CAROLINA CARNEIRO SOARES MACEDO
SIGNIFICADO CLÍNICO-PATOLÓGICO DAS
PROTEÍNAS PGK1, NDRG1, LTA4H E CSTB NO FRONTE
INVASIVO DO CARCINOMA ESPINOCELULAR ORAL
Piracicaba 2018
SIGNIFICADO CLÍNICO-PATOLÓGICO DAS
PROTEÍNAS PGK1, NDRG1, LTA4H E CSTB NO FRONTE
INVASIVO DO CARCINOMA ESPINOCELULAR ORAL
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Estomatopatologia, na Área de Patologia.
Orientador: Adriana Franco Paes Leme
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA CAROLINA CARNEIRO SOARES MACEDO E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ADRIANA FRANCO PAES LEME.
Piracicaba 2018
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Heloisa Maria Ceccotti - CRB 8/6403
Macedo, Carolina Carneiro Soares,
M151s MacSignificado clínico-patológico das proteínas PGK1, NDRG1, LTA4H e CSTB no fronte invasivo do carcinoma espinocelular oral / Carolina Carneiro Soares Macedo. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2018.
MacOrientador: Adriana Franco Paes Leme.
MacTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Mac1. Câncer. 2. Carcinoma de células escamosas. 3. Imuno-histoquímica. 4. Proteômica. 5. Biomarcadores tumorais. I. Leme, Adriana Franco Paes. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Clinical-pathological significance of PGK1, NDRG1, LTA4H e CSTB proteins in the invasive front of oral squamous cell carcinoma
Palavras-chave em inglês: Cancer
Carcinoma, squamous cell Immunohistochemistry Proteomics
Biomarkers, tumor
Área de concentração: Patologia
Titulação: Doutora em Estomatopatologia Banca examinadora:
Ricardo Della Coletta
Sabrina Daniela da Silva Wurzba Nilva de Karla Cervigne Furlan Ricardo Santiado Gomez Edgard Graner
Data de defesa: 20-03-2018
Programa de Pós-Graduação: Estomatopatologia
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de Doutorado, em sessão pública realizada em 20 de Março de 2018, considerou a candidata CAROLINA CARNEIRO SOARES MACEDO aprovada.
PROF. DR. RICARDO DELLA COLETTA
PROFª. DRª. SABRINA DANIELA DA SILVA WURZBA
PROFª. DRª. NILVA DE KARLA CERVIGNE FURLAN
PROF. DR. RICARDO SANTIAGO GOMEZ
PROF. DR. EDGARD GRANER
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
A Deus e a quem Ele confiou a minha vida, Rosane Carneiro Soares Macedo e Ricardo Carlyle de Aguiar Macedo (in memoriam).
“Tudo tem seu tempo determinado e há tempo para todo o propósito debaixo do céu”. (Eclesiastes 3)
“Mas os que esperam no Senhor renovarão as forças, subirão com asas como águias; correrão, e não se cansarão; caminharão, e não se fadigarão”. (Isaías 40:31)
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba FOP/UNICAMP, na pessoa do seu diretor Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques.
À Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora do Progama de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia da FOP/UNICAMP, na pessoa do seu coordenador Prof. Dr. Márcio Ajudarte Lopes.
Ao CNPq pela concessão de bolsa durante o doutorado.
À Profa. Dra. Adriana Franco Paes Leme pela orientação no mestrado e doutorado, pelos ensinamentos compartilhados e pela parceria. Agradeço por dividir os seus conhecimentos com os seus alunos e buscar sempre desenvolver uma pesquisa de alta qualidade. Foi muito gratificante aprender com você o universo da proteômica e poder aplicar uma parte disso na minha formação e no desenvolvimento de uma boa ciência.
Ao Prof. Dr. Ricardo Della Coletta pelo suporte científico, convivência, competência, amizade e ensinamentos. Muito obrigada por me guiar no caminho da pesquisa, por contribuir tanto na minha formação, por confiar no meu trabalho e por me proporcionar tantas oportunidades de crescimento e aprendizagem. O sr. é o exemplo de pesquisador que pauta a minha carreira profissional. Muito obrigada, foi um privilégio ter esses ensinamentos!
À Profa. Dra. Sabrina Daniela da Silva Wurzba pela orientação durante o meu estágio na McGill University e no Jewish General Hospital. Muito obrigada por todos os conhecimentos divididos, pela amizade, pelo carinho, por me receber na sua família e pelo esforço em me ver crescer na vida pessoal e profissinal. Todos os agradecimentos aqui seriam insuficientes para corresponder todo o amor que você trouxe para a minha vida. O meu mais sincero obrigada!
Ao Prof. Dr. Moulay Alaoui-Jamali pela gentileza em me receber no seu laboratório no Jewish General Hospital, McGill University. Muito obrigada por me
presentear com conhecimentos sólidos na pesquisa em câncer, da maneira mais cortez e atenciosa.
À Profa. Dra. Tuula Salo pelos conhecimentos concedidos ao nosso programa de pós-graduação e pelas oportunidades de parceria em trabalhos científicos. Muito obrigada por sua abordagem de trabalho tão aberta e pelos momentos nos quais eu tive o provilégio de aprender com você.
À Profa. Dra. Nilva Cervigne muito obrigada pelos ensinamementos em microdissecção a laser que pautaram o desenvolvimento do meu mestrado e do meu dourado. Agradeço por dividir comigo os seus conhecimentos, por sua amizade e carinho. À Profa. Dra. Iris Sawazaki Calone e à Profa. Dra Priscila Campinoni Rodrigues pela parceria primordial no desenvolvimento desta tese de doutorado. Muito obrigada!
Ao Prof. Dr. Alan Roger dos Santos Silva pela honra de aprimorar os meus conhecimentos em diagnóstico oral e por contribuir na minha formação em Estomatopatologia. Muito obrigada por me receber no Orocentro, por todos os casos clínicos, por todos os ensinamentos, pela amizade e pelo o apoio.
Ao Prof. Dr. Felipe Paiva Fonseca pelo exemplo de excelência e pela amizade. Muito obrigada por acompanhar de perto a minha formação, pela cooperação em trabalhos científicos e pela parceria além da vida acadêmica.
Ao Prof. Dr. Wilfredo González Arriagada pela amizade e colaborações em pesquisa. Muito obrigada pelo apoio durante a minha pós-graduação e pelas oportunidades de aprender com você.
Ao Prof. Dr. Marcondes Sena Filho por ter sido um amigo fiel durante a minha caminhada na pós-graduação. Muito obrigada por todas as conversas, conselhos, por sua amizade e carinho. Com certeza o meu trajeto profissional foi mais feliz por ter o seu apoio.
À Profa. Dra. Ana Camila Messetti pela amizade incondicional desde o meu mestrado. Muito obrigada por fazer do laboratório de Biologia Molecular um ambiente de trabalho mais feliz. Muito obrigada pelo companheirismo, compreensão e parceria. Muito obrigada por ser a minha família no estado de São Paulo e por me presentear com
uma das maiores alegrias durante o doutorado: a Valentina! Estendo os meus agradecimentos ao Marcelo e à unidade da sua família que são presença de Deus na minha vida.
Ao Prof. Dr. Maurício da Rocha Dourado por me acompanhar na vida, desde a graduação em Odontologia. Muito obrigada por sua amizade e carinho, por me apoiar durante o doutorado, pelas discussões científcas e parceria que vai além das portas do laboratório. Muito obrigada por trazer para Piracicaba o amparo de Minas Gerais.
À Profa. Dra. Elisabete Bagordakis muito obrigada por ser uma amiga tão maravilhosa e estar do meu lado sempre. Pelas conversas, pelo amparo e por se fazer presente em cada momento decisivo.
