Efeito do veneno do escorpião Tityus serrulatus em células epiteliais brônquicas humanas (BEAS) e células endoteliais (tEnd)

Texto

(1)UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU. VERA LUCIA SILVA RIGONI. EFEITO DO VENENO DO ESCORPIÃO Tityus serrulatus EM CÉLULAS EPITELIAIS BRÔNQUICAS HUMANAS (BEAS) E CÉLULAS ENDOTELIAIS (tEnd). SÃO PAULO 2013.

(2) UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU. VERA LUCIA SILVA RIGONI. EFEITO DO VENENO DO ESCORPIÃO Tityus serrulatus EM CÉLULAS EPITELIAIS BRÔNQUICAS HUMANAS (BEAS) E CÉLULAS ENDOTELIAIS (tEnd). Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Nove de Julho, como requisito para obtenção do título de Mestre em Medicina.. Orientador: Profª. Drª. Stella Regina Zamuner Co-orientador: Prof. Dr. Rodolfo de Paula Vieira. SÃO PAULO 2013.

(3) Rigoni, Vera Lucia Silva. Efeito do veneno do escorpião Tityus serrulatus em células epiteliais brônquicas humanas (BEAS) e células endoteliais (tEnd)./ Vera Lucia Silva Rigoni. 2013. 50 f. Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho - UNINOVE, São Paulo, 2013. Orientador (a): Pra. Dra. Stella Regina Zamuner. 1. Inflamação. 2. Citocinas. 3. Veneno tityus serrulatus. I. Zamuner, Stella Regina. II. Titulo CDU 615.831.

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(5) DEDICATÓRIA. Ao Criador pelo inestimável presente da vida, pela paz e serenidade para fazer bom uso do meu livre arbítrio, buscando o meu e respeitando a individualidade de cada um. Aos meus queridos pais, Jair Araujo Rigoni e Gilda Silva Rigoni (in memorian), ao meu irmão Marcelo Rigoni e minha cunhada Laís Silva, por me apoiarem e me fazerem acreditar que sou capaz. Aos meus queridos e amados filhos, Caroline Rigoni Jacomino e Luiz Felipe Rigoni Jacomino, razão de toda minha existência, pela qual dedico esta obra. Ao meu marido Luiz Américo Amadei Jacomino, pelo apoio e paciência na minha ausência. À minha orientadora Profª. Drª Stella Regina Zamuner, mestre e mentora, por todo conhecimento compartilhado, pela paciência, confiança, apoio e amizade. Meu exemplo de dedicação e sabedoria. Ao meu querido Amigo (orientador), Prof. Dr. Joelmir Lucena Veiga da Silva, pela força, participação, paciência, amizade, sugestões, sempre disponível a me auxiliar: ”(...) Há orientadores que são gaiolas. Há orientadores que são asas. Orientadores que são gaiolas existem para que os pássaros desaprendam a arte do vôo. Passáros engaiolados são pássaros sob controle. Engaiolados, o seu dono pode levá-los para onde quiser. Pássaros engaiolados sempre têm um dono. Deixaram de ser pássaros. Porque a essência do pássaro é o vôo. Orientadores.

(6) que são asas não amam pássaros engaiolados. O que eles amam são os pássaros em vôo. Existem para dar aos pássaros coragem para voar. Ensinar o vôo eles não podem fazer, porque o võo já nasce dentro dos pássaros. O võo não pode ser ensinado. Só pode ser encorajado. (...)” Meus mais sinceros agradecimentos à vocês dois, Profª. Stella e Prof. Joelmir, por sempre terem sido grandes asas, no meio de tantas gaiolas!!! Adaptação do texto “Gaiola e Asas” de Rubens Alves, colunista da Folha de São Paulo, publicado em 5 de dezembro de 2001, p A3..

(7) AGRADECIMENTOS. Ao Prof. Dr. Humberto Dellê, pelas críticas construtivas e idéias brilhantes. Ao Prof. Dr. Rodolfo de Paula Vieira, pela confiança, apoio e infinitas sugestões. À Profª Ana Paula Ligeiro, pelo suporte nas dosagens de citocinas. À Profª. Drª. Camila Daher, do laboratório de Neurobiologia da dor (USP) e seu aluno de doutorado Adriano, pela colaboração e confiança. À Profª. Silvia Zamuner pela participação e sugestões. À coordenadora da pós graduação da Universidade Nove de Julho (UNINOVE), Profª. Drª Fernanda Consolim Colombo pela oportunidade e confiança. À Profª. Drª. Viviane Louise Andree Nouailhetas, Departamento de Biofísica (UNIFESP) pela convivência, compreensão e apoio. À Drª. Telma Lisboa, grande Amiga, por me incentivar sempre nesta caminhada e me fazer acreditar sempre. À Silene Fernandes da Costa, Amiga e irmã do coração, por sempre me ouvir e compartilhar dos momentos bons e ruins. Aos grandes Amigos Cátia Rosa Trebacchetti, Heloisa Bolorino e Orion Santana, pela inestimável amizade, atenção e apoio sempre. Às alunas de iniciação científica da UNINOVE, Luciana Mioto e Aline pela grande participação e ajuda. Aos colegas da pós graduação, Ana Teresa Barufi Franco, Nikele Andrade, Camila Alves, Adriano Santos, Marcelo de Paula Silva, pela união, colaboração e convivência..

(8) Às queridas técnicas de laboratório de pesquisa da Universidade Nove de Julho (UNINOVE), Luciana Teixeira e Angela Santos, pelas horas que passamos juntas, por serem super prestativas e preocupadas no desenvolvimento da pesquisa e de todo trabalho de bancada. Aos colegas do laboratório de eletrofisiologia do departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo, Thalyta Munhoz, Gabriel Andrade Alves, Amanda Araújo, Marcus Buri pela ajuda e apoio. À mestre e Amiga do laboratório de Biofísica (UNIFESP) Alessandra Campos pela convivência, apoio e amizade. À secretaria da pós. graduação UNINOVE, Denise Freitas pela sua amizade,. carinho e paciência para a realização deste trabalho. À todos que direta ou indiretamente foram responsáveis pela conclusão desta tese..

(9) ÍNDICE RESUMO ............................................................................................................. ABSTRACT ......................................................................................................... Lista de Figuras ................................................................................................. 1.Introdução ....................................................................................................... 1.1 Epidemiologia .............................................................................................. 1.2 Escorpião Tityus serrulatus .................................................................. 1.3 Quadro Clínico do escorpionismo e tratamento ................................ 1.4Comprometimento Respiratório em Resposta ao veneno escorpião Tityus serrulatus 1.5 Células epiteliais brônquicas humanas (BEAS) .................................. 1.6 Considerações gerais sobre o endotélio ............................................. 2. Justificativa .................................................................................................... 3. Objetivos ........................................................................................................ 3.1 Geral ......................................................................................................... 3.2 Específicos .............................................................................................. 4. Material e métodos ........................................................................................ 4.1 Drogas e reagentes ................................................................................ 4.1.1 Células endoteliais de camundongos ........................................ 4.1.2 Células epiteliais brônquicas humanas ..................................... 4.1.3 Veneno do escorpião Tityus serrulatus ..................................... 4.2 Preparação dos meios de cultura celular ............................................ 4.2.1 Meio DMEN .................................................................................... 4.2.2 Meio BEBM .................................................................................... 4.3 Cultura de células ................................................................................... 4.3.1Células endoteliais de camundongo (tEnd) ................................ 4.3.2 Células epiteliais brônquicas humanas(BEAS) ......................... 4.4 Preparação de monocamadas ............................................................... 4.5 Avaliação de Viabilidade Celular (MTT) ................................................ 4.6 Dosagem de LDH .................................................................................... 4.7 Citologia BEAS e tEnd............................................................................ 4.8 Dosagem de citocinas ............................................................................ 4.9 Análise estatística .................................................................................. 5. Resultados ..................................................................................................... 5.1 Análise da viabilidade celular (MTT) .................................................... 5.1.1 BEAS ............................................................................................. 5.1.2 tEnd ............................................................................................... 5.2 Lactato desidrogenase (LDH) ................................................................ 5.2.1 BEAS ............................................................................................. 5.2.2 tEnd ............................................................................................... 5.3 Citologia BEAS ....................................................................................... 5.3.1 ....................................................................................................... 5.3.2 tEnd................................................................................................ 5.4 Interleucinas BEAS ................................................................................. 5.4.1 IL-1β ............................................................................................. 5.4.2 IL-6 ............................................................................................... 5.4.3 IL-8 ............................................................................................... 6.Discussão ........................................................................................................ 7.Conclusão ....................................................................................................... 8. Referências bibliográficas ............................................................................. i iii v 1 1 3 5 10 11 12 14 15 15 15 16 16 17 17 17 18 18 18 18 19 19 19 20 21 21 22 23 24 24 25 26 27 27 28 29 29 30 31 31 32 33 34 40 41.

