Validação do Método QuEChERS

A seletividade do método foi avaliada para algumas amostras de cevada (extratos de cevada com fortificação) que foram injetadas para monitorar, através das janelas de aquisição, os cromatogramas dos analitos individualmente sem a necessidade de separá-los completamente. Na Figura 55 estão os cromatogramas do extrato obtido utilizando-se o método QuEChERS para a amostra fortificada. O cromatograma de cada composto fenólico foi obtido no canal correspondente à sua transição.

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Figura 55: Cromatogramas do extrato fortificado com 3 µg mL-1 obtidos pelo método QuEChERS.

Neste método foi feita uma diluição de 5 vezes nos extratos de cevada após a etapa de extração a fim de melhorar a resolução dos picos e diminuir o efeito matriz. Pode-se notar que o fator de diluição nos extratos de cevada melhorou a resolução dos picos cromatográficos quando comparados com os cromatogramas do método de extração sob refluxo apresentado anteriormente (Figura 51).

O coeficiente de determinação (r2) e a faixa linear foram determinados pela obtenção das curvas analíticas (0,3 até 100 µg mL-1) preparadas pelas soluções dos compostos em solvente e na matriz. A Figura 56 mostra os comportamentos distintos das curvas analíticas.

Foi possível observar que existe uma diferença significativa nos coeficientes angulares para alguns compostos, indicando a presença do efeito matriz pronunciado quando o espectrômetro de massas sequencial foi empregado.

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Figura 56: Curvas analíticas preparadas em solvente e na matriz pelo método QuEChERS.A: catequina, B: ácido cafeico, C: ácido p-cumárico, D: ácido protocatecóico, E: ácido clorogênico, F: rutina, G: ácido sinápico, H: epicatequina, I: ácido ferúlico, J: ácido vanílico e K: miricetina.

Os analitos que apresentaram maiores efeito matriz foram a miricetina e o ácido cafeico, sendo que para a miricetina, a curva preparada em solvente mostrou sensibilidade bem maior em relação à curva preparada na matriz, enquanto que para o ácido cafeico a curva preparada em solvente mostrou sensibilidade bem menor em relação à curva preparada na matriz. Os compostos fenólicos que apresentaram um médio efeito matriz foram o ácido p-cumárico e a catequina. O composto fenólico que praticamente não apresentou efeito matriz foi o ácido protocatecóico, pois as curvas analíticas tiveram comportamentos semelhantes.

Outros analitos que apresentaram grande influência do efeito matriz foram os ácidos sinápico, ferúlico, vanílico e epicatequina. A epicatequina e o ácido ferúlico apresentaram respostas cromatográficas (área dos picos) maiores quando estes se encontravam na presença da matriz do que em solvente. Os ácidos sinápico e vanílico apresentaram respostas cromatográficas (área dos picos) menores quando estes se encontravam na presença da matriz do que em solvente (supressão iônica). Já os compostos ácido clorogênico e rutina apresentaram um leve efeito matriz.

O efeito matriz também foi avaliado neste método. Os valores do efeito matriz (%) para cada composto fenólico estão mostrados na Figura 57.

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Figura 57: Percentual do efeito matriz (%) empregando QuEChERS acetato para extração dos compostos fenólicos em cevada usando UHPLC-MS/MS. (1) catequina; (2) epicatequina; (3) ácido clorogênico; (4) ácido vanílico; (5) ácido cafeico; (6) ácido p-cumárico; (7) ácido ferúlico; (8) ácido sinápico; (9) rutina; (10) ácido protocatecóico; (11) miricetina.

Pode-se observar que alguns compostos como miricetina, ácido p- cumárico, ácido sinápico e ácido vanílico apresentaram respostas cromatográficas (área dos picos) menores quando estes se encontravam na presença da matriz do que em solvente (supressão do sinal).

Concluiu-se que o efeito matriz é significativo para grande parte dos compostos fenólicos estudados, sendo necessário o emprego na presença da matriz para a quantificação dos compostos fenólicos, a fim de corrigir os efeitos da matriz provocados por interferentes coextraídos.