Aos meus amigos de pós-graduação que me acompanharam neste caminho de desenvolvimento profissional e crescimento pessoal. A Débora Lima pelo amor, pela escuta, pelo cuidado e por acreditar tanto em mim! A Mariana Paglioni por ser luz nos meus dias, pela amizade e por me receber na família Paglioni. A Natália Palmier pelo carinho fiel, por todo amor e companheirismo. Ao melhor vizinho de todos os tempos, Bruno Mariz, muito obrigada por ser meu amigo e meu irmão durante a pós-graduação. Ao meu admirado amigo Wagner, muito obrigada por ser tão próximo como um irmão, você foi um dos melhores companheiros nesta caminhada. À Marisol Miranda pelas parcerias científicas e por ser uma amizade radiante nos meus dias, focando sempre no lado bom. Ao meu amigo Ciro por todas as conversas e por toda parceria neste caminho. Ao meu amigo Pedro, por me ensinar que as maiores dores da vida podem ser a força propulsiva para acreditar e ser melhor. À minha turma de doutorado Renata, Isabel e Juliana muito obrigada por me acompanharem, pelos exemplos de garra e sucesso e pela ternura da nossa amizade. Aos queridos Rodrigo, Diego, Léo, Luan, Patrícia, Rachel, João e Raisa que fazem a sala da semiologia o lugar mais agradável e divertido da FOP. Aos meus amigos Vinícius, Celeste, Gleyson, Felipe e Jamile que estiveram sempre presentes, com tanto afeto pelos corredores da FOP. Aos meus companheiros de laboratório Iara, Florence, Renato e Débora. Muito obrigada por dividirem comigo a vida, por me ensinarem tanto e por transformarem Piracicaba no nosso lar, da maneira mais aconchegante.
Adriano, pelo convívio, ensinamentos e amizade.
Ao Orocentro por fazer as minhas terças-feiras mais felizes. Muito obrigada a todos os pacientes e aos queridos Prof. Dr. Alan, Dr. Rogério, Dona Cida, Daniele Morelli, Dra. Elisabete, Dra. Karina Morais, Renata, Mariana, Vinícius, Rodrigo e Natália.
Aos pacientes desta pesquisa que tanto me ensinaram. Muito obrigada por permitirem a realização deste estudo. O meu motivo principal de seguir a carreira científica é proporcionar o melhor cuidado à saúde para os pacientes com câncer oral.
Ao Serviço de Assistência Psicológica e Psiquiátrica ao Aluno (SAPPE), principalmente à Nara. Muito obrigada pelo espaço de pensamento e reflexão nos dias mais difíceis da pós-graduação.
Ao Laboratório Nacional de Biociências – LNBio, na pessoa do seu diretor Dr. Kleber Gomes Franchini.
Aos meus queridos amigos do Laboratório de Espectrometria de Massas no LNBio, Sami, Daniela, Bianca, Romênia, Tatiane, César, Flávia, Carol, Rute e Ariane. Especialmente a Carolina Carnielli por dividr comigo este grande trabalho, pelos ensinamentos em proteômica e bioinformática e pela amizade. À Tatiane De Rossi e Daniela Granato por todo cuidado e parceria essencial com as amotras de saliva e análises de SRM. Ao meu querido César Rivera pela amizade, apoio, conversas, discussões e colaborações científicas. E à minha grande amiga de todos esses anos Flávia Zandonadi, muito obrigada por sua amizade emponderadora, por todo apoio e por ser exemplo de força, garra e competência em tudo o que você faz. Foi muito gratificante conviver e aprender com vocês!
À McGill University e ao Jewish General Hospital em Montreal no Canadá por me permitirem expandir conhecimentos na pesquisa em câncer e pela contribuição na minha carreria profissional. Aos queridos Fernando, Jasper, Henry, Su, Krikor e Amine por me receberem com tando carinho nos laboratórios do Lady-Davis Cancer Center.
Ao Instituto do Câncer de São Paulo (ICESP), Octavio Frias de Oliveira, ICESP pela cooperação em diversas pesquisas científicas com o nosso programa de
pós-graduação e à Profa. Dra. Ana Carolina Prado pela parceria e solicitude.
Aos meus queridos amigos Luiz Arthur, Thalita, Leórick, Jefferson, Amanda, Hugo, Profa. Dra. Andréia do Carmo, Profa. Dra. Bárbara Monteiro, Profa. Dra. Ana Luiza, Profa. Dra. Márcia Miguel, muito obrigada por dividirem comigo o amor pela Patologia Oral, pelas colaborações e pela amizade estabelecida.
À Universidade Estadual de Montes Claros UNIMONTES, na pessoa do seu reitor Dr. João dos Reis Canela, pela minha formação como cirurgiã-dentista.
À minha querida e eterna orientadora Profa. Dra. Desirée S’Antana Haikal, responsável por me apresentar a pesquisa e incentivar a minha carreira acadêmica desde a graduação. Muito obrigada pela amizade e inúmeras conversas, você é parte de mais esta etapa na minha vida. Extendo os meus agradecimentos ao Prof. Dr. Alfredo Maurício Batista de Paula, responsável por me apresentar a Patologia, me mostrando que é na conclusão da graduação que tudo começa. Muito obrigada por apoiarem a minha escolha pela pós-graduação e por serem parte das minhas conquistas.
Ao Prof. Dr. André Luiz Sena Guimarães por me apresentar à Patologia Especial na UNIMONTES, contribuindo de maneira decisiva para a minha escolha de seguir carreira acadêmica. Muito obrigada pelo seu exemplo como professor e pesquisador. Agradeço a amizade e a parceria.
À Profa. Dra. Lívia Máris Ribeiro Paranaíba pela amizade, suporte e principalmente por ter acreditado em mim antes mesmo que eu acreditasse e por me encorajar a fazer pós-graduação em Estomatopatologia na FOP/UNICAMP.
Ao Prof. Dr. Hercílio Martelli Júnior, pelo exemplo, amizade e apoio e por também contribuir para a minha decisão de fazer mestrado e doutorado na FOP/UNICAMP.
Ao querido Prof. Dr. Paulo Rogério Ferreti Bonan pelo grande exemplo docente na minha formação na UNIMONTES e ainda mais, pela parceria de momentos felizes e de aprendizagem durante o meu estágio na McGill Univerty no Canadá.
Aos meus queridos professores Dra. Andrea Maria Eleutério de Barros Lima Martins, Dr. Luis Nogueira, Dr. Mário Melo, Dra. Sabina Pêgo, Dr. André Luís Faria e
Silva, Dr. Robertson Carvalho Batista e Dr. Manoel Brito Júnior, por serem meus exemplos de mestres e pelos ensinamentos em Odontologia na UNIMONTES.
Aos meus grandes amigos da graduação em Odontologia, que continuaram presentes apoiando a minha carreira profissional, Amanda Alves, Flávia Barros, Priscila Almeida, Pedro Emílio, Hiram Silveira, Patrícia Souza, Priscila Leocádio, Guilherme Passos, Maílson Eleutério, Cláudia Rabelo.
Ao Colégio Berlaar Imaculada Conceição, na pessoa de sua diretora Irmã Leda, pela minha formação escolar básica e por minha formação espiritual.
Aos meus amigos da vida inteira Priscilla Lessa, Débora Freitas, Emuriela Dourado, Ana Carolina Ferreira, Gil Tolentino, Tiago Dias, Flávia Barros, Felipe Mendes, Jaísa Arruda, Carlos Viriato, André Leopoldo, André Miguel, Bruna Maia, Rafaela. Muito obrigada por se fazerem presentes mesmo na distância. Aos meus amigos da 4a série e à eterna 8aD, por me acompanharem e por representarem as minhas mémorias mais felizes no colégio. E a João Henrigue, nosso eterno anjo.
Aos amigos e pacientes das cidades Capitão Enéas, Patis, Santa Fé de Minas, MG. Muito obrigada por dividirem comigo as alegrias e dificuldades do ínicio da minha vida profissional.
À família Carneiro Soares pela alegria, pela força e pelas orações.
À minha família, base da minha vida, força e esteio. Obrigada à minha mãe Rosane por ser a melhor pessoa que eu conheço e permitir que eu seguisse os meus sonhos. Às minhas irmãs Camila e Carla, pelo amor e amizade. Ao meu pai Ricardo, por ser a maior força da minha busca por uma vida melhor. Muito obrigada pelo amor incondicional e por acreditarem nos meus sonhos. Amo vocês!
À Piracicaba por me proporcionar uma nova vida e às pessoas especiais que conheci aqui, especialmente Dona Leni, Dona Ana, Sr. Samuel e Luana.
Ao São Dimas por ser o bairro mais charmoso desta cidade.
À família Uhlik-Ockermüller por me receber na Áustria de braços abertos e com tanto amor. Muito obrigada Erni, Eric, Max, Poldi e Monika.
À Sieghartskirchen por ser o meu lugar feliz no mundo e onde eu consegui escrever a maior parte dessa tese.
À luz do sol da minha vida, Jakob. Muito obrigada por ser amor e por construir comigo uma história que mais parece um conto de fadas. Agradeço imensamente o seu apoio, o seu carinho, a sua força e a sua compreensão durante o meu doutorado. Obrigada por aceitar a distância e fazer dos meses longe a nossa maior força para não parar nunca de acreditar no nosso amor. Ich habe dich lieb!
