 glass flask; 16 glass float rotameter; 17 flow totalizer. ... 126

Figure 7.2.4.1 - Schematic diagram of the RESS apparatus. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 manometers; 4 valves; 5 thermostatic bath; 6 CO2 pump; 7 back pressure regulator; 8 pre-expansion vessel; 9 micrometric valve with a heating system; 10 temperature controller; 11 nozzle; 12 expansion vessel. ... 129

Figure 7.3.1.1.1 - SEM micrograph of quercetin micronized particles obtained by SAS process. ... 133

Figure 7.3.1.1.2 - SEM micrograph of quercetin micronized particles obtained by conventional process... 133

Figure 7.3.1.1.3 - Size distribution of quercetin particles obtained by SAS and conventional processes. ... 135

Figure 7.3.1.2.1 - SEM micrograph of β-carotene micronized particles obtained by SAS process. ... 136

Figure 7.3.2.1.1 - Optical micrographs of: 1) PEG sample; 2) bixin-rich extract encapsulated in PEG by SAS process (CO2 flow rate of 0.6 kg.h-1; mass ratio between core material and PEG of 1:10); 3) rutin encapsulated in PEG by RESS process (mass ratio between core material and PEG of 1:10); 4) anthocyanin-rich extract encapsulated in PEG by RESS process (mass ratio between core material and PEG of 1:10)... 140 Figure 7.3.2.1.2 - SEM micrographs of: 1) bixin-rich extract encapsulated in PEG by SAS process (CO2 flow rate of 0.6 kg.h-1; mass ratio between core material and PEG of 1:10); 2) rutin encapsulated in PEG by RESS process (mass ratio between core material and PEG of 1:2); 3) rutin encapsulated in PEG by RESS process (mass ratio between core material

(15)

xv and PEG of 1:10); 4) anthocyanin-rich extract encapsulated in PEG by RESS process (mass ratio between core material and PEG of 1:10). ... 141 Figure 8.8.2.3.1.1 - Schematic diagram of the RESS apparatus. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 manometers; 4 valves; 5 thermostatic bath; 6 CO2 pump; 7 back pressure regulator; 8 pre-expansion vessel; 9 micrometric valve with a heating system; 10 temperature controller; 11 nozzle; 12 expansion vessel. ... 158 Figure 8.2.3.2.1 - Encapsulation by entrapment in Ca-alginate beads. ... 162 Figure 8.3.1.1 - Optical micrographs of unprocessed PEG (a), Encapsulated anthocyanin extract – T: 313.15 K; P: 100 bar (b), Encapsulated anthocyanin extract – T: 323.15 K; P: 100 bar (c) ... 166 Figure 8.3.1.2 - Influence of different proportions of anthocyanin extract:PEG on the percentage of encapsulated (gray bars); encapsulation efficiency (black bars) ... 168 Figure 8.3.1.3 - Antioxidant activity of encapsulated anthocyanin extracts obtained using different operating RESS conditions (gray symbols), the anthocyanin extract (♦) and pure synthetic BHT (■); without any antioxidant compound (▲) ... 169 Figure 8.3.3.1 - Degradation of free anthocyanin extract at different environments. ... 170 Figure 8.3.3.2 - Degradation of encapsulated anthocyanin extract at different environments by RESS process and conventional method. ... 171 Figure 8.3.4.3 - DSC thermograms of free anthocyanin extract, Ca-alginate beads, PEG, anthocyanin extract encapsulated in Ca-alginate beads and anthocyanin extract encapsulated in PEG. ... 173 Figure 8.3.4.1 - The cumulative release of anthocyanin extract from the encapsulated systems obtained by RESS process and conventional method at pH 1.4 and temperature 37 ºC. ... 174 Figura A1- Esquema das transformações estruturais das antocianinas em função do pH gerando soluções coloridas. ... 201 Figura A2- Espectro de varredura para os extratos de casca de jabuticaba obtidos utilizando diferentes métodos de extrações. ... 203 Figura A3 - Curva de calibração previamente construída de ácido gálico (AG) ... 206

(16)

xvi NOMENCLATURAS/ABREVIATURAS

RESS - Rapid Expansion of Supercritical Solutions SAS - Supercritical fluid Anti-Solvent

SSI - Supercritical Solvent Impregnation PGSS - Particles from Gas Saturated Solutions SFEE - Supercritical Fluid Extraction of Emulsions GRAS - Generally Recognised as Safe

PEG - PolyEthylene Glycol

SFE - Supercritical Fluid Extraction PLE - Pressurized Liquid Extraction

USFE - Ultrasound-Assisted Supercritical Fluid Extraction LPLE - Low Pressure Liquid Extraction

ASE – Accelerated Solvent Extraction PSE - Pressurized Solvent Extraction RSM - Response Surface Methodology

HPCDAE - High Pressure Carbon Dioxide Assisted Extraction SCFs - SuperCritical Fluids

(17)

