DANIELA ABRANTES LEAL
EFEITO DA TEMPERATURA DE ARMAZENAMENTO NAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E MICROBIOLÓGICAS DE SALSICHAS EMBALADAS A
VÁCUO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, para obtenção do título de Magister Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, que de forma espetacular guiou meus passos, cuidou dos meus sonhos e meu deu forças para alcançar a vitória.
À minha orientadora Regina Célia Santos Mendonça, pela orientação, e confiança. À minha coorientadora Monique Renon Eller, pelo carinho e orientação. A professor Nélio José de Andrade, pelos ensinamentos.
Aos meus pais, Umberto e Raquel pelo amor incondicional, pelas orações constantes que tanto me abençoam, por terem me apoiado em todos os momentos desta caminhada, por acreditarem na minha capacidade e pelos laços de amor eternos. Sem vocês este sonho não se tornaria realidade. Aos meus avós, Pedro e Estela, Sara e Vasco, pelo amor e pelas orações.
À minha irmã, Débora, pelo amor e amizade ao longo da vida, pelos conselhos e ensinamentos. Você é meu orgulho!
Ao meu namorado, Fernando, pelo carinho, companhia, compreensão e principalmente pelo amor dado. Sem você, minha caminhada não seria tão feliz como foi.
À minhas amigas, Mariana e Paula, pela amizade, cumplicidade e momentos de descontração.
À Universidade Federal de Viçosa pela oportunidade de realização do curso. Aos funcionários e técnicos do DTA pelo apoio e disposição em ajudar.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudo.
Ao Nubiomol UFV, em especial a Pedro, pela essencial ajuda com a análise dos dados. A todos os colegas do Laboratório de Microbiologia de Patógenos de Origem Alimentar e Hídrica (LAMPOAH) e do DTA pela amizade e pelas trocas de conhecimento, em especial, Jéssica, Lucas, Luana, Nélio, Maria Paulina, Nayara, Beatriz, Taliny, Camila, Pedro.
A todos os meus verdadeiros amigos pelo apoio, amizade e companheirismo. E a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para eu chegar até aqui,
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SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ... v LISTA DE FIGURAS ... vi RESUMO ... vii ABSTRACT ... ix 1. INTRODUÇÃO GERAL ... 1 2. OBJETIVOS ... 2 2.1. Objetivo geral ... 2 2.2. Objetivos específicos... 2 CAPÍTULO 1 ... 31. DEFINIÇÕES, CLASSIFICAÇÃO E PADRÕES MICROBIOLÓGICOS DE SALSICHAS ... 3
2. PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE SALSICHAS ... 5
3. VIDA ÚTIL DE SALSICHA ... 8
4. MICROBIOTA DETERIORADORA DE PRODUTOS CÁRNEOS ... 9
4.1. Bactérias do ácido lático (BAL) ... 10
4.2. Brochothrix thermosphacta ... 11
4.3. Pseudomonas spp. ... 11
4.4. Clostridium spp. sulfito redutores ... 12
5. SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO APLICADO À MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS ... 12
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 14
CAPÍTULO 2 ... 18
1. INTRODUÇÃO ... 19
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 20
2.1. Coleta e armazenamento das amostras ... 20
2.2. Outros materiais ... 20
2.3. Preparo das amostras ... 20
2.4. Análises microbiológicas ... 21
2.4.1. Contagem de Bactérias láticas ... 21
2.4.2. Contagem de psicrotróficos ... 21
2.4.3. Contagem de Clostridium sulfito redutores ... 21
2.4.4. Contagem de fungos filamentosos e leveduras ... 21
2.5. Análises físicas e químicas ... 22
iv
2.5.2. Atividade de água ... 22
2.5.3. Análise instrumental da cor ... 22
2.5.4. Desprendimento da embalagem ... 23
2.6. Análises estatísticas ... 24
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 24
3.1. Crescimento microbiano ... 24
3.2. Acidez total titulável e Atividade de água ... 28
3.3. Desprendimento da embalagem ... 30
3.4. Análise Instrumental da cor ... 31
4. CONCLUSÃO ... 32
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 32
CAPÍTULO 3 ... 38
1. INTRODUÇÃO ... 39
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 40
2.1. Coleta das amostras ... 40
2.2. Determinação do pH... 40
2.3. Extração de DNA total ... 41
2.4. Sequenciamento ... 42
2.5. Análise dos dados de sequenciamento ... 42
2.6. Análises estatíticas ... 43
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 43
3.1. Análise metagenômica das amostras ... 43
3.2. Análise comparativa dos metagenomas das salsichas ... 46
3.3. Sucessão bacteriana nas salsichas ... 49
4. CONCLUSÃO GERAL ... 52
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 52
v
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1: Quantidade máxima permitida de ingredientes em salsichas...4 Tabela 2: Padrão microbiológico sanitário para salsichas...5 CAPÍTULO 2
Tabela 1:Modelo de regressão ajustado os dados de multiplicação bacteriana em salsichas embaladas a vácuo ao longo do tempo...25 CAPÍTULO 3
vi
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1:
Figura 1: Fluxograma da produção de salsichas...6
CAPÍTULO 2:
Figura 1: Preparo das salsichas para a análise instrumental da cor...22 Figura 2: Esquema utilizado para quantificar o desprendimento da embalagem...23 Figura 3: Multiplicação de bactérias do ácido lático e de psicrotróficos em salsichas embaladas a vácuo armazenadas a 5 °C () e a 15 °C () durante 60 d...24 Figura 4: Limo superficial observado a partir do vigésimo dia em salsichas armazenadas a 15°C...26 Figura 5: Comportamento da acidez total titulável das salsichas armazenadas a 5 °C () e 15 °C () em função do tempo...28 Figura 6: Atividade de água das salsichas armazenadas a 5 °C () e 15 °C () em função do tempo...29 Figura 7: Desprendimento da embalagem de salsichas armazenadas a 5 °C () e 15 °C () em função do tempo...29 CAPÍTULO 3:
Figura 1: Gêneros bacterianos pertencentes ao filo Firmicutes observados nas amostras (A) e espécies do grupo de bactérias do ácido lático (B) presentes nas amostras de salsichas embaladas a vácuo e armazenadas a 5 °C e a 15 °C...43
Figura 2: Gráfico de dispersão bidimensional dos componentes principais para as temperaturas de armazenamento 5 °C (T5) e 15 °C (T15)...45 Figura 3: Gráfico de dispersão bidimensional dos componentes principais para os diferentes lotes de fabricação (L1 e L2)...45 Figura 4: Contagens de sequências bacterianas desconhecidas presentes nas amostras...46 Figura 5: Sucessão microbiana e pH nas salsichas armazenadas a 15 °C...47 Figura 6: Sucessão microbiana e pH nas salsichas armazenadas a 5 °C...48
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RESUMO
LEAL, Daniela Abrantes, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, outubro de 2018. Efeito da temperatura de armazenamento nas características físico-químicas e microbiológicas de salsichas embaladas a vácuo. Orientadora: Regina Célia Santos Mendonça.