RESUMO
O carcinoma espinocelular (CEC) oral é a neoplasia maligna mais comum em cabeça e pescoço, com o potencial de promover metástase linfática e à distância. Histologicamente, as células neoplásicas no fronte invasivo e no interior do tumor mostram características morfológicas e moleculares distintas, resultando em comportamentos clínicos específicos. Em estudo recente, nosso grupo demonstrou que proteínas diferencialmente expressas encontradas nas ilhas neoplásicas do fronte invasivo tumoral estavam correlacionadas com o prognóstico desses pacientes, evidenciando o fronte invasivo como área de interesse para avaliação de marcadores de prognóstico. Assim, o objetivo desta pesquisa foi avaliar as proteínas PGK1, NDRG1, LTA4H e CSTB e verificar o seu significado clínico-patológico no fronte invasivo do CEC oral. Para isso, foram utilizadas duas abordagens i) a reação de imuno-histoquímica em amostras clínicas de tecido e ii) a proteômica baseada em alvos na saliva, como uma ferramenta duplamente sensível para monitorar pacientes com CEC oral. Peças cirúrgicas (125 amostras) de CEC oral fixadas em parafina foram submetidas à reação de imuno-histoquímica do painel de proteínas avaliando a sua imunomarcação no fronte invasivo em comparação com o interior do tumor. Um sistema de seis escores (A a F) foi desenvolvido para avaliar a expressão protéica, levando em consideração a intensidade e a porcentagem de células neoplásicas marcadas, bem como a combinação desses dois parâmetros. Os dados clínico-patológicos dos pacientes foram correlacionados com a imunomarcação das proteínas através de tabulação cruzada e teste qui-quadrado. Para as análises de sobrevida univariada e multivariada, foram utilizados o método Kaplan-Meier em comparação com o teste de log-rank e o modelo de riscos proporcionais de Cox (p ≤ 0,05). Para o monitoramento das proteínas selecionadas na saliva, foram utilizadas 33 amostras de pacientes com CEC oral, divididos em dois grupos: 10 amostras de salivas de pacientes sem metástase linfonodal (N0) e 23 amostras de salivas de pacientes com metástase linfonodal (N+). A proteômica baseada em alvos foi utilizada por meio do método de monitoramento seletivo de reações (SRM), supervisionando de 2-3 peptídeos em cada proteína e a diferença entre os grupos foi analisada pelo teste t de Student (p ≤ 0,05). Os resultados da associação dos dados clínico-patológicos com a marcação imuno-histoquímica revelaram associações significativas em todos os scores e em cada uma das proteínas investigadas. A análise multivariada de Cox revelou CSTB como marcador independente para recorrência local (no score E) e PGK1 como marcador independente de situação (no score D). As proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1 e PGK1 apresentatam menor abundância na presença de metástase linfonodal. Assim, essa abordagem contribui para a compreender melhor as características do fronte invasivo no CEC oral, identificando o seu significado clínico. Os nossos resultados sugerem o painel de proteínas aqui investigadas como uma assinatura prognóstica em potencial para auxiliar no processo de tomada de decisões clínicas, no que se refere à recorrência do tumor, à metástase dos linfonodos ou ao risco de morte do paciente.
Palavras-chave: Câncer. Carcinoma de Células Escamosas Oral. Imuno-histoquímica.
ABSTRACT
Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common malignant neoplasm in the head and neck, with the potential to promote lymphatic and distant metastasis. Histologically, neoplastic cells on the invasive front and inner tumor show distinct morphological and molecular characteristics, resulting in specific clinical behaviors. In a recent study, our group demonstrated that differentially expressed proteins found in the neoplastic islands of the invasive umor front were correlated with the prognosis of these patients, evidencing the invasive front as an area of interest for the evaluation of prognostic markers. Thus, the objective of this research was to evaluate the clinical and pathological significance of the presence of PGK1, NDRG1, LTA4H and CSTB proteins in the invasive tumor front of OSCC, as well as to validate the presence of these proteins in the saliva of patients with this neoplasia. Based on knowledge of histopathology and tumor regions, the immunohistochemical reaction was used in clinical tissue samples and target-based proteomics in saliva as a doubly sensitive tool to monitor patients with OSCC. Surgical paraffin embedded OSCC specimens (125 samples) were submitted to the immunohistochemical reaction of the protein panel evaluating their immunostaining on the invasive front compared to the inner tumor. A six-score system (A to F) was developed to evaluate protein expression, taking into account the intensity and percentage of labeled neoplastic cells, as well as the combination of these two parameters. The clinical-pathological data of the patients were correlated with the immunostaining of the proteins through cross-tabulation and chi-square test. For the univariate and multivariate survival analyzes, there were used the Kaplan-Meier method in comparison with the log-rank test and the Cox proportional hazards model. The significance level considered was 5% (p ≤ 0.05). For the monitoring of target proteins in saliva, 33 samples of patients with OSCC were divided into two groups: saliva from 10 patients without lymph node metastasis (N0) and saliva from 23 patients with lymph node (N +) metastasis. Target-based proteomics was used through the Selective Reaction Monitoring (SRM) method, supervising 2-3 peptides in each protein and the Student t-test was performed to verify the difference between the groups. The correlation of clinical-pathological data with immunohistochemical staining revealed significant associations in all scores and in each of the proteins investigated. Cox multivariate analysis revealed CSTB as an independent marker for local recurrence (on E score) and PGK1 as an independent score marker (on D score). CSTB, LTA4H, NDRG1 and PGK1 proteins show lower abundance in the presence of lymph node metastasis. Thus, this approach contributes to a better understanding of the characteristics of the invasive front in OSCC, identifying its clinical significance. Our results suggest the panel of proteins investigated here as a potential prognostic signature to improve the clinical decision-making process, regarding tumor recurrence, lymph node metastasis or patient risk of death.
Keywords: Cancer. Oral Squamous Cell Carcinoma. Immunohistochemistry. Proteomics. Tumor Biomarkers.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Desenho de estudo adotado para a presente pesquisa. ... 44 Figura 2 – Coloração por imuno-histoquímica das proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1 e
PGK1 no CEC oral. ... 58
Figura 3 – Fotomicrografias mostrando detalhe da coloração por imuno-histoquímica
das proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1 e PGK1 no CEC oral (imagens histológicas obtidas utilizando uma magnificância de 400x). ... 59
Figura 4 – Curvas de sobrevida da análise de Kaplan-Meier referente ao Score F... 84 Figura 5 – Quantificação do número de resultados significantes e significantes com
coerência das análises de sobrevida... 86
Figura 6 – Proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1 e PGK1 indentificadas na saliva de
pacientes com CEC oral por proteômica baseada em alvos evidenciando diferença de expressão entre os grupos N0 e N+. ... 90
Figura 7 – Curvas de ROC do valor prognóstico da proteína LTA4H para predizer
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Método de pontuação geral considerado na avaliação imuno-histoquímica da
expressão de CSTB, LTA4H, NDRG1 e PGK1 no fronte invasivo e no interior do CEC oral. ... 49
Tabela 2 – Seis diferentes métodos de divisão/pontuação considerados para avaliar a
expressão de CSTB, LTA4H, NDRG1 e PGK1 no fronte invasivo e no interior do CEC oral. ... 49
Tabela 3 – Dados clínico-patológicos das amostras teciduais de pacientes com CEC
oral. ... 55
Tabela 4 – Associação dos parâmetros clinico-patológicos e demográficos com a
expressão das proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1, PGK1 no fronte invasivo
tumoral de acordo com o Score A. ... 62
Tabela 5 – Associação dos parâmetros clínicos e demográficos com a expressão das
proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1, PGK1 no interior tumoral de acordo com o
Score A. ... 64
Tabela 6 – Associação dos parâmetros clínicos e demográficos com a expressão das
proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1, PGK1 no fronte invasivo tumoral de acordo com o Score B. ... 66
Tabela 7 – Associação dos parâmetros clínicos e demográficos com a expressão das
proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1, PGK1 no interior tumoral de acordo com o
Score B. ... 68