xvii RESUMO

A indústria de alimentos está constantemente à procura de compostos que apresentam propriedades físicas e químicas para melhorar seus produtos. A maioria destes compostos são aditivos com propriedades antioxidantes, corantes ou aditivos com efeitos positivos sobre a saúde humana. Aditivos naturais são sempre preferíveis aos compostos sintéticos. Flavonóides e carotenóides são duas das principais classes de pigmentos funcionais pelas quais as indústrias de alimentos, cosmética e farmacêutica têm apresentado maior interesse. No entanto, estes compostos apresentam uma série de limitações ao serem aplicados em produtos processados. Diversos fatores, tais como luz, temperatura, pH, entre outros, desencadeiam a degradação oxidativa destes pigmentos funcionais limitando não só a aplicação final destes, mas também restringindo toda a cadeia do processo: desde a escolha do método de extração do pigmento da fonte vegetal até o tratamento que o produto formulado irá sofrer após a sua formulação passando pela escolha do método de redução do tamanho e/ou encapsulação das partículas visando a melhora da taxa de dissolução, biodisponibilidade e estabilidade destes compostos. Tecnologias de extração, micronização e estabilização de pigmentos funcionais por encapsulação em matrizes poliméricas utilizando fluidos pressurizados podem representar uma alternativa ambientalmente correta, uma vez que estão incluídas no conceito de "química verde" e do desenvolvimento sustentável, e economicamente viável em relação aos respectivos métodos convencionais, onde grandes quantidades de solventes orgânicos, longos tempos de processo e altas temperaturas são requeridas, o que pode promover a degradação, isto é, perda de cor e capacidade antioxidante, condições estas normalmente utilizadas nos processos convencionais. Adicionalmente, processos de extração e formação de partículas utilizando fluidos supercríticos permitem um fácil e eficiente controle do processo através de pequenas variações nas condições de operação (Pressão, Temperatura, etc.). Apesar de comercialmente encontrarem-se disponíveis equipamentos distintos para cada processo mencionado uma unidade para pesquisa que possibilite o estudo de diferentes processos com fluidos pressurizados proporcionaria uma melhor relação custo-benefício associada a esta tecnologia. Portanto, uma unidade multipropósito para o desenvolvimento de processos com fluidos pressurizados que possibilite a extração e formação de partículas de pigmentos

(18)

xviii funcionais, bem como de outros compostos bioativos em um único equipamento foi projetada, construída e testada. Processos de extração utilizando CO2 supercrítico ou líquidos pressurizados como solventes, assistidos por dióxido de carbono a alta pressão; de formação de partículas encapsuladas ou não via RESS (Rapid Expansion of Supercritical Solutions) e SAS (Supercritical fluid Anti-Solvent) foram desenvolvidos na unidade multipropósito produzindo resultados semelhantes aos obtidos por equipamentos similares, reprodutíveis e melhores do que quando utilizando processos convencionais.

Palavras-chave: Estabilização, Extração, Fluidos Pressurizados, Micronização, Pigmentos Funcionais.

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xix ABSTRACT

The food industry is continuously searching compounds that present physical and chemical properties to improve their products. Most of them are additives with antioxidant properties, colorants or additives with positive effects to human health. Natural additives are always preferred to synthetic compounds. Flavonoids and carotenoids are two of the major functional pigments class that food, cosmetic and pharmaceutical industries are more interested recently. Nevertheless, these compounds present a series of limitations when applied to processed products. Several factors, such as light, temperature, pH, among others, trigger the oxidative degradation of theses functional pigments limiting not only their final applications, but also restricting all the process chain: from the choice of the extraction method of the pigment from the vegetable source, passing through the choice of the particle reduction and/or encapsulation technique aiming the improvement of the dissolution rate, biodisponibility and stability of these compounds. Technologies for extraction, micronization and stabilization of functional pigments into polymeric matrices using supercritical fluids may represent an environmentally friend alternative, once they are inserted in the concept of green chemistry and sustainable development, and economically viable comparing to conventional methods, wherein large amounts of organic solvents, long process time and high temperatures are required, that can promote degradation, i. e., color and antioxidant activity loss, conditions normally employed on conventional processes. Moreover, extraction and particle formation processes utilizing supercritical fluids permit an easy and efficient process control with little variation on operational conditions (Pressure, Temperature, etc.). Despite distinct commercial equipments are available to carry out each mentioned process a unit for research that can be used to carry out different processes with pressurized fluids would lead to a better cost-benefit relation associated to this technology. Therefore, a multipurpose unit to develop processes with pressurized fluids that can be used for extraction and particle formation purposes of functional pigments, as well as of other bioactive compounds using the same apparatus was designed, constructed and tested. Extraction processes using supercritical CO2, employing pressurized liquid solvents, assisted by high pressure carbon dioxide; particle formation processes to obtain encapsulated or non encapsulated particles via RESS (Rapid Expansion of Supercritical

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xx Solutions) and SAS (Supercritical Anti-Solvent) were done using the multipurpose unit producing comparable experimental results to those obtained by similar equipments. Good reproducibility and better results than those obtained using conventional processes were observed employing our home-made apparatus.

Keywords: Stabilization, Extraction, Pressurized Fluids, Micronization, Functional Pigments.

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1 CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO E OBJETIVOS 1.1 Introdução

O aumento da preocupação dos consumidores sobre o uso de aditivos sintéticos em produtos tem impulsionado as indústrias alimentícias, de cosméticos e farmacêutica em direção à substituição destes aditivos por produtos naturais. Entretanto, dificuldades têm sido encontradas devido, principalmente, à instabilidade destes compostos. Um exemplo são os pigmentos funcionais extraídos de fontes vegetais, tais como as antocianinas e carotenóides (KONG et al., 2003; MIKI, 1991).

Os flavonóides e os carotenóides são responsáveis por uma grande variedade de cores presentes em vegetais, flores, frutas e produtos derivados. Oriundos do metabolismo secundário das plantas, ambas as classes de compostos são de grande importância para a sobrevivência delas, bem como quando ingeridos são responsáveis por diversos benefícios à saúde devido às suas atividades biológicas. Entre tais benefícios encontram-se a redução da incidência de muitas doenças oxidativas, inflamatórias, entre outras (REYNERTSON et al., 2008; ARTS; HOLLMAN, 2005).

Diversos fatores, tais como luz, temperatura, pH, entre outros, desencadeiam a degradação oxidativa destes pigmentos funcionais (SANTOS; MEIRELES, 2009, 2010) limitando não só a aplicação final destes, mas também restringindo toda a cadeia do processo: desde a escolha do método de extração do pigmento da fonte vegetal até o tratamento que o produto final irá sofrer após a sua formulação, passando pela escolha do método de redução do tamanho (micronização) e/ou encapsulação das partículas visando a melhora da taxa de dissolução, biodisponibilidade e estabilidade destes compostos.