Carnes e produtos cárneos possuem características como atividade de água elevada e pH próximo da neutralidade que favorecem a multiplicação bacteriana, o que contribui para a sua rápida deterioração em poucos dias, dependendo das condições de armazenamento. A perda de produtos cárneos por deterioração é problema comumente enfrentado pelas indústrias e por consumidores. Diversos fatores como a qualidade da matéria-prima, condições higiênicas durante o processamento, condições de embalagem e distribuição são relevantes e influenciam no prazo de vida útil de um produto cárneo. Abusos na temperatura de armazenamento aceleram a ocorrência de uma série de reações químicas e bioquímicas no produto, que se torna deteriorado e impróprio para consumo em pouco tempo. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes temperaturas de armazenamento (5 e 15 ºC) na estabilidade e na composição da microbiota bacteriana de salsichas embaladas a vácuo durante a sua vida útil. Salsichas coletadas diretamente na linha de processamento e provenientes de três lotes foram armazenadas a 5 ou 15 ºC e analisadas ao longo de 60 d quanto à presença de bactérias do ácido lático (BAL), psicrotróficos, Clostridium sulfito redutores, fungos filamentosos e leveduras. Avaliou-se também ao longo do tempo a acidez total titulável (ATT), pH, atividade de água (Aa), desprendimento da embalagem (perda de vácuo) e cor das salsichas. Além disso, procedeu-se ao longo dos 60 d, a extração de DNA bacteriano total, para sequenciamento e identificação das espécies que compunham a microbiota das salsichas. A ATT aumentou de 0,13 para 0,26 %, a Aa se manteve praticamente constante (~0,98), o pH foi de 6,4 para 5,9 e o desprendimento da embalagem de 0 para 86 % ao longo dos 60 d nas salsichas armazenadas a 5 °C. Nas salsichas armazenadas a 15 °C a ATT aumentou em quase cinco vezes, a Aa se manteve estável em ~0,98, o pH foi de 6,4 para 5,2 e o desprendimento da embalagem de 0 para 100 %. O aumento da ATT é vista como um indicativo da multiplicação bacteriana nas amostras, especialmente de BAL, que teve sua população aumentada em aproximadamente 7 log nas salsichas armazenadas a 15 ºC e em 6 log naquelas armazenadas a 5 °C. A população de psicrotróficos teve aumento de 7,2 log nas salsichas armazenadas a 15 °C e de 6,8 ciclos log nas salsichas a 5 °C. Não foram observados Clostridium sulfito redutores (< 10 UFC·g-1), bem como fungos filamentosos e leveduras (< 100 UFC·g-1). A cor das salsichas não se alterou ao longo do tempo, independente da temperatura. Sinais macroscópicos de deterioração como
viii limosidade e odor desagradável foram observados apenas nas salsichas armazenadas a 15 °C que alcançaram números populacionais elevados (108 UFC·g-1) mais rapidamente do que as armazenadas a 5 °C. Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei e Lactococcus lactis foram predominantes em ambas as condições de armazenamento. Além da predominância de BAL, grandes quantidades de DNA de soja e uma significativa porção (68,2 %) de sequências genômicas de bactérias ainda desconhecidas foram detectadas no sequenciamento. Não houve diferença (p > 0,05) entre as microbiotas dos lotes e entre as microbiotas das salsichas armazenadas sob diferentes temperaturas. O produto em estudo possui um prazo de validade longo (60 d) dentro do qual foram observadas alterações importantes, mesmo quando armazenado sob temperatura ideal, o que reforça a importância do controle das condições de armazenamento para a conservação desse tipo de produto cárneo.
ix
ABSTRACT
LEAL, Daniela Abrantes, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, October 2018. Effect of storage temperature on the physico-chemical and microbiological characteristics of vacuum-packed sausages. Advisor: Regina Célia Santos Mendonça.
Meat and meat products have charachteristics such as high water activity and pH close to neutrality that favors bacterial multiplication and contributes to spoilage in few days, depending on the storage conditions. Meat products losses by spoilage is a problem commonly faced by the industries and by consumers. Several factors as raw material quality, hygienic conditions during manufacturing, packing and distribution conditions are relevant and influences on the shelf life of a meat product. Abusive storage temperatures accelerates several chemical and biochemical reactions in the product, which becomes spoiled and inappropriate to consumption in a short period. The goal of this study was evaluate the effect of different storage temperatures (5 and 15 °C) on the stability and on the sausages’ bacterial microbiota composition during its shelf life. Sausages directly collected from the manufacturing process and from three diferent lots were stored under 5 or 15 °C and analysed throughout 60 days for presence of latic acid bactéria (LAB), psycrotrophics, Clostridium sp., mold and yeast. Was too evaluated throughout this period the total titrable acidity (TTA), pH, water activity (Aw), detachment of the packaging (vacuum loss) and the color of the sausages. Besides that, over the 60 days was proceeded total bacterial DNA extraction to sequencing and identification of the species that composed sausages microbiota. The TTA increased from 0,13 to 0,26 %, the Aw remained constant (~0,98), pH was from 6,4 to 5,9 and the detachment of the packaging was from 0 to 86 % over the 60 days in the sausages stored at 5 °C. On the sausages stored at 15 °C the TTA increased almost five times, Aw remained stable in ~0,98, pH was from 6,4 to 5,2 and the detachment of the packaging was from 0 to 100 %. The TTA increase is an indicative of bacterial multiplication on the samples, especially LAB, which had an increase of 7 log on its population in the sausages stored at 15 °C and of 6 log on that stored at 5 °C. Psychotrophics population had an increase of 7,2 log on the sausages stored at 15 °C and of 6,8 log in the sausages at 5 °C. Clostridium sp. (< 10 CFU·g-1) were not observed, as well molds and yeasts (< 100 UFC·g-1). Sausages color didn’t change over the time, independent of the temperature. Macroscopic signs of spoilage as slime and off flavor were observed only in the sausages stored at 15 °C, which reached high populational numbers (108 CFU·g-1) faster than that stored at 5 °C. Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei e Lactococcus lactis were predominant in both storage conditions. Besides LAB prevailing, a big amount of soy DNA and a significant portion
x (68,2 %) of yet unknown bacteria genomic sequences were detected through sequencing. There was no difference (p > 0,05) between lots microbiotas and between the microbiotas of the sausages stored at different temperatures. The studied product has a log shelf life (60 days) in which it were observed important changes, even when stored under an ideal temperature, what reinforce the importance of the storage conditions control to the preservation of this kind of meat product.
1
1.
INTRODUÇÃO GERAL
Cerca de 974,7 mil toneladas de carne suína e 3,35 milhões de toneladas de carne de frango foram produzidas em 2017 no Brasil. Embora o consumo per capita anual de carne suína no Brasil, de 15 Kg, seja considerado baixo, a maior parte da produção nacional é destinada ao mercado interno, já que apenas 20 % da produção brasileira de carne suína é exportada (ABPA, 2016). Além da carne in natura, produtos cárneos processados, produzidos a partir de carne suína e de aves, também são amplamente consumidos pela população brasileira, especialmente presunto, mortadela e salsichas (MESQUITA et al., 2018). O elevado consumo de produtos cárneos chama a atenção das indústrias e desperta o interesse de produção em larga escala para que se possa atender às demandas de mercado com um menor custo de produção e consequentemente, melhores lucros.
