UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
BRUNO MOLERO DA SILVA
“DESENVOLVIMENTO
E
VALIDAÇÃO
DE
MÉTODOS
PARA
DETERMINAÇÃO
DE
COMPOSTOS
FENÓLICOS
EM
CEVADA
EMPREGANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA
ALTA
EFICIÊNCIA
ACOPLADA
À
ESPECTROMETRIA
DE
MASSAS
SEQUENCIAL”
CAMPINAS 2017
BRUNO MOLERO DA SILVA
“DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EM CEVADA EMPREGANDO
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQUENCIAL”
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientador(a): Prof(a). Dr(a). Carla Beatriz Grespan Bottoli
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO BRUNO MOLERO DA SILVA, E ORIENTADA PELA PROF(A). DR(A). CARLA BEATRIZ GRESPAN BOTTOLI.
CAMPINAS 2017
Dedico este trabalho...
Aos meus pais, Ataides e Marinês que me deram oportunidade e incentivo para realizar meus estudos. Vocês me deram o presente que dinheiro nenhum pode comprar nesse mundo material; que foi a educação e os exemplos de dignidade e honestidade que tive desde criança. Tenho muito orgulho de vocês! Também dedico este trabalho à minha querida avó Matilde Toral Ortega pelo carinho e ensinamentos deixados, que me deram força para seguir nos momentos mais difíceis (in memorium).
“Nada na vida deve ser temido, somente compreendido.
Agora é hora de compreender mais para temer menos!”
Marie Curie
AGRADECIMENTOS
À Deus pelo amor incondicional e aos protetores de luz pela oportunidade desta conquista em minha vida.
À Profa. Dra. Carla Beatriz Grespan Bottoli pela orientação, liberdade de trabalho, ensinamentos e otimismo na rotina diária. Agradeço pelo voto de confiança e por permitir o desenvolvimento desta pesquisa juntamente com o meu trabalho.
À minha família: meus pais Ataides e Marinês pela compreensão e apoio em todos os momentos da minha vida. À minha irmã Laíze e meu cunhado Rudnei que sempre torceram por mim. Ao meu querido sobrinho Rafael que é a alegria da nossa família.
À minha amada noiva Gabriela pelo incomparável carinho, compreensão e paciência comigo. Você é a mulher da minha vida! Te amo!!
Aos meus familiares, tios, tias e primos (especialmente ao Fábio por enviar as amostras de cevada comercializadas em Belo Horizonte) pelo carinho e amizade.
Em especial ao meu tio Dorival que sempre me inspirou e incentivou pela sua forma racional de encarar a vida mesmo quando surgem inesperados desafios.
Aos colegas de laboratório do LabCrom: Jordana, Carla Grazielli, Fabiana, Camila, Mariana, Cláudio, Luana, Karen, Julie e Mariane pela amizade e bons momentos compartilhados. Obrigado galera!
Aos colegas do laboratório de Cromatografia Gasosa: Mayra, Soraia, Jadson, Paloma, Leandro, Bruna e Sandra. Em especial às guerreiras no trabalho Gabriela Salazar e Paula Lima pela verdadeira amizade e companheirismo.
À Ms. Lucília responsável pelo LabCrom pela amizade e por ser uma pessoa tão solícita.
À Priscila que é responsável técnica do laboratório de Espectrometria de Massas pelo treinamento no equipamento, disponibilidade, experiência e amizade.
Aos grandes amigos de Palmital que sempre estiveram do meu lado. Agradecimento especial ao Bruno Orlandi, Bruno Ireno, Tunico e Tugu.
Ao meu amigo Everson Biazon que enviou as amostras de Curitiba pela disposição em ajudar-me.
À Daiane Cobianchi por enviar as amostras de cevada de Florianópolis meu sincero agradecimento.
Ao amigo Fabricio Ferreira, aluno de Doutorado do IQ-Unicamp pela disponibilidade de discussão de temas relevantes em Química Analítica.
À Dra. Fernanda Oliveira Lima pelos ensinamentos e treinamento no equipamento de Eletroforese Capilar.
Aos funcionários do Restaurante Universitário da Unicamp que tanto me ajudaram com as refeições durante esses anos.
Ao Professor Dr. Ronaldo Pilli por permitir o uso do rotaevaporador de seu laboratório.
Aos meus alunos da rede pública estadual das escolas por onde passei e em especial à E.E. Professor Celso Henrique Tozzi de Jaguariúna-SP.
Aos amigos do SKK de Palmital-SP pela amizade de longos anos e pela alegria de sempre!!
Aos secretários da CPG do IQ, Isabela, Miguel e Bel pela constante disposição em ajudar-me.
Aos pais da Gabi, Inês e Nelson, pela amizade e finais de semana descontraídos em Mogi Guaçu.
Aos Professores do IQ- Unicamp pelas disciplinas que cursei e em especial à Profa. Dra Isabel Jardim pela atenção e ensinamentos.
À todos aqueles que, de maneira direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho.
RESUMO
A cevada é um cereal com alto valor nutricional e baixo custo que pode servir como uma excelente fonte de antioxidantes. Para quantificar os compostos fenólicos em cevada é necessária a escolha de técnicas de preparo de amostras adequadas, principalmente por se tratar de uma matriz complexa. Neste trabalho, vários extratos de cevada foram preparados usando diferentes técnicas de extração como refluxo, agitação com aquecimento, com e sem atmosfera inerte, avaliação da hidrólise ácida ou básica e o método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged e Safe). Os parâmetros de extração dos extratos etanólicos realizados com agitação sob atmosfera inerte e em refluxo foram otimizados a partir de um planejamento fatorial completo e os fatores avaliados foram técnica de extração, temperatura e tempo de extração. As respostas foram obtidas pela caracterização dos extratos por ionização por eletrospray no modo negativo (ESI(-)-MS/MS), a partir da intensidade do sinal analítico e o número de compostos fenólicos identificados. A quantificação dos compostos fenólicos em grãos de cevada foi realizada empregando os métodos por refluxo e QuEChERSe a técnica de cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (UHPLC-MS/MS). Os métodos foram validados de acordo com as recomendações da Agência Brasileira de Vigilância Sanitária (ANVISA) e na avaliação de algumas amostras comerciais de grãos de cevada, notou-se que as concentrações dos compostos fenólicos catequina e epicatequina foram as mais elevadas. Já os ácidos cafeico e protocatecóico tiveram as concentrações mais baixas. Estas diferenças podem ocorrer devido à variação sazonal, assim como as condições de armazenamento dos grãos na comercialização.