O projeto de processos industriais, sob a ótica da sustentabilidade, visa alterações substanciais na indústria atual. Para tanto, é exigido o desenvolvimento de novos processos baseados em matérias-primas renováveis, na utilização mínima necessária de energia e solventes sem restrições ambientais. Neste contexto, as tecnologias baseadas na utilização de fluidos pressurizados parecem oferecer soluções para essas demandas.

Tecnologias de extração de antocianinas e carotenóides utilizando fluidos pressurizados podem representar uma alternativa ambientalmente correta e

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economicamente viável em relação aos métodos convencionais de extração onde grandes quantidades de solventes, longos tempos de extração e altas temperaturas são requeridas, o que pode promover a degradação destes compostos durante o processo extrativo (JU; HOWARD, 2003; NOBRE et al., 2006).

Uma vez extraídos os pigmentos, pré-tratamentos destes aditivos podem ser realizados visando uma maior dissolução e/ou proteção/estabilização destes através de, respectivamente, técnicas de micronização e encapsulação em matrizes poliméricas (SELIM; TSIMIDOU; BILIADERIS, 2000). Técnicas utilizando fluidos pressurizados acima da condição crítica (conhecidos como fluidos supercríticos) permitem os objetivos requeridos sem levar o aditivo às condições que podem ocasionar sua degradação, isto é, perda de cor e capacidade antioxidante, condições estas normalmente utilizadas nos processos convencionais. Adicionalmente, processos de precipitação utilizando fluidos supercríticos permitem um fácil controle da formação de partículas através de pequenas variações nas condições de operação (Pressão, Temperatura, Relação Pigmento: Material de Encapsulação, etc.) (MATTEA; MARTÍN; COCERO, 2008).

Diferentes processos de encapsulação que usam fluidos supercríticos, bem como equipamentos para a realização destes processos, têm sido desenvolvidos. Estes processos podem ser classificados de acordo com a função do fluido supercrítico no processo: solvente [“Rapid Expansion of Supercritical Solutions” (RESS)]; “Supercritical Solvent Impregnation” (SSI); soluto [“Particles from Gas Saturated Solutions” (PGSS)] ou anti-solvente [“Supercritical Anti-Solvent” (SAS); “Supercritical Fluid Extraction of Emulsions” (SFEE)] (MARTÍN; COCERO, 2008).

Geralmente, tanto para os processos de extração com fluidos pressurizados, quanto para os processos de precipitação, solventes GRAS (“Generally Recognised as Safe”) são preferidos, sendo dióxido de carbono, água e etanol os mais utilizados. Apesar de, comercialmente, encontrarem-se disponíveis equipamentos distintos para cada processo, uma unidade para pesquisa que possibilite o estudo de diferentes processos com fluidos pressurizados proporcionaria uma melhor relação custo-benefício associada a esta tecnologia.

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3 1.2 Objetivos da Pesquisa

1.2.1 Geral

Construir e validar uma unidade multipropósito para o desenvolvimento de processos com fluidos pressurizados que possibilite a extração, micronização e encapsulação de pigmentos funcionais, bem como de outros compostos bioativos em um único equipamento.

1.2.2 Específicos

o Obter extratos ricos nos pigmentos antocianinas e em outros compostos antioxidantes a partir de cascas de jabuticaba utilizando a unidade construída para estudar os seguintes métodos: Extração com Líquidos Pressurizados utilizando etanol ou água acidificada como solvente; Extração Assistida por CO2 a Alta Pressão utilizando água acidificada como solvente, comparando os resultados com os obtidos utilizando o método convencional de Percolação em Leito Fixo;

o Verificar a viabilidade técnica da extração supercrítica assistida por ultrassom na unidade construída, utilizando a extração de pigmentos carotenóides de sementes de urucum por CO2 supercrítico como processo de extração modelo;

o Verificar a viabilidade técnica da encapsulação/co-precipitação de extrato rico em carotenóides oriundo de sementes de urucum, com o polímero polietilenoglicol (PEG) via SAS, utilizando a unidade construída e CO2 supercrítico como anti-solvente;

o Verificar a viabilidade técnica da encapsulação/co-precipitação de extrato antociânico de casca de jabuticaba e do pigmento funcional também da classe dos flavonóides rutina, com o polímero polietilenoglicol (PEG) via RESS utilizando a unidade construída e CO2 supercrítico como solvente e etanol como co-solvente; o Otimizar o processo de encapsulação/co-precipitação de extrato antociânico de

casca de jabuticaba com o polímero polietilenoglicol (PEG) via RESS, utilizando a unidade construída e CO2 supercrítico como solvente e etanol como co-solvente, comparando os resultados relacionados à estabilidade com os obtidos pelo método

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convencional de gelificação iônica utilizando o biopolímero alginato como material de encapsulação. Adicionalmente, também se objetivou analisar a influência dos parâmetros de processo pressão e temperatura na estabilidade do extrato antociânico.

1.3 Estrutura da Tese de Doutorado

Esta Tese de Doutorado está dividida em 8 capítulos da seguinte forma:

O Capítulo 1 (Introdução) insere o leitor ao tema central desta tese, colocando, de forma sucinta, os pontos mais relevantes.

O Capítulo 2 (Revisão da literatura) contextualiza o leitor no estado da arte referente a este trabalho de tese.

O Capítulo 3 detalha a construção e o funcionamento da unidade multipropósito.