Além de suprir a demanda do mercado consumidor, a produção em larga escala enfrenta desafios para garantir a qualidade e segurança microbiológica dos produtos cárneos processados, os quais constituem, de modo geral, matrizes favoráveis à multiplicação microbiana (pH próximo à neutralidade, grande disponibilidade de nutrientes, atividade de água elevada). Diversos fatores como a qualidade microbiológica da matéria-prima, condições de processamento e de estocagem, tipo de embalagem, atividade de água final do produto são críticos para a garantia da qualidade e segurança microbiológica dos produtos cárneos. Esses fatores, por si só, ou a sua combinação resultam em alterações na cor, textura, sabor do produto e consequentemente, na rejeição do produto. A temperatura de armazenamento é um dos principais fatores relacionados à garantia da qualidade e segurança microbiológica de produtos cárneos. Muitas vezes, durante a distribuição no varejo o produto é submetido a temperaturas abusivas, o que compromete sua qualidade uma vez que produtos cárneos em sua maioria, necessitam armazenamento a baixas temperaturas, geralmente 0 a 5 °C. (MOHAREB et al., 2015; ZHOU, XU, & LIU, 2010; BORGES & FREITAS, 2002;).
A deterioração de alimentos, de modo geral, é um processo heterogêneo e complexo que envolve várias comunidades bacterianas conhecidas e também desconhecidas. A deterioração microbiana de produtos cárneos é responsável por uma quantidade significativa de perdas de alimentos no mundo inteiro. Estas perdas por deterioração têm impacto econômico, social e ambiental na sociedade e por isso, motivam a realização de estudos que busquem compreender melhor os fenômenos envolvidos e desenvolver métodos que objetivem reduzir estas perdas (WU et al., 2018; NYCHAS et al., 2008).
2 2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Avaliar o efeito da temperatura de armazenamento nas características físico-químicas e microbiológicas de salsichas embaladas a vácuo.
2.2. Objetivos específicos
i. Avaliar as alterações físico-químicas em salsichas embaladas a vácuo armazenadas a 5 °C e 15 °C ao longo de 60 dias.
ii. Avaliar se o armazenamento em diferentes temperaturas promove a alteração na diversidade bacteriana das salsichas.
iii. Conhecer a sucessão microbiana nas salsichas embaladas a embaladas a vácuo armazenadas a 5 °C e 15 °C ao longo de 60 dias.
3 CAPÍTULO 1
REVISÃO DE LITERATURA
1. DEFINIÇÕES, CLASSIFICAÇÃO E PADRÕES MICROBIOLÓGICOS DE SALSICHAS
De acordo com o Anexo IV do Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Salsicha da Instrução Normativa Nº 4, de 31 de março de 2000 (BRASIL, 2000), do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), “salsicha é o produto cárneo industrializado obtido da emulsão de carne de uma ou mais espécies de animais de açougue (estômago, coração, língua, rins, miolos, fígado), tendões, pele e gorduras, adicionado de ingredientes, embutido em envoltório natural, artificial ou por processo de extrusão, submetido a um tratamento térmico adequado e podem ter como processos alternativos o tingimento, a depelagem, a defumação e a utilização de recheios e molhos” (BRASIL, 2000).
A matéria-prima da salsicha, conforme o anexo IV da Instrução Normativa Nº 4 (BRASIL, 2000), é “composta de carne de diferentes espécies de animais de açougue, carnes mecanicamente separadas, miúdos comestíveis de diferentes espécies de animais de açougue, tendões, pele, gordura, além de ingredientes opcionais como água, proteína vegetal e/ ou animal, agentes de liga, aditivos intencionais, açúcares, aromas, especiarias e condimentos”. Para cada ingrediente são permitidos os limites máximos no produto (Tabela 1).
Tabela 1: Quantidade máxima permitida de ingredientes em salsichas.
Ingrediente Limite máximo (% m/ m)
Carne mecanicamente separada 60
Miúdos comestíveis e gorduras 10
Proteína não animal 4
Amido 2
Gordura 30
Água 10
Carboidratos totais 7
Fonte: BRASIL, 2000.
O principal componente cárneo das salsichas é a carne mecanicamente separada (CMS). Entende-se por Carne Mecanicamente Separada a carne obtida por processo mecânico de moagem e separação de ossos de animais de açougue, destinada à elaboração de produtos
4 cárneos específicos. Após a separação mecânica a carne é congelada em blocos (BRASIL, 2000; GONÇALVES et al., 2009).
De acordo com a composição da matéria-prima e das técnicas de fabricação usadas, diferentes tipos de produtos podem ser elaborados e são classificados em (BRASIL, 2001):
Salsicha - Carnes de diferentes espécies de animais de açougue, carnes mecanicamente separadas até o limite máximo de 60 %, miúdos comestíveis de diferentes espécies de animais de açougue (estômago, coração, língua, rins, miolos, fígado), tendões, pele e gorduras.
Salsicha Tipo Viena e Tipo Frankfurt - Carnes bovina e/ ou suína e carnes mecanicamente separadas até o limite máximo de 40 %, miúdos comestíveis de bovino e/ ou suíno (estômago, coração, língua, rins, miolos, fígado), tendões, pele e gorduras.
Salsicha Viena -Porções musculares de carnes bovina e/ ou suína e gordura, podendo ser defumada.
Salsicha Frankfurt - Porções musculares de carnes bovina e/ ou suína e gorduras. Se diferencia da salsicha Viena por ser, geralmente, mais temperada e incluir bacon ou toucinho em sua composição.
Salsicha de Carne de Ave - Carne de ave e carne mecanicamente separada, no máximo de 40 %, miúdos comestíveis de ave e gorduras.
Visando a proteção à saúde da população e a regulamentação dos padrões microbiológicos para alimentos, a RDC Nº 12 (BRASIL, 2001) cita os micro-organismos de interesse sanitário para produtos cárneos cozidos ou não, embutidos ou não, onde se encaixam as salsichas. Na Tabela 2, estão descritos os padrões microbiológicos para salsicha, de acordo com esta legislação.
5 Tabela 2: Padrão microbiológico para salsichas.
Micro-organismo Tolerância para amostra indicativa (UFC·g-1)
Tolerância para amostra representativa (UFC·g-1) n c m M Coliformes a 45 °C 1,0 x 103 5 2 1,0 x 102 1,0 x 103 Staphylococcus sp. coagulase positivo 3,0 x 10 3 5 1 1,0 x 102 3,0 x 103 Salmonella sp. Ausente/ 25 g 5 0 - - Clostridium sp. sulfito redutor a 46 °C 5,0 x 10 3 5 1 1,0 x 102 5,0 x 102 Fonte: BRASIL, 2001.
2. PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE SALSICHAS
Previamente à coleta das amostras para este estudo, realizou-se o acompanhamento do processo de produção das salsichas na indústria. A produção (Figura 1) se inicia com o recebimento e pesagem dos aditivos e ingredientes, e após isso, o bloco de carne congelada é quebrado com o auxílio de um quebrador de blocos. As carnes utilizadas na fabricação de salsicha devem estar congeladas (-5 ºC a 2 ºC), de forma a facilitar o controle de temperatura no cutter, onde ocorre a trituração da carne. Durante a cutterização, temperaturas baixas (inferiores a 16 ºC) contribuem para evitar a desnaturação das proteínas e evitam a liquefação da gordura.