(10) RESUMO. O escorpionismo é considerado um problema mundial de saúde pública, sendo a espécie Tityus serrulatus a principal causadora de acidentes graves no Brasil. Os sintomas do envenenamento pelo escorpião Tityus serrulatus vão desde dor local até reações sistêmicas severas, como disfunção cardíaca e edema pulmonar agudo, sendo este a principal causa de morte. A quantidade de veneno inoculado, idade, condições físicas e fatores genéticos das vítimas relacionam-se com a gravidade dos sintomas apresentados pelos pacientes. As células endoteliais, em condições fisiológicas, desempenham papel protetor do sistema cardiovascular. Em caso de disfunção ou lesão desse tecido há repercussão sobre a estrutura vascular, tecido adjacente e, por fim sobre o sistema cardiovascular. Já, nas células epiteliais brônquicas após injúria, ocorre mecanismo de reparo mediado por citocinas e fatores de crescimento, ocorrendo também proliferação e diferenciação celular após o dano epitelial. Assim, o presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito modulador do veneno do escorpião Tityus serrulatus em células endoteliais e células epiteliais brônquicas, analisando a viabilidade destas células e o mecanismo de inflamação pela qual são acometidas. Para tanto, as células em estudo foram cultivadas e incubadas em placas de cultura com o veneno do escorpião Tityus serrulatus, em diferentes concentrações e em diferentes períodos de tempo. O mecanismo inflamatório foi avaliado através da dosagem. de. citocinas. no. sobrenadante. destas. células.. Os. resultados. demonstraram que o veneno de Tityus serrulatus alterou a viabilidade de i.

(11) monocamadas das células epiteliais brônquicas e células endoteliais, sendo que esse efeito foi mais evidente nas células epiteliais brônquicas. Ainda, os resultados demonstraram que o veneno induz a liberação das citocinas IL-1, IL-6 e IL-8. Estes estudos ampliam o conhecimento das ações do veneno do escorpião Tityus serrulatus nas células endoteliais (tEnd) e epiteliais brônquicas (BEAS), comprovando assim alterações na fisiologia pulmonar que poderão contribuir para uma melhor estratégia de tratamento do envenenamento escorpiônico.. Palavras chave: células epiteliais brônquicas, veneno Tityus serrulatus, escorpião, citocinas, inflamação, células endoteliais.. ii.

(12) ABSTRACT. The scorpionism is considered a public health worldwide, with Tityus serrulatus the main cause of accidents in Brazil. Symptoms of envenomation by Tityus serrulatus ranging from local pain to severe systemic reactions such as cardiac dysfunction and pulmonary edema, which is the leading cause of death. The amount of venom injected the age, physical and genetic factors of the victims are related to the severity of the symptoms presented by patients. Endothelial cells under physiological conditions play a protective role in the cardiovascular system. In the case of dysfunction or injury of that tissue occurs repercussion in. the. vascular structure, surrounding tissue, and finally on the cardiovascular system. In bronchial epithelial cells after injury, occurs repair mechanism mediated by cytokines and growth factors also occur increase in cell proliferation and differentiation after epithelial damage. Thus, this study aims to evaluate the modulating effect of Tityus serrulatus scorpion venom on endothelial cells and bronchial epithelial cells analyzing the viability of these cells and the mechanism by which inflammation occurs. Therefore, the cells in this study are cultured and incubated in culture plates with Tityus serrulatus scorpion venom in different concentrations and periods of time. The inflammatory mechanism was assessed through the measurement of cytokines in the supernatant of these cells. The results showed that Tityus serrulatus venom changed the viability of monolayers of endothelial cells (tEnd), and bronchial epithelial cells (BEAS), and this effect was more marked in bronchial epithelial cells. The results also demonstrate that the venom induces the release of cytokines IL-1, IL-6 and IL-8. iii.

(13) This study extend the knowledge of the actions of the venom of the scorpion Tityus serrulatus on bronchial epithelial and endothelial cells thus demonstrating changes in pulmonary physiology that may contribute to a better treatment strategy of scorpion envenomation.. Key Words: bronchial epithelial cells, Tityus serrulatus venom, scorpion, cytokines, inflammation, endothelial cells.. iv.

(14) LISTA DE FIGURAS. Fig.1 Notificações de acidentes por animais peçonhentos no Brasil 1 Fig.2 Distribuição geográfica dos escorpiões da espécie TsV no Brasil 3 Fig.3 Escorpião Tityus serrulatus 4 Fig.4 Efeito do TsV (0,5 - 10µg/mL) na viabilidade (MTT) de BEAS 24 Fig.5 Efeito do TsV (10 - 50µg/mL) na viabilidade (MTT) de BEAS 25 Fig.6 Efeito do TsV na viabilidade de tEnd 26 Fig.7 Efeito do TsV na liberação de LDH nas BEAS 27 Fig.8 Efeito do TsV na liberação de LDH nas tEnd 28 Fig.9 Aspecto citológico das células BEAS 29 Fig.10 Liberação de IL-1β induzida pelo TsV em BEAS 30 Fig.11 Liberação de IL-6 induzida pelo TsV em BEAS 31 Fig.12 Liberação de IL-8 induzida pelo TsV em BEAS 32. v.

(15) 1. INTRODUÇÃO. 1.1 Epidemiologia. O escorpionismo representa um problema mundial de saúde pública, sendo que aproximadamente 1,2 milhões de acidentes ocorrem anualmente, com mais de 3.250 óbitos/ano (Chippaux et al., 2008). No Brasil, dentre os acidentes causados por animais peçonhentos, o escorpionismo é o que vem crescendo ao longo dos anos, segundo dados do Sistema de Informações de Agravos de Notificações, do Ministério da Saúde (Fig. 1).. Figura 1: Notificações de acidentes por animais peçonhentos no Brasil.. 1.

(16) Em 2012, foram notificados 65.008 casos novos de acidentes por escorpiões no Brasil, ou seja 45% do total de acidentes por animais peçonhentos (SINAN, 2012). Os escorpiões são. classificados. como. animais peçonhentos, sendo. capazes de gerar diferentes tipos de reações nos animais no qual injetam seu veneno, geralmente acompanhado de muita dor. Os escorpiões têm hábitos noturnos. Encontram-se em pilhas de madeiras, cercas, sob pedras, cupinzeiros, muros cobertos por plantas onde podem ficar escondidos de 2 até 3 meses (Santos, 1999). Os escorpiões não são agressivos para o homem e somente picam quando tocados ou se sentem ameaçados. São praticamente cegos e sentem suas presas através de vibrações do solo e apenas a curtas distâncias. Em sua defesa ou para se alimentarem, agarram a vítima com suas pinças, e num movimento de trás para frente, cravam a cauda em seus corpos. É no último segmento da cauda, o télson, que se localizam as glândulas de veneno (Cupo et al., 1999). Existem grandes variações dos venenos das diferentes espécies de escorpião. No entanto, pode-se observar uma sintomatologia muito parecida nas vítimas que tem sido picadas. O efeito tóxico do veneno de escorpião decorre de alguns fatores como: a espécie do escorpião, a capacidade e o estado fisiológico das glândulas de veneno, a dose inoculada, o peso, a idade e o estado de saúde da vítima, sua sensibilidade específica e o local da picada (Santos, 1999). Nos países tropicais, o envenenamento humano por escorpiões é frequente e acidentes fatais são comumente relatados, especialmente em crianças (FreiraMaia et al., 1994). No Brasil, três espécies de escorpiões do gênero Tityus têm 2.