ABSTRACT
Barley is a cereal with high nutritional value and low cost that can serve as an excellent source of antioxidants. In order to quantify phenolic compounds in barley, it is necessary to choose suitable sample preparation techniques, mainly because it is a complex matrix. In this work, several barley extracts were prepared using different extraction techniques such as reflux, heating with stirring, with and without an inert atmosphere, evaluation of acid or basic hydrolysis and the QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) method. The extraction parameters of the ethanolic extracts carried out under agitation using an inert atmosphere and at reflux were optimized from a complete factorial design. The factors evaluated were extraction technique, temperature and extraction time. The responses were obtained by the characterization of the extractions by electrospray MS in the negative mode [ESI (-) - MS / MS], based on the intensity of the analytical signal and the number of phenolic compounds identified. Quantification of phenolic compounds in barley grains was performed using the reflux and QuEChERS methods, followed by ultra high efficiency liquid chromatography coupled to sequential mass spectrometry (UHPLC-MS / (UHPLC-MS). The methods were validated according to the recommendations of the Brazillian Health Regulatory Agency (ANVISA). When some commercial samples of barley grains were evaluated, the concentrations of the phenolic compounds catechin and epicatechin were the highest. Caffeic and protocatecoic acids had the lowest concentrations. These differences can occur due to the seasonal variation, as well as the storage conditions of the grains during the commercialization.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura do grão de cevada...22
Figura 2: Algumas fontes de EROs e mecanismos de defesa...24
Figura 3: Esqueleto de base a partir dos quais os compostos fenólicos de origem vegetal são derivados...25
Figura 4: Representação das etapas das principais versões do método QuEChERS a) original; b) acetato; e c) citrato...36
Figura 5: Esquema ilustrativo de um equipamento de eletroforese capilar onde R1 e R2, e1 e e2 são os reservatórios e eletrodos, respectivamente. F representa a fonte de alta tensão, D é o detector, C é o computador para obtenção dos dados e EOF representa o fluxo eletrosmótico, que é gerado após ser aplicado o potencial...42
Figura 6: Esquema de um analisador triplo quadrupolo operando no modo SRM onde Q1 e Q3 são quadrupolos de transmissão e Q2 um quadrupolo onde ocorre a fragmentação dos íons...48
Figura 7: Mecanismo da evaporação do íon e da explosão coulômbica...51
Figura 8: Estruturas químicas dos compostos fenólicos em estudo...62
Figura 9: Fluxograma referente ao procedimento do método QuEChERS...67
Figura 10: Fragmentação do padrão do ácido ferúlico no modo negativo empregando infusão direta...73
Figura 11: Fragmentação do padrão do ácido p-cumárico no modo negativo empregando infusão direta...73
Figura 12: Fragmentação do padrão da catequina no modo negativo empregando infusão direta...74
Figura 13: Fragmentação do padrão de epicatequina no modo negativo empregando infusão direta...74
Figura 14: Fragmentação do padrão do ácido cafeico no modo negativo empregando infusão direta...75
Figura 15: Fragmentação do padrão sintético de rutina no modo negativo empregando infusão direta...75
Figura 16: Fragmentação do padrão sintético do ácido vanílico no modo negativo empregando infusão direta...76
Figura 17: Fragmentação do pico de razão m/z 193 (ácido ferúlico) na fração do extrato A no modo negativo empregando infusão direta...77 Figura 18: Fragmentação do pico de razão m/z 193 (ácido ferúlico) na fração do extrato C1 no modo negativo empregando infusão direta...79 Figura 19: Fragmentação do pico de razão m/z 193 (ácido ferúlico) na fração do extrato C2 no modo negativo empregando infusão direta...79 Figura 20: Fragmentação do pico de razão m/z 163 (ácido p-cumárico) na fração do extrato C1 no modo negativo empregando infusão direta...80 Figura 21: Fragmentação do pico de razão m/z 163 (ácido p-cumárico) na fração do extrato C2 no modo negativo empregando infusão direta...80 Figura 22: Fragmentação do pico de razão m/z 289 (catequina) na fração do extrato C1 no modo negativo empregando infusão direta...81 Figura 23: Fragmentação do pico de razão m/z 289 (catequina) na fração do extrato C2 no modo negativo empregando infusão direta...81 Figura 24: Fragmentação do pico de razão m/z 289 (epicatequina) na fração do extrato C2 no modo negativo empregando infusão direta...82 Figura 25: Fragmentação do pico de razão m/z 193 (ácido ferúlico) na fração do extrato C3 no modo negativo empregando infusão direta...83 Figura 26: Fragmentação do pico de razão m/z 179 (ácido cafeico) na fração do extrato C3 no modo negativo empregando infusão direta...84 Figura 27: Fragmentação do pico de razão m/z 179 (ácido cafeico) na fração do extrato C4 no modo negativo empregando infusão direta...84 Figura 28: Fragmentação do pico de razão m/z 289 (catequina) na fração do extrato C3 no modo negativo empregando infusão direta...85 Figura 29: Fragmentação do pico de razão m/z 289 (catequina) na fração do extrato C4 no modo negativo empregando infusão direta...85 Figura 30: Fragmentação do pico de razão m/z 289 (epicatequina) na fração do extrato C3 no modo negativo empregando infusão direta...86 Figura 31: Fragmentação do pico de razão m/z 289 (epicatequina) na fração do extrato C4 no modo negativo empregando infusão direta...86 Figura 32: Fragmentação do pico de razão m/z 163 (ácido p-cumárico) na fração do extrato C3 no modo negativo empregando infusão direta...87
Figura 33: Fragmentação do pico de razão m/z 163 (ácido p-cumárico) na fração do extrato C4 no modo negativo empregando infusão direta...87 Figura 34: Fragmentação do pico de razão m/z 609 (rutina) na fração do extrato C4 no modo negativo empregando infusão direta...88 Figura 35: Fragmentação do pico de razão m/z 167 (ácido vanílico) na fração do extrato C4...88 Figura 36: ESI no modo positivo dos íons precursores da mistura contendo 11 padrões de compostos fenólicos com voltagens do cone avaliadas em (A) 60, (B) 45, (C) 30, (D) 20, (E) 10 V...91 Figura 37: ESI no modo negativo da mistura contendo 11 padrões de compostos fenólicos com voltagem do cone avaliada em 30 V...92 Figura 38: Cromatograma da mistura contendo 11 padrões a 3 µg mL-1 com ESI no modo negativo. Condições cromatográficas: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1.7 μm (50 × 2,1 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O(0,1% ácido fórmico) e B= ACN
(0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a 15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI-(ionização por eletronebulização no modo negativo, 30 kV). Volume de injeção: 2 μL. Detecção: espectrômetro de massas com analisador triploquadrupolar...95 Figura 39: Cromatograma da mistura contendo 11 padrões a 3 µg mL-1 com ESI no
modo negativo com adição de NH4OH 0,025%. Condições cromatográficas: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1.7 μm (50 × 2,1 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O
(0,025% NH4OH) e B= ACN (0,1% ácido fórmico). Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a
15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI-(ionização por eletronebulização no modo negativo, 30 kV). Volume de injeção: 2 μL. Detecção: espectrômetro de massas com analisador triploquadrupolar...96 Figura 40: Cromatograma de íons totais dos compostos fenólicos presentes numa solução de 50 µg mL-1 em metanol e determinação por UHPLC-MS/MS em 11 canais de aquisição, no modo SRM. Identificação dos picos: A e B: Catequina e Epicatequina; C: ácido clorogênico; D: ácido vanílico; E: ácido cafeico; F: ácido p-cumárico; G: ácido ferúlico; H: ácido sinápico; I: rutina; J: ácido protocatecóico e L: miricetina...98
Figura 41: Cromatogramadeidentificação do ácido ferúlico no extrato A. Condições cromatográficas: coluna Waters Acquity UPLC BEH C-18 1.7 μm (50 × 2,1 mm d.i.); Fase móvel: A= H2O (0,1% ácido fórmico) e B= ACN (0,1% ácido fórmico).