6 Pesagem da matéria-prima, condimentos e aditivos
Pré-emulsão Cutterização
Misturadeira Outros ingredientes
Embutimento
Cozimento
Choque térmico (chuveiro) e descanso
Banho gelado
Depelagem
Acidificação e tingimento
Embalagem primária e embalagem secundária
Estocagem (câmara fria)
Distribuição Figura 1: Etapas da produção de salsichas embaladas a vácuo.
Paralelo à cutterização é preparada a pré-emulsão. Na pré-emulsão, gelo, pele suína cozida e parte da proteína são triturados e reservados, para na etapa seguinte, serem misturados à carne cutterizada. Em seguida as massas formadas na pré-emulsão e cutterização são adicionadas à misturadeira, seguido da adição dos condimentos e demais ingredientes. Na misturadeira, a massa é mantida sob movimentação constante, o que contribui para uma melhor homogeneização. Ao final desta etapa, a massa pronta é transferida para as embutideiras.
Na operação de embutimento de salsichas são utilizados envoltórios artificiais, de calibre de 22 mm. O envoltório é torcido (equipamento mecânico de torção) para que se formem
7 gomos de 9 a 12 cm de comprimento. Os gomos são colocados em varas, e estas em gaiolas, para serem transportadas para as estufas de cozimento.
Na etapa de cozimento objetiva-se obter características sensoriais do produto final (cor, sabor e consistência), estabilizar a mistura e melhorar a conservação da salsicha. O cozimento das salsichas pode ser feito em estufas (calor seco) ou cozimento a vapor (calor úmido). As gaiolas são colocadas dentro da estufa, onde a temperatura deve permanecer a 70 °C por 30 min. Passado esse tempo, a temperatura é aumentada para 80 °C durante 15 min.
Com o cozimento a 65 a 70 °C, as proteínas da carne são coaguladas e a gordura é estabilizada, isto é, a emulsão é estabilizada por um determinado período de tempo. O cozimento promove uma redução da carga microbiana do produto, o que irá depender do binômio tempo/ temperatura utilizado. Após o cozimento, o manuseio adequado e a estocagem sob refrigeração são essenciais para prevenir a recontaminação e retardar o crescimento de micro-organismos termorresistentes que tenham sobrevivido no produto.
Após o cozimento, as salsichas passam por um choque térmico promovido por um banho de água fria (chuveiro) até que sua temperatura interna atinja cerca de 40 °C. Após o choque térmico as gaiolas com as salsichas são retiradas do chuveiro e passam pelo descanso. Em seguida, as salsichas são imersas em um banho de gelo (2 ºC) para que a temperatura do produto alcance cerca de 15 ºC.
A depelagem ocorre apenas para produtos embutidos com tripa artificial e que tenham passado por cozimento. Este processo, que consiste na remoção do envoltório sintético utilizado para embutir a emulsão, ocorre em um equipamento no qual ajusta-se a lâmina de modo a cortar a tripa da forma mais precisa possível, evitando cortes no produto.
Após a depelagem as salsichas são levadas a um banho em tanque de tingimento com corante. Em seguida, elas passam por tanque contendo ácido lático para garantir a fixação da cor. O corante utilizado para o tingimento é o extrato de urucum, e o pigmento bixina é responsável pela coloração alaranjada conferida ao produto.
As salsichas podem ser colocadas manualmente ou automaticamente nas embalagens e seladas a vácuo. Os materiais usados como embalagem primária podem variar, podendo ser Nylon/ Polietileno; PVdC/ Nylon/ Polietileno ou outros que sejam capazes de manter o vácuo na embalagem.
8 Após a embalagem primária, os pacotes de salsicha são condicionados em caixas de papelão (embalagem secundária) e mantidas em câmaras de resfriamento (5 – 7) °C ou congelamento, caso o produto seja para exportação.
3. VIDA ÚTIL DE SALSICHA
A salsicha é um alimento muito consumido e de fácil preparo. Entretanto, se manipulada de maneira inadequada, pode se tornar uma excelente fonte de contaminação e proliferação de micro-organismos (SUKUMARAN et al., 2018). Quando comercializadas a granel, as salsichas tem sua vida útil reduzida em função da exposição ao ambiente, aumentando o risco de contaminação e deterioração. Vida útil é definida o como o tempo em que o alimento pode ser conservado em determinadas condições de temperatura, umidade relativa e luz, passando por alterações que são até certo ponto, consideradas aceitáveis pelo fabricante, pelo consumidor e pela legislação alimentar vigente (CORRADINI, 2018).
O Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (BRASIL, 2017), em seu artigo 497, cita: “Consideram-se impróprios para o consumo humano, na forma em que se apresentam, no todo ou em parte, as matérias-primas ou os produtos de origem animal que: apresentem-se alterados, fraudados; danificados por umidade ou fermentação, rançosos, com características físicas ou sensoriais anormais, contendo quaisquer sujidades ou que demonstrem pouco cuidado na manipulação, na elaboração, na conservação ou no acondicionamento; que contenham substâncias ou contaminantes que não possuam limite estabelecido em legislação, mas que possam prejudicar a saúde do consumidor; contenham substâncias tóxicas ou compostos radioativos em níveis acima dos limites permitidos em legislação específica; contenham micro-organismos patogênicos em níveis acima dos limites permitidos; apresentem embalagens estufadas, defeituosas e com seu conteúdo exposto à contaminação e à deterioração, etc” (BRASIL, 2017).
Nos embutidos, os micro-organismos alteradores podem se multiplicar sobre a superfície do envoltório, entre o envoltório e a carne ou no seu interior. Várias espécies de bactérias são capazes de se multiplicar no interior dos embutidos durante o período de armazenamento. Os micro-organismos e/ ou seus produtos metabólicos, em determinadas quantidades, são indicadores da qualidade do alimento e estão diretamente relacionados com o prazo de vida útil dos mesmos (RUKCHON et al., 2014).
A deterioração causa alterações físicas, químicas ou sensoriais, isto é, alterações na cor, odor, textura, sabor, ou aparência, como consequência da atividade metabólica dos
micro-9 organismos presentes (TAVARES & SERAFINI, 2003), e ocorre basicamente de três formas: viscosidade, acidificação e manchas verdes.
Franco e Landgraf (2008) destacam os principais e mais comuns defeitos em salsichas durante a sua vida útil:
Liberação de líquido: resultado do desequilíbrio entre os teores de água, gordura e proteínas solúveis. Esse líquido liberado pode possibilitar o desenvolvimento de micro-organismos, o que contribui para a deterioração do produto.
Manchas verdes: o esverdeamento é o resultado do desenvolvimento de micro-organismos que produzem peróxido de hidrogênio (H2O2) que, ao reagir com o nitrosohemocromo (Eq. 01), pigmento responsável por conferir cor rósea-avermelhada às salsichas, produz coleglobina, pigmento de cor verde (Eq. 02).
� � + ó�� í � → � � � → �∆ ℎ (01)
� ℎ + �2 2→ � (02)
Perda de vácuo ou estufamento da embalagem: pode decorrer da presença de microfuros na termosoldagem ou do desenvolvimento de bactérias láticas heterofermentativas que, ao produzirem gás carbônico, provocam a perda do vácuo.
Limosidade superficial: é um líquido viscoso formado, geralmente, exopolímeros produzidos por bactérias.