O Capítulo 4 traz o artigo intitulado “Antioxidant pigment extraction using a home-made pressurized solvent extraction system”, que compara os resultados em termos de eficiência de extração utilizando CO2 supercrítico puro, obtidos pela unidade multipropósito com os obtidos por uma unidade de extração supercrítica comercial, com a finalidade de validação da unidade construída. Para tanto, foram utilizadas como fontes vegetais modelos duas fontes ricas em pigmentos funcionais: sementes de urucum e cascas de jabuticaba. Adicionalmente, neste capítulo, a viabilidade técnica de se desenvolver processos de extrações fracionadas e extrações com fluidos pressurizados assistida com ultrassom foi verificada. De uma maneira geral, este capítulo relata uma etapa fundamental para o sucesso no desenvolvimento do restante do trabalho, uma vez que os resultados obtidos demonstraram que a unidade construída no desenvolvimento de extrações utilizando fluidos pressurizados produz resultados similares aos obtidos por equipamentos comerciais, bem como resultados reprodutíveis.

O trabalho seguinte foi explorar a potencialidade de obtenção de extratos ricos em antocianinas utilizando a unidade multipropósito validada conforme descrito no capítulo anterior. Neste contexto, o artigo apresentado no Capítulo 5, intitulado “Pressurized liquid

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extraction of phenolic compounds from jabuticaba skins: optimization study”, investiga a influência das variáveis: Pressão, Temperatura e Tempo de Extração Estática, e otimiza o processo de extração de antocianinas e outros compostos fenólicos de cascas de jabuticaba utilizando etanol pressurizado. Ao final, os resultados obtidos empregando condições otimizadas foram comparados aos obtidos utilizando o método convencional à baixa pressão de percolação em leito fixo.

O artigo apresentado no Capítulo 6, intitulado “Optimization of bioactive compounds extraction from jabuticaba (Myrciaria cauliflora) skins assisted by high pressure CO2”, traz os resultados obtidos para a extração de antocianinas e outros compostos fenólicos de cascas de jabuticaba também utilizando a unidade construída, porém agora configurada para desenvolver uma metodologia de extração diferente, chamada de extração assistida com CO2 a alta pressão. Neste trabalho é investigada a influência das variáveis: Pressão, Temperatura e Relação entre o Volume de Matéria-prima + Solvente e o Volume de CO2 dentro da célula extratora na extração de antocianinas e outros compostos fenólicos. Ao final, foi realizada uma comparação dos resultados obtidos empregando condições otimizadas com os obtidos desenvolvendo a metodologia de extração com líquidos pressurizados também utilizando esta unidade com o mesmo solvente (Água acidificada) nas mesmas temperatura e pressão.

Continuando com a mesma abordagem descrita no Capítulo 4, de verificar se a unidade construída produz resultados similares aos obtidos por equipamentos similares (validação da unidade multipropósito construída), o Capítulo 7 traz o artigo intitulado “Micronization and encapsulation of functional pigments using supercritical carbon dioxide” que apresenta um estudo comparativo das partículas formadas pela unidade construída com as formadas por outros equipamentos de outros grupos de pesquisa. Adicionalmente, neste capítulo foi estudada a viabilidade técnica de se desenvolver processos de formação de partículas encapsuladas de extrato de sementes de urucum (obtidos conforme descrito no Capítulo 4), de extrato de cascas de jabuticaba (obtidos conforme descrito no Capítulo 5) e de pigmento rutina puro utilizando como material de encapsulação polietilenoglicol (PEG).

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Uma vez demonstrada a potencialidade de formação de partículas encapsuladas de extrato de cascas de jabuticaba empregando a unidade multipropósito no Capítulo 7 este processo foi mais bem explorado no Capítulo 8, bem como foi verificado o potencial de aumento de estabilidade deste extrato quando protegido por matrizes poliméricas. O artigo intitulado “Stabilization of anthocyanins from jabuticaba skins by encapsulation using supercritical CO2” analisa também a influência dos parâmetros de processo pressão e temperatura na estabilidade do extrato antociânico. Ao final, foi realizada uma comparação dos resultados obtidos empregando condições otimizadas com os obtidos utilizando o método convencional à baixa pressão gelificação iônica. De uma maneira geral, este capítulo encerra os objetivos previstos para este trabalho de tese, fechando o ciclo de validação-experimentação dos processos de extração e formação de partículas que a unidade multipropósito pode desenvolver.

O Capítulo 9 (Conclusões gerais) discorre sobre os principais resultados obtidos em cada um dos artigos apresentados nesta tese.

O Apêndice I traz um artigo de revisão sobre as antocianinas, discorrendo sobre a estrutura química, propriedades benéficas à saúde e principais fontes de obtenção destes compostos, enfatizando que para o Brasil as cascas de jabuticaba podem ser uma potencial fonte destes pigmentos instáveis. Já o Apêndice II traz o detalhamento do procedimento de cálculo para a determinação da concentração de antocianinas e compostos fenólicos presentes nos extratos obtidos neste trabalho. O Apêndice III traz um artigo de revisão sobre os métodos de formação de partículas que discorre sobre as vantagens e limitações dos principais métodos empregados atualmente, descrevendo como cada processo é desenvolvido, bem como enfatizando a potencialidade de utilizar os métodos que empregam fluidos supercríticos na formação de partículas encapsuladas em matrizes poliméricas. Finalmente, o Apêndice IV traz o manual de operação da unidade multipropósito construída, detalhando o procedimento adotado para o desenvolvimento dos processos estudados nesta tese, bem como os procedimentos para a realização de outros processos que a unidade possibilita desenvolver.

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Nesta Tese de Doutorado, o desenvolvimento dos capítulos e apêndices apresenta-se através de artigos publicados/submetidos ou a serem submetidos a periódicos. Permissões para a utilização dos artigos publicados em periódicos foram devidamente obtidas com as respectivas editoras, previamente.