Gradiente: 3% B por 1 min; 3% a 15% B em 4 min; 15% a 40% em 3 min; 40% a 3% em 1 min. Vazão: 0,350 mL min-1. Modo de Ionização: ESI-(ionização por eletronebulização no modo negativo, 30 kV). Volume de injeção: 2 μL. Detecção: espectrômetro de massas com analisador triploquadrupolar...99 Figura 42: Cromatograma deidentificação de ácidos ferúlico, p-cumárico e cafeico; catequina e epicatequina obtidos para o extrato C1. Condições cromatográficas da Figura 41...99 Figura 43: Cromatograma deidentificação dos ácidos ferúlico, p-cumárico e cafeico; catequina e epicatequina no extrato C2. Condições cromatográficas da Figura 41...100 Figura 44: Cromatograma deidentificação de ácidos ferúlico, p-cumárico e cafeico; catequina e epicatequina no extrato C3. Condições cromatográficas da Figura 41...101 Figura 45: Cromatograma do extrato C4 otimizado com ESI no modo negativo. Condições cromatográficas da Figura 41...102 Figura 46: Superfície de resposta dos fatores A: tempo de extração × temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração × tempo para a epicatequina...104 Figura 47: Superfície de resposta dos fatores A: tempo de extração ×
temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração × tempo para a catequina...106 Figura 48: Superfície de resposta dos fatores A: tempo de extração × temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração × tempo para o ácido cafeico...108 Figura 49: Superfície de resposta dos fatores A: tempo de extração × temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração × tempo para o ácido ferúlico...110 Figura 50: Superfície de resposta dos fatores A: tempo de extração × temperatura; B: técnica de extração × temperatura e C: técnica de extração × tempo para o ácido p-cumárico...112
Figura 51: Cromatogramas obtidos por UHPLC-MS/MS para separação da mistura de compostos fenólicos do extrato C4 fortificado (3 µg mL-1).Condições cromatográficas da Figura 41...114 Figura 52: Curvas analíticas para os ácidos clorogênico, sinápico, ferúlico e vanílico, cafeico, p-cumárico e protocatecóico além de rutina, catequina, epicatequina e miricetina preparadas em solvente e na matriz pelo método de extração em refluxo...117 Figura 53: Efeito matriz (%) para os compostos fenólicos em cevada usando UHPLC-MS/MS. (1) catequina; (2) epicatequina; (3) ácido clorogênico; (4) ácido vanílico; (5) ácido cafeico; (6) ácido p-cumárico; (7) ácido ferúlico; (8) ácido sinápico; (9) rutina; (10) ácido protocatecóico; (11) miricetina...118 Figura 54: Resíduos da regressão linear obtida para os compostos fenólicos analisados por UHPLC-MS/MS para a curva analítica construída na matriz...121 Figura 55: Cromatogramas do extrato fortificado com 3 µg mL-1 obtidos pelo método QuEChERS...126 Figura 56: Curvas analíticas para os ácidos clorogênico, sinápico, ferúlico e vanílico, cafeico, p-cumárico e protocatecóico além de rutina, catequina, epicatequina e miricetina preparadas em solvente e na matriz pelo método QuEChERS...129 Figura 57: Percentual do efeito matriz (%) empregando QuEChERS acetato para extração dos compostos fenólicos em cevada usando UHPLC-MS/MS. (1) catequina; (2) epicatequina; (3) ácido clorogênico; (4) ácido vanílico; (5) ácidocafeico; (6) ácido p-cumárico; (7) ácido ferúlico; (8) ácido sinápico; (9) rutina; (10) ácido protocatecóico; (11) miricetina...130 Figura 58: Resíduos da regressão linear obtida para os compostos fenólicos analisados por UHPLC-MS/MS para a curva analítica construída na matriz pelo método QuEChERS...132 Figura 59: Cromatogramas adquiridos no modo SRM do extrato de cevada por QuEChERS e análise por UHPLC-MS/MS para amostra A6...139
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Produção de cevada em 2005: área de colheita e produção...21 Tabela 2: Ensaios para um planejamento fatorial 23 para otimização da extração de compostos fenólicos em cevada...69 Tabela 3:Presença de compostos fenólicos em diferentes extratos...89 Tabela 4: Compostos fenólicos analisados com ionização no modo positivo...92 Tabela 5: Melhores condições de operação do espectrômetro de massas para a análise dos compostos fenólicos...93 Tabela 6: Parâmetros do espectrômetro de massas para a análise dos compostos fenólicos...93 Tabela 7: Figuras de mérito para a validação do método de extração otimizado. LQm: Limite de quantificação do método. LQi: Limite de quantificação do instrumento...122 Tabela 8: Concentração dos compostos fenólicos na amostra de cevada BRS lagoa 225...123 Tabela 9: Eficiência de extraçãodos compostos fenólicos no método por refluxo...124 Tabela 10: Figuras de mérito da validação referente ao método QuEChERS. LOQm: Limite de quantificação do método. LOQi: Limite de quantificação do instrumento...133 Tabela 11: Concentração dos compostos fenólicos na amostra de cevada...134 Tabela 12: Eficiência de extraçãodos compostos fenólicos no métodoQuEChERS...135 Tabela 13: Comparação entre as técnicas de preparo de amostras empregadas...135 Tabela 14: Concentração de compostos fenólicos em grãos de cevada avaliada pelo método por refluxo e pelo método QuEChERS...137 Tabela 15: Comparação entre a diferença nas médias do método por refluxo e método QuEChERS...138 Tabela 16: Concentração de compostos fenólicos em amostras comerciais de grãos cevada provenientes de diferentes regiões do Brasil...140
LISTA DE ACRÔNIMOS E ABREVIATURAS ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
CE- Eletroforese capilar, do inglês “Capillary electrophoresis”. CV- Coeficiente de variação.
C18- Octadecil
GC- Cromatografia Gasosa
ERO- Espécies reativas de oxigênio
ESI- Ionização por eletrospray, do inglês “Electrospray ionization”. FM- Fase móvel.
GCB- Carbono grafitizado, do inglês, “Graphitized Carbon Black”.
HPLC- Cromatografia líquida de alta eficiência, do inglês “High Performance Liquid Cromatography”.
LD- Limite de detecção. LQ- Limite de quantificação.
MS- Espectrometria de massas, do inglês “Mass Spectrometry”. MS/MS- Espectrometria de massas sequencial.
m/z- razão massa/carga. n- número de replicatas.
PSA- amina primária secundária, do inglês, Primary Secondary Amine. PTFE- politetrafluoretileno.
QuEChERS: rápido, fácil, barato, efetivo, robusto e seguro, do inglês, “Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust and Safe”.
SRM- Monitoramento de reações selecionadas, do inglês “Selected reaction monitoring”.
TOF- Analisador por tempo de voo, do inglês “Time of flight”.
UHPLC- Cromatografia líquida de ultra alta eficiência, do inglês “Ultra High Performance Liquid Chromatography”.
UHPLC-MS/MS- Cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial, do inglês “Ultra High Performance Liquid Chromatography with tandem mass spectrometry”.
20
1.INTRODUÇÃO
1.1. Cevada
A cevada (Hordeum vulgare L.) é um cereal muito antigo, sendo alguns fragmentos deste grão foram encontrados no Irã em aproximadamente 7900 a.C, antes mesmo do trigo.
A composição da cevada inclui proteínas, vitaminas, minerais e fibras, sendo um cereal bastante consumido no mundo [1]. É o cereal que melhor se adapta a baixas temperaturas e cresce em terras expostas à luz, bem escoadas e porosas e se adaptam melhor em solos com pH acima de 6,0, pois o pH baixo retarda o crescimento da sua raiz [2]. O grão pode ser plantado no solo sem arar e por esta razão pode ser cultivado em lotes minúsculos.
A cevada tem sido cultivada no Brasil desde a década de 1930 e, como consequência dos esforços do melhoramento genético e do desenvolvimento de técnicas de manejo, a cultura foi difundida pelo sul do Brasil, onde se localizam as áreas com locais mais adequados, em termos de clima e solo, para o plantio deste cereal [3].
A cevada tem sidoo quarto cereal mais consumido no mundo de acordo com a Organização das Nações Unidas para alimentação e Agricultura[4].
No entanto, apenas cerca de 2% do total tem sido usado para alimentação humana com o consumo do cereal e, o restante é direcionado para alimentação animal e para a indústria de cerveja [5]. Nos últimos anos, no Brasil, houve um grande interesse da sua utilização na alimentação humana, devido ao seu alto valor nutricional e também ao seu baixo custo. Mesmo assim, mais de 95% da cevada ainda é cultivada para fins cervejeiros [6].
O grão de cevada é constituído por casca, aleurona, endosperma, escutelo e embrião. A casca é formada pela palha, que é eliminada por uma fina camada, a aleurona, que recobre o endosperma, e o embrião, que corresponde a apenas 7% do grão. O endosperma é constituído basicamente de amido e proteína, sendo responsável pela formação de enzimas durante a malteação, enquanto que o embrião é o local das atividades vitais do grão [7].
21
A Tabela 1 mostra a produção de cevada em 2005 e relaciona a área de colheita e produção [4]. Dados mais recentes não foram encontrados na literatura.