A acidificação ocorre normalmente na parte interna do envoltório das carnes processadas e é resultado do crescimento de Lactobacillus, Enterococcus e micro-organismos relacionados. A acidez resulta da utilização de açúcares pelos micro-organismos com a produção de ácidos.
Os tipos de deterioração variam de acordo com as condições do micro-ambiente que envolvem os produtos e com a temperatura de armazenamento.
4. MICROBIOTA DETERIORADORA DE PRODUTOS CÁRNEOS
Cada etapa da cadeia de produção de alimentos é parte integrante na segurança alimentar, desde o campo até a mesa do consumidor. Os contaminantes dos produtos cárneos são originados, principalmente, da própria matéria-prima. A contaminação da carne pode acontecer em diferentes fases da obtenção da matéria-prima, desde a recepção dos animais até etapas como a sangria e evisceração (ROUGER, TRESSE, & ZAGOREC, 2017). Fatores
10 intrínsecos e extrínsecos favorecem o crescimento microbiano em salsichas e demais produtos cárneos, sendo alguns destes: alta atividade de água; pH favorável para a maioria dos micro-organismos e elevado teor de nutrientes (FRANCO & LANDGRAF, 2008).
Alguns micro-organismos tipicamente envolvidos na deterioração dos derivados cárneos são Pseudomonas spp., Acinetobacter moraxella, Shewanella putrefaciens, Brochotrix thermosphacta, Lactobacillus spp. e algumas espécies da família Enterobacteriaceae, além de leveduras e fungos filamentosos. Condições inadequadas de higiene dos manipuladores e do ambiente favorecem a contaminação por estes micro-organismos (DE ALCANTARA et al., 2012).
4.1. Bactérias do ácido lático (BAL)
As BAL constituem um heterogêneo grupo de cocos ou bacilos gram-positivos e anaeróbios facultativos, sem motilidade, catalase-negativos e que produzem ácido lático como principal produto final da fermentação de carboidratos (RAMÍREZ et al., 2011). Estas bactérias possuem alta tolerância a pH baixos, o que confere vantagem competitiva em determinados ambientes. BAL podem ser isoladas a partir de alimentos, mas também a partir do trato digestivo de mamíferos. Para sua multiplicação, estes micro-organismos requerem fontes de carbono como glicose e lactose além de aminoácidos, vitaminas e outros fatores de crescimento (RAMÍREZ et al., 2011; WATERS et al., 2015).
Bactérias deste grupo são frequentemente identificadas como a maior população deteriorante em produtos embalados a vácuo e em atmosfera modificada, além de outros produtos cárneos processados armazenados sob temperatura de refrigeração. Sob anaerobiose, provocam modificações nestes produtos como o aumento da acidez, formação de limo, perda da coloração e, devido à produção de gás, podem ainda provocar estufamento e a perda de vácuo da embalagem (SAMELIS, KAKOURI, & REMENTZIS, 2000).
O processo de deterioração de um alimento por BAL inicia-se pela fermentação de açúcares, resultando na formação de ácido lático e limo superficial, o que provoca uma queda de pH e alteração de cheiro e de sabor. Em condições de anaerobiose, como no caso de carnes e produtos cárneos embalados a vácuo a deterioração se inicia com a acidificação. Alterações na qualidade sensorial do alimento são causadas pelo acúmulo de produtos resultantes da atividade metabólica das BAL que, neste ambiente, dominam a microbiota e atingem populações numerosas (POTHAKOS et al., 2015; FANG et al., 2017).
11 Doulgeraki e colaboradores (2010) relataram que as condições de armazenamento, temperatura e embalagem a vácuo têm um efeito importante na diversidade da população microbiana e aumentam o potencial de deterioração pelas BAL.
Os gêneros de BAL mais comumente identificadas em produtos cárneos são Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc e Pediococcus spp. Algumas espécies heterofermentativas como Lactobacillus viridescens podem produzir peróxidos que reagem com os pigmentos da carne e causam o esverdeamento (NATTRESS, YOST & BAKER, 2001). L. sakei é considerada a BAL mais resistente a baixas temperaturas, comumente associada a carne fresca e à deterioração de vários produtos cárneos embalados em vácuo ou em atmosfera protetora (ERCOLINI et al., 2006).
4.2. Brochothrix thermosphacta
Brochothrix thermosphacta é um bacilo gram-positivo, anaeróbio facultativo que utiliza a glicose como substrato principal. Já foi conhecido como Microbacterium thermosphactum. Este bacilo constitui, com frequência, uma proporção significativa da microbiota de deterioração da carne e produtos cárneos armazenados em aerobiose, em atmosferas protetoras ou em vácuo, em ambientes refrigerados (NEWTON, HARRISON & SMITH, 1977).
O metabolismo de B. thermosphacta resulta na produção de acetoína, ácido acético, ácido isobutírico e ácido isovalérico (DAINTY & HIBBARD, 1980). O sinal mais relevante de deterioração em carnes por B. thermosphacta é o odor agridoce associado principalmente com a produção de acetoína e, em menor escala, com os ácidos restantes produzidos (PIN, DE FERNANDO & ORDOÑEZ, 2002). Em condições de anaerobiose, como nas embalagens a vácuo, este micro-organismo utiliza a glicose produzindo ácido lático e os odores detectados são descritos como azedos (PIN, DE FERNANDO & ORDOÑEZ, 2002). B. thermosphacta pode atuar como micro-organismo dominante, especialmente se a atmosfera e o pH (> 6) forem favoráveis ao seu crescimento (DAINTY & HIBBARD, 1980).
4.3. Pseudomonas spp.
Pseudomonas são bactérias bastonetes gram-negativas, aeróbias, móveis, não fermentativas, produtoras de pigmentos hidrossolúveis e quase sempre encontradas na microbiota normal intestinal e cutânea humana (TAVARES & SERAFINI, 2003). São reconhecidas como importantes deterioradoras de produtos cárneos armazenados sob refrigeração e em condições de aerobiose.
12 Diferentes espécies de Pseudomonas são relatadas na literatura como psicrotróficas devido a sua habilidade em se multiplicar e em produtos cárneos armazenados sob refrigeração e contribuírem para a sua deterioração (CASABURI et al., 2015; ERCOLINI et al., 2009). Uma vez presentes, elas colonizam, se multiplicam e promovem a formação de limo e mau odor, comprometendo a qualidade do produto. Pseudomonas sp. colonizam o ambiente de processamento formando biofilmes que se comportam como disseminadores destas bactérias para os produtos (NYCHAS et al., 2008; CASABURI et al., 2015; POTHAKOS et al., 2015; STELLATO et al., 2017). Em alimentos com alta atividade de água mantidos sob refrigeração e condições aeróbias, como é o caso de muitos produtos cárneos, P. alcaligenes é comumente referida como responsável pela formação de limo superficial.
Quando o produto cárneo é embalado a vácuo ou é usada uma atmosfera modificada com mais de 20 % de CO2, o crescimento de Pseudomonas spp. é suprimido e sob estas condições as BAL crescem mais rapidamente (JABERI, KABAN, & KAYA, 2018).