(17) sido responsabilizados por acidentes humanos graves, inclusive casos fatais: Tityus serrulatus (escorpião amarelo), Tityus Bahienses (escorpião marrom) e Tityus stigmurus. O escorpião Tityus serrulatus é a mais importante espécie, que causa maior número de acidentes, e induz às mais severas formas de envenenamento.. Escorpião Tityus serrulatus. No Brasil, o escorpião Tityus serrulatus, que será nossa base de estudo, é encontrado em grande parte de território brasileiro, sendo a espécie mais causadora de acidentes, principalmente na região sudeste (Fig 2).. Figura 2: Distribuição geográfica dos escorpiões da espécie Tityus serrulatus no Brasil.. 3.

(18) O escorpião Tityus serrulatus (Fig. 3) possui alta plasticidade ecológica, podendo ser encontrado em florestas tropicais, pradarias, savanas, florestas temperadas, cavernas e montanhas (revisado por Cologna et al., 2009). Essa espécie é oportunista, pois, se adapta muito bem em ambientes modificados pela ação do homem, com falta de saneamento básico e problemas de coleta de lixo, onde se acumulam baratas e outros insetos, que servem de alimento aos escorpiões (Lourenço; Von Eickstedt, 2009). As fêmeas do escorpião Tityus serrulatus são capazes de se autoreproduzirem por partenogênese, forma de reprodução assexuada, a qual ocorre sem a necessidade da fecundação do gameta masculino (Cologna et al., 2009).. Figura 3: Escorpião da espécie Tityus serrulatus.. 4.

(19) Os venenos de escorpiões consistem de uma mistura de compostos farmacologicamente ativos, principalmente proteínas e peptídeos. Tais proteínas são geralmente de baixo peso molecular e com ponto isoelétrico variando entre 8,0 e 9,0 (Miranda et al.,1964). A tityotoxina (TsTX) é um dos componentes mais tóxicos do veneno. O veneno do escorpião Tityus serrulatus (TsV) não é miotóxico, mas apresenta propriedades biológicas, composição. química,. toxicidade, ação. biológica, características farmacocinéticas e farmacodinâmicas muito variáveis (Petricevich et al., 2007). Grande parte das toxinas isoladas de venenos de escorpiões atuam sobre canais iônicos, como os de sódio (Na+), potássio (K+), cálcio (Ca2+) e cloreto (Cl-) que estão presentes em diferentes tipos celulares como neurônios, células musculares e células do sistema imune, sendo essenciais para a manutenção do equilíbrio eletrolítico do organismo (Catterall et al., 2007).. 1.2 Quadro Clínico do escorpionismo e Tratamento. Os envenenamentos por escorpiões progridem com sintomas de dor local a reações sistêmicas severas levando à morte quando não são devidamente tratadas (Cupo et al.,1994). Os sintomas se iniciam dentro de poucos minutos após a picada e normalmente progridem até a máxima severidade dentro de aproximadamente cinco. horas. (Mebs,. 2002). 5.

(20) Os sintomas pós picada do escorpião Tityus serrulatus com atividade sobre o sistema nervoso autônomo é responsável pelo quadro sistêmico, observado principalmente em crianças, nas quais ocorre após intervalo de minutos até poucas horas (2 a 3 horas) podendo surgir diversas manifestações sistêmicas tais como hipertensão arterial, taquipnéia e hiperpnéia, taquicardia e bradicardia, sudorese profunda, vômitos profusos, salivação excessiva, alternância entre agitação e exaustão, convulsões, podendo evoluir para choque cardíaco e edema agudo de pulmão, podendo também induzir uma resposta inflamatória sistêmica ocasionando a liberação de mediadores inflamatórios tanto em pacientes (AbdelHallem, 2006;D Suze et al., 2003; Fukuhara et al., 2003; Magalhães et al., 1999), quanto em modelos experimentais (De Matos et al., 1997; Pessini et al.,2003 Petricevich; Penã, 2002). O tratamento pelo CIT/RS (Centro de Informação Toxicológica do Rio Grande do Sul), e o Ministério da Saúde, recomendam manutenção de sinais vitais e tratamento específico com soro anti-escorpiônico ou anti-aracnídico (Cologna et al., 2009). O objetivo do soro é neutralizar a ação do veneno na circulação. Dessa forma, o tempo entre o acidente e a utilização do soro é importante. A dor local e os vômitos melhoram rapidamente após o uso do soro. Já a sintomatologia cardiovascular regride mais tardiamente. Casos leves não tem indicação de soro; em casos moderados devem ser usadas duas a três ampolas do soro por via endovenosa (EV); enquanto que casos graves possuem indicação de 4 a 6 ampolas do soro, EV. Deve se atentar para as reações ao soro, que ocorrem em 6.

(21) torno de 7,5% dos acidentes que necessitam de soroterapia, com predomínio de lesões cutâneas (Cologna et al.,2009, Cupo et al.,1994). O prognóstico geralmente é bom, principalmente para acidentes leves a moderados. Nos casos graves, as primeiras 48 horas são as que merecem maior atenção, pois é neste período que podem surgir complicações cardiovasculares e pulmonares (Petricevich et al., 2007). O TsV é capaz de exercer uma variedade de efeitos nos tecidos excitáveis, com. ação. no. sistema. nervoso. periférico. aumentando. a. liberação. de. neurotransmissores. Vítimas de envenenamento pelo escorpião Tityus serrulatus podem apresentar várias patologias envolvendo principalmente estimulação do sistema nervoso simpático como taquicardia, hipertensão arterial, sudorese e midríase e estimulação do sistema nervoso parassimpático como bradicardia, hipotensão, secreções e mioses. No sistema nervoso central, as manifestações que podem ocorrer, pela ação do TsV são: irritabilidade, hipertermia, vômitos, tremores e convulsão (Petricevich, et al.,2007). Ainda, após o envenenamento pelo escorpião Tityus serrulatus, podem ocorrer reações sistêmicas severas, como disfunção cardíaca, edema pulmonar agudo e hemorragia alveolar (Petricevich et al,2007). Ademais, dados obtidos tem mostrado disfunção ventricular esquerda em pacientes com edema pulmonar agudo após envenenamento pelo escorpião Tityus serrulatus (Gueron et al.,1996). A disfunção cardíaca tem sido tradicionalmente atribuída ao aumento abrupto da sobrecarga ventricular esquerda, secundária à liberação maciça de catecolaminas pelo TsV (Freire-Maia et al., 1978; Freire-Maia and Campos, 1989).. 7.

(22) O edema pulmonar é a principal causa de morte por envenenamento causado pelo Tityus serrulatus, especialmente em crianças. São sugeridos dois mecanismos responsáveis pela indução do edema pulmonar sendo um deles de origem cardiogênica, pelo qual ocorre disfunção cardíaca ventricular esquerda e o de origem não cardiogênica, pela possível liberação de mediadores inflamatórios por meio da ativação da resposta inflamatória e subsequente aumento da permeabilidade vascular (Benvenuti et al.,2002).Os mediadores inflamatórios de origem não cardiogênica envolvidos no envenenamento pelo TsV incluem as cininas, os fatores de ativação plaquetária (PAF) e as citocinas. inflamatórias. (Freire et al, 1993). Algumas alterações bioquímicas também são observadas, tanto em pacientes quanto em modelos experimentais, como a liberação massiva de angiotensina-II, aumento de marcadores de função hepática, como aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase e gama- glutamil transferase. Ocorre também hiperamilasemia, leucocitose, policitemia, hiperglicemia, que é causada pelo aumento da secreção de cortisol e diminuição dos níveis de insulina. Também foi observado em pacientes, alterações nos níveis plasmáticos de cininas (bradicinina e calicreína), sugerindo que tais componentes podem estar envolvidos na patogênese do envenenamento humano (Corrêa et al.,1997; D’Suze et al., 2003; Fukuhara et al., 2003; revisado por Petricevich, 2010; Ribeiro et al., 2010). Além dos sintomas clínicos e alterações bioquímicas os pacientes severamente envenenados por escorpiões apresentam um aumento significativo nos níveis plasmáticos de mediadores inflamatórios como IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ, TNF-α e óxido nítrico, pouco tempo após o envenenamento, a 8.