Tabela 1: Produção de cevada em 2005: área de colheita e produção. Área Geográfica Hectares Colhidos
(× 1000) Toneladas métricas (× 1000) Europa 28.841 (51,0)a 83.202 (60,3)a Ásia 12.056 (21,3)a 21.302 (15,4)a América do Norte 5.203 (9,2)a 16.746 (12,1)a Canadá 3.880 (74,6)b 12.133 (72,5)b Estados Unidos Oceania África América do Sul Total 1.323 (25,4)b 4.789 (8,5)c 4.897 (8,7)a 811 (1,4)a 56.597 4.613 (27,5)b 10.269 (7,4) c 4.517 (3,3)a 1.897 (1,4)a 137.933 a
Valores em parênteses correspondem à porcentagem total.
b
Porcentagens de produção na América do Norte.
cAustrália e Nova Zelândia em relação à porcentagem total.
Um embrião de gramínea, quando totalmente formado, possui um cotilédone maciço, o escutelo, estreitamente aderente ao endosperma, conforme a Figura 1. A casca tem a função de proteção e contém fibras, antioxidantes, minerais e vitaminas. A principal diferença da cevada para outros grãos se deve ao fato de que a fibra alimentar está distribuída em todo o grão e não apenas na camada externa [8]. Um produto processado a partir da camada externa do grão de cevada, como o farelo, contribui nutricionalmente com os teores de fibra e de antioxidantes.
A cevada é conhecida pelo seu alto conteúdo de fibra alimentar solúvel (β-glucanas), a qual diminui o colesterol plasmático e índice glicêmico, além de reduzir o risco de câncer de cólon [9-11]. A propriedade de redução do colesterol em frangos com consumo de cevada foi mostrada inicialmente por Fisher e Griminger [12] (1967) e depois confirmada por Bengtsson et al. [13] (1990).
22
Figura 1: Estrutura do grão de cevada. Adaptado de [9]
Em 1975, Trowell et al. [14] fomentaram a hipótese de que a dieta rica em fibras pode ter um papel importante no controle do colesterol, no entanto, essas investigações foram centradas na fibra de trigo. Em 1996, Rimm et al. [15] conduziram um estudo com mais de 50.000 profissionais de saúde e concluíram que havia uma relação inversa entre ingestão de fibras e infarto do miocárdio. Dentre os três principais alimentos que contribuem para o total de fibras, estão: vegetais, frutas e cereais. A fibra de cereais foi a mais fortemente associada com a prevenção de doenças do coração.
1.2. Antioxidantes
Antioxidantes são compostos que reagem com substâncias reativas como os radicais livres presentes, por exemplo, no corpo humano. Eles atuam em diferentes níveis na proteção dos organismos com mecanismo de defesa contra os radicais livres, além de impedir a sua formação, principalmente pela inibição das reações em cadeia com ferro e o cobre.
Estudos comprovam que os grãos de cereais contêm compostos antioxidantes [16, 17].
23
Os antioxidantes em alimentos são caracterizados como compostos que podem retardar ou inibir as reações de oxidação provocadas pelas espécies reativas de oxigênio (ERO), as quais são compostos químicos resultantes da ativação ou redução do oxigênio molecular. Dentre as principais espécies reativas de oxigênio estão o ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio (H2O2), o radical peroxila, o
radical hidroxila, o oxigênio singlete e o radical peroxinitrito [18].
De modo geral, as reações de oxidação são de natureza radicalar com propagação em cadeia envolvendo o oxigênio e outras substâncias, normalmente envolvendo os lipídios e proteínas, que levam à formação dos radicais livres. As reações ocorrem em três estágios, iniciação, propagação e terminação.
O radical livre pode ceder o elétron desemparelhado, oxidando-se, ou receber um elétron, reduzindo-se. Na tentativa de se estabilizar quimicamente, os radicais livres propiciam reações em cadeia que terminam alterando a conformação, a estrutura e as funções de diversos componentes celulares [19].
O estresse oxidativo, resultante da formação e ação das espécies reativas de oxigênio, está relacionado com o envelhecimento celular, desenvolvimento de câncer, doenças neurológicas, doenças cardiovasculares e diabetes [20]. Além disso, a exposição a alguns agentes agressores externos, como a poluição ambiental, o fumo do tabaco, toxinas, entre outros, podem propiciar a acumulação de radicais livres no organismo. Os radicais livres podem ser originados através de fontes endógenas e exógenas e esses são metabolizados no organismo pelo sistema de antioxidantes enzimáticos (por ação das enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx e catalase) ou, também, podem ser neutralizados através de substâncias antioxidantes não enzimáticas (como tocoferóis, ácido ascórbico, carotenos, entre outros) [21, 22]. Verificam-se algumas fontes de espécies reativas de oxigênio (EROs) na Figura 2.
24
Figura 2: Algumas fontes de EROs e mecanismos de defesa [23].
Os antioxidantes atuam em diferentes níveis na proteção dos organismos como no mecanismo de defesa contra os radicais livres, cuja função é impedir a sua formação, principalmente pela inibição das reações em cadeia com ferro e cobre. Os antioxidantes são capazes de interceptar os radicais livres gerados pelo metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre os lipídios, os aminoácidos das proteínas, a dupla ligação dos ácidos graxos poli-insaturados e as bases do DNA, evitando a formação de lesões e perda da integridade celular [24].
1.2.1. Compostos Fenólicos
Dentre as diversas classes de antioxidantes de ocorrência natural, os compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos. Esses compostos englobam uma vasta gama de substâncias, as quais possuem pelo menos um anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos. Os intermediários formados pela ação dos compostos fenólicos são relativamente estáveis, devido à ressonância do anel aromático presente na estrutura dessas
25
substâncias [25]. O número de hidroxilas presentes nos compostos fenólicos, assim como a sua localização, têm influência na sua ação como antioxidante [26].
A ação desses compostos como antioxidante ocorre devido ao mecanismo de doação de hidrogênio e/ ou transferência de elétrons para o radical livre, sendo assim chamados de sequestradores de radicais livres. Portanto, os compostos fenólicos podem ser definidos como moléculas capazes de diminuir ou previnir a oxidação de outras moléculas, podendo atuar em alimentos ou em sistemas biológicos [18].
Os compostos fenólicos se enquadram em diversas categorias como fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados dos ácidos benzóico e cinâmico), cumarinas, flavonóides, estilbenos, taninos condensados e hidrolisáveis, lignanas e ligninas [27]. A Figura 3 representa as estruturas gerais dos compostos fenólicos.
Figura 3: Esqueleto de base a partir dos quais os compostos fenólicos de origem vegetal são derivados. Adaptado de Stalikas [28].
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Figura 3: Esqueleto de base a partir dos quais os compostos fenólicos de origem vegetal são derivados. Adaptado de Stalikas (continuação) [28].
Os principais grupos de compostos fenólicos encontrados nos cereais são os flavanóides e derivados hidroxicinâmicos [29].
Nos cereais, os compostos fenólicos podem ser encontrados na forma livre, solúvel ou conjugados, tanto no endosperma, como no gérmen e nas frações de farelo [30]. A maior parte destes compostos encontra-se na forma conjugada, esterificada aos polissacarídeos das paredes celulares [31].
Os compostos fenólicos solúveis encontram-se compartimentalizados dentro dos vacúolos celulares [32] e estão na forma livre (aglicona) ou conjugada, enquanto os fenólicos insolúveis encontram-se ligados à estruturas da parede celular, esterificados com arabinose ou resíduos de galactose dos componentes pécticos ou hemicelulósicos [33]. Os ácidos fenólicos livres representam a menor parte dos compostos fenólicos e são solúveis em soluções aquosas-orgânicas, tais como metanol, etanol ou acetona [34]. Os compostos fenólicos conjugados frequentemente estão sob a forma de ésteres e amidas, raramente ocorrendo como glicosídeos. Eles incluem compostos de baixa massa molar, solúveis em água, presentes no citosol, ou formas lipossolúveis, associadas às ceras da superfície dos cereais [35].
27
De forma geral, os compostos fenólicos são abundantes nos cereais e entre eles incluem-se: ácido ferúlico, ácido p- cumárico, ácido cafeico, ácido vanílico e ácido protocatecóico, presentes comumente nas camadas mais externas dos grãos [36].