4.4. Clostridium spp. sulfito redutores
Espécies do gênero Clostridium são, com exceção de alguns aerotolerantes, anaeróbias estritas e catalase negativas. Clostridium spp. podem ser encontrados no solo, trato intestinal do homem e de animais, podem ser mesófilos ou termófilos, proteolíticos ou não proteolíticos. Dentre as espécies mesófilas proteolíticas responsáveis pela putrefação de diversos tipos de alimentos estão: C. putrefaciens, C. sporogenes, C. perfringens, C. botulinum e C. lentoputrecens, as quais são produtoras de toxinas causadoras de intoxicações alimentares (FRAZIER & WESTHOFF, 1993).
Algumas espécies do gênero Clostridium (C. gasigenes, C. algidicarnis, C. tagluense, C. frigidicarnis and C. estertheticum) têm sido reportadas como psicrotróficos deterioradores de produtos cárneos embalados a vácuo, promovendo excessivo acúmulo de gás e mau cheiro, além da perda de cor e textura da carne (BONKE, DREES, & GAREIS, 2016; REID et al., 2017; BRIGHTWELL & HORVÁTH, 2018).
5. SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO APLICADO À
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
A década de 90 marcou o início da transição da genética para a genômica, com o desenvolvimento de métodos de sequenciamento automatizados que se baseavam no método de sequenciamento dideoxi ou sequenciamento de Sanger conhecidos como sequenciamentos de primeira geração. Com o aumento do poder das ferramentas computacionais, o rendimento
13 desse método de sequenciamento aumentou ainda mais, possibilitando o sequenciamento do genoma de organismos com pouca ou nenhuma informação prévia disponível (HAMILTON & BUELL, 2012; MARDIS, 2008).
Nos últimos anos novas estratégias de sequenciamento, referidas como sequenciamento de nova geração (NGS), vem sendo desenvolvidas. As técnicas de NGS são ditas como de alto rendimento uma vez que produzem milhares e até milhões de sequências, as quais são usadas para a identificação acurada de um micro-organismo, incluindo os não cultiváveis e aqueles presentes em baixo número (MAYO et al., 2014).
O resultado do sequenciamento corresponde a milhões de pequenos pedaços de DNA (chamados de reads, com dezenas ou centenas de pares de bases) e sem identificação de qual organismo este DNA foi extraído. Atualmente a plataforma Illumina é a mais utilizada para NGS, produzindo reads com comprimentos que variam de 25 a 600 bases em uma velocidade maior e custos mais baixos do que o sequenciamento de Sanger. Dado o comprimento reduzido dos reads obtidos por essa tecnologia, seu uso na montagem de genomas demanda a utilização de coberturas maiores. O aumento da cobertura de sequenciamento, ao compensar esta redução, permite a obtenção de conjuntos de dados de alta qualidade, com taxas de erro pequenas (~10 -16), considerando que cada nucleotídeo tenha sido confirmado pelo menos oito vezes por reads idênticos (cobertura mínima de 8x) (SCHATZ, WITKIWSKI & MCCOMBIE, 2012; SIMS et al., 2014).
Métodos independentes de cultivo surgiram para superar as limitações da abordagem clássica baseada no cultivo de micro-organismos e vêm sendo amplamente utilizados na microbiologia de alimentos com o intuito de se estudar a ocorrência e o comportamento dos micro-organismos. As populações microbianas em alimentos merecem atenção devido à sua importância no que se refere a contaminações, deterioração e até mesmo produção de alimentos, como no caso de fermentados (ERCOLINI, 2013). Ercolini e colaboradores (2011) puderam, a partir de um sequenciamento do metagenoma, observar que a microbiota inicial de uma carne bovina mudou drasticamente após o armazenamento por 40 dias em diferentes condições de embalagem.
O estudo de alimentos como microbiomas implica na análise de amplicons gerados de um conjunto de genomas extraídos da amostra de produto. Os amplicons são sequenciados e as sequências são comparadas com uma base de dados referência para que se possa fazer a identificação taxonômica. Embora tenha limitações, como o alto custo, o sequenciamento de
14 alto rendimento tem sido reconhecido como uma ferramenta muito útil para estudos de microbiomas de alimentos (ERCOLINI, 2013).
Compreender como a microbiota evolui ao longo do tempo é uma prioridade no estudo da ecologia microbiana dos alimentos. As mudanças nas populações microbianas fornecem informações úteis para entender, por exemplo, a dinâmica de uma fermentação natural, monitorar culturas starters, e até mesmo observar mudanças nas populações associadas à deterioração de acordo com as condições de armazenamento de alimentos.
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18 CAPÍTULO 2
EFEITO DA TEMPERATURA DE ARMAZENAMENTO NAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E MICROBIOLÓGICAS DE SALSICHAS EMBALADAS A
VÁCUO RESUMO
Salsichas cozidas embaladas a vácuo são produtos que requerem armazenamento sob refrigeração, pois se deterioram rapidamente devido às suas características favoráveis à multiplicação bacteriana. Bactérias do ácido lático (BAL) são o principal grupo bacteriano que compõe a microbiota desses produtos, sendo observadas desde o pós-fabricação e dominando até os tempos finais de vida útil. Nem sempre os produtos cárneos são armazenados nas condições recomendadas sendo, muitas vezes, submetido a temperaturas abusivas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes temperaturas de armazenamento (5 e 15 ºC) na estabilidade de salsichas embaladas a vácuo durante a sua vida útil. Salsichas embaladas a vácuo coletadas diretamente na linha de processamento e provenientes de três lotes foram armazenadas a 5 ou 15 ºC e analisadas ao longo de 60 d quanto à presença de BAL, psicrotróficos, Clostridium sulfito redutores, fungos filamentosos e leveduras. Avaliou-se também a acidez total titulável (ATT), atividade de água (Aa), desprendimento da embalagem e cor das salsichas. Ao longo dos 60 d, as salsichas armazenadas a 5 °C tiveram a ATT aumentada de 0,13 para 0,26 %, enquanto a Aa se manteve praticamente constante (~0,98) e o desprendimento da embalagem foi de 0 para 86 % ao final do tempo de armazenamento. Nas salsichas armazenadas a 15 oC a ATT aumentou em quase cinco vezes, a Aa se manteve estável em ~0,98, e o desprendimento da embalagem foi de 0 para 100 %. O aumento da ATT é vista como um indicativo da multiplicação bacteriana, especialmente de BAL, que teve sua população aumentada em 7 log nas salsichas armazenadas a 15 ºC e em 6 log nas salsichas armazenadas a 5 °C. Níveis populacionais similares aos de BAL foram observados para psicrotróficos, e os resultados indicam ser os psicrotróficos as próprias BAL. Não foram observados Clostridium sulfito redutores, bem como fungos filamentosos e leveduras. A cor das salsichas não se alterarou ao longo do tempo, independente da temperatura. Sinais macroscópicos de deterioração como limosidade e odor desagradável foram observados apenas nas salsichas armazenadas a 15 °C que alcançaram números populacionais elevados de BAL (108UFC·g-1) mais rapidamente do que as armazenadas a 5 °C. A população de psicrotróficos teve aumento de 7,2 ciclos log nas salsichas armazenadas a 15 °C e de 6,8 ciclos log nas salsichas a 5 °C. O produto em estudo possui um prazo de validade longo (60 d) dentro do qual
19 foram observadas alterações importantes, mesmo quando armazenado sob temperatura ideal. O controle das condições de armazenamento é essencial para a conservação desse tipo de produto cárneo.