(23) presença desses mediadores no soro podem estar diretamente relacionada com as manifestações fisiopatológicas (Abdel-Hallem et al., 2006). Para o tratamento de acidentes moderados e graves causados pelo escorpião Tityus serrulatus é feita a administração endovenosa dos soros antiescorpiônico ou polivalente anti-aracnídico, sendo iniciado o mais cedo possível para que se torne eficaz, já que as toxinas do veneno são rapidamente difundidas do local da picada para os órgãos alvos (FUNASA, 2001; Rezende,1995). Após inoculação pelo TsV, foram observadas alterações pulmonares, como presença de edema e hemorragia alveolar, bem como aumento de neutrófilos e macrófagos, liberação de citocinas e quimiocininas (Petricevich et al., 2007). Ainda, níveis alterados de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α) e anti-inflamatórias (IL-10) podem ser detectadas em indivíduos picados pelo escorpião Tityus serrulatus (Fukuhara et al., 2004). Citocinas são mediadores inflamatórios produzidas por células imunes e não imunes, quando ocorre processos inflamatórios e mediadas em todas as fases dos processos inflamatórios. As citocinas pró inflamatórias tem como função aumentar a resposta inflamatória, enquanto que as citocinas anti-inflamatórias atenuam esta reposta. As IL-1β, IL-6 e TNF-α são consideradas citocinas pró inflamatórias (Simons and Hoyt, 1994), e altas concentrações de IL-1 e TNF-α podem estar associadas com a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), choque séptico e morte (Amaral et al., 1997). Por outro lado, IL-10 inibe a liberação de citocinas pró-inflamatórias e a expressão de enzimas envolvidas em processos. 9.

(24) inflamatórios como Cox 2 (ciclooxigenase 2) e óxido nítrico sintase (Amaral et al., 1997). As citocinas são liberadas por macrófagos em resposta inflamatória ao envenenamento (Petricevich, 2004). Autores como Sofer et al. (1996); Barbouche et al. (1996), Barraviera (1997), Meki: Mohey-el-Dean (1998) e Magalhães et al. (1999) demonstraram um aumento de interleucinas (IL-6, IL-1α e IL-1β), óxido nítrico(NO), interferon gama (IFN-γ) e fator estimulante de colônias monocíticas granulocíticas (GM-CSF) após a picada de escorpiões do gênero Leiurus, Buthotus e Tityus no sangue de pacientes. Estas citocinas podem contribuir para o choque e disfunção cardíaca e pulmonar (Petricevich, 2004, Petricevich et al., 2007). A resposta inflamatória sistêmica com subsequente liberação de citocinas (Chaudry et al., 1989) pode mobilizar leucócitos e causar a liberação de fatores de ativação de plaquetas (PAF), leucotrienos e prostaglandinas (Magalhães et al., 1989; De Matos et al., 2001; Sofer et al., 1996; Meki; Monhey El-Dean, 1998; Petricevich; D’Suze et al., 2003; Fukuhara et al., 2003; Andrade et al., 2007).. 1.3. Comprometimento Respiratório em Resposta ao veneno de escorpião. Tityus serrulatus Segundo Ismael (1995), estudo clínicos das vítimas por escorpiões descrevem diferentes tipos de movimentos respiratórios anormais, tais como taquipnéia, respiração anormal ofegante e falência respiratória. O edema pulmonar é um achado frequente e muitas vezes fatal e implica no surgimento de um padrão ventilatório intenso a ponto de produzir insuficiência respiratória aguda.. 10.

(25) A manifestação mais séria e fatal encontrada nos casos de intoxicação produzida pelo TsV é o edema pulmonar. Os casos de edema pulmonar de origem não cardiogênica estariam relacionados com o aumento da permeabilidade vascular que acompanha a ativação da cascata inflamatória (Amaral e Resende, 1997). A literatura mostra que o edema pulmonar é secundário a ativação de um processo inflamatório, o qual envolve liberação do fator de ativação plaquetária de leucotrienos e prostaglandinas, consequentemente resultando num aumento da permeabilidade. vascular. pulmonar. (De-Matos. et. al.,. 1997).. Ainda,. foi. recentemente mostrado que o edema pulmonar causado pelo TsV não é devido ativação de mastócitos no pulmão (Zuliani et al., 2013). E também o TsV diminui o “clearance” (depuração) do líquido pulmonar de ratos, por uma diminuição da quantidade da bomba Na+/K+-ATPase no epitélio alveolar (Comellas et al., 2003).. 1.4 Células epiteliais brônquicas. As células epiteliais brônquicas humanas (BEAS) são células do trato respiratório humano, sendo consideradas células de defesa contra vários patógenos aéreos (Kim et al., 2013), podendo produzir citocinas e quimiocininas, aumentando a inflamação local e a resposta imune. Após injúria, células epiteliais brônquicas humanas migram, ocorrendo um mecanismo de reparo precoce, sendo mediado por citocinas e fatores de crescimento (Kim et al., 2013), ocorrendo também proliferação e diferenciação celular após o dano epitelial.. 11.

(26) Estudos in vitro sobre a ação do TsV em células epiteliais brônquicas humanas (BEAS) poderão contribuir significativamente no entendimento sobre o mecanismo inflamatório local, contribuindo assim para inovações terapêuticas e farmacológicas futuras.. 1.5 Considerações gerais sobre o endotélio. O endotélio vascular é constituído por uma camada continua de células endoteliais que revestem o lúmem dos vasos e separam o sangue dos tecidos. A sua integridade funcional e estrutural é fundamental para a manutenção da homeostasia e da função circulatória (Moncada et al.,1988). As células endoteliais de um modo geral são alongadas, poligonais e dotadas de ampla superfície. A parte luminal está continuamente exposta às células circulantes e aos componentes plasmáticos. A porção oposta, abluminal, está em contato com a matriz extracelular e tecidos adjacentes, que por meio de integrinas, liga-se a lâmina basal. Esta é constituída por vários tipos de colágenos (tipo IV, V e VII), laminina, sulfato de heparan e de condroitina, proteoglicianos, entactina, nidogênio e sialoglicoproteínas, associados à fribonectina (Ondetti MA & Cushman DW, 1982). O endotélio, além da sua função como membrana semipermeável, é considerado um tecido metabolicamente ativo. Por sua capacidade de sintetizar e secretar inúmeras substâncias que exercem várias funções fisiológicas: a) no metabolismo de substâncias vasoativas, por conter enzimas que transformam a angiotensina I em angiotensina II e inativam a noradrenalina, serotonina e. 12.

(27) bradicinina; b) na hemostasia, por meio da produção de substâncias coagulantes (fator de Von Willebrand; c) inibidor de antígenos dos grupos A e B, fibronectina, colágenos; d) na modulação do tônus vascular, por sua capacidade de produzir e liberar fatores relaxantes da musculatura lisa dos vasos, como o óxido nítrico (Vane et al., 1987). Por outro lado as células endoteliais sofrem alterações de estrutura, função e propriedades metabólicas, em resposta a fatores de crescimento, substâncias vasoativas e citocinas, que variam de acordo com o tecido em que se localizam (Thuillez et al.,2005). Desse modo, o endotélio ativado afeta o crescimento de músculo liso, por sua capacidade de gerar diversos fatores de crescimento que induzem espessamento da parede dos vasos e favorecem o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Carvalho et al.,1996). Em síntese, o endotélio, em condições fisiológicas, desempenham papel protetor do sistema cardiovascular, liberando substâncias que modulam a contração do músculo liso vascular, a sua proliferação, a adesão e a agregação plaquetária e controlam a hemostasia. Portanto, em condições de disfunção ou lesão desse tecido, há repercussão sobre a estrutura vascular, tecido adjacente e, por fim, sobre o sistema cardiovascular.. 13.

(28) 2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO A literatura mostra que o envenenamento causado pelo escorpião Tityus serrulatus apresenta ação neurotóxica, citotóxica e não miotóxica, podendo causar alterações na mecânica pulmonar, bem como liberação de mediadores inflamatórios no sangue de pacientes picados por esse escorpião. Estudos em humanos mostram como principal causa mortis, edema agudo de pulmão e a participação das células pulmonares. O endotélio vascular é formado por células que desempenham várias funções fisiológicas, tanto no metabolismo como na homeostasia, mas em casos de disfunção pode haver repercussão neste tecido e sobre o sistema cardiovascular. Desse modo, o conhecimento das ações in vitro do TsV em células endoteliais (tEnd) e células epiteliais brônquicas (BEAS) poderão contribuir para um melhor entendimento no processo fisiopatológico e para uma melhor estratégia de tratamento do envenenamento escorpiônico.. 14.