Vários efeitos benéficos à saúde têm sido atribuídos aos compostos fenólicos presentes nos alimentos. Estes compostos estão presentes em uma grande variedade de gêneros alimentícios e bebidas, incluindo frutas, chás, café e vinho tinto [37]. Estudos realizados correlacionam aos mesmos propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, anti-microbiana, anti-carcinogênica e atividade antiviral, principalmente contra vírus envelopados, além de agirem melhorando a permeabilidade capilar, podendo auxiliar no tratamento de alguns distúrbios circulatórios [38,39].
1.3. Técnicas de preparo de amostras para determinação de
compostos fenólicos
Vários métodos de preparação de amostras têm sido desenvolvidos para determinar compostos fenólicos em uma grande variedade de amostras, desde a filtração em membrana de 0,45 µm de espessura [28,40,41] até procedimentos mais elaborados como extração acelerada por solvente, do inglês Accelerated Solvent Extraction (ASE) [17]. As técnicas de preparo de amostras mais difundidas para determinação de compostos fenólicos são: extração sólido-líquido [9,42], extração em fase sólida, do inglês Solid Phase Extraction (SPE) [19,43], microextração em fase sólida, do inglês Solid Phase Micro Extraction (SPME) [44], sonicação, entre outras [17, 28].
Por causa da grande diversidade de compostos fenólicos com diferenças de polaridade, acidez, número de grupos hidroxilas, anéis aromáticos e níveis de concentração, diversos procedimentos de tratamentos das amostras podem ser empregados para identificar e quantificar compostos fenólicos.
Para avaliação de matrizes complexas como cereais, a presença de interferentes pode encobrir o sinal analítico dos compostos em estudo e, portanto um tratamento prévio neste tipo de amostras é fundamental para fazer a limpeza
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(clean-up) para redução dos materiais co-extraídos da amostra e para reduzir o limite de detecção do método e evitar resultados imprecisos e inexatos [45].
De modo geral, as amostras de cereais são inicialmente trituradas, passando pelo processo de maceração, aumentando a superfície de contato quando um solvente for adicionado à amostra. Vários fatores são considerados relevantes no processo de extração, dentre eles: a natureza do solvente, a dissolução das substâncias extraíveis, a temperatura, o pH e o tempo de extração.
Os compostos fenólicos raramente estão presentes nos vegetais em sua forma livre, mas comumente, apresentam-se em sua forma glicosilada [46]. Assim, para extração de compostos fenólicos em grãos, pode-se optar pela escolha de solventes orgânicos como etanol, metanol, acetona e acetato de etila em mistura com água para extração de compostos fenólicos solúveis (CFS).
Para determinadas sementes ou matérias primas onde os compostos fenólicos encontram-se na forma glicosilada (ligados a carboidratos), torna-se necessário uma etapa adicional com o uso de ácidos para promover a hidrólise[18].
No caso da cevada, dentre os diversos métodos utilizados no preparo de amostras para identificação e/ou determinação de compostos fenólicos, destacam-se a extração por refluxo [39], agitação mecânica [47], ultrassom, [27, 16, 48], hidrólise ácida ou hidrólise básica [40, 41, 49, 50] e extração assistida por micro-ondas [51].
Um tratamento por explosão a vapor tem sido proposto como um dos métodos mais promissores para separar os principais constituintes dos materiais lignocelulósicos, seguido de extração com metanol, e foi aplicado para extração de compostos fenólicos em cevada. O pré-tratamento com explosão a vapor atua tanto química como fisicamente na estrutura do material lignocelulósico e está baseado no contato direto da biomassa com vapor saturado à alta pressão por um determinado tempo de residência no reator, seguido de descompressão rápida à condição atmosférica (explosão) [52]. Ao longo deste processo, as ligações químicas que mantêm os componentes macromoleculares da fitobiomassa fortemente associados são em parte quebradas, de forma que, no momento da descompressão, o material é desfibrado com facilidade e assim reduzido a partículas menores. Gong et al. [52] empregaram este processo em diferentes temperaturas variando entre 210 a 250°C durante 30 s para avaliação dos compostos fenólicos em cevada. A técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), do inglês, High Performance Liquid
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Cromatography com detecção por UV foi usada para avaliar o teor de ácido p-cumárico e ácido ferúlico antes e depois da explosão com vapor. Os resultados mostraram que o total de compostos fenólicos solúveis e a capacidade antioxidante total aumentaram com a utilização da explosão a vapor com maiores tempos de extração [52].
Uma metodologia baseada na liofilização das amostras de sementes, folhas e caules de cevada coletadas em diferentes regiões de Portugal passou por um processo de maceração à temperatura ambiente, seguida de extração com água em banho de ultra-som e centrifugação durante 10 min para posterior análise em HPLC/UV. Foram determinados uma grande diversidade de compostos fenólicos, incluindo flavonóides como isoorientina, isovitexina, seus glicosídeos eácido ferúlico [16]. Destaca-se neste trabalho a concentração de 2150,8 mg kg-1 para isorientina nas folhas de cevada.
Diferentes tipos de solventes extratores foram avaliados por sonicação durante 1 h em 3 variedades de cevada chinesa para avaliar o efeito da mistura de solventes na atividade antioxidante, capacidade de extração e seletividade de compostos fenólicos em cevada através da análise individual e do teor de compostos fenólicos totais. Os extratos com 80% de acetona mostraram a maior capacidade de extração para catequina e ácidos ferúlico, cafeico, vanílico, p-cumárico, 80% de metanol para epicatequina e ácido siríngico e 100% de água para os ácidos protocatecóico e gálico. Os autores concluíram que a extração com 80% de acetona é a mais recomendada para determinação de compostos fenólicos livres em cevada [48]. Embora neste trabalho os autores tenham ressaltado o uso da acetona, sabe-se que o etanol também é um poderoso solvente extrator de compostos fenólicos [39, 42].
Dvorakova et al. [47] testaram duas proporções de misturas de solventes, metanol/água ou acetona/água na razão 70:30 v/v, usando agitador mecânico a 250 rpm para a extração de compostos fenólicos. Em seguida, os extratos foram centrifugados durante 5 min. O sobrenadante foi coletado e evaporado até a secura. Posteriormente, a amostra foi extraída com acetato de etila e concentrada por evaporação para posterior análise por HPLC acoplada à Espectrometria de Massas com ionização por eletrospray (HPLC-ESI-MS). Catequina e prodelfinidina B3 foram os principais compostos encontrados e a acetona: água 70:30 v/v mostrou maior capacidade de extração dos compostos fenólicos.
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Bonoli et al. [53] avaliaram a eficiência para recuperar compostos fenólicos em cevada pela extração com solventes pressurizados, empregando a técnica de Extração Acelerada por Solvente, usando diferentes misturas como etanol-água 4:1 (v/v); metanol-água 4:1 (v/v); acetona-água 4:1 (v/v) e posterior hidrólise ácida ou básica. As recuperações das extrações foram avaliadas após a hidrólise ácida ou hidrólise alcalina e determinadas pela técnica de Eletroforese Capilar, do inglês, Capillary Electrophoresis (CE) e análises espectrofotométricas. Acetona aquosa e etanol aquoso extraíram elevadas concentrações de catequinas e taninos hidrolisados. O aumento na extração dos compostos fenólicos, especialmente ácidos hidroxicinâmicos, ocorreu quando o tempo de digestão por hidrólise básica foi prolongado. O estudo concluiu que compostos fenólicos livres podem ser perdidos no processo de desengorduramento numa etapa prévia à hidrólise.
Gallegos-Infanteet al. [54] reportaram um estudo no qual os grãos de cevada foram processados e submetidos à remoção de gordura com hexano seguido de extração dos compostos fenólicos com acetona/água 70:30 v/v, num agitador mecânico à temperatura ambiente. O teor de compostos fenólicos totais foi avaliado pelo método de Folin-Ciocalteau e pelo método de 2,2-difenil-1-picrilidrazil (DPPH). Os resultados mostraram que o aquecimento dos extratos e a torrefação da cevada aumentou o teor de compostos fenólicos em comparação com os extratos sem o processamento, mas a germinação reduziu o teor de compostos fenólicos [54]. Os autores reportaram que o aumento na concentração de compostos fenólicos apóso aquecimento dos extratos e torrefação pode ser associado à liberação dos mesmos a partir da decomposição dos constituintes celulares em função do tratamento térmico. Similarmente, Siddhuraju & Becker [55] também observaram a diminuição do teor de compostos fenólicos após a germinação e o aumento após o cozimento ou ao assar o grão de feijão.