Osresíduos da regressão linear obtida para os analitos correspondentes à curva analítica construída na matriz podem ser vistos na Figura 58.

Os resíduos das curvas analíticas preparadas na matriz mostram a situação ideal, em que o modelo está bem ajustado: os resíduos estão distribuídos aleatoriamente, e não há nada que indique que sua variância não é constante.

Não houve nenhum analito no qual os resíduos cresceram com o aumento do valor da concentração. Para o ácido p-cumárico, há maior evidência do terceiro caso, com o aparecimento de uma estrutura não aleatória, de aspecto curvilíneo. Os resíduos são menores nas extremidades da faixa de calibração e maiores na região intermediária.

131 Ácido p-cumárico Ácido protocatecóico Ácido clorogênico Ácido cafeico Ácido Ferúlico Miricetina

132 Rutina Ácido vanílico Catequina Sinápico Epicatequina

Figura 58: Resíduos da regressão linear obtida para os compostos fenólicos analisados por UHPLC-MS/MS para a curva analítica construída na matriz pelo método QuEChERS.

Os valores das figuras de mérito referentes à validação analítica do método QuEChERS são encontrados na Tabela 8.

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A exatidão foi avaliada experimentalmente pela recuperação através da fortificação dos extratos em 3, 6 e 30 µg g-1 _{e em cinco replicatas cada uma,}

resultando num total de 15 determinações. Esse parâmetro foi obtido pelas injeções de cinco amostras, em três níveis de fortificação.

Todos os compostos fenólicos estudados apresentaram valores de recuperação satisfatórios, pois se encontram dentro do intervalo aceito da ANVISA, uma vez que foram obtidas recuperações entre 71 e 120% para os três níveis de concentrações avaliados.

A precisão foi avaliada em termos de repetitividade e precisão intermediária, obtida pela média das três injeções feitas em três níveis de fortificações e realizada em quintuplicata. A precisão intermediária variou de 3,8% a 18,2% e foi avaliada realizando-se ensaios em 3 dias consecutivos.

Os parâmetros da validação estão na Tabela 10.

Tabela 10: Figuras de mérito da validação referente ao método QuEChERS. LOQm: Limite de quantificação do método. LOQi : Limite de quantificação do instrumento.

Composto Linearidade (mg L-1₎ LOQm (µg kg-1₎ LOQi (mg L-1₎ r2 _Precisão intermediária (CV, %) Recuperação (% ± CV) 3 µg g-1 _{6 µg g-}1 _{30 µg g-}1 Ácido p- cumárico 0,5-100 61,2 0,01 0,9973 8,8 119 ±12 100 ±5 107 ±2 Ácido protocatecóico 0,3-50 34,2 0,2 0,9947 16,4 119 ±1 116 ±2 119 ±1 Catequina 0,3-50 132,8 0,3 0,9912 13,6 99 ±10 110 ±15 86 ±7 Ácido clorogênico 0,3-50 21,3 0,3 0,9914 8,8 91 ±8 84 ±8 104 ±1 Ácido cafeico 0,5-100 15,8 0,3 0,9914 18,2 88 ±10 71 ± 12 90 ± 5 Ácido ferúlico 0,3-50 58,4 0,3 0,9938 11,3 96 ±7 89 ±8 106 ±1 Miricetina 0,5-100 30,2 0,25 0,9840 5,4 120 ±18 92 ±8 102 ± 2 Epicatequina 0,3-50 136,5 0,3 0,9836 5,2 73 ±15 87 ±5 91 ±3 Rutina 0,5-50 3,5 0,1 0,9945 12,1 119 ±19 88 ±1 82 ±17 Ácido vanílico 0,5-100 25,3 0,3 0,9911 3,8 96 ±5 93 ±6 101 ±1 Ácido sinápico 0,5-100 18,7 0,25 0,9924 4,7 106 ±2 97 ±3 100 ±1 * n= 5 replicatas

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4.5.2. Quantificação dos compostos fenólicos pelo método