4.4.1 Coleta das amostras de saliva
Para esta fase do estudo foram utilizadas amostras do Instituto do Câncer de São Paulo (ICESP), Octavio Frias de Oliveira, ICESP, São Paulo. O consentimento foi obtido de todos os pacientes e os procedimentos utilizados para a coleta de saliva e anotação dos dados clínicos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas e os protocolos experimentais definidos pelo comitê de ética do ICESP (protocolo CAAE 30658014.1.1001.0065). As amostras de saliva foram obtidas voluntariamente de 33 pacientes com CEC oral e com lesões ativas no momento da coleta. As informações coletadas dos registros médicos e o seguimento dos pacientes foram: sexo, idade, hábitos como tabagismo e consumo de álcool, estadiamento clínico TNM, recorrência, tratamento e situação. Os pacientes foram então divididos em dois grupos com base no seu estágio clínico: pacientes N0, sem metástase linfonodal (n=10) e pacientes N+, com metástase linfonodal (n=23).
Para a coleta de saliva foi utilizado protocolo anteriormente publicado por Winck et al. (2015). Os voluntários desta pesquisa não comeram ou ingeriram líquidos por pelo menos uma hora antes da coleta, em seguida realizaram enxague bucal com 5 ml de água potável e a saliva não estimulada foi coletada em um recipiente de vidro. As amostras de saliva foram aliquotadas em tubos de 15 ml em um volume apromixado de 1 ml, congeladas e armazenadas em freezer a -80°C para uso posterior.
4.4.2 Peptídeos proteotípicos e seleção de transição
Para o monitoramento das proteínas CSTB, LTA4H, NDRG1 e PGK1 na saliva de pacientes sem (N0) e com metástase (N+) linfonodal, foi realizada a abordagem proteômica baseada em alvos, com a técnica de SRM. Os peptídeos foram selecionados com base em especificações relatadas anteriormente (Lange et al., 2008, Gallien, Duriez & Domon, 2011). Em resumo, foram escolhidos de 2-3 peptídeos proteotípicos por proteína com base no número de resíduos, hidrofobicidade e evidência no SRMAtlas (http://www.srmatlas.org). Um total de 21 peptídeos proteotípicos foram selecionados e comparados com os padrões de peptídeos marcados com isótopos pesados (Thermo Fisher Scientific, EUA). Os peptídeos marcados com isótopos estáveis (SIL, do inglês
stable isotope-labeled peptides) foram sintetizados com isótopos pesados em lisina,
no C-terminal do peptídeo (Thermo Scientific , EUA). Três transições foram monitoradas para a condição leve e pesada de cada peptídeo, com um total de 125 transições monitoradas. Um total de 9 peptídeos e 27 transições do padrão de tempo de retenção interno (iRT - Mistura de Calibração de Tempo de Retenção de Peptídeos Pierce™, Thermo Fisher Scientific, EUA) foi adicionado em todas as amostras para controlar os turnos de tempo de retenção na cromatografia líquida.
4.4.3 Preparação das amostras de saliva para proteômica baseada em alvos
As amostras de saliva foram centrifugadas a 1.500 g durante 5 minutos a 4°C para sedimentar os detritos. O sobrenadante resultante foi recolhido e quantificado pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Foi utilizado um volume correspondente a 10 μg de proteína total para a preparação da amostra. Dez microgramas de proteína total foram desnaturados em solução de Tris-HCl 100 mM, pH 7,5 contendo ureia 8 M, tioureia 2 M, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM e inibidor de protease (Protease Inhibitor Cocktail Complete Mini Tablets (Roche, Auckland New Zealand). As amostras foram sonicadas durante 10 minutos e depois centrifugadas a 10000 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi recolhido e as proteínas foram reduzidas com DDT e alquiladas com iodoacetamida. Em seguida, as proteínas foram digeridas durante a noite a 37°C utilizando 1,8 μg de tripsina. Após a digestão, a reação foi interrompida pela adição de ácido trifluoroacético. A dessalinização foi realizada por extração em fase sólida usando resina (Stage-tips C18), com modificações (Villén & Gygi, 2008; Winck et al, 2015). Após a secagem sob vácuo, os peptídeos foram resolubilizados em ácido fórmico a 0,1%. Os peptídeos SIL e os padrões de tempo de retenção iRT (Pierce) foram adicionados em 10 μg da saliva digerida.
Para evitar o viés durante as medidas, a coleta de dados foi organizada por
blocking e randomização para cada grupo (N0 e N+) de acordo com as recomendações de
um estudo anterior (Oberg & Vitek, 2009). As amostras dos dois grupos (N0 e N+) foram randomizadas usando o ambiente R (v3.4.0). A randomização foi aplicada para cada conjunto de repetições técnicas. Cada amostra foi analisada em três repetições técnicas utilizando os mesmos parâmetros do instrumento, conforme descrito na próxima seção.
4.4.4 Espectrometria de massas baseada em alvos utilizando o método de monitoramento seletivo de reações (SRM)
As amostras foram analisadas em um espectrômetro de massas triplo quadrupolo Xevo TQ-XS (Waters, Milford, MA, EUA) equipado com uma fonte de íons electrospray (Ion Key, Waters, Milford, MA, EUA) com o programa MassLynx (versão 4.2).
Uma alíquota contendo 1 μg da mistura de peptídeos da saliva foi separada em uma coluna BEH Shield C18 IonKey (10cm x 150μm ID embalada com partículas C18 de 1,7 μm, Waters, EUA) aquecida a 40°C. Os peptídeos foram mantidos a 4°C e carregados na coluna do equipamento Acquity UPLC-Class M LC (Waters, Milford, MA, EUA). A aquisição dos íons foi realizada usando o espectrômetro de massas operando no modo SRM-MS com os analisadores Q1 e Q3 ajustados para 0,7 Th FWMH e um tempo de ciclo de 3 segundos. Para todas as corridas de SRM-MS, foram utilizadas múltiplas injeções agendadas com uma janela de eluição de 3 minutos, cada uma segmentando aproximadamente 3 transições por peptídeo. A energia de colisão ideal foi determinada para cada peptídeo pelo Skyline (MacLean et al., 2010). O tempo de permanência para todos os peptídeos monitorados foi definido automaticamente no programa MassLynx (v.4.2), de 14 ms a 163 ms, com pelo menos 10 pontos por pico.
4.4.5 Análise quantitativa do SRM e estatística
A visualização e a inspeção de picos foram realizadas manualmente no Skyline. Ambos os peptídeos leves e pesados foram verificados quanto à qualidade dos dados, observando a co-eluição de todas as três transições, o alinhamento dos picos e os tempos de eluição de peptídeos pesados, a correlação de intensidade relativa com a biblioteca espectral (dotp), a correlação de intensidade relativa dos picos com fragmentos pesados (rdotp) e a reprodutibilidade entre as repetições técnicas. Cada peptídeo foi quantificado em uma amostra, dividindo a intensidade do peptídeo leve (soma das transições de luz) pela intensidade de cada peptídeo SIL de referência (soma de transições pesadas) para obter a relação peptídeo leve/pesado. O teste t de Student foi utilizado para encontrar as proteínas diferencialmente expressas entre o grupo N0 e N+ (p≤0,05), com resultado visualizado em um Volcano plot.
Adicionalmente, a correlação entre a abundância das proteínas na análise de SRM e os dados clínico-patológicos dos tumores foi