(29) 3. OBJETIVOS 3.1 Geral Analisar o efeito in vitro do TsV em BEAS e tEnd.. 3.2 Específicos Através de ensaios in vitro, avaliar o efeito modulador do TsV em cultura de células BEAS e tEnd no que se refere a: - Viabilidade das células pela dosagem de MTT e LDH. - Liberação de citocinas pró inflamatórias IL-1β, IL-6 e IL-8.. 15.

(30) 4. MATERIAL E MÉTODOS. Este projeto foi desenvolvido no laboratório de pesquisa em biologia celular e molecular do curso de Mestrado e Doutorado em Medicina da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) em parceria com o Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Foram realizados os ensaios de viabilidade celular pelo método MTT nas BEAS e tEnd, dosagem da. enzima. lactato desidrogenase no sobrenadante das mesmas incubadas com TsV em diferentes concentrações e em diferentes períodos de tempo. Foram realizados também dosagens das interleucinas IL1β, IL6 e IL8 no sobrenadante das BEAS incubadas com TsV em diferentes concentrações e em diferentes períodos de tempo.. 4.1 Drogas e Reagentes Avidina fosfatase alcalina (Sigma) Bicarbonato de sódio (Merck) Cloreto de sódio (Merck) Cromógeno α nitrofenil fosfato (Sigma) Estreptomicina (Sigma) Glicose (Merck) Hepes (Sigma) Meio BEBM (Bronchial Epithelial Cell Basal Medium, marca Lonza) Meio DMEN (Dulbeccos Modified Eagle Medium, marca Cultilab). 16.

(31) Sal MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5,-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma) NADH (Sigma) PBS gelatina (Sigma) PBS tween (Sigma) Penicilina (Sigma) Piruvato (Sigma) Soro fetal bovino (Cultilab) Tampão fosfato salina (Merck) Tris HCl (Merck). 4.1.1 Células endoteliais de camundongos (tEnd): Foram utilizadas células endoteliais murinas (hibridomas) da linhagem tEnd (thimic endothelium), gentilmente cedidas pelo Dr. Bruno Lomonte, do Instituto Clodomiro Picado, da Universidade da Costa Rica, Costa Rica.. 4.1.2 las epiteliais brônquicas humanas (BEAS-2b): Cedida pelo Prof. Dr. Roger Chammas, do Laboratório de Oncologia Experimental, LIM 24 da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.. 4.1.3 neno do escorpião Tityus serrulatus (TsV): Gentilmente cedido pelo prof. Dr. Fabio Kwasniewski da Universidade Estadual de Londrina, Paraná.. 17.

(32) 4.2 Preparações dos meios de cultura 4.2.1 MEN (Cultilab) O meio de cultura Dulbeccos Modified Eagle (DMEN) utilizado nas tEnd, foi dissolvido em aproximadamente 950 ml de água Milli-Q, sendo adicionados 25 mM de bicarbonato de sódio, 11 mM de HEPES e 11 mM de glicose, sob agitação magnética. O PH foi acertado em 7,4 em pHmetro. Após completar o volume para um litro, a solução foi filtrada em filtros com poros de 0,22 micrômetros de diâmetro no fluxo laminar, aliquotada e colocada em estufa a 37°C por 48 horas para o teste de esterilidade. Posteriormente, o meio DMEN foi armazenado a 4° C até o momento do uso, quando foram suplementados com 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina. Também foi adicionado SFB a 10% segundo o experimento a ser realizado.. 4.2.2 cultura BEBM (Lonza) O meio de cultura BEBM (Lonza) utilizado para BEAS, já vem pronto para uso. Apenas suplementamos com soro fetal bovino (SFB) a 10% e adicionamos 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina.. 4.3 Culturas de células As culturas de células BEAS e tEnd foram cultivadas e mantidas no laboratório de cultivo celular do Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).. 18.

(33) 4.3.1 las endoteliais de camundongo (tEnd) Após o descongelamento das tEnd, estas foram colocadas em um tubo cônico estéril e centrifugadas a 1.111 xg por 05 minutos, desprezando o sobrenadante e ressuspendendo o pellet formado em meio DMEN, suplementado com SFB 10% e penicilina e streptomicina 1%, e colocadas em garrafa de cultura estéril média (75 cm3) e mantidas em estufa com 5% CO2 a 37°C até apresentarem uma boa subconfluência. Para expansão e repique das células tEnd, realizou se a tripsinização e posteriormente expansão para novas garrafas de cultura a cada 2 ou 3 dias.. 4.3.2 las epiteliais brônquicas humanas (BEAS) Para as BEAS foram realizados procedimentos similares de cultivo celular aos das tEnd, exceto o meio de cultura utilizado para as BEAS foi meio BEBM (Lonza), suplementado com SFB 10% e penicilina e streptomicina 0,01%. Para expansão das células epiteliais brônquicas realizamos a observação destas a longo prazo, de 30 a 60 dias, devido a demora quanto a aderência destas células. Após aderência e com uma boa subconfluência, realizamos expansão e repique destas células.. 4.4 Preparação de monocamadas de células endoteliais e epiteliais brônquicas humanas para ensaios com o veneno de Tityus serrulatus: A partir das culturas celulares obtidas, foram feitas as diluições necessárias para a semeadura das células em placas estéreis de 96 poços e colocadas em 19.

(34) estufa com 5% de CO2 a 37°C por 48 horas. Após a confluência, o meio específico para cada tipo celular (tEnd e BEAS) foi retirado e as células foram incubadas com TsV, diluídos nos meios específicos sem suplementação nas concentrações de 10 e 50 µg/mL após 01 hora, 03 horas, 06 horas e 24 horas de incubação.. 4.5. Avaliação. da. Viabilidade. Celular:. Análise. da. Atividade. Mitocondrial Qualitativa: ensaio de MTT. A função mitocondrial das células BEAS e tEnd foi avaliada usando o ensaio. MTT. (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5,-diphenyltetrazolium. bromide). (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). É uma forma de medida da atividade da desidrogenase mitocondrial. Este é um sal tetrazólico que possui cor amarela e após ser metabolizado por desidrogenases presentes nas mitocôndrias de células vivas, origina um sal que cristaliza, os cristais de formazan e cuja concentração pode ser expressa pelo aparelho de Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) (Siewerts et al., 1995). As células foram plaqueadas (106 células/por poço) em placas de 96 poços e após aderência (24 a 48 horas), estas foram carenciadas de Soro Fetal Bovino (SFB) para sincronização do ciclo celular por 24 horas. Os poços foram lavados com PBS e então acrescentados 50 µL de MTT, sendo incubadas na estufa de CO2 por 02 a 03 horas para que ocorra o metabolismo do sal tetrazólico. Em seguida foram acrescentados 50µL de isopropanol por poço e feito a quebra dos cristais de formazan, mecanicamente com auxílio de uma ponteira. A leitura da absorbância nos poços foi realizada em 660 nm no leitor de ELISA.. 20.

(35) 4.6. Avaliação. da. Viabilidade. Celular:. Dosagem. da. Enzima. Desidrogenase Láctica (LDH): A desidrogenase láctica (LDH) é uma enzima intracelular responsável pela oxidação reversa do lactato em piruvato, catalisa a conversão reversível de ácido láctico muscular em ácido pirúvico, um passo essencial nos processos metabólicos que, em última análise, produzem energia celular. É amplamente distribuída. em. todas. as. células. do organismo,. concentrando. se. mais. especialmente no miocárdio, rim, fígado, hemáceas e músculos. A atividade enzimática da LDH, presente no sobrenadante das culturas celulares em estudo, foi tomada como parâmetro da viabilidade celular. Após cada período de incubação, o sobrenadante foi retirado e centrifugado a 1.111 xg (2000 rpm) por 6 minutos. A seguir, 20 µL do sobrenadante foi adicionado a outras placas de cultura de 96 poços, acompanhados da adição de 200 µL do substrato, em tampão fosfato contendo: NaCl 200 mM, NADH 0,2 mM, piruvato 1,6 mM/poço. Foi feita a leitura da densidade óptica a 340 nm, no intervalo de tempo entre 0 e 10 minutos. Os resultados foram expressos pelo decréscimo da D.O. resultante da oxidação do NADH, na presença do piruvato, em relação ao tempo zero.. 4.7 Citologia das BEAS e tEnd Para verificar a citologia das BEAS e tEnd, as mesmas foram fotografadas antes e depois da incubação do TsV na concentração de 50µg/ml por 24 hs (Fig.10). As preparações foram visualizadas em microscópio óptico Nikon TS-100 com objetivas de câmera 40x (abertura numérica: 0,55) e 100x (abertura. 21.