Entre os vários solventes extratores relatados na literatura para a extração de compostos fenólicos em cevada, vale ressaltar a eficiência do etanol como solvente extrator para este tipo de análise. A variabilidade na capacidade antioxidantefoi determinada por diferentes métodos independentes para a avaliação
da atividade antioxidante, incluindo os testes de DPPH,
Ressonância paramagnética eletrônica (RPE) e análise térmica diferencial, do inglês
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a 80 °C. Destaca-se que a DTA é uma técnica rápida para investigação da capacidade antioxidante nos cereais e foi utilizada para a determinação da estabilidade à oxidação das culturas selecionadas como trigo, cevada e milho [42].
Em pesquisa recente, compostos fenólicos como a rutina, ácidos cafeico e ferúlico foram identificados e quantificados em diferentes cultivares de cevada brasileira em extração com mistura de solvente hidroetanólico 80:20 v/v e banho ultra-sônico para avaliar os fatores climáticos no conteúdo de compostos fenólicos [56]. Os autores concluíram que uma menor incidência solar, maior índice pluviométrico e uma menor temperatura média foram considerados fatores favoráveis no aumento do conteúdo de fenólicos totais e de rutina nas cultivares de cevada de diferentes safras.
Em outro trabalho, os compostos fenólicos foram extraídos da casca de cevada utilizando a extração com fluido pressurizado, usando etanol ou o líquido iônico 2-metil-hidroxietil acetato de amônio. Os melhores resultados para extração de compostos fenólicos (189,1 ± 3,1 mg/g de casca) foram obtidos com o líquido iônico pressurizado. Já para extração de carboidratos (450,3 ± 7,8 mg/g de casca), os melhores resultados foram com o etanol pressurizado [57]. Concluiu-se que dentre as variáveis avaliadas para otimizar a extração usando fluido pressurizado para determinação de carboidratos e compostos fenólicos, a temperatura foi considerada a variável mais significativa quando comparada com a razão do fluxo e concentração do etanol, parâmetros avaliados na etapa de otimização [57].
Um procedimento muito comum na determinação de compostos fenólicos em cevada é a hidrólise. A hidrólise alcalina e a hidrólise ácida são bastante citadas nos procedimentos de preparo de amostras de compostos fenólicos em alimentos [17, 28]. A hidrólise ácida e a saponificação são os meios mais comuns de liberar os ácidos fenólicos, ainda que possam se decompor sob estas condições. O método de hidrólise ácida envolve o tratamento do extrato, como por exemplo com o ácido clorídrico em refluxo [28]. Já a hidrólise básica consiste no tratamento da amostra com solução contendo um álcali, normalmente hidróxido de sódio. As principais variáveis investigadas na hidrólise química são a concentração do ácido/base, tempo de hidrólise e temperatura. Neste contexto, alguns trabalhos são citados na literatura destacando a importância desse tipo de procedimento na determinação de compostos fenólicos.
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Após a hidrólise alcalina do extrato metanólico de cevada, 7 compostos fenólicos foram separados por HPLC/UV. Para isso, 1 g de cevada foi hidrolisado com 50 mL de NaOH 2 mol L-1 sob atmosfera de nitrogênio, por 4 h. A mistura foi acidificada com HCl 2 mol L-1 até pH 1 e extraída 3 vezes com acetato de etila. Três compostos, o ácido trans-ferúlico, o ácido trans-cumárico e o ácido cis-ferúlico, foram quantificados [58].
Em 2008, outro trabalho realizado por Kvasnicka et al. [59] relataram que submetendo as amostras de cevada pulverizadas dispersas em solução alcalina de NaOH ou solução ácida de HCl, foi possível hidrolisar seus compostos fenólicos, facilitando a separação da matriz heterogênea que compõe seus grãos. Após a hidrólise, uma extração fazendo uso de um solvente como metanol auxiliado por ultrassom pôde ser eficaz para posterior análise por CE e HPLC. Foi possível a determinação da concentração do ácido ferúlico de 43,4 mg 100 g-1 em uma das amostras de cevada por CE e 43,0 mg 100 g-1 por HPLC.
Com duas etapas de hidrólises alcalinas e outra com extração hidroetanólica, seguidos por análise por cromatografia líquida e detecção por espectrometria de massas com ionização por eletrospray e analisadores por tempo de voo e quadrupolo, foi possível identificar o ácido p-cumárico, ácido gálico e isoquercitrina nos grãos de cevada. A extração com etanol 50% atingiu o maior conteúdo fenólico livre em comparação com água e etanol absoluto. Notou-se também que a elevação da temperatura até 80 °C aumentou os teores fenólicos [41]. Diferentes solventes extratores foram avaliados para obter a composição de compostos fenólicos por métodos espectrofotométricos com absorção em 280, 320 e 370 nm pelo método de Folin-Ciocalteu. Foram utilizados o metanol, etanol e acetona misturados com água na proporção de 4:1 (v/v) para extração de compostos fenólicos livres. A mistura etanólica forneceu a maior recuperação dos compostos fenólicos. Também foi realizada a comparação entre a hidrólise alcalina e a hidrólise ácida. Notou-se que a concentração de ácidos fenólicos tais como cinâmico, ferúlico e cumárico aumentou quando o tempo de digestão na hidrólise alcalina foi prolongado, sendo que o ácido ferúlico foi o mais abundante nas amostras de cevada. Houve um decréscimo na concentração de compostos fenólicos quando a hidrólise ácida foi utilizada [53].
Em outro trabalho, algumas amostras de cevada foram submetidas à hidrólise com solução de 3% de H2SO4 por 15 min a 130°C na razão líquido/ sólido
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de 8:1 g/g. Os sólidos foram separados por filtração, lavados com água, secos com ar e a remoção das ligninas foi feita com acetato de etila. O fracionamento dos extratos foi realizado com diferentes razões de metanol:água. O processo de fracionamento usado permitiu a obtenção de extratos com diferentes atividades antioxidantes [60].
Em 2006, Freitas [61] observou o aumento do efeito antioxidante de forma proporcional ao aumento da concentração de polifenóis totais em diferentes tipos de cerveja. Para determinar os polifenóis totais foi utilizado o método de Folin-Ciocalteu. Os conteúdos fenólicos nas cervejas analisadas variaram de 249,73 a 808,58 mg/L. A cerveja escura de trigo apresentou os maiores valores de polifenóis totais, seguida das cervejas escuras de cevada, as cervejas claras de trigo e as cervejas claras de cevada.
1.3.1. QuEChERS
Em 2003, Anastassiades e colaboradores relataram um atraente método para preparo de amostras denominado QuEChERS (rápido, fácil, barato, efetivo, robusto e seguro, do inglês, quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) com o objetivo de superar as limitações práticas das técnicas de preparo de amostra de multirresíduos de agrotóxicos disponíveis, introduzindo um novo procedimento de preparo de amostras para explorar as possibilidades oferecidas pela instrumentação analítica moderna [62]. Este método cobre um grande escopo de analitos, incluindo analitos polares, moderadamente polares e apolares em várias matrizes. O procedimento envolve uma etapa única de extração da amostra com acetonitrila, seguido de um particionamento líquido-líquido pela adição de sulfato de magnésio anidro e cloreto de sódio. A remoção de água e a purificação são realizadas simultaneamente com extração em fase sólida dispersiva (d-SPE, do inglês Dispersive Solid Phase Extraction), usando sulfato de magnésio e um sorvente de amina primária secundária (PSA, do inglês Primary Secundary Amine).
A utilização de acetonitrila como solvente possibilita a extração de uma menor quantidade de co-extrativos lipofílicos provenientes da amostra, como por exemplo, ceras, gorduras e pigmentos. Por outro lado, a acetonitrila possibilita uma ampla faixa de extração de compostos com diferentes polaridades e, quando
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acidificada permite eficazes recuperações de agrotóxicos que geralmente apresentam problemas de estabilidade [62]. Além disso, a acetonitrila é mais adequada para LC-MS/MS do que acetona e acetato de etila.