Tabela 8 – Associação dos parâmetros clínicos e demográficos com a expressão das
proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1, PGK1 no fronte invasivo tumoral de acordo com o Score C. ... 70
Tabela 9 – Associação dos parâmetros clínicos e demográficos com a expressão das
proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1, PGK1 no interior tumoral de acordo com o
Score C. ... 72
Tabela 10 – Associação dos parâmetros clínicos e demográficos com a expressão das
proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1, PGK1 entre o fronte invasivo e o interior tumoral de acordo com o Score D. ... 74
Tabela 11 – Associação dos parâmetros clínicos e demográficos com a expressão das
proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1, PGK1 entre o fronte invasivo e o interior tumoral de acordo com o Score E. ... 76
Tabela 12 – Associação dos parâmetros clínicos e demográficos com a expressão das
proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1, PGK1 entre o fronte invasivo e o interior tumoral de acordo com o Score F. ... 78
Tabela 13 – Análise univariada de sobrevida (Kaplan-Meier) de acordo com a
expressão das proteínas em cada score nos casos de CEC oral deste estudo. ... 82
Tabela 14 – Análise multivariada de sobrevida (Regressão de Cox) para recorrência
local (CSTB) e situação (PGK1) nos casos de CEC oral deste estudo... 85
Tabela 15 – Dados clínico-patológicos das amostras de pacientes com CEC oral usadas
na análise proteômica baseada em alvos. ... 88
Tabela 16 – Associação dos parâmetros clínicos e demográficos com as proteínas
LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AUC – Área sob a curva do inglês, Area Under the Curve CEC – Carcinoma de Espinocelular
CSTB – Cistatina B
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
DTT – Ditiotreitol
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-acético; do inglês, Ethylenediamine
tetraacetic acid
EGFR do inglês, Epidermal Growth Factor Receptor EMT – do inglês, Epithelial mesenchymal transition
FAPESP Fundação de Aparo à Pesquisa do Estado de São Paulo HPV – Papilomavírus Humano (do inglês Human Papillomavirus) HR – do inglês, Hazard Ratio
IC – Intervalo de Confiança
INCA – Instituto Nacional do Câncer
iRT – índice para predição do Tempo de Retenção, do inglês Retention
Time Prediction
LC-MS/MS – Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem
LTA4H – Leucotrieno A4 Hidrolase
M – Metástase à distância
ML – Microdissecção a Laser
MS – Espectrometria de Massas
mRNA – RNA mensageiro
miRNA – micro RNA
MYC do inglês, MYC Proto-Oncogene
N – Metástase linfonodal
N0 – Grupo de pacientes sem metástase linfonodal N+ – Grupo de pacientes com metástase linfonodal
NDRG1 – proteína NDRG1 (do inglês, N-myc downstream regulated 1)
PBS – Tampão Fosfato Salino
PGK1 – Fosfoglicerato Quinase 1
PI – Padrão de Invasão
PIK3CA do inglês, Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha
PMSF – Fluoreto de Fenilmetilsulfonil, do inglês Phenylmethane Sulfonyl
Fluoride
PTEN do inglês, Phosphatase And Tensin Homolog
QRT – Quimioradioterapia
QT – Quimioterapia
RL – Resposta linfocitária
RT – Radioterapia
SE – Sobrevida Específica
SIL – Peptídeos marcados com isótopos estáveis, do inglês Stable
Isotope-labeled peptides
SLD – Sobrevida Livre de Doença
SRM – Monitoramento Seletivo de Reações, do inglês Selective Reaction
Monitoring
T – Tamanho do tumor
TEM – Transição Epitélio-Mesenquimal
TGF-β Fator de crescimento de transformação β
TP53 do inglês, Tumor protein p53
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 22
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 25
2.1 Carcinoma espinocelular oral (CEC oral) ... 25
2.2 Sistemas de classificação histopatológica do CEC oral ... 31
2.3 A região de fronte invasivo tumoral ... 33
2.4 Espectrometria de massas baseada em proteômica... 34
2.5 Marcadores prognósticos em câncer oral ... 36
2.6 A busca por marcadores prognósticos no fronte invasivo do CEC oral ... 37
2.7 O uso da saliva no estudo do CEC oral ... 39
2.8 Métodos para validação de marcadores prognósticos ... 40
3 OBJETIVO ... 43
3.1 Objetivo Geral: ... 43
3.2 Objetivos específicos: ... 43
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 44
4.1 Aprovação Comitê de Ética em Pesquisa ... 44
4.2 Amostras teciduais de CEC oral ... 45
4.3 Imuno-histoquímica ... 46
4.3.1 Análise da marcação por imuno-histoquímica ... 46
4.4 Proteômica baseada em alvos ... 50
4.4.1 Coleta das amostras de saliva ... 50
4.4.2 Peptídeos proteotípicos e seleção de transição ... 50
4.4.3 Preparação das amostras de saliva para proteômica baseada em alvos . 51 4.4.4 Espectrometria de massas baseada em alvos utilizando o método de monitoramento seletivo de reações (SRM) ... 52
4.4.5 Análise quantitativa do SRM e estatística ... 52
4.4.6 Análise do valor prognóstico das proteínas alvo na saliva de pacientes com CEC oral ... 53
4. RESULTADOS ... 54 5. DISCUSSÃO ... 94 6. CONCLUSÃO ... 100 REFERÊNCIAS ... 101 ANEXOS ... 110 Anexo 1 ... 110
1 INTRODUÇÃO
O carcinoma de células escamosas (CEC) oral é o tipo mais comum de tumor maligno de cabeça e pescoço, representando o oitavo câncer mais encontrado em todo o mundo. O CEC oral exibe alta prevalência e morbidade, onde são estimados 300 mil novos casos e 145 mil mortes por ano (Ferlay et al., 2015). A abordagem terapêutica para o CEC oral é baseada em um sistema de classificação clínica designado como TNM, que leva em consideração o tamanho do tumor (T), a presença de metástase linfonodal (N) e a presença de metástase à distância (M) (Edge & Compton, 2010). Esta classificação clínica também tem se mostrado primordial para definir o prognóstico desses pacientes (Scully & Bagan, 2009). No entanto, este sistema não oferece uma avaliação precisa do desfecho clínico do paciente e os tumores podem apresentar comportamentos diferentes, mesmo em estágio de desenvolvimento semelhante (da Silva et al., 2012; Almangush et al., 2015). De fato, apesar dos esforços para melhorar as modalidades terapêuticas, o prognóstico do CEC oral, incluindo as taxas de sobrevivência, permanece pobre e com possibilidade de ampla variação mesmo nos estágios iniciais da doença, onde podem existir de 20% a 40% de metástases ocultas já na primeira apresentação da doença (da Silva et al., 2012; Ganly et al., 2012; van der Waal et al., 2013). Além disso, as taxas de recorrência do CEC oral oscilam de 18% a 76% em pacientes submetidos a tratamento padrão e a recidiva local representa um desafio clínico para o manejo terapêutico (da Silva et al., 2012). Assim, a identificação de marcadores biológicos complementares que auxiliem na determinação do prognóstico de pacientes com CEC oral é essencial para decisões clínicas.
Os parâmetros histopatológicos foram utilizados em vários estudos que visam melhorar o prognóstico do CEC oral e complementar as deficiências do sistema de estadiamento TNM (Brandwein-Gensler et al., 2005, 2010; Almangush et al., 2015; Sawazaki-Calone et al., 2015). Os modelos baseados em histopatologia podem ser usados para estratificar os pacientes em grupos de baixo e alto risco (Brandwein-Gensler et al., 2010), contribuindo para a compreensão da progressão desta doença e possibilitando um tratamento mais direcionado. Além disso, as classificações histopatológicas podem contribuir para a caracterização molecular de regiões tumorais, como o fronte invasivo tumoral e o interior do tumor, revelando diferentes características morfológicas e moleculares (Costa et al., 2015; Bagordakis et al., 2016). Por exemplo, verifica-se que no fenótipo de transição epitélio-mesenquimal (TEM), as células com menor grau de
diferenciação e maior dissociação celular são mais frequentemente observadas no fronte de invasão do que em outras áreas tumorais (Sharma et al., 2013; Costa et al., 2015).
Desta forma, os sistemas de classificação histopatológica demonstraram seu valor preditivo para o prognóstico do CEC oral, destacando a importância do padrão de invasão tumoral, além outros parâmetros como a profundidade de invasão, invasão perineural e a presença de infiltrado inflamatório crônico (Bryne et al., 1989; Almangush et al., 2015). No que se refere ao fronte de invasão, este padrão pode ocorrer de forma dispersa com ilhas neoplásicas ou com células únicas, caracterizando tumores mais agressivos em comparação com aqueles com padrões de crescimento uniformes (Bryne et al., 1989; Bryne et al., 1992; Brandwein-Gensler et al., 2005). Além disso, há evidências de que os componentes do estroma tumoral podem influenciar de forma crítica a carcinogênese e o fenótipo maligno em estádios múltiplos de desenvolvimento e progressão da neoplasia (Curry et al., 2014; Bagordakis et al., 2016). As interações complexas entre as células tumorais e os vários tipos de células e componentes da matriz dentro do microambiente desempenham papéis importantes na iniciação, progressão, invasão e metástase do câncer (Turley, Cremasco & Astarita, 2015).