(36) numérica: 1,25). As imagens foram captadas na câmera CCD DS-Fi 1 (Nikon, EUA).. 4.8 Dosagem de Citocinas Para verificar se o TsV incubado nas BEAS e tEnd em diferentes concentrações e em diferentes tempos libera em seu sobrenadante citocinas próinflamatórias, realizou-se a dosagem das citocinas IL-1β, IL-6 e IL-8 pelo método ELISA (enzima imuno ensaio) no sobrenadante colhido destas células. Os sobrenadantes foram coletados 1, 3, 6 e 24 hs após a incubação com o TsV em solução com meio de cultura, para a determinação das citocinas. Após a centrifugação a 277,8 xg (1000 rpm) por 2 minutos, o sobrenadante foi coletado para a determinação dos níveis de IL-6 e IL-1β e IL8. Em resumo, placas de 96 poços foram sensibilizadas com 50 µL do anticorpo de captura (anti- IL-1β ou antiIL-6 ou IL-8) marca Abcam, diluídos em PBS, e incubadas por 2 horas, a 37ºC. Após esse período, os sítios livres foram bloqueados com 200 L de tampão de bloqueio, contendo gelatina 3% em PBS e as placas incubadas por 18 horas, a 4ºC. Após lavagem da placa com PBS/Tween 20 0,05%, 50 L de amostras ou padrões (recombinantes) foram adicionados em cada poço e as placas incubadas por 1 hora, a 37ºC. A placa foi lavada com de PBS/Tween20 0,05% e a ligação aos anticorpos foi detectada pela adição do anticorpo de captura, diluído em PBSgelatina 1% (5 g/mL, 50 L/poço), seguido de incubação por 1 hora a 37ºC. Após lavagem da placa, 50 L de avidina-fosfatase alcalina, na diluição de 1:15000 em PBS-gelatina 1%, foram adicionados e incubados por 1 hora à temperatura ambiente, lavando-se em seguida. Para a revelação, foi utilizado o substrato 22.

(37) cromógeno -nitrofenil fosfato (200 L/mL), diluído em 1:5 em TRIS-HCl pH 9,8 1 M e salina 0,5 M. A absorbância foi determinada em leitor de ELISA (Labsystems Multiscan) a 405 nm e os resultados confrontados a uma curva padrão efetuada com o anticorpo recombinante para a determinação da concentração de cada citocina, representada em ng/mL.. 4.9 Análise estatística Os valores foram expressos em média e desvio-padrão se aderirem à curva de Gauss ou em mediana e intervalo interquartílico se não aderirem. A comparação entre os grupos foi realizada pelo teste de ANOVA, dados paramétricos. O teste de contraste (Pos Hoc) utilizado foi o Pós Teste Dunnet. Os resultados foram considerados estatisticamente significantes se p menor ou igual a 0,05. Os dados foram analisados por meio do programa GraphPadPrism 5.0 (GraphPad. Software,. San. Diego,. CA,. EUA).. 23.

(38) 5. RESULTADOS. 5.1. Determinação do efeito citotóxico do veneno Tityus serrulatus. (TsV): método MTT. 5.1.1 las epiteliais brônquicas (BEAS) O efeito do TsV sobre a viabilidade de BEAS foi analisado nos tempos de 30 e 60 minutos após a adição do veneno na concentração de 0.5, 1, 5 e 10 µg/mL. Os resultados demonstraram que não houve diferença estatisticamente significativa em nenhuma das doses utilizadas que receberam o veneno nos períodos de 30 e 60 minutos (Fig. 4), quando comparado ao controle.. Figura 4. Efeito do veneno Tityus serrulatus (TsV) na viabilidade de células epiteliais brônquicas. Células brônquicas BEAS foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24-48 horas para adesão celular. Após esse período o veneno foi adicionado nas concentrações 0,5, 1, 5, e 10 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 30 e 60 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes.. 24.

(39) Para verificar se o veneno teria uma ação mais tardia ou se doses maiores causariam inviabilidade celular, incubamos o TsV (10 e 50 µg/mL) por 1, 3, 6 e 24 horas e avaliamos a viabilidade celular das BEAS. Como observado na figura 5, o TsV (10 e 50 µg/mL, respectivamente) reduziu de maneira significante a viabilidade apenas após 3 horas (50,1 ± 0,1 e 49,2 ± 2,2 %, respectivamente) e 24 horas (51,1 ± 2,2 e 26,7 ± 2,5 %, respectivamente).. 1 h 3 h 100. A b s (% c o n tr o le ). A b s (% c o n tro le ). 100. 75. 50. 25. 0. 75. 50. * **. 25. 0. [ T s V ] g / m L. [ T s V ] g / m L. 24 h. 6 h 100. A b s (% c o n tro le ). 100. A b s ( % c o n t r o le ). * **. 75. 50. 25. 0. 75. 50. ** **. 25. 0. [ T s V ] g / m L. [ T s V ] g / m L. Figura 5. Efeito do veneno Tityus serrulatus (TsV) na viabilidade de BEAS. As BEAS foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24-48 horas para adesão celular. Após esse período o veneno foi adicionado nas concentrações 10 e 50 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 1, 3, 6 e 24 horas. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes. * p < 0,05, vs controle (ANOVA).. 25.

(40) 5.1.2 Células endoteliais (tEnd). Quando avaliamos a viabilidade de tEnd incubadas com o TsV, verificamos que o veneno não foi capaz de alterar a viabilidade das mesmas, mesmo na concentração mais alta (50 g/mL) e em todos os tempos de incubação (fig. 6).. 1 h. 3 h 100. A b s (% c o n tro le ). A b s (% c o n tro le ). 100. 75. 50. 25. 0. 75. 50. 25. 0. [ T s V ] g / m L. [ T s V ] g / m L. 6 h. 24 h. 100. A b s (% c o n tro le ). A b s (% c o n tro le ). 100. 75. 50. 25. 0. 75. 50. 25. 0. [ T s V ] g / m L. [ T s V ] g / m L. Figura 6. Efeito do veneno Tityus serrulatus (TsV) na viabilidade de tEnd. As tEnd foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24-48 horas para adesão celular. Após esse período o veneno foi adicionado nas concentrações 10 e 50 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 1, 3, 6 e 24 horas. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes.. 26.

(41) 5.2 Determinação do efeito citotóxico do veneno Tityus serrulatus (TsV): dosagem de LDH 5.2.1 las epiteliais brônquicas (BEAS). A perda da integridade da membrana após incubação com TsV foi monitorada pela análise da liberação no meio de cultura da enzima citoplasmática LDH. Células que receberam o veneno, na concentração de. 50 µg/mL,. apresentaram aumento de 85% nos níveis de LDH no sobrenadante, no tempo de 24 horas, comparado ao grupo que recebeu somente meio de cultura (controle). O mesmo efeito não foi observado nos outros tempos estudados e na concentração de 10 µg/mL (fig. 7).. C o n t r o le T s V ( 1 0 g /m L ). 1 .5. m m o l N A D H /m in. T s V ( 5 0 g /m L ). * 1 .0. 0 .5. 0 .0. 1. 3. 6. 24. T e m p o (h ). Figura 7: Efeito do veneno do escorpião Tityus serrulatus (TsV) na liberação de LDH de BEAS.. Células brônquicas epiteliais foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24-48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o TsV (10 e 50 µg/mL), ou meio de cultura (controle) e foram incubadas por 1, 3, 6 e 24 horas. Após cada período de tempo, 20 uL de cada amostra foram adicionados ao substrato e a atividade da LDH foi determinada pelo decréscimo da D.O., como descrito em Material e Métodos. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, * p < 0,05, vs controle (ANOVA).. 27.