Palavras chave: produtos cárneos, bactérias do ácido lático, psicrotróficos, refrigeração, deterioração.
1. INTRODUÇÃO
A deterioração de alimentos por micro-organismos é um dos maiores desafios enfrentados pelas indústrias de produtos cárneos. O aumento na demanda e a produção em larga escala significam, ao mesmo tempo, para a indústria, oportunidade de crescimento e o aumento da preocupação com processos de deterioração dos seus produtos e como estes podem ser controlados (SAUCIER, 2016).
Os produtos cárneos constituem matrizes favoráveis ao crescimento microbiano. A grande disponibilidade de nutrientes, a umidade elevada e pH próximo à neutralidade favorecem a presença, sobrevivência e multiplicação de ampla gama de micro-organismos, como as bactérias do ácido lático (BAL) e psicrotróficos como Pseudomonas sp. (JAYASENA & JO, 2013). A deterioração de produtos cárneos é um evento complexo que pode envolver diversas populações bacterianas e resultar em diferentes alterações físico-químicas na matriz do alimento. Estratégias como boas práticas de fabricação (BPF), embalagem a vácuo, armazenamento e distribuição sob baixas temperaturas são comumente utilizadas para retardar essas alterações do alimento (NYCHAS et al., 2008).
Flutuações na temperatura e temperaturas abusivas podem levar a alterações que comprometem a qualidade do produto (RUKCHON et al., 2014). Muitas vezes, a falta de controle durante a distribuição e armazenamento, no varejo e doméstico, dos alimentos perturba a cadeia do frio, tratada com seriedade pela indústria que preza por garantir a qualidade e segurança alimentar dos seus produtos (KOUTSOUMANIS & GOUGOULI, 2015).
Acompanhar a multiplicação bacteriana e as alterações físico-químicas em um produto de interesse é importante para que se possa conhecer como o alimento se altera diante de condições ideais e não ideais de armazenamento que, na prática, acontecem e devem ser consideradas. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes temperaturas de armazenamento (5 °C e 15 °C), uma considerada recomendada para o produto e outra, considerada abusiva, na estabilidade de salsichas embaladas a vácuo durante a vida útil do produto.
20 2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Coleta e armazenamento das amostras
As salsichas utilizadas neste estudo foram coletadas diretamente da linha de processamento. Cada lote foi composto de 24 pacotes de 450 g de salsichas embaladas a vácuo (10 salsichas por pacote), que foram armazenados sob a temperatura recomendada para o produto (5 °C) e outra considerada como abusiva (15 °C). As salsichas foram submetidos a análises microbiológicas (descritas no item 2.4), físicas e químicas (descritas no item 2.5) a cada cinco dias, desde o dia do processamento (tempo 0) até 60 d após a fabricação (tempo 12). O estudo foi conduzido coletando-se amostras de três lotes diferentes, sendo o primeiro de outubro de 2017, o segundo de janeiro de 2018 e o terceiro de fevereiro de 2018. As análises físico-químicas e microbiológicas foram conduzidas em triplicatas.
2.2. Outros materiais
Todos os reagentes e meios de cultura foram utilizados sem nenhuma purificação adicional. Os meios de cultura utilizados foram All Purpose Tween (APT - Acumedia, EUA); Plate Count Agar (PCA – Difco, EUA); Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS– Merck, Alemanha) e Potato Dextrose Agar (PDA – HIMEDIA, Índia). Os reagentes utilizados foram NaCl (Labsynth, Brasil); Peptona (Himedia, Índia); Púrpura de bromocresol (Merck, Alemanha); Fenolftaleína (Merck, Alemanha) e Ácido tartárico (Merck, Alemanha).
A água para dissolução dos meios de cultura e preparo de soluções passou por sistema de purificação (Elix 35, Millipore, França) antes de ser utilizada.
2.3. Preparo das amostras
Inicialmente, o exterior da embalagem foi higienizado com álcool 70 % (v/ v) e, então, o pacote foi assepticamente aberto com o auxílio de uma faca esterilizada. Para a análise instrumental da cor foram reservadas duas salsichas inteiras. Para a análise de atividade de água reservou-se uma salsicha inteira. Para as demais análises (acidez total titulável e microbiológicas) as salsichas restantes foram assepticamente transferidas para um saco plástico esterilizado e trituradas, a fim de se obter uma massa uniforme da qual seriam tomadas as porções necessárias.
21 2.4. Análises microbiológicas
Para as análises microbiológicas homogenatos foram preparados a partir de 25 g da massa de salsichas e 225 mL de solução salina (0,85 % m/ v) peptonada (0,1 % m/ v) esterilizada, e este conteúdo foi homogeneizado por 2 min (APHA, 2001).
Apesar de a RDC Nº 12 (BRASIL, 2001), referência de padrões microbiológicos para alimentos, definir padrões sanitários, o que se propõe neste estudo é o estudo de micro-organismos tipicamente deterioradores de salsichas, não definidos na legislação brasileira, o que justifica a escolha de se avaliar diferentes grupos de micro-organismos não citados pela legislação.
2.4.1. Contagem de Bactérias láticas
A contagem de BAL foi realizada por plaqueamento em profundidade e sobrecamada de ágar APT acrescido do indicador de pH púrpura de bromocresol na concentração de 0,004 % (m/ v) (APHA, 2001). As placas foram inseridas em jarras de anaerobiose (Permution, Brasil) e incubadas a 30 °C por 48 h (APHA, 2001). Procedeu-se a contagem de colônias típicas (formato de grão de arroz e bordas amarelas) e os resultados foram expressos em UFC·g-1. 2.4.2. Contagem de psicrotróficos
Após preparadas as diluições seriadas, alíquotas de 0,1 mL foram plaqueadas na superfície de ágar PCA e espalhadas com o auxílio de uma alça de Drigalsky esterilizada. Após a secagem do inóculo as placas foram incubadas a 7 ± 2 °C por 8 d (APHA, 2001). Procedeu-se a contagem de colônias e os resultados foram expressos em UFC·g-1.
2.4.3. Contagem de Clostridium sulfito redutores
A contagem total de Clostridium spp. sulfito redutores foi realizada por meio de plaqueamento em profundidade (1 mL) e sobrecamada de ágar SPS (9 mL). As placas foram incubadas sob anaerobiose a 37 ± 1 °C por 48 h (APHA, 2001) e contadas, e os resultados foram expressos em UFC·g-1.
2.4.4. Contagem de fungos filamentosos e leveduras
Foi feito plaqueamento por superfície em ágar PDA acrescido de 1,0 % (v/ v) de ácido tartárico (10 % m/ v). Alíquotas de 0,1 mL foram inoculadas e espalhadas na superfície do ágar com o auxílio de uma alça de Drigalsky e após a secagem, as placas foram incubadas a 25 °C por 5 d (APHA, 2001). Procedeu-se a contagem de colônias e os resultados foram expressos em UFC·g-1.
22 2.5. Análises físicas e químicas
2.5.1. Acidez total titulável
Preparou-se um homogenato (5 g de massa de salsichas + 50 mL de água destilada) e três gotas de solução fenolftaleína a 1,0 % (m/ v) foram adicionadas. Em seguida, procedeu-se a titulação com uma solução de hidróxido de sódio 0,01 mol∙L-1. O cálculo de acidez foi feito de acordo com a Eq. 1 (IAL, 2001).