Outro aspecto que requer atenção é a necessidade de um monitoramento pós-operatório preciso de pacientes com CEC oral para detecção precoce de recidivas ou toxicidades relacionadas a quimioterapia e radioterapia (Cohen et al., 2016). Neste contexto, associar classificações histopatológicas com a expressão de marcadores em diferentes regiões tumorais pode contribuir no gerenciamento do desfecho clínico para pacientes com CEC oral. Isto, devido ao fato de que o fronte de invasão é uma região chave onde ocorre a dinâmica de alterações que levam a diferenciação de tumores malignos e a sua progressão (Sharma et al., 2013; Jensen et al., 2015).
Além do uso rotineiro da histopatologia tecidual, a saliva pode ser uma promissora ferramenta prognóstica não invasiva para validar biomarcadores, como proteínas, lipídios, mRNA, miARN e a composição de exossomos (Chen et al., 2015; Wang et al., 2015; Winck et al., 2015; Kawahara et al., 2016). Alterações moleculares, como proteínas prognósticas, podem ser detectadas na saliva de pacientes com câncer, permitindo a sua estratificação em classes de baixo e alto risco (Chen et al., 2015). Assim, partindo do conhecimento de histopatologia e das regiões tumorais, utilizar amostras clínicas de tecido e saliva parece ser uma ferramenta duplamente sensível para monitorar pacientes com CEC oral.
Em um estudo recente do nosso grupo de pesquisa (Macedo, 2015), combinou-se a histopatologia, a microdissecção laser (ML), a espectrometria de massas (MS) baseada em proteômica e a bioinformática para a identificação de proteínas expressas em ilhas neoplásicas das regiões de fronte e interior do CEC oral. O proteomoa total do fronte invasivo tumoral foi comparado com o proteoma do interior do tumor, gerando uma lista de proteínas diferencialmente expressas que foram correlacionadas em seguida com os dados clínico-patológicos dos pacientes. A partir destes resultados surgiu a necessidade de uma maior compreensão do papel das proteínas descobertas. Desta forma, foram selecionadas quatro proteínas para um estudo mais aprofundado em um número maior de casos. Dentre estas proteínas estão: cistanina B (CSTB), leucotrieno A4 hidrolase (LTA4H), proteína NDRG1 e fosfoglicerato quinase 1 (PGK1).
A seleção de proteínas para validação neste estudo foi baseada na associação entre os biomarcadores candidatos e os parâmetros clínico-patológicos. Além disso, o papel das proteínas diferencialmente expressas entre o fronte de invasão e o interior correlacionadas com dados clínicos foi investigado na literatura e a coloração histológica foi verificada no The Human Protein Atlas (O Atlas de Proteínas Humanas:
https://www.proteinatlas.org). Assim, as proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1 e PGK1 foram priorizadas.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2. 1 Carcinoma espinocelular oral (CEC oral)
De acordo com os últimos estudos epidemiológicos, o câncer oral é a sexta neoplasia maligna mais comum em todo mundo, responsável por mais de 140 mil mortes por ano e representando 6% de todos os tumores malignos e 2% de todos os novos casos de câncer diagnosticados (Podlodowska et al, 2012; van der Waal et al., 2013; Ferlay et al., 2015). No Brasil, o câncer oral equivale a 5ª neoplasia maligna mais comum em homens e a 12ª mais comum em mulheres, com estimativa de 15.490 novos casos por ano, sendo 11.140 em homens e 4.350 mulheres. Esses valores refletem um risco estimado de 11,27 casos novos a cada 100 mil homens e 4,21 a cada 100 mil mulheres (Instituto Nacional do Câncer - INCA 2016). A ocorrência de CEC oral é variável em diferentes regiões geográficas do mundo, com peculiaridades relacionadas a cultura, hábitos, educação preventiva e expectativa de vida (Scully e Bagan, 2009). O diagnóstico tardio do câncer oral, torna esta neoplasia maligana como um crescente problema de sáude pública, com impacto negativo no prognóstco dos pacientes afetados (Ferlay et al., 2015; Scully & Bagan, 2009).
A variante histopatológica carcinoma de células escamosas (CEC) corresponde a mais de 90% do grupo de câncer oral, sendo o oitavo tipo de câncer mais frequente na população mundial (Ganly et al., 2012; Ferlay et al., 2015). O CEC oral é entendido como uma neoplasia maligna de origem epitelial, com diversos graus de diferenciação escamosa, potencial para invadir localmente os tecidos subjacentes normais e levar à metástase linfonodal e/ou regional (Scully e Bagan, 2009; Podlodowska et al, 2012). O padrão histopatológico de invasão do CEC oral é caracterizado como a presença de ninhos ou ilhas neoplásicas e cordões de células escamosas epiteliais malignas infiltrando os tecidos normais, como o tecido conjuntivo, músculo, glândulas salivares, dentre outros (Brandwein-Gensler et al., 2010; Sharma et al., 2013).
A etiopatologia do CEC oral é considerada como multifatorial, por incluir de fatores extrínsecos e intrínsecos, onde a participação simultânea de mais de um fator é frequente. Este evento é conhecido como cocarcinogênese e desempenha um papel relevante no desenvolvimento desta neoplasia (Petti, 2009; Scully e Bagan, 2009; Ganly et al; 2012). O hábito tabagista e o hábito etilista, concomitantemente, são os principais fatores extrínsecos, com ação dose dependente. Estima-se que o risco para o desenvolvimento do câncer oral atribuído aos hábitos tabagista e etilista é de
aproximadamente 65%. Além disso, a radiação ultravioleta (no câncer de lábio) e a infecção pelo papilomavírus humano (HPV) principalmente os subtipos 16 e 18 (com papel importante no câncer de orofaringe) também são apontados como fatores extrínsecos (Fakhry & D’Souza; 2013). Os fatores intrínsecos que podem estar relacionados ao desenvolvimento do câncer oral são principalmente as alterações genéticas e a imunossupressão (Petti, 2009; Fulzele et al., 2013).
Com base nos fatores iniciadores, diversas alterações genéticas devem ocorrer para o desenvolvimento e a progressão tumoral (Omar, 2015). Assim, como nos outros tipos de neoplasias malignas, modificações genéticas específicas como a ativação de proto-oncogenes (por exemplo, o MYC, o RAS, o PIK3CA, e o EGFR), a inativação de genes supressores tumorais (por exemplo, o TP53 e o PTEN); bem como a inter-relação destas complexas alterações, garantem à célula maligna vantagens de crescimento, multiplicação e invasão, fugindo ao controle do organismo (Hanahan & Weinberg, 2011). Em virtude das transformações sofridas pelo comportamento sexual, houve um aumento nas taxas de incidência de CEC de orofaringe, amígdala e base da língua entre pacientes adultos jovens, relacionado à infecção pelo HPV. Estudos apontaram que o DNA do vírus HPV foi encontrado em até 70% dos CEC de orofaringe (Kang, Kiess & Chung, 2015). Além disso, a alteração do hábito tabagista entre as mulheres levou a um aumento dos casos de CEC oral neste grupo, mudando ligeiramente o perfil dos pacientes afetados. Entretando, o perfil epidemiológico habitual dos pacientes com CEC oral é formado por homens da quinta a oitava décadas de vida, tabagistas e etilistas crônicos. A predisposição genética também está relacionada aos pacientes que fogem ao perfil clássico (Túri et al.,2013; Rivera, 2015).
O CEC oral acomete principalmente língua, lábios e assoalho da boca (Scully e Bagan, 2009; Rivera, 2015). No entanto, esta neoplasia maligna pode ocorrer também na mucosa de revestimento do trígono retromolar, mucosa jugal, mucosas alveolares e palato. A apresentação mais comum do CEC oral é como uma úlcera de borda elevadas e endurecidas que não cicatriza após três semanas (Rivera, 2015). Mas outras apresentações clínicas com crescimento endofítico ou exofítico também são possíveis. A disseminação ocorre por invasão de estruturas adjacentes, como musculatura profunda da língua, musculatura pterigóidea, mandíbula, maxila, laringe, hipofaringe, nasofaringe e por via linfática (Scully e Bagan, 2009). As metástases linfonodais são o fator prognóstico mais importante para o CEC oral (Fan et al., 2011). Por outro lado, as metástases à distância não são muito comuns em estágios iniciais, mas podem ocorrer principalmente nos
estágio mais avançados da doença. Os órgãos frequentemente acometidos por metástases do CEC oral são pulmão, ossos e fígado. Em casos de recorrência ou doença avançada, estes locais devem ser investigados (Scully e Bagan, 2009; Noguti et al., 2012; Rivera, 2015).