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9 CAPÍTULO 2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Pigmentos Funcionais

Existe grande interesse sobre as propriedades benéficas que os componentes nutracêuticos presentes em alimentos propiciam à saúde humana (PALIYATH, 2003). Têm sido adquirido conhecimento científico a respeito dos ingredientes presentes nos alimentos que ingerimos, com potencial para prevenir e tratar doenças específicas. Paralelo a isto, novas tecnologias, como a biotecnologia e a engenharia genética especificamente, têm criado uma era onde descobertas científicas e produtos inovadores são cada vez mais comuns. Estes desenvolvimentos têm resultado num aumento do número de produtos potencialmente nutricionais com benefícios para a saúde, produtos estes chamados de “alimentos funcionais”. Os alimentos funcionais, além do valor nutritivo básico, contêm um equilíbrio próprio de ingredientes, os quais podem ajudar diretamente na prevenção e tratamento de doenças (GOLDBERG, 1994). As substâncias bioativas presentes nos alimentos funcionais representam constituintes “extranutricionais” naturalmente presentes em pequenas quantidades na matriz do alimento (KITTS, 1994).

Estas substâncias bioativas são pertencentes ao grupo dos compostos do metabolismo secundário de plantas, também chamados de compostos fitoquímicos, e podem ser definidos como substâncias derivadas de plantas que são altamente ativas do ponto de vista nutricional, fisiológico e/ou medicinal (GOLDBERG, 1994).

Os pigmentos naturais presentes naturalmente em alimentos proporcionam cor, contribuindo para seu aspecto visual, atributo que está diretamente relacionado à aceitação deste alimento pelos consumidores (CLYDESDALE, 1993). O consumo de um alimento que possui em sua composição aditivos corantes naturais é associado à imagem de um alimento de qualidade e saudável; além dos corantes sintéticos possuírem a tendência de serem vistos como indesejáveis e prejudiciais, alguns são responsabilizados por reações alergênicas e de intolerância (MONTES et al., 2005). Pigmentos das classes dos flavonóides e carotenóides têm sido relacionados a importantes funções e ações fisiológicas, podendo ser considerados promotores da saúde humana. A ingestão de frutas e vegetais está sendo associada com a diminuição do desenvolvimento de doenças

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crônico-10

degenerativas tais como câncer, inflamações, doenças cardiovasculares, catarata, degeneração macular, entre outras (KONG et al., 2003; KRINSKY, 1994). De forma geral, as propriedades antioxidantes destes compostos parecem ser a chave para a elucidação dos mecanismos envolvidos nestas ações.

2.1.1 Flavonóides

Os flavonóides são pigmentos naturais presentes nos vegetais que desempenham um papel fundamental na proteção contra agentes oxidantes, como por exemplo, os raios ultravioleta, a poluição ambiental, substâncias químicas presentes nos alimentos, entre outros. Eles atuam como agentes terapêuticos num elevado número de patologias, tais como arteriosclerose, cancer, etc (PASSAMONTI et al., 2009).

Dado que não podem ser sintetizados pelo nosso organismo, sendo representativos da parte não energética da dieta humana, os flavonóides são obtidos através da ingestão de alimentos que os contenham. Exemplos de fontes de flavonóides são frutas, verduras, cerveja, vinho, chá e soja. A maioria dos flavonóides presentes no vinho provém da uva, especialmente da pele (KOSMIDER; OSIECKA, 2004).

Os flavonóides apresentam uma estrutura química base C6-C3-C6 (dois anéis benzênicos – A e B – ligados através de um anel pirano – C (Figura 2.1.1.1). Dependendo da substituição e do nível de oxidação no anel C, os flavonóides podem ser divididos em 14 classes, sendo os que se incluem na dieta humana divididos essencialmente em 6 grupos (PASSAMONTI et al., 2009; KOSMIDER; OSIECKA, 2004; ERLUND, 2004):

• Flavanóis – possuem um grupo hidroxila na posição 3. Exemplos: catequina, epicatequina.

• Flavonóis – possuem um grupo carbonila na posição 4, um grupo hidroxila na posição 3 e uma ligação dupla entre as posições 2 e 3. Exemplos: quercetina, kaempferol, quercitagetina, etc.

• Flavonas – possuem um grupo carbonila na posição 4 e uma ligação dupla entre as posições 2 e 3. Exemplos: rutina, apigenina, luteoleína, etc.

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• Antocianidinas – possuem um grupo hidroxila na posição 3 e duas ligações duplas: uma entre o átomo de oxigênio e o carbono 2 e outra entre os carbonos 2 e 3. Exemplos: cianidinas, petunidinas, malvidina, etc.

• Isoflavonóides – possuem um grupo carbonila na posição 4 e o anel B encontra-se ligado ao restante da molécula através do carbono 3. Podem ainda possuir uma ligação dupla entre os carbonos 2 e 3. Exemplos: genisteína, coumestrol, etc.

• Flavononas – possuem um grupo carbonila na posição 4. Exemplos: miricetina, hesperidina, etc.

Figura 2.1.1.1 - Estrutura base dos flavonóides.

Dentro da mesma classe, os flavonóides diferem na substituição dos anéis A e B. Estes se encontram na natureza sob a forma de glicosídeos, o que promove uma melhor absorção intestinal e uma maior biodisponibilidade destes compostos. Os glicosídeos formam-se através da união de resíduos de D-glicose à posição 3 ou à posição 7 destes flavonóides, sendo a primeira substituição a mais freqüente. Outros resíduos de açúcares, que também podem se encontrar ligados a este tipo de compostos, são a D-galactose, a L-ramnose, a L-arabinose, a D-xilose e o ácido D-glucurônico (ERLUND, 2004).