� � � % = � ∙ ∙∙ (1)
Onde, V = nº de mL da solução de hidróxido de sódio 0,01 mol∙L-1 gasto na titulação; f = fator da solução de hidróxido de sódio 0,01 mol∙L-1; P = massa da amostra usado na titulação (g); c = 100, valor de correção para solução de NaOH 1 mol∙L-1 (IAL, 2001).
2.5.2. Atividade de água
A atividade de água das salsichas foi mensurada usando um analisador de bancada (4TE, Aqualab, Brasil), a 25 ± 1 °C. As salsichas foram fracionadas em pedaços de 0,5 x 0,5 x 0,5 cm. Estas frações foram dispostas na cápsula do equipamento de modo que toda a superfície fosse preenchida com o material.
2.5.3. Análise instrumental da cor
Para determinar parâmetros relativos à cor das salsichas, foi utilizado um colorímetro portátil (CR-10, Konica Minolta, Japão) e o sistema de leitura utilizado foi o CIE (Commission
Internationale de I’Eclairage) L*, a*, b*. Duas salsichas de cada pacote amostral foram
divididas ao meio, no sentido longitudinal, e dispostas em uma superfície plana, e as medidas de L*, a*, b* foram tomadas em três pontos (Figura 1) das superfícies interna e externa das amostras.
23 No sistema CIE L* a* b* o valor de L* determina a posição no eixo vertical do diagrama de cromaticidade, representa a luminosidade da amostra e varia de 0 (preto puro) a 100 (branco puro). Em produtos cárneos, onde cores verdes e azuis não são comuns, o valor de a*, ponto sobre o eixo que vai do verde (-) ao vermelho (+), determina o que é chamado de índice de vermelho, e o valor de b*, que varia do azul (-) ao amarelo (+) determina o índice de amarelo (HERNÁNDEZ, 2016).
O cálculo do índice de saturação da cor (C*) é a relação entre os valores de a* e b*, e define a intensidade da cor. O ângulo de tonalidade (h*) formado entre a* e b*, permite definir a tonalidade da cor do objeto (JUNG et al., 2015).
As Eq. 2 e 3, foram utilizadas para os cálculos de C* e h*, respectivamente.
∗ = √ ∗2+ ∗2 (2)
ℎ∗ = ∗
∗ (3)
2.5.4. Desprendimento da embalagem
À medida em que se observava perda de vácuo nas embalagens o filme plástico tornava-se desprendido das salsichas. Os pacotes de salsicha foram dispostos em uma bancada, e com o auxílio de uma régua, as medidas foram tomadas no ponto central do pacote. Media-se a altura do filme que não estava aderido às salsichas (Figura 2).
Figura 2: Esquema utilizado para quantificar o desprendimento da embalagem.
O cálculo da porcentagem de desprendimento (Eq. 4) utilizou como referência 25 mm, isto é, a altura máxima observada na perda total do vácuo.
24
� % = ℎ5 · (4)
Onde h é a altura do filme não aderido às salsichas 2.6. Análises estatísticas
Os resultados obtidos nas determinações físicas, químicas e microbiológicas dos três lotes de salsichas foram analisados e comparados pelo teste t de comparação pareada (p ≤ 0,05) entre as salsichas armazenadas a 5 ou 15 °C, em cada um dos tempos, usando o SAS (version 9.3, SAS Institute Incorporation, USA; licenciado pela Universidade Federal de Viçosa). Um modelo exponencial foi ajustado aos dados de contagem de BAL e psicrotróficos totais ao longo do tempo. As demais variáveis foram submetidas a análises de variância (ANOVA) que se significativa, procedia-se o teste de Dunnet, que compara cada valor com os valores nos tempos zero para cada tratamento.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Crescimento microbiano
A multiplicação de BAL foi maior nas salsichas armazenadas a 15 °C, sendo observado um aumento de quase 7 ciclos logarítmicos (log) no decorrer dos 60 d de armazenamento (Figura 3A). Nas salsichas armazenadas a 5 °C a população de BAL aumentou em 6 ciclos log ao longo do tempo (Figura 3A). Comportamento similar foi observado na população de psicrotróficos: um aumento de 7,2 ciclos log nas salsichas armazenadas a 15 °C e de 6,8 ciclos log nas armazenadas a 5 °C (Figura 3B).
Figura 3: Multiplicação de bactérias do ácido lático e de psicrotróficos em salsichas embaladas a vácuo armazenadas a 5 °C () e a 15 °C () durante 60 d.
25 Na Tabela 1 está apresentado o modelo de regressão ajustado aos dados e os parâmetros de ajuste (Eq. 05), onde A e τ são os parâmetros de ajuste, t é o tempo (d), e UFC·g -1 é a contagem de células por grama de salsicha.
Tabela 1: Modelo de regressão ajustado os dados de multiplicação bacteriana em salsichas embaladas a vácuo ao longo do tempo.
��� ���·�−� = � ∙ � − �−�⁄� (Eq 05)
Parâmetros
de ajuste Indicador do ajuste
A
τ
R2Bactérias do ácido lático a 5 °C 7,52 1,94 0,90 Bactérias psicrotróficas a 5 °C 7,93 1,97 0,96 Bactérias do ácido lático a 15 °C 8,36 1,04 0,93 Bactérias psicrotróficas a 15 °C 8,37 1,09 0,94
A: densidade populacional máxima alcançada pela população; τ: tempo para atingir a densidade populacional máxima; R2: coeficiente de determinação.
Ao se avaliar o modelo de regressão proposto para o crescimento microbiano, bserva-se que os valores de R2 indicam bons ajustes dos dados ao modelo proposto. O parâmetro A representa o valor de contagem em que as populações bacterianas tem sua multiplicação estabilizada, isto é, representa a densidade populacional máxima. A densidade populacional máxima de crescimento é observada na fase estacionária, momento no qual a velocidade de crescimento é similar à velocidade de morte (NYSTRÖM, 2004). O parâmetro τ está relacionado ao tempo necessário para que a população atinja a fase estacionária. Menores valores de τ são observados para as populações das salsichas armazenadas a 15 °C, indicando que estas populações atingem mais rapidamente a fase estacionária de crescimento.
Ao observar as curvas de crescimento (Figura 3) e o parâmetro τ para os tratamentos (Tabela 1) nota-se que a multiplicação bacteriana é mais lenta nas salsichas armazenadas a 5 °C e mais intensa naquelas a 15 °C, tanto para BAL quanto para psicrotróficos. Em 20 d de armazenamento a 5 °C, a população de BAL das salsichas havia aumentado em 4,4 ciclos log, e as salsichas ainda não apresentavam sinais de deterioração. Para aquelas armazenadas a 15 °C, aos 20 d observou-se um aumento de 6,7 ciclos log de BAL, e a partir deste momento as salsichas apresentavam intenso mau odor e limosidade superficial (Figura 4). Além disso, a partir de 40 d as contagens praticamente não se alteram, pois as populações atingem a fase estacionária e densidades populacionais similares a 5 e a 15 °C são observadas. Pode-se afirmar, portanto, que a temperatura de 5 °C, recomendada pelo fabricante, não é capaz de evitar a multiplicação bacteriana no produto, apenas retarda seu desenvolvimento.