2.1.1 Patogênese
Um número limitado de células epiteliais normais inicia o processo da carcinogênese oral. Assim, a patogênese do CEC oral que leva ao comportanto invasivo dessa neoplasia é decorrente da sucessão de certas alterações em genes que codificam proteínas de controle do ciclo celular, sobrevivência celular, motilidade celular e a angiogênese em um grupo reduzido de queratinócitos normais. As alterações genéticas envolvidas neste processo podem ocorrer por mutação aleatória, amplificações ou inativações decorrentes da exposição a uma variedade de fatores biológicos carcinogênicos ou erros no processo de reparo do DNA (Feller et al., 2013). Dessa foram, as alterações citogenéticas, além dos processos epigenéticos nos oncogenes e genes supressores de tumor garantem vantagens às células neoplásicas malignas resultando em um crescimento seletivo e uma expansão clonal (Merlo et al., 2006; Feller et al., 2013). Consequentemente há uma diminuição do controle do ciclo celular, um aumento da proliferação celular ao mesmo tempo que ocorre uma redução no processo de apoptose. Por fim, a célula epitelial maligna adquiri motilidade e capacidade de degradação da matriz extracelular, propiciando invasão e metástase (Hanahan & Weinberg, 2011; Sinha et al., 2013). Todo o microambiente tumoral oferece suporte para a progressão da neoplasia (Hanahan & Weinberg, 2011). Evidências recentes mostram que os sinais biofísicos e bioquímicos da conversa cruzada entre o tumor e matriz extracelular influenciam eventos essenciais em câncer e, portanto, são essenciais para a transformação maligna (Pickup, Mouw & Weaver, 2014).
Neste contexto, o microambiente tumoral desempenha um papel relevante na progressão do tumor, onde os fibroblastos associados ao carcinoma (CAFs) e as células imunológicas podem contribuir para a proliferação, invasão e metástase. Ademais, o acúmulo de radicias livres, a hipóxia e a superprodução de fatores de crescimento (o fator de crescimento de transformação β - TGF-β) estão envolvidas em processos que favorecem o crescimento tumoral. A transição epitélio-mesenquimal é outro evento que marca a evolução do CEC oral, onde a célula epitelial maligna deixa de expressar marcadores epiteliais (E-caderina, citoqueratina) e começa a expressar marcadores
mesenquimais (N-caderina, vimentina), garantindo habilidades de mobilidade e invasão (Rivera & Venegas, 2014; Costa et al., 2015). Com o sistema imunológico suprimido, as células neoplásicas podem crescer livremente (Carvalho et al., 2011).
Todos estes eventos necessários para a transformação maligna de uma célula normal foram consagrados na sequência de estudos publicados por Hanahan & Weinberg (2011). Estes autores definiram os principais eventos para o desenvolvimento de uma neoplasia maligna: 1) aquisição de sinalização proliferativa autônoma; 2) interdição dos sinais inibidores de crescimento; 3) evasão da morte celular programada; 4) imortalização; 5) aquisição de um fornecimento de sangue (angiogênese); e 6) aquisição da capacidade de invadir tecidos (invasão).
Para o desenvolvimento do CEC, a mucosa oral normal sofre diferentes estágios de progressão como hiperplasia epitelial, graus de displasia até desenvolver o carcinoma in situ e carcinoma invasivo. As lesões com potencial de transformação maligna como leucoplasias, eritroplasias ou eritroleucoplasias podem anteceder o desenvolvimento do CEC oral. Umas das características principais que parecem preceder o início dos tumores epiteliais malignos é a displasia epitelial, um termo histológico que descreve a combinação da maturação desordenada e distúrbio da proliferação celular (Scully e Bagan, 2009; van der Waal, 2009). As alterações atípicas que podem estar presentes no epitélio displásico são queratinização intraepitelial, aumento da atividade mitótica, perda de estratificação do epitélio, perda da polaridade, pleomorfismo celular e nuclear, mitoses atípicas (Barnes et al., 2005; van der Waal, 2009).
A leucoplasia é definida como uma placa branca em mucosa oral, não destacável e que não pode ser diagnóstica como outra doença ou distúrbio (Warnakulasuriya, Johnson & van der Waal, 2007). Microscopicamente, exibe várias alterações epiteliais reativas como hiperplasia, hiperqueratose e acantose e certo grau de displasia nas chamadas leucoplasias displásicas, onde cerca de 1% podem progredir para a transformação maligna (van der Waal, 2009). A eritroplasia possui alto potencial para malignização, sendo definida como uma placa vermelha que não pode ser caracterizada clinicamente ou patologicamente como outra doença (van der Waal, 2009). Por sua vez, a eritroleucoplasia é uma placa branca e vermelha na mucosa oral, que geralmente mostra algum grau de displasia ou até mesmo carcinoma (van der Waal, 2009). Histologicamente estas três lesões podem apresentar displasia epitelial mostrando hipercromatismo, aumento do tamanho nuclear, pleomorfismo, figuras mitóticas anormais ou maior número de mitoses. Quando as alterações ocorrem nos queratinócitos basais ou parabais, tem-se
a displasia leve; por sua vez, quando as alterações acometem o terço médio do epitélio tem-se a displasia moderada; por fim, quando as mudanças são estendidas até a camada superficial, os termos displasia severa e carcinoma in situ (atipia celular em todo o epitélio, da base à superfície) são utilizados (Rivera, 2015).
2.1.2 Diagnóstico, tratamento, prognóstico e sobrevida
O diagnóstico de uma lesão suspeita de CEC oral é feito através da realização de biópsia incisional e exame anatomopatológico, a fim de detectar as características histopatológicas que definem esta neoplasia. Estudos reforçam que as medidas de controle dos fatores de risco para o CEC oral, associadas ao exame clínico feito por profissionais capacitados é a melhor estratégia para o diagnóstico precoce e para minimizar a incidência e a mortalidade desta neoplasia. Principalmente porque lesões em estágio inicial possuem uma resposta mais favorável ao tratamento e, portanto, uma melhor sobrevida (INCA).
Tanto o tratamento como o prognóstico do CEC oral são fundamentados no sistema de classificação clínica do tumor, conhecido como TNM (Edge e Compton, 2010), onde T é o tumor primário, N metástase em linfonodo regional e M metástase à distância. As modalidades de tratamento incluem a ressecção cirúrgica do tumor, radioterapia e quimioterapia. Nos estágios iniciais da doença (T1 e T2) a cirurgia é utilizada como monoterapia ou associada à radioterapia, com um prognóstico mais favorável. Nos casos de tumores em estágios avançados (T3 e T4) uma ressecção cirúrgica mais ampla, bem como o esvaziamento da cadeia linfática e a reconstrução de tecidos são associados à radioterapia pós-operatória e/ou quimioterapia (Dunkel et al., 2013; Uchiyama et al., 2014). Cirurgias para a remoção de tumores mais amplos também dificultam a função oral do paciente.
Apesar dos protocolos terapêuticos bem definidos, as modalidades de tratamento para o cuidado de tumores em estágio inicial ainda não é consenso, uma vez que tumores do mesmo tamanho podem apresentar comportamentos distintos (Noguti et al., 2012). O CEC oral em estágio inicial e sem metástase linfonodal é geralmente tratado com ressecção do tumor primário e acompanhamento clínico dos linfonodos cervicais. Entretanto, estudos revelaram que de 20% a 40% dos casos apresentam metástases cervicais ocultas nas fases iniciais da doença (da Silva et al., 2012; Ganly et al., 2012; van der Waal et al., 2013).
Apesar dos diversos estudos e investigações sobre o CEC oral, no esforço de comprender melhor a doença e buscar por implementações no tratamento (Carvalho et al., 2005; Zheng et al., 2008; Agra et al., 2010; Leemans et al., 2011), não houve uma melhora significa da sobrevida nas últimas décadas, sendo que apenas 40-50% dos pacientes vão sobreviver após cinco anos (Leemans et al., 2011; van der Waal, 2013). Estes números são decorrentes principalmente do desenvolvimento frequente de recidivas locorregionais, metástases à distância e segundos tumores primários (Alam et al., 2012; Leemans et al., 2011). As taxas de recorrência do CEC oral variam de 18% a 76% em pacientes submetidos a tratamento padrão e a recidiva local, representando um desafio clínico para o manejo terapêutico (da Silva et al., 2012).