As antocianinas são um dos exemplos de flavonóides encontrados na natureza sob a forma de glicosídeos. Antocianinas são compostos derivados das antocianidinas. Nas antocianinas, uma ou mais hidroxilas das posições 3, 5 e 7 estão ligadas a açúcares, aos

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quais podem estar ligados ácidos fenólicos. Os diferentes grupos R e R´ ligados nas posições 3´e 5´ e açúcares ligados nas posições 3, 5 e 7, assim como os ácidos a eles ligados, caracterizam os diferentes tipos de antocianinas, sendo que a mais comum é a cianidina-3-glicosídeo (SANTOS; MEIRELES, 2009). Maiores detalhes sobre as antocianinas: estrutura química, instabilidade, propriedades benéficas à saúde e principais fontes de obtenção destes compostos são encontrados no Apêndice I desta tese. Neste Apêndice também é demonstrado que, para o Brasil, as cascas de jabuticaba (Figura 2.1.1.2) podem ser uma potencial fonte destes pigmentos.

Diversos fatores, tais como luz, temperatura, pH, entre outros, desencadeiam a degradação oxidativa das antocianinas, sendo estes compostos mais estáveis em meios ácidos do que em alcalinos. A natureza da estrutura iônica das antocianinas possibilita mudanças na estrutura molecular de acordo com o pH, resultando diferentes cores. Em pH < 3, a antocianina cianidina-3-glicosídeo, por exemplo, existe primariamente como uma estrutura molecular que resulta na cor vermelha. Aumentando-se os valores de pH do meio, novas formas moleculares são produzidas, resultando em cores que vão desde o violeta a uma forma incolor. Zhang et al. (2010) sugere que a degradação da cianidina-3-glicosídeo se inicia devido a facilidade de se hidrolisar o grupo glicosídeo ligado a estrutura base. Um esquema das transformações estruturais das antocianinas em função do pH gerando soluções coloridas é apresentado no Apêndice II.

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Além da identificação dos tipos de antocianinas presentes nos extratos, a determinação da sua concentração, bem como de outros compostos co-extraídos, é de extrema importância, pois elas estão associadas às funções biológicas destes extratos. Para a determinação da concentração dos flavonóides antocianinas nos extratos, os métodos baseados nas transformações estruturais das antocianinas em função do pH, gerando soluções coloridas, têm propiciado resultados confiáveis, sendo o método denominado de método do pH diferencial descrito por Giusti e Wrolstad (2001) um dos mais utilizados. Maiores informações sobre o procedimento de cálculo deste método são encontradas no Apêndice II desta tese. Neste Apêndice também é descrito como é feito o cálculo da concentração de compostos fenólicos presentes nos extratos (incluindo a concentração de antocianinas e outros compostos fenólicos co-extraídos).

2.1.2 Carotenóides

Os carotenóides são uma classe de compostos lipofílicos amplamente conhecidos pelo seu poder corante que pode variar do amarelo ao vermelho. A sua estrutura básica é um tetraterpeno com 40 átomos de carbono, formado por oito unidades isoprenóides de cinco carbonos, ligados de tal forma que a molécula é linear com simetria invertida no centro. A principal característica dos carotenóides é um sistema de ligações duplas conjugadas, que corresponde ao cromóforo, e que permite a estes compostos absorver luz na região do visível, como pode ser observado na estrutura do β-caroteno (Figura 2.1.2.1) (MIKI, 1991).

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Os carotenóides são inicialmente divididos em dois grandes grupos, os carotenos que quimicamente são hidrocarbonetos, e as xantofilas que são derivados oxigenados. Neste último grupo estão incluídos pigmentos que possuem em sua estrutura grupos hidroxílicos, carbonílicos, carboxílicos e/ou epóxidos. Podendo ser também acíclicos, monocíclicos ou bicíclicos. Muitas outras modificações estruturais ainda são possíveis, permitindo obtenção de uma diversidade de compostos (BRITTON, 1995). Alguns dos tipos de carotenóides mais amplamente distribuídos na natureza são: β-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina, bixina, entre outros (MCCLEMENTS et al., 2009; ALBUQUERQUE; MEIRELES, 2010).

A significância dos carotenóides não é somente devido às suas propriedades corantes, eles também são muito importantes para a saúde. Estes compostos também desempenham importante papel nutricional como precursores de vitamina A, além de outras ações, tais como proteção contra alguns tipos de câncer, doenças cardiovasculares, cataratas, degeneração macular e melhoria do sistema imunológico (GOUVEIA; EMPIS, 2003; ROBERT et al., 2003).

Edge, McGarvey e Truscott (1997) associaram, em seus estudos, as funções biológicas dos carotenóides em seres humanos. De acordo com estes autores, esses compostos podem ser importantes na proteção de células atuando como antioxidantes contra radicais livres e seqüestrando oxigênio singlete devido ao seu longo sistema de ligações duplas conjugadas.

Pigmentos das classes dos carotenóides, assim como os da classe dos flavonóides, têm sua degradação oxidativa acelerada pela luz, temperatura e/ou pH extremo na presença de oxigênio (SANTOS; MEIRELES, 2010).

Comercialmente, uma das fontes vegetais de pigmentos mais amplamente utilizadas pela indústria de alimentos é o urucum (Bixa orellana), correspondendo em torno de 90% do total de consumo de corantes naturais no Brasil, e em torno de 70% de corantes naturais mundialmente empregados em alimentos (CONSTANT; STRINGHETA; SANDI, 2002). No Brasil, o urucum é uma espécie economicamente importante e ocorre em todas as regiões brasileiras e sua disseminação em diversas regiões do mundo está relacionada

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com a procura por corante natural pelas indústrias de medicamentos, cosméticos, têxteis e principalmente alimentar (FRANCO et al., 2008).

Urucum (Bixa orellana L.) é uma arvore tropical cujas sementes são ricas no pigmento da classe dos carotenóides conhecido como bixina, o qual é somente encontrado nesta fonte vegetal. Quimicamente bixina (C25H30O4) é um mono-metil ester do ácido dicarboxílico norabixina, um outro importante pigmento encontrado nas sementes de urucum (Figura 2.1.2.2). Entre outras aplicações, estes corantes são usados pela indústria alimentícia para melhorar queijos, margarinas e manteigas (ANDERSON et al., 1997).