Na etapa de partição, a adição de sais para promover o efeito salting out proporciona melhores percentuais de recuperação para os analitos polares, uma vez que os sais diminuem a solubilidade destes compostos na fase aquosa, bem como a quantidade de água na fase orgânica e vice-versa [63]. A escolha do MgSO4 no
desenvolvimento do método QuEChERS foi devido à maior capacidade de remover água quando comparado com outros sais. Além disso, sua hidratação se trata de uma reação exotérmica, tendo como resultado o aquecimento entre 40 e 45 °C da amostra, favorecendo a extração, especialmente dos compostos apolares [63].
O procedimento de agitação manual ou com auxílio do agitador tipo vórtex possui várias vantagens em relação à agitação mecânica, tais como possibilidade de realizar a extração a campo; a extração ocorre em um único frasco fechado; rapidez, uma vez que não há necessidade de lavagem do homogeneizador no intervalo entre as extrações. Portanto, no método QuEChERS, a agitação pode ser manual ou utilizando vórtex [62].
A etapa de limpeza ou clean-up é fundamental para aumentar a confiabilidade dos resultados e promover robustez ao sistema cromatográfico.
A d-SPE proposta por Anastassiades et al. [64] está relacionada com um procedimento muito simples para ser empregado na limpeza de diferentes extratos destinado à análise cromatográfica. Na proposta original agita-se o extrato (1 mL) com pequena quantidade de sorvente PSA (25 mg). A função deste sorvente é de remover açúcares, ácidos graxos, ácidos orgânicos e pigmentos [65]. A agitação tem como objetivo a distribuição uniforme do sorvente e tende a favorecer a etapa de limpeza do extrato. Após a centrifugação, uma alíquota do extrato final é retirada para análise. Assim, o sorvente atua como um filtro químico, retendo os coextrativos da matriz. A d-SPE busca alcançar um extrato final com menor quantidade de interferentes, aliada a um menor custo quando comparada com outras técnicas convencionais [63, 66].
O método QuEChERS apresenta algumas vantagens sobre os métodos tradicionais de preparo de amostras para determinação de resíduos de agrotóxicos, dentre eles podem-se citar: altos porcentuais de recuperação (> 85%) para um grande número de compostos de diferentes polaridades e volatilidades.
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A desvantagem do método QuEChERS está na relação massa de amostra/volume de extrato final que é de 1 g por 1 mL. Este valor é baixo quando comparado com os obtidos por outros métodos que utilizam uma etapa de concentração, apresentando relação amostra/ extrato final de 2 a 5 g por 1 mL [63] . Portanto, se a matriz não é uma fonte de ruídos nas análises isto pode conduzir, no método QuEChERS, a valores de limite de quantificação (LQ) mais elevados, para o mesmo volume de injeção. No entanto, considerando a alta detectabilidade das técnicas cromatográficas disponíveis atualmente como Cromatografia Gasosa acoplada à espectrometria de massas sequencial (GC-MS/MS) e Cromatografia Líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS), o método QuEChERS é adequado e constitui o estado da arte para determinação de agrotóxicos.
1.3.2. Diferentes versões do método QuEChERS
Mesmo com a versão original do método que forneceu excelentes resultados para diferentes tipos de amostras, algumas aplicações mostraram que certas substâncias químicas apresentavam problemas de estabilidade e/ ou recuperação dependendo do pH da matriz [66]. Em 2005, de acordo com Lehotay et al. [67], a adição de uma etapa de tamponamento foi a primeira modificação no método QuEChERS, com o objetivo de obter recuperação entre 70 e 120%.
O método QuEChERS e suas várias versões modificadas têm sido utilizado com sucesso para a extração de agrotóxicos de uma variedade de frutas e vegetais. Anastassiades e Lehotay [64] e Lehotay et al. [67] modificaram o método QuEChERS original, não tamponado, passando a utilizar um tampão acetato e citrato, respectivamente, para evitar a degradação de certos agrotóxicos sob condições alcalinas. Na Figura 4 é possível diferenciar as três diferentes versões deste método.
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Figura 4: Representação das etapas das principais versões do método QuEChERS a) original; b) acetato; e c) citrato [62].
Em 2005, Lehotay et al. [67] desenvolveram o método QuEChERS acetato, no qual o efeito tamponante é decorrente da adição de acetato de sódio. No método QuEChERS acetato, a extração é efetuada com acetonitrila contendo 1% (v/v) de ácido acético (HAc) e efeito tamponante (pH=4,8) é decorrente da adição de acetato de sódio.
Em 2007 este método foi adotado como método oficial da Association of Official Analytical Chemists (AOAC) para a determinação de resíduos de agrotóxicos em alimentos [68].
Em 2007, Anastassiades et al. propuseram o desenvolvimento do método QuEChERS citrato, que utiliza uma mistura de citrato de sódio di-hidratado e sesqui-hidratado como responsáveis pelo efeito tamponante (pH=5,0-5,5) [69]. A partir disso, o Comité Européen Committee de Normalisation (CEN), oficializou o método “QuEChERS citrato” como método de referência na União Européia [70].
Outra modificação muito relevante na etapa de limpeza foi o uso de uma maior quantidade de PSA na etapa de d-SPE em amostras de cereais com o objetivo de remover, de forma mais eficiente, os ácidos graxos co-extraídos,
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açúcares e pigmentos [71]. Além do uso de PSA, o carbono grafitizado também pode ser usado na etapa de limpeza para redução do teor de pigmentos nos extrato provenientes de amostras vegetais a partir da adição de uma pequena quantidade de carvão ativado ou carbono grafitizado. Este possui uma grande área superficial e contém grupos altamente polares na superfície com alto potencial para formação de ligações de hidrogênio.
Aplicações diversas do método QuEChERS são citadas na literatura. Em 2012, Hackbart et al. usaram o método QuEChERS nas versões original e acetato para determinação de ocratoxina e citrinina em arroz e farelo de arroz [72]. As condições otimizadas ocorreram quando foi utilizada a maior quantidade de água (20 mL) e menor quantidade de terra diatomácea (200 mg).
Em 2005, a partir dos excelentes resultados obtidos para frutas e legumes com o método QuEChERS, levou Lehotay et al. [67] a fazer a avaliação da determinação de resíduos de agrotóxicos em matrizes que contivessem até 20% de gordura (leites e ovos). Eles concluíram que alimentos que contêm de 2 a 20% de gordura também podem conter resíduos de agrotóxicos tanto lipofílicos como hidrofílicos, e portanto, seria fundamental desenvolver métodos analíticos capazes de determinar analitos com uma ampla faixa de polaridade. Dentre os alimentos incluem o leite, ovos, nozes, milho, soja, trigo, cevada entre outros grãos, peixes, aves, carne de porco, carne bovina e abacate.
Assim, a eficiência da limpeza dos extratos de matrizes gordurosas como leite, carnes, leite e abacate usando o método QuEChERS foi avaliada empregando sorventes como PSA, carbono grafitizado, do inglês, graphitized carbon black (GCB) e ciclo(hetero)alquenila (B38) na etapa de d-SPE [73].
Uma modificação bastante importante na etapa d-SPE foi a adição do sorvente octadecilsilano (C18) para propiciar uma limpeza mais efetiva de amostras com elevados teores de gordura [66].
Alguns trabalhos realizados com amostras com elevado teor de gordura, como o leite bovino, empregaram C18 e PSA na etapa de limpeza [73]. Neste estudo foram avaliados diferentes sorventes na etapa de limpeza por d-SPE como C18 e PSA em combinação com MgSO4 anidro. Esta combinação de sorventes também foi
aplicada com sucesso na determinação de agrotóxicos em carne e gordura bovina por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Os percentuais de recuperação obtidos para os agrotóxicos em carne e gordura bovina
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em diferentes concentrações variaram de 70 a 129%, com estimativa de desvio padrão ≤ 27%. Em 2009, Prestes et al. determinaram 19 agrotóxicos em amostras de leite, abacate e ovos [74].