(42) 5.2.2 las endoteliais (tEnd) Quando o TsV foi incubado com tEnd, houve liberação significante de LDH no sobrenadante, no tempo de 24 horas nas concentrações de 10 e 50. g/mL,. quando comparado ao grupo que recebeu somente meio de cultura (controle). O mesmo efeito não foi observado nos outros tempos estudados (fig. 8).. mmol NADH/min. 1.2. * *. Controle TsV (10 g/mL) TsV (50 g/mL). 0.9. * 0.6 0.3 0.0. 1. 3. 6. 24. Tempo (h). Figura 8: Efeito do TsV na liberação de LDH de tEnd.. As tEnd foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24-48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o TsV (10 e 50 µg/mL) ou meio de cultura (controle) e foram incubadas por 1, 3, 6 e 24 horas. Após cada período de tempo, 20 uL de cada amostra foram adicionados ao substrato e a atividade da LDH foi determinada pelo decréscimo da D.O., como descrito em Material e Métodos. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes. * p < 0,05, vs controle (ANOVA).. 28.

(43) 5.3 CITOLOGIA. 5.3.1 Citologia de células BEAS após incubação com o veneno de Tityus serrulatus (TsV). As células BEAS em cultura foram observadas em microscopia óptica antes e após 24 horas da incubação de TsV (50 µg/mL). Pode-se observar uma redução na quantidade de células na presença do TsV (Fig. 9 C e D), quando comparadas com o controle (Fig. 9 A e B). Além disso, também se observa uma diminuição do volume citoplasmático (plasmólise) das mesmas. Controle. TsV (50 µg/mL). A. C. B. D. Figura 9: Aspecto citológico das BEAS. As BEAS foram plaqueadas em placas de 96 poços e colocadas para aderir por 24-48 horas. Após esse período foi adicionado o TsV (50 µg/mL) ou meio de cultura (controle) e incubadas por 24 horas, a seguir a placa foi fotografada em microscópio invertido. A e B: controle, C e D: TsV 50 µg/mL (100 e 400x respectivamente). A e C: 10x, B e D: 40x.. 29.

(44) 5.3.2 das células tEnd após incubação com o veneno de Tityus serrulatus (TsV) As células tEnd em cultura foram observadas em microscopia óptica antes e após 24 horas da incubação de TsV (50µg/mL). Pode se observar que não ocorreu uma redução significativa na quantidade de células na presença do TsV (Fig. 10 C e D), quando comparadas com o controle (Fig 10 A e B).. Figura 10: Aspecto citológico das tEnd. As tEnd foram plaqueadas em placas de 96 poços e colocadas para aderir por 24-48 horas. Após esse período foi adicionado o TsV (50 µg/mL) ou meio de cultura (controle) e incubadas por 24 horas, a seguir a placa foi fotografada em microscópio invertido. A e B: controle, C e D: TsV 50 µg/mL (100 e 400x respectivamente). A e C: 10x, B e D: 40x.. 30.

(45) 5.4 Dosagem de interleucinas em células BEAS 5.4.1 Liberação de IL-1β induzida pelo TsV em BEAS.. As concentrações de IL-1β foram avaliadas no sobrenadante de cultura de BEAS, no período de 1, 3, 6 e 24 horas após a incubação com o TsV (10 e 50 µg/mL) ou meio de cultura (controle). O TsV foi capaz de aumentar significativamente a liberação da IL-1β quando foi incubado por 6 horas na concentração 50 g/mL (Figura 10).. Controle TsV (10 g/mL) TsV (50 g/mL). 30. IL1 ng/mL. * 20. 10. 0. 1. 3. 6. 24. Tempo (h). Figura 10: Liberação de IL-1β induzida pelo TsV em BEAS. As BEAS foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24-48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o TsV (10 e 50 µg/mL) ou meio de cultura (controle) e foram incubadas por 1, 3, 6 e 24 horas. As concentrações de IL-1β foram avaliadas por EIA em sobrenadante das células em cultura. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, * p< 0,05, vs controle (ANOVA).. 31.

(46) 5.4.2 Liberação de IL-6 induzida pelo TsV em BEAS.. As concentrações de IL-6 foram avaliadas no sobrenadante de cultura de BEAS, no período de 1, 3, 6 e 24 horas após a incubação com o TsV (10 e 50 µg/mL) ou meio de cultura (controle). Ambas as concentrações estudadas foram capazes de induzir a liberação de IL-6, pelas BEAS, que foi significativamente diferente do controle em todos os tempos analisados, sendo que a maior liberação dessa citocina ocorreu às 3 e 24 horas após a incubação do TsV (Fig. 11).. Controle TsV (10 g/mL) 4000. TsV (50 g/mL). *. IL-6 ng/mL. 3000. * *. 2000. * * *. * * 1000 0. 1. 3. 6. 24. Tempo (h). Figura 11: Liberação de IL-6 induzida pelo TsV em BEAS. As BEAS foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24-48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o TsV (10 e 50 µg/mL) ou meio de cultura (controle) e foram incubadas por 1, 3, 6 e 24 horas. As concentrações de IL-6 foram avaliadas por ELISA em sobrenadante das células em cultura. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, * p< 0,05, vs controle (ANOVA).. 32.

(47) 5.4.3 Liberação de IL-8 induzida pelo TsV em BEAS. As concentrações de IL-8 foram avaliadas no sobrenadante de cultura de BEAS, no período de 1, 3, 6 e 24 horas após a incubação com o TsV (10 e 50 µg/mL) ou meio de cultura (controle). Ambas as concentrações estudadas foram capazes de induzir a liberação de IL-8, pelas BEAS, que foi significativamente diferente do controle em todos os tempos analisados, sendo que a maior liberação dessa citocina ocorreu às 3 e 6 horas após a incubação do TsV (Fig. 12).. Controle TsV (10 g/mL) TSV (50 g/mL). 2500. *. IL-8 ng/mL. 2000. * 1500. * *. 1000 500. *. * *. *. 0. 1. 3. 6. 24. Tempo (h). Figura 12: Liberação de IL-8 induzida pelo TsV em BEAS. As BEAS foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24-48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o TsV (10 e 50 µg/mL) ou meio de cultura (controle) e foram incubadas por 1, 3, 6 e 24 horas. As concentrações de IL-8 foram avaliadas por ELISA em sobrenadante das células em cultura. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, * p< 0,05, vs controle (ANOVA).. 33.

(48) 6. DISCUSSÃO. O TsV é o que causa o maior número de acidentes em humanos, e induz às mais severas formas de envenenamento, quando comparado as outras espécies de escorpião de importância médica no Brasil. No entanto, os estudos da ação deste veneno em células em cultura são escassos. Assim, este trabalho teve como objetivo investigar o efeito in vitro do TsV de em cultura de células epiteliais brônquicas humanas (BEAS) e células endoteliais murinas (tEnd). A literatura mostra que o envenenamento causado pelo TsV causa alterações pulmonares como edema pulmonar agudo, sendo a principal causa de óbito, principalmente em crianças (Amaral e Resende, 1997). No entanto, não está esclarecido os mecanismos celulares pelo qual isto ocorre. Neste estudo avaliou-se a capacidade do TsV em causar injúria em células epiteliais brônquicas e em células endoteliais in vitro. Na primeira fase do trabalho avaliou-se a viabilidade das BEAS e tEnd, pelo método do MTT, onde dosou-se a enzima desidrogenase mitocondrial, pois em casos de injúria ocorre extravasamento desta enzima para o citoplasma das células, onde pode se observar na literatura que o método MTT serve também para estimar o número de mitocôndrias e o número de células vivas em lavado bronco alveolar de cavalos após injúria (Hall JA et al, 2006). Já Xie et al. (2011) determinaram a atividade anti-proliferativa pelo MTT, onde quantificou a viabilidade/morte celular por apoptose em carcinoma mucoepidermóide de pulmão em humanos. Após a avaliação pelo MTT, os resultados mostraram que o TsV foi capaz de diminuir a viabilidade das células BEAS em 3, 6 e 24 horas de incubação 34.