Figura 2.1.2.2 - Sementes de urucum.

2.2. Métodos de Extração

Existem, na literatura, várias metodologias de obtenção de extratos de vegetais, utilizando vários solventes, empregando ou não altas pressões e temperaturas ou até mesmo associando metodologias no intuito de obter um ou mais extratos com o perfil fitoquímico desejável, com alto rendimento e que não possua características indesejáveis como a presença de compostos co-extraídos como ceras e clorofila e a presença residual de solventes (BRAGA, 2005). A seguir são descritos alguns métodos que foram utilizados na obtenção de extratos ricos em antocianinas e no carotenóide bixina.

O solvente mais utilizado na extração de antocianinas é o metanol, apesar da sua toxicidade. Entretanto, para algumas aplicações onde o aspecto quantitativo não é

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prioritário, etanol e água também têm sido utilizados. A limitação do uso de etanol e água está relacionada com a menor eficiência na extração de antocianinas (TERCI, 2004). Estas metodologias, também chamadas de convencionais, implicam na co-extração de compostos não fenólicos como açúcares, ácidos orgânicos e proteínas, requerendo uma subseqüente purificação destes extratos, uma vez que estes processos geralmente apresentam baixa seletividade (CASTAÑEDA-OVANDO et al., 2009).

Comumente, métodos de extração convencionais, tais como soxhlet, por agitação, por percolação em leito fixo, entre outros, são utilizados nos processos de extração de antocianinas, entretanto, estes métodos geralmente consomem muito tempo e grande quantidade de solventes e podem degradar estes compostos durante o processo extrativo. Segundo Pinedo (2007), a hidrólise completa dos açúcares ligados a antocianinas, açúcares que propiciam melhor estabilidade dos pigmentos após a extração, ocorre em 1 hora a 333,15 K na presença de etanol acidificado com 1% de HCl.

Visando eliminar estas limitações, métodos de extrações rápidas que utilizam fluidos pressurizados têm sido empregados com sucesso para a obtenção de extratos ricos em antocianinas (ARAPITSAS; TURNER, 2008). Também, a utilização de tratamentos com ultrassom e CO2 a alta pressão, auxiliares ao processo extrativo de antocianinas, tem demonstrado melhorar o desempenho da extração, aumentando rendimento, reduzindo o tempo de extração, etc. (CAI et al., 2003; XU et al., 2010).

Extratos comerciais de sementes de urucum são obtidos utilizando vários processos, tais como extração com óleos vegetais, com solução alcalina e com solventes orgânicos: clorofórmio, diclorometano, acetona e metanol (PRESTON; RICKARD, 1980). As preparações de extratos ricos em pigmentos têm as desvantagens de conterem pequenas concentrações do composto bioativo alvo (bixina), bem como apresentar solvente tóxico no produto final. Suspensões de extratos de urucum em óleos vegetais são mais concentradas, mas podem conter produtos de degradação devido ao fato de altas temperaturas (> 100 ºC) serem empregadas nestes processos, afetando a qualidade do extrato (MCKEOWN; MARK, 1962; REITH; GIELEN, 1971).

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Visando eliminar estas limitações, o emprego de fluidos pressurizados em condições supercríticas como solventes de extração na obtenção de extratos ricos no carotenóide bixina tem se demonstrado uma potencial opção (MENDES et al., 2003).

A alta seletividade do processo de extração supercrítica, através de pequenas alterações nas variáveis do processo (pressão e temperatura), aliada à eliminação de solventes residuais no produto final e ao uso de baixas temperaturas ao se utilizar CO2 supercrítico puro na obtenção de extratos ricos em bixina a partir de sementes de urucum, têm sido as principais justificativas para a utilização deste método de extração em substituição aos métodos convencionais (ANDERSON et al., 1997; NOBRE et al., 2006; SILVA et al., 2008).

2.2.1 Extração com Fluidos Pressurizados

Os fluidos supercríticos caracterizam-se por a sua temperatura e pressão serem superiores aos correspondentes valores críticos. Acima do ponto crítico, deixa de haver tensão superficial e separação entre as fases líquida e gasosa em equilíbrio, formando-se uma única fase supercrítica, cujas propriedades são intermediárias daqueles dois estados. Abaixo do ponto crítico o fluido pode existir como um líquido ou como um vapor (SANDLER, 1989). A Tabela 2.2.1.1 registra a pressão e temperatura críticas de alguns fluidos com interesse em processos de extração.

Tabela 2.2.1.1 - Propiedades críticas de alguns fluidos com interesse em extração (MENDES et al., 2003) Fluido Tc (ºC) Pc (bar) Etileno 9,4 50,4 Dióxido de carbono 31,1 73,8 Etano 32,4 48,8 Óxido nitroso 36,6 72,4 Propano 96,8 42,5

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Etanol 240,9 61,4

Benzeno 289,1 48,9

Tolueno 318,8 41,0

Água 401,3 221,2

Nas proximidades da região crítica, os fluidos não apenas são solventes eficazes para a extração de compostos bioativos de fontes vegetais, mas apresentam uma série de peculiaridades que os tornam mais vantajosos com relação aos solventes líquidos, comumente utilizados (REZENDE, 1998). Algumas peculiaridades/vantagens são:

* Ausência de resíduos do solvente nos produtos (extratos);

* Uma variedade maior de solventes pode ser utilizada, já que as características básicas da extração supercrítica devem-se, além das propriedades do solvente, às condições termodinâmicas;

* A seletividade de um dado soluto, em uma solução do solvente, pode ser controlada, manipulando-se a densidade do solvente.