O elevado número de trabalhos que aplica este tipo de preparo de amostra na determinação de resíduos de agrotóxicos em alimentos demonstra claramente as vantagens desta técnica que é rápida, fácil, econômica, efetiva, robusta e segura, como seu próprio nome afirma.
Embora o método QuEChERS seja muito explorado para análise de agrotóxicos em diversos tipos de matrizes, ainda há pouco relatos na literatura sobre seu uso na determinação de compostos fenólicos.
Recentemente, Fontana & Bottini [75] determinaram 9 compostos fenólicos em vinhos produzidos na Argentina empregando o método QuEChERS. A partir das condições otimizadas, as amostras contendo 5 mL de vinho (previamente acidificado com 1% de ácido fórmico) foram extraídas usando 2,5 mL de acetonitrila. Para etapa de separação 1,5 g de NaCl e 4 g de MgSO4 foram adicionados. Em
seguida, 1 mL do sobrenadante da etapa de partição foi submetido à etapa de limpeza utilizando d-SPE com uma combinação de 150 mg de CaCl2, 50 mg de PSA e 50 mg de C18 como sorventes. Uma alíquota do extrato foi analisada por HPLC/UV. Os resultados encontrados para as figuras de mérito foram satisfatórios e o método proporcionou limites de quantificação variando de 0,03 a 0,26 µg mL-1
entre os analitos. A precisão intermediária ficou abaixo de 12% para todos os analitos em amostras de vinho tinto e branco.
1.4. Planejamento experimental no preparo de amostras
A quimiometria é a ciência que aplica estatística por meio de planejamentos de experimentos (fatoriais, de misturas ou mistos) e tem sido frequentemente utilizada como uma ferramenta no auxílio das otimizações em química. Assim, muitas vezes, facilitam o entendimento das variáveis relevantes e consequentemente, reduz o tempo e os custos das análises. Isso também favorece a análise de dados de uma forma mais rápida, criteriosa e sistemática [76].
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De forma geral, na aplicação da quimiometria, ressalta-se o potencial do uso de planejamentos de experimentos como ferramenta auxiliar de otimização em investigações envolvendo o preparo de amostras [66].
As técnicas de superfície de resposta são ferramentas matemáticas muito úteis quando se está interessado na otimização de um processo em que se tem a influência de vários fatores em uma variável resposta, ou seja, os modelos de superfície de resposta podem ser explorados para determinar condições ótimas para se trabalhar ou a sensibilidade da variável resposta a mudanças dos níveis dos fatores de interesse. Para a fase de otimização, é importante ressaltar que a visualização gráfica da superfície de resposta é possível quando se tem até 2 fatores.
A metodologia de superfícies de respostas é uma técnica de otimização de sistemas que é baseada em planejamentos fatoriais. Possui duas etapas distintas, a modelagem e o deslocamento. A primeira é feita ajustando-se modelos simples às respostas obtidas com planejamentos fatoriais. A segunda trata-se do deslocamento ao longo do caminho de máxima inclinação de um determinado modelo, que é a trajetória na qual a resposta varia de forma mais pronunciada [76].
Os resultados obtidos a partir das superfícies de resposta contribuem para encontrar as variáveis significativas, assim como as condições ótimas dos fatores.
Alguns trabalhos são citados na literatura destacando a importância do planejamento experimental para otimização dos procedimentos de extração.
Uma superfície de resposta foi obtida na otimização das condições de extração em amostras de cevada: porcentagem de solventes orgânicos, temperatura e tempo. A capacidade antioxidante aumentou ao utilizar 80,2% de metanol e 60,5°C por 38,36 min, parâmetros obtidos através da superfície de resposta. Compostos fenólicos de 6 amostras de cevada foram extraídos para obter a superfície de resposta depois do desengorduramento com hexano e, subsequentemente, os extratos foram avaliados quanto à sua atividade antioxidante. O teor de compostos fenólicos totais medido de acordo com o método Folin-Ciocalteau, variou de 13,58 a 22,93 mg de ácido ferúlico por grama de amostra [77].
A determinação de compostos fenólicos foi otimizada por micro-ondas em grãos de cevada torrada [51]. As melhores condições para obtenção da cevada torrada com maior atividade antioxidante foi a potência de 600 W para micro-ondas,
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tempo de aquecimento de 8,5 min e 65,5 g de grãos. A extração com acetona teve a maior inibição da peroxidação lipídica. Foram avaliadas 3 variáveis independentes no planejamento experimental tais como potência do micro-ondas, tempo e quantidade de grãos de cevada com 3 níveis para cada variável, enquanto que as variáveis dependentes foram atividade antioxidante com a % de inibição usando o método DPPH e conteúdo de fenólicos totais. As superfícies de respostas mostraram que mantendo o tempo e a quantidade de cevada constante, houve um aumento significativo na atividade antioxidante com a elevação da potência das micro-ondas. No entanto, as superfícies de respostas também mostraram uma diminuição na concentração de compostos fenólicos devido à degradação, quando elevadas potências do micro-ondas foram utilizadas. A atividade antioxidante inicialmente aumentou e depois diminuiu com o tempo de aquecimento e quantidade de grãos.
Com o objetivo de determinar compostos fenólicos em cascas de cevada, após a auto-hidrólise com água líquida quente e a partir do fracionamento usando coluna Sephadex LH-20, constatou-se que dentre os solventes testados, o acetato de etila permitiu a maior extração de compostos fenólicos. As maiores concentrações de compostos isolados foram para o ácido benzóico e o ácido cinâmico. A partir da elaboração de um planejamento experimental de 23 com a realização de 16 experimentos, considerando 3 variáveis independentes, tais como pH, T°C e % de etanol. Foi possível concluir que a diminuição na concentração de etanol diminuiu a concentração de compostos fenólicos para valores mais baixos de pH. Já outra variável dependente evidenciou, a partir da superfície de resposta, o aumento da atividade antioxidante com a maior concentração de etanol [78].
1.5.Técnicas de separação para determinação de compostos
fenólicos
As técnicas analíticas mais usadas para a determinação de compostos fenólicos em cevada incluem a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) [16, 48, 58] e a eletroforese capilar (CE) [53, 79]. Mais recentemente, a cromatografia líquida de ultra alta eficiência, do inglês, Ultra High Performance Liquid Cromatography (UHPLC) [80] têm sido usada para análise de compostos fenólicos.
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1.5.1. Eletroforese Capilar
A eletroforese capilar (CE) é uma técnica analítica de separação baseada na migração diferenciada de compostos iônicos ou ionizáveis em um campo elétrico.
Esta técnica que é aplicável na determinação de uma grande variedade de analitos em amostras diversas possui uma série de vantagens como rapidez, versatilidade, baixo custo das análises, alto poder de resolução e pouco consumo de amostras, reagentes e solventes. Por outro lado, esta técnica oferece algumas limitações como a sua baixa detectabilidade [81].
O equipamento é composto por uma fonte de alta tensão conectada por dois eletrodos de platina a dois reservatórios contendo uma solução de eletrólitos, além de um capilar com passagem por um centro óptico de um sistema de detecção, conectado a um receptor de dados, e a um sistema de introdução da amostra que é controlado por um computador [82]. A Figura 5 representa um esquema ilustrativo de um equipamento de Eletroforese Capilar.
A utilização de capilares de sílica fundida na execução da técnica introduziu a geração do chamado fluxo eletrosmótico (EOF). Este fluxo é a consequência de uma interação entre a solução e as paredes do capilar. A sílica fundida é quimicamente caracterizada pela presença de vários tipos de grupo silanol (SiOH), os quais apresentam caráter ácido. Em contato com a solução aquosa, alguns desses grupos são dissociados e por este motivo a superfície do capilar torna-se negativamente carregada, gerando um saldo positivo de espécies carregadas positivamente na solução. Quando um campo elétrico é aplicado à superfície, forças elétricas causam um movimento unilateral de íons em direção ao eletrodo de carga oposta [83].
