Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma das técnicas cromatográficas mais empregadas na atualidade. Apresenta muitas vantagens para as análises de combinações orgânicas. Amostras não voláteis e termolábeis são preferencialmente analisadas por HPLC devido à sua rapidez na análise, sensibilidade e precisão nas medições realizadas pelo equipamento, que apesar de sofisticado e de alto custo, possui aplicação em diversos tipos de matrizes [84,85].

A técnica de HPLC é a mais usada e estabelecida para a determinação de compostos fenólicos em cevada devido ao seu grande poder de separação e possibilidade de acoplamento com diferentes detectores [84].

Zhao et al. [48] avaliaram o efeito de uma mistura de solventes na atividade antioxidante, capacidade de extração e seletividade de compostos fenólicos em cevada. A análise individual de compostos fenólicos foi realizada por

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HPLC/UV. A separação dos compostos fenólicos foi alcançada usando cromatografia no modo fase reversa com eluição por gradiente empregando fase móvel A (água com 0,1% de ácido acético) e fase móvel B (metanol com 0,1% de ácido acético) durante 60 min de análise [48]. Foram identificados e quantificados 9 compostos fenólicos tais como catequina, epicatequina, ácidos siringico, ferúlico, protocatecóico, cafeico, vanílico, gálico e cumárico em diferentes solventes extratores (etanol, metanol e água) e em 3 variedades de cevada. Os autores determinaram 56,15µg g-1 para catequina; 12,45 µg g-1 para epicatequina; 10,29 µg g-1 para o ácido siringico; 12,05 µg g-1 para o ácido ferúlico; 7,88µg g-1 para o ácido cafeico; 3,62 µg g-1 para o ácido vanílico; 2,71 µg g-1 para o ácido gálico e 1,78 µg g-

1 _{para o ácido p-cumárico em grãos de cevada.}

Os ácidos fenólicos que estão ligados às paredes celulares da cevada germinada apresentam elevado potencial antioxidante na cerveja. Neste contexto, os autores fizeram um estudo para determinar compostos fenólicos em cerveja. Depois da hidrólise alcalina do extrato metanólico de cevada germinada (malte), 7 compostos fenólicos foram separados por HPLC/UV com coluna C18 e eluição por gradiente usando fase móvel A (água com ácido ortofosfórico) e fase móvel B, acetonitrila. Os 3 principais compostos, como ácidos trans-ferúlico, trans-cumárico e cis-ferúlico (177,79; 78,50 e 47,15 µg g-1) respectivamente foram quantificados por padronização externa. Os autores relataram que os ácidos fenólicos devem ser protegidos antes do final do processo de malteação, que é um processo de germinação controlada da cevada e que envolve a umidificação e a secagem, cujos propósitos são amolecer os grãos para facilitar a moagem, além de introduzir cor e aromas desejáveis à cerveja. Quando o processo de malteação não é controlado, seus produtos de degradação, como por exemplo a descarboxilação do ácido ferúlico podem ser responsáveis pela perda de sabor da cerveja [58].

Aleksenko et al. [86] identificaram vários compostos fenólicos por HPLC/UV e ionização por eletrospray com espectrometria de massas sequencial (ESI-MS/MS) em amostras de cevada. Os principais compostos encontrados foram rutina, catequina, epicatequina, além de procianidinas B3 e C. A análise realizada por HPLC/MS empregou analisador quadrupolo com ionização por ESI. A separação foi alcançada a partir de uma coluna C18 com gradiente de eluição por gradiente usando fase móvel contendo acetonitrila com 10 mmol L-1_{de ácido acético [86].}

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Um estudo realizado em 2010 por Li et al. [87] determinou 3 ácidos fenólicos (ácido p-cumárico, ácido ferúlico e ácido sinápico) por HPLC/UV usando coluna C18 e fase móvel com eluição por gradiente contendo água com 0,1% de ácido acético no solvente A e acetronitrila com 0,1% de acetonitrila no solvente B em 5 amostras comerciais de cevada. O ácido ferúlico foi o composto fenólico predominantemente encontrado na razão de 42 a 400 mg kg-1. Outros ácidos fenólicos (cafeico, cumárico e sinápico) foram identificados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) [87].

Dvorakova et al. [47] constataram que catequina e prodelfinidina B3 foram os principais compostos encontrados na avaliação de 10 variedades de amostras de cevada usando HPLC/UV e HPLC-ESI-MS. O estudo qualitativo de compostos fenólicos foi realizado por HPLC-ESI-MS com coluna C18, usando fase móvel A contendo 100% de metanol e fase móvel B com 0,1 % de ácido fórmico, com eluição por gradiente, vazão de 0,2 mL min-1 e volume de injeção de 20 µL, além de ionização no modo negativo. Já a análise quantitativa dos extratos de acetona:água (70:30, v/v) foi feita por HPLC/UV, com detecção em 280 nm, nas mesmas condições cromatográficas empregadas em HPLC-ESI-MS.

Verardo et al. [79] fizeram um estudo comparando dois métodos de separação de compostos fenólicos, HPLC/UV-MS e MECK. O objetivo do estudo foi produzir farelo de cevada com compostos fenólicos para obter ingredientes naturalmente enriquecidos para a indústria alimentícia. A análise por HPLC/UV foi realizada no modo fase reversa com coluna C18 e detecção em 280 nm. Os autores concluíram que as amostras de cevada analisadas continham principalmente catequina e proantocianidinas como fenólicos livres, ácidos hidróxicinâmicos e seus derivados na faixa de 130,6 a 166,5 mg 100 g-1 _{nas amostras de cevada [79]. Os}

dados de quantificação mostram que tanto a MECK como HPLC apresentaram resultados semelhantes em termos de precisão e quantidade de compostos fenólicos (mesma ordem de grandeza).

Em 2011, Hao e Beta [80] realizaram a análise qualitativa e quantitativa de compostos fenólicos em cascas de cevada no modo fase reversa por HPLC- MS/MS e HPLC/UV, na qual determinaram ácido ferúlico, ácido p-cumárico, ácido vanílico e vanilina nas concentrações de 2260,0; 1365,0; 58,6 e 157,2 mg kg-1 respectivamente. A análise por HPLC/UV com detecção em 280 nm foi realizada no modo reverso com coluna C18, com fase móvel contendo água com 0,1% de ácido

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acético no solvente A e acetronitrila com 0,1% de ácido acético no solvente B e eluição por gradiente em 75 min. A identificação e caracterização dos compostos fenólicos foi baseada na comparação do perfil dos espectros de UV e espectros de MS/MS com os padrões. Os resultados quantitativos alcançados por HPLC/UV mostraram que ácido ferúlico e ácido p-cumárico foram os compostos fenólicos abundantes em cascas de cevada [80].

Um trabalho realizado para obtenção do perfil fitoquímico em cevada negra constatou a predominância do ácido ferúlico e ácido p-cumárico por HPLC no modo reverso com coluna C18 e eluição por gradiente usando 0,05% de ácido trifluoracético em água (solvente A) e 0,05% ácido trifluoracético em acetonitrila (solvente B). O comprimento de onda usado para detecção foi de 280 nm [88].