2.2.1.1 Extração com Líquidos Pressurizados

Um fluido pressurizado e aquecido à pressões e temperaturas abaixo das críticas pode existir como um líquido ou como um vapor. No caso de o fluido ser etanol ou água, por exemplo, à pressões menores que 200 bar e temperaturas menores que 200 ºC este fluido se mantém no estado líquido, apesar de a temperatura estar acima da sua temperatura de ebulição a pressão atmosférica. A utilização destes fluidos nestas condições em processos extrativos permite uma melhora da solubilidade dos compostos a serem extraídos, bem como uma aceleração da cinética de dessorção destes compostos da matriz vegetal (RICHTER et al., 1997).

Nestes processos, a utilização de elevada temperatura de extração aumenta a capacidade do solvente de solubilizar os compostos alvo, já o emprego de altas pressões

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acelera a difusão nos poros da matriz e diminui a viscosidade do solvente, causando uma maior penetração do solvente na matriz e, portanto aumentando sua capacidade de extração (LOPEZ-AVILA, 1999).

O método de extração com líquidos pressurizados emprega menor volume de solvente que as extrações convencionais (soxhlet, etc.) e é mais rápido (tempo de extração varia entre 10 e 20 minutos).

De outras perspectivas, incluindo considerações sobre meio ambiente, segurança e economia, muitos esforços têm sido feitos com o objetivo de diminuir o uso de solventes orgânicos nos laboratórios químicos e processos industriais. O uso da água como solvente de extração apresenta vantagens adicionais. A água é barata, não-tóxica, não combustível ou explosiva e é ambientalmente segura. A alta temperatura, o aumento do produto iônico e a mudança na constante dielétrica fazem com que os compostos bioativos a serem extraídos sejam altamente solúveis na água sob estas condições. A constante dielétrica pode influenciar as taxas de extrações com o aumento da polaridade do solvente extrativo. Assim, a densidade pode ser usada para manipular a constante dielétrica e, conseqüentemente as cinéticas de extração (CORRALES; BUTZ; TAUSCHER, 2008; JU; HOWARD, 2003; CACACE; MAZZA, 2002).

Mais detalhes sobre a metodologia de extração com etanol e água pressurizados, particularmente de pigmentos antociânicos, são apresentados nos Capítulos 5 e 6, respectivamente.

2.2.1.2 Extração com CO2 supercrítico

Na maioria das vezes tem-se utilizado o dióxido de carbono para a extração supercrítica de produtos naturais. A grande aceitação do dióxido de carbono deve-se (REVERCHON; OSSÉO, 1994):

* À sua atoxidade, em pequenas quantidades; * À sua não-inflamabilidade;

* Ao seu ponto crítico ocorrer em condições relativamente brandas. A temperatura crítica é de 31,0 °C (304,1 K) e a pressão crítica de 73,8 bar (Figura 2.2.1.2.1);

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20 * À sua estabilidade química;

* À sua disponibilidade a baixo custo. O dióxido de carbono pode ser obtido, por exemplo, a partir de processos fermentativos.

Mais detalhes sobre a metodologia de extração com CO2 supercrítico, particularmente de pigmento bixina da classe dos carotenóides, são apresentados no Capítulo 4.

Figura 2.2.1.2.1 - Diagrama de fase pressão-temperatura do dióxido de carbono.

2.2.2 Métodos de Extração Assistida 2.2.2.1. Com ultrassom

Processos de extração assistidos com ultrassom têm sido cada vez mais estudados, pois o emprego do ultrassom na extração de diferentes fontes vegetais utilizando diferentes solventes de extração tem propiciado: i) um maior rendimento de extração; ii) um aumento da taxa de extração; iii) uma redução no tempo de extração, dentre outras vantagens (VILKHU et al., 2008).

A gama de aplicações do uso da extração assistida com ultrassom inclui ervas, óleos, proteínas e compostos bioativos de materiais vegetais e animais (por exemplo,

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compostos fenólicos, antocianinas, compostos aromáticos, polissacarídeos, etc.) e a gama de solventes de extração já empregados nestes processos incluem água, etanol, hexano, dióxido de carbono supercrítico, entre outros (VINATORU, 2001; RIERA et al., 2010; ROMDHANE; GOURDAN, 2002).

A melhora do processo de extração através do uso do ultrassom tem sido atribuída à propagação das ondas de pressão ultrasônicas, o que resulta em cavitação. Altas forças de cisalhamento provocam o aumento da transferência de massa dos compostos a serem extraídos. Durante esta etapa temperaturas muito elevadas (cerca de 5.000 K) e pressões (aproximadamente 2.000 bar) são atingidas localmente. Quando as bolhas atingem um volume em que já não podem absorver energia, ocorre um colapso violento. Este fenômeno é denominado de cavitação. A implosão das bolhas de cavitação gera microturbulência, colisões entre as partículas em alta velocidade e perturbação nos micro-poros das partículas da matriz vegetal, o que acelera a difusão. Este efeito proporciona uma exposição de novas superfícies aumentando ainda mais a transferência de massa (JIAN-BING et al., 2006).

Os efeitos do ultrassom no processo de extração dependem da freqüência e capacidade do equipamento e do tempo empregado para a extração. Alguns autores têm informado a ocorrência de transformações químicas nos extratos, resultantes da utilização de longos tempos de irradiação ultrasônica (VINATORU, 2001).

Mais detalhes sobre a metodologia de extração assistida com ultrassom são apresentados no Capítulo 4.

2.2.2.2. Com CO2 a alta pressão

O efeito explosivo da descompressão de CO2 a alta pressão em primeiro lugar demonstrou romper células bacterianas através da rápida liberação de pressão de gás com o objetivo de recolher o conteúdo da célula (lise celular). Numerosos estudos têm mostrado a eficácia do uso de CO2 a alta pressão para inativar microrganismos e enzimas (BALABAN et al., 1991; KINCAL et al., 2006).