Outro dado relevevante para o prognóstico dos pacientes com CEC oral é o momento do diagnóstico, onde mais de 60% dos CEC são confirmados em estágios avançados da doença. Para o paciente isso significa um tumor mais agressivo e a necessidade de ressecção cirúrgica ampla com combinação de radioterapia e quimioterapia e interferência negativa na qualidade de vida. Além disso, o sistema TNM não provem dados sobre as características biológicas do tumor, deixando uma lacuna acerca dos mecanismos moleculares que ordenam o desenvolvimento da doença. Antecipar o comportamento clínico do CEC oral ainda é um desafio, principalmente devido aos fatores prognósticos subjetivos e a dificuldade de dividir os pacientes em grupos de baixo e alto risco, dos quais 10-30% sofrem recidivas após ressecção cirúrgica com margens livres de doença (Sepiashvili et al., 2012). Assim, o diagnóstico tardio desses tumores, somado a localização anatômica complexa, bem como a ausência de sistemas de classificação dos pacientes que levem em consideração as alterações moleculares podem estar associadas à baixa eficácia terapêutica (Romanska et al., 2013). O prognóstico dos pacientes com CEC oral é influenciado por dados clínico-patológicos e histoclínico-patológicos dos tumores como o tamanho do tumor, recorrência ou recidiva local e regional nos linfonos cervicais (Fan et al., 2011), padrão de invasão em ilhas nos tecidos subjacentes, invasão perineural, profundidade de invasão (Almangush et al., 2015; Brandwein-Gensler et al., 2010; Sawazaki-Calone et al., 2015; Xie et al., 2015), presença de infiltrado inflamatório (Brandwein-Gensler et al., 2010; Wolf et al., 2015).
Nas últimas décadas estudou-se muito sobre câncer oral, apesar disso, não houve uma melhora significativa na sobrevida dos pacientes acometidos por essa neoplasia (Leemans et al., 2011; van der Waal, 2013). Isso se deve principalmente por ainda não
haver um completo entendimento da biologia tumoral, aos comportamentos clínicos específicos dos tumores e à falta de sistemas que auxiliem na estratificação clínica do paciente em grupos de alto e baixo risco, levando em consideração características particulares do tumor, seja por meio de avaliação microscópica ou molecular (Leemans et al., 2011; van der Waal, 2013; Rivera et al., 2017).
2.2 Sistemas de classificação histopatológica do CEC oral
Os sistemas de classificação histopatológica do CEC oral foram propostos no esforço de completar o sistema de estadiamento clínico TNM. Como os estudos evidenciaram que existe uma ampla diferença no prognóstico e resposta ao tratamento dos CEC orais no mesmo estágio e no mesmo local, os sistemas de classificação histológica surgiram com um auxílio para decisões cínicas, classificação do prognóstico dos pacientes e tratamento individualizado (Almangush et al., 2015; Brandwein-Gensler et al., 2005; Bryne et al., 1992).
O primeiro modelo foi proposto por Broders (1920) avaliando o grau de similaridade do CEC oral com o seu tecido de origem (mucosa oral normal), utilizando parâmetros como o grau de queratinização do tumor, a presença de polimorfismo celular e nuclear e a presença de mitoses atípicas. Assim, os tumores podem ser classificados em bem diferenciados, moderadamente diferenciados ou pouco diferenciados desde a sua maior diferenciação e proximidade com o tecido de origem até tumores que não demonstram características epiteliais, com alto grau de pleomorfismo e muitas mitoses. Os tumores indiferenciados, ou seja, mais distantes das características histológicas de uma célula epitelial normal apresentam o pior prognóstico (Barnes et al., 2005).
Em 1992, Bryne et al., propôs o sistema de classificação histopatológica do CEC oral que leva em consideração o fronte invasivo do tumor. Neste sistema também foram avaliados o grau de queratinização, o polimorfismo celular e nuclear e o número de mitoses, com avaliação adicional dos padrões de invasão e da infiltração linfoplasmocitária. Os padrões de invasão nas margens do tumor podem apresentar-se de diversas maneiras, como crescimento sólido bem delimitado, ou cordões de células neoplásicas malignas formando estruturas semelhantes a dedos (do inglês, fingers like), ilhas neoplásicas grandes (com mais de 15 células por ilhas) ou ilhas neoplásicas pequenas (com menos de 15 células por ilha). Os tumores com baixo grau de
queratinização, alto polimorfismo celular e nuclear, padrões de invasão em ilhas e presença de infiltrado linfoplasmocitário, demonstraram um pior prognóstico.
Utilizando como base o estudo de Bryne et al., (1992), Brandweien-Gensler et al., (2005) desenvolveu um sistema de classificação histopatológica que levou em consideração o pior padrão de invasão, a resposta linfocitária do hospedeiro e a invasão perineural para predizer o prognóstico dos pacientes com CEC oral. Para esta autora, o padrão de invasão no fronte tumoral poderia ser um crescimento sólido, cordões de células neoplásicas malignas, ilhas neoplásicas grandes (com mais de 15 células por ilhas), ilhas neoplásicas pequenas (com menos de 15 células por ilha) ou as chamadas ilhas satélites que estão a 1 mm de distância do fronte invasivo do tumor. Dessa forma, este estudo dividiu os pacientes em três grupos de risco de acordo com a pontuação do sistema criado. Os pacientes com tumores onde as ilhas satélites, invasão perineural e infiltrado inflamatório estavam presentes, foram classificados no grupo de alto risco, e os autores sugeriram nestes casos a radioterapia como tratamento adjuvante.
Recentemente, em 2015, Almangush et al., descreveram e testaram um modelo de classificação histopatológica para o CEC de língua em estágio inicial que leva em consideração o brotamento tumoral e a profundidade de invasão. Neste modelo, os brotamentos tumorais (do inglês, tumor buddings) foram definidos como pequenos agrupamentos celulares com 5 células ou menos no fronte invasivo tumoral. Pacientes com cinco budding ou mais e com profundidade de invasão do tumor maior do que 4 mm apresentaram um maior risco de recorrência locorregional e morte pela doença, definindo um grupo de pacientes com CEC inicial agressivo.
Apesar de outras investigações reproduzirem estes sistemas de classificação histopatológica e demonstrarem o valor prognóstico dos modelos, não há um consenso quanto ao uso de algum destes sistemas na prática clínica (Sawazaki-Calone et al., 2015). A realização de mais estudos, com abordagem multicêntrica e com um maior número de pacientes poderia fortaceler a indicação desses sistemas e finalmente auxiliar o sistema TNM.
Somado ao padrão histomorfológico, a composição molecular do tumor em regiões específicas também poderia ser válida para predizer a agressividade do tumor e o prognóstico dos pacientes acometidos pelo CEC oral (Macedo, 2015). Estes achados deixam clara a necessidade de um estudo mais aprofundado das regiões tumorais, principalmente na região de fronte tumoral em comparação a outras áreas.
2.3 A região de fronte invasivo tumoral
O fronte invasivo tumoral (do inglês “invasive tumor front”) é a região do tumor que invade em primeiro lugar os tecidos normais subjacentes e onde ocorrem alterações fundamentais para o processo de progressão neoplásica (Bryne et al., 1989; 1998; Sharma et al., 2013; Costa et al., 2015). As células neoplásicas malignas nessa margem do tumor apresentam menor grau de diferenciação e um maior grau de dissociação em comparação com o interior tumoral, sofrendo diversas modificações moleculares, como a transição epitélio–mesenquimal (Sharma et al., 2013). Estas modificações transformam a margem de tecido conjuntivo logo abaixo, estabelecendo uma interação entre as células malignas e as células do estroma. Além disso, é no fronte invasivo que ocorre a maior interação entre o tumor e as células inflamatórias, contribuindo para crescimento infiltrativo (Costa et al., 2015; Sharma et al., 2013; Bryne, 1992; 1998).
É bem aceito na literatura que as características histológicas do fronte invasivo são importantes para predizer o comportamento clínico dos tumores, sendo avaliado por diferentes sistemas de classificação histopatológica em CEC oral (Bryne 1989; et al., 1992, 1998; Almangush et al., 2015). O fronte de invasão também é apontado como a área de interesse para investigação do perfil molecular dos tumores, com provável valor prognóstico (Costa et al., 2015; Macedo, 2015; Romanska et al., 2013; Kato et al., 2011; Almangush et al., 2015; Agarwal e Ballabh, 2013; Metwaly et al., 2012).