(49) nas concentrações de 10 e 50 g/mL, mostrando que o TsV é tóxico para essas células. Já foi demonstrado que o TsV é capaz de causar alterações na mecânica do tecido pulmonar em camundongos (Peres et al, 2009), onde essas alterações podem ser. decorrentes da toxicidade do veneno sobre as BEAS. como. observamos neste trabalho. Já em períodos mais precoces de incubação (30 min e 1 h) o TsV não causou citotoxicidade. Quando avaliou-se o efeito do TsV nas tEnd, verificou-se que o veneno não é citotóxico para essas células em nenhum dos tempos avaliados e nenhuma das concentrações, resultados semelhantes foram encontrados quando o TsV foi avaliado sobre macrófagos em cultura (Petricevich, 2002). No entanto, não se pode descartar a possibilidade do veneno ter alguma modulação sobre as tEnd, uma vez que o endotélio é um importante componente tecidual que medeia o processo inflamatório e a resposta vascular à injúria pulmonar (Parra-Bonilla G et al., 2010). Para avaliar outra forma de dosagem da viabilidade celular frente ao TsV, dosou-se a liberação da enzima lactato desidrogenase (LDH), uma enzima intracelular que após rompimento da membrana celular é liberada, podendo ser dosada no sobrenadante de cultura celular. A LDH converte piruvato a lactato, gerando NAD, que é importante para sustentação do fluxo glicolítico. A LDH converte o piruvato, que é o produto final da glicólise em lactato na ausência ou em pequenas quantidades de oxigênio, realiza também reação reversa via glicolítica anaeróbica no fígado. Na presença de grandes concentrações de lactato, a enzima exibe inibição por “feedback” e a taxa de lactato a piruvato é reduzida. Na literatura podemos observar que a enzima LDH está presente na 35.

(50) disfunção endotelial e que pode ser considerada uma indicadora de morte celular por necrose (Zhang SL et al, 2010). Já em células endoteliais pulmonares de ratos, é mostrado que uma subunidade da LDH, a LDH-A está relacionada com a regulação do rápido crescimento celular e que a supressão de LDH-A expressa estímulo respiratório mitocondrial e diminuição do crescimento celular, enquanto que em células cancerígenas a LDH-A participa da tumorigênese (Parra-Bonilla et al, 2010). Os resultados mostraram um aumento significante da LDH após 24 horas da incubação do TsV (50 g/mL), tanto nas células BEAS como nas células tEnd, indicando que o TsV leva a lesão celular nos dois tipos celulares estudados. Os dados obtidos demonstraram que o veneno causa tanto a liberação de LDH e alteração da atividade oxidativa mitocondrial em células BEAS. Por outro lado, o veneno causou a liberação de LDH, mas não alterou a atividade oxidativa mitocondrial nas tEnd . A partir desses dados, pode-se sugerir que os mecanismos de ação do TsV sobre a viabilidade das monocamadas de BEASl e tEnd sejam diferentes. A análise citológica das células BEAS está de acordo com a observada na análise bioquímica de citotoxicidade, uma vez que foi observado redução do número de células e do volume citoplasmático na presença do TsV em 24 horas. Esta redução de volume está de acordo com a alteração da bomba Na+/K+ATPase causada pelo TsV relatada em células epiteliais alveolares do tipo II em ratos, que pode contribuir para a morbidade e mortalidade de vítimas que desenvolveram edema pulmonar após a acidente com o TsV (Comellas et al., 2003).. 36.

(51) Com a finalidade de verificar se as BEAS estariam participando da inflamação local, avaliou-se a capacidade das BEAS de produzir citocinas próinflamatórias, visto que diversas citocinas já foram verificadas in vivo após envenenamento pelo Tityus serrulatus. (Fukuhara et al., 2002). As citocinas são um grupo de proteínas muito importantes nos processos de comunicação entre as células. Constituem uma classe de compostos diferentes em termos de origem e função e são fundamentais para o funcionamento adequado da resposta imune inata e adaptativa (Mtodzikowska-Albrecht et al., 2007). Além de sua ação sobre os neurotransmissores, já foi demonstrado que o veneno do escorpião pode estimular a liberação de citocinas principalmente em casos de envenenamento severo (Meki, Monhey-El-Dean, 1998; Zoccal et al., 2011). Níveis elevados de IL-6 foram encontrados no plasma de pacientes picados pelo escorpião Tityus serrulatus (Magalhães et al, 1999; Fukuhara et al., 2003) e ocorreu aumento de IL-6 e IL-1 em camundongos expostos aos venenos dos escorpiões T. serrulatus e Centruroides noxius (Petricevich e Peña 2002; Pessini et al., 2003; Petricevich et al., 2006). Há trabalhos na literatura com o TsV ou toxinas purificadas deste, mostrando que o pico máximo de IL-1β ocorre antes do pico máximo de IL-6. (Petricevich et al, 2007). Baseado nestas informações, estudou-se as citocinas IL-1β, IL-6 e IL-8, pelo fato de estudos mostrarem, em humanos, uma correlação direta dessas interleucinas no plasma, com a severidade do envenenamento pelo TsV (Fukuhara Y D et al, 2003). Os resultados obtidos nas células BEAS, mostrou que houve um aumento significativo na liberação da IL-1β no período de incubação de 37.

(52) 6 horas pelo TsV. Já, o TsV causou um aumento significante das citocinas IL-6 e IL-8, nas células BEAS em todos os períodos de tempo analisados. A IL-1 é sintetizada por vários tipos celulares incluindo as células epiteliais. As ações biológicas da IL-1 são múltiplas e diversificadas. O principal efeito biológico desta citocina é mediar o processo inflamatório. Essa citocina aumenta a síntese e secreção de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos e promove acúmulo de granulócitos, particularmente de neutrófilos, nos sítios de inflamação, através do aumento da expressão de moléculas de adesão nas células endoteliais. A IL-1 causa edema e induz a produção de quimiocinas como a IL-8 e de outras citocinas como o TNF-e a IL-6 (para revisão vide DINARELLO, 1988; 1991; MIZEL, 1989; STYLIANOU & SAKLATVALA, 1998). A IL-6 está relacionada à resposta de fase aguda da reação inflamatória, que é caracterizada por leucocitose,. febre,. aumento. da. permeabilidade. vascular,. alterações. das. concentrações plasmáticas de esteróides, aumento da produção de proteínas de fase aguda (KISHIMOTO, 1989) e aumento da expressão da molécula de adesão ICAM-1 (TILG et al., 1997). A IL-8 é produzida por uma enorme variedade de células (monócitos, linfócitos, células do endotélio ou epitélio, fibroblastos) em resposta a diferentes estímulos como o LPS e a outras citocinas (TNFα, IL-1β). Ainda, a IL-8 é um potente quimiotático e ativador de neutrófilos (Montón et al 1998). Desse modo, pode-se sugerir que as citocinas IL-1β, Il-6 e IL-8, liberadas pelas células BEAS contribuam para o recrutamento leucocitário induzido pelo veneno e/ou aumento de permeabilidade vascular, eventos causados pelo TsV já demostrados na literatura (ZULIANI et al., 2013; Fialho et al., 2011; Peres et al., 2009). 38.

(53) Em conjunto, pelos dados obtidos, verificou-se a ação in vitro do TsV em BEAS e tEnd. Concluiu-se que o envenenamento causado pelo TsV que ocorre no pulmão (mecanismo in vivo) apresenta ação local em BEAS (mecanismo in vitro), e que essas células contribuem para o processo inflamatório observado nos pacientes picados pelo TsV. Podemos também inferir que o TsV é tóxico para BEAS e que esta seria uma das causas das alterações na mecânica pulmonar causada por este veneno. Esses dados colaboram para um melhor entendimento no processo fisiopatológico deste envenenamento, contribuindo para uma conduta médica precoce e mais direcionada da vítima logo após a picada pelo TsV, evitando evolução para o edema agudo de pulmão e morte.. 39.

(54) 7. CONCLUSÃO. √. O veneno de TsV alterou a viabilidade de monocamadas das BEAS e. tEnd, sendo que esse efeito foi mais pronunciado nas BEAS.. √. O TsV induz a liberação das citocinas IL-1, IL-6 e IL-8 pelas BEAS.. 40.