Nessa região as células neoplásicas dissociadas possuem vantagem de invasão no estroma, ganhando habilidades de motilidade com montagem e desmontagem da adesão focal, secreção de enzimas proteolíticas para a degradação da matriz extracelular, aumento da proliferação celular, iniciação de angiogênese até alcançar o sistema vascular e linfático (Bryne et al., 1992; Sharma et al., 2013; Costa et al., 2015). Todo esse processo no fronte de invasão direciona as células tumorais para o desenvolvimento de metástases regionais e à distancia. Por serem eventos fundamentais para as alterações que ocorrem no CEC oral, o fronte invasivo tumoral pode refletir melhor as características clínico-patológicas do tumor do que outras partes (Sharma et al., 2013).
2.4 Espectrometria de massas baseada em proteômica
A espectrometria de massas (MS) é uma técnica analítica que mede a relação massa-carga para identificar e quantificar moléculas em qualquer tipo de amostra. Este método foi criado na área da física, mas atualmente é largamente utilizado também na pesquisa em química e biologia (Aebersold & Mann, 2016). Dentro das possibilidades de moléculas identificáveis, a MS é capaz de detectar e quantificar proteínas, através dos seus peptídeos, no método conhecido como espectrometria de massas baseada em
proteômica, onde tanto a qualidade quanto a quantidade de protéinas descobertas ou
proteínas alvos são acessadas (Borrebaeck, 2012). Além disso, essa técnica eficientemente determina modificações pós-traducionais nas proteínas e interação proteína-proteína (Aebersold & Mann, 2016). O princípio central da MS baseada em proteômica é a avaliação em larga-escala das chamadas misturas complexas de proteínas (amostras), através do uso principalmente da cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas, através da separação dos peptídeos mais comumente por hidrofobicidade seguida pela medida dos íons pela determinação da razão massa/carga (m/z) dos mesmos (Ong e Mann, 2005; Borrebaeck, 2012).
Os principais métodos dentro da proteômica são conhecidos como: 1) proteômica baseada em descoberta, quando o objetivo é detectar e quantificar todas as proteínas mais intensas de uma amostra; e 2) proteômica baseada em alvos, quando o objetivo é detectar e quantificar proteínas específicas (já conhecidas) em uma amostra (Aebersold & Mann, 2016; Lange et al., 2008; Picotti & Aebersold, 2012). Estas estratégias amparam a pesquisa em câncer, onde é viável identificar o proteoma total de uma neoplasia maligna (descoberta) e verificar um potencial biomarcador, na possibilidade de identificá-lo em diferentes amostras (alvo) (Macedo, 2015; Borrebaeck, 2012).
O uso da MS baseada em proteômica permitiu um grande avanço nas pesquisas em câncer, viabilizando a descoberta de potenciais candidatos à biomarcadores e alvos terapêuticos (Bagordakis et al., 2016; Flores et al., 2016; Fulzele et al., 2013; Patel et al., 2008). Uma vez que a proteômica baseada em descoberta é capaz de detectar milhares de proteínas em uma amostra biológica, é possível determinar o perfil proteico dessa amostra, contribuindo para revelar características moleculares de determinadas condições, como por exemplo o desenvolvimento de câncer, a presença de metástases, o prognóstico do paciente ou a resposta a um tratamento específico (Carnielli et al., 2015; Ong e Mann, 2005;). Essa estratégia também possibilita o entendimento dos processos
biológicos envolvidos na carcinogênese (Hoeben et al., 2006) em diversos tipos de neoplasias malignas e no CEC oral (Rodrigues et al., 2017; Bagordakis et al., 2016; Flores et al., 2016).
Nos últimos anos, estudos em proteômica revelaram que possivelmente um grupo de proteínas seja mais coeso na determinação uma condição patológica do que uma única proteína. Dessa premissa, surgiu a “assinatura de expressão proteica” da doença investigada, do inglês “protein expression signature”. Esta assinatura poderia ser utilizada tanto para o diagnóstico como para o prognóstico de determinadas condições de saúde e doença (Kreeger e Lauffenburger, 2009).
Como os métodos de MS baseada em proteômica originam um grande volume de dados, a associação com uma análise de bioinformática se faz necessária para extrair as informações mais relavantes e determinadar, por exemplo, as vias de interação e processos biológicos envolvidos nas amostras (Carnielli et al., 2015). Assim, apenas a identificação primária de proteínas não reflete todo o complexo processo que ocorre para o desenvolvimento de uma neoplasia maligna, onde diversas vias interconectadas estão desreguladas, abrangendo processos celulares fundamentais, como proliferação, diferenciação, migração e morte celular (Kreeger e Lauffenburger, 2009). Neste contexto, programas computacionais podem ser utilizados para armazenar, buscar, analisar e e integrar o grande número de dados gerados (Carazzolle et al., 2014).
Para a proteômica baseada em alvos, como a finalidade é detectar e quantificar proteínas particulares em uma mistura complexa (amostra), os analítos específicos (peptídeos) devem ser pré-determinados e as suas características de fragmentação e aquisição no equipamento já devem ser conhecidas (Boja e Rodriguez, 2012). Diversos métodos podem ser utilizados nessa estratégia baseada em alvos afim de garantir a acquisição e a análise de dados. Um desses métodos é conhecido como monitoramento seletivo de reações (SRM, do inglês selected reaction monitoring), sendo proficiente para avaliar um grupo de proteínas, de maneira coerente e minuciosa e com uma quantificação confiável de analitos de baixa abundância em misturas complexas (Lange et al., 2008; Picotti & Aebersold, 2012). Estudos do nosso grupo de pesquisa foram capazes e utilizar esta técnica de forma consistente, seja em linhagens celulares ou em amostras de saliva de pacientes com CEC oral (Kawahara et al., 2016; Winck et al., 2015).
2.5 Marcadores prognósticos em câncer oral
Um marcador biológico ou biomarcador é compreendido como qualquer molécula (DNA, mRNA, proteínas, lipídeos ou metabólitos) capaz de definir um estado biológico normal ou patológico em determinado organismo (Biomarkers Definitions Working, 2001; Fuzery et al., 2013). Na pesquisa em câncer, os biomarcadores ou candidatos a biomarcadores são testados e avaliados para diagnóstico, prognóstico, resposta ao tratamento e monitoramento dos pacientes com diferentes tipos de neoplasias malignas (Rivera et la., 2017; Fuzery et al., 2013).
Um biomarcador em câncer pode ser uma molécula segregada por uma célula neoplásica maligna ou uma resposta específica do corpo à presença da neoplasia. Os biomarcadores podem ser utilizados para a avaliação do paciente em múltiplos contextos clínicos, incluindo estimar o risco da doença e distinguir os tecidos benignos e malignos (Henry & Hayes, 2012). Ademais, os biomarcadores de câncer podem ser classificados com base no estado da doença, incluindo biomarcadores preditivos, de diagnóstico e prognóstico (Mishra & Verma, 2010). Um biomarcador prognóstico informa sobre um resultado provável do câncer (por exemplo, sobrevivência global, sobrevida livre de doença e sobrevivência específica), independentemente do tratamento recebido (Ballman, 2015), ajudando assim nas decisões clínicas.
Apesar de anos de pesquisa acerca dos marcadores biológicos em oncologia, o número de marcadores que emergiram com utilidade cliníca ainda é pequeno (Ballman, 2015; Fuzery et al., 2013). Esta realidade também se reflete no CEC oral, onde diversos biomarcadores tumorais (metaloproteinases, caderina-1, mucina-1, interleucina-8, HPV-16, EGFR e TP53) foram sugeridos para prever o prognóstico dos pacientes, no entanto apenas a infecção pelo vírus HPV tem mostrado alguma utilidade clínica (The Cancer Genome Atlas Network, 2015; Mohtasham et al., 2013; Kato et al., 2011). Isso sugere que os CEC de cabeça e pescoço positivos para o HPV formam uma entidade clínica distinta com melhor resultado do tratamento (Dork & Nuyts, 2016).
De uma maneira geral, a qualidade da conduta e o relatório desses estudos são geralmente insatisfatórios, o que não permite conclusões confiáveis (Almangush et al., 2017; Rivera et al., 2017). Recentemente dois trabalhos realizaram uma revisão sistemática da literatura em relação aos marcadores prognósticos em CEC oral (Rivera et al., 2017) e os marcadores prognósticos em CEC de língua (Almangush et al., 2017). Os achados levaram às conclusões de que ainda faltam estudos de acompanhamento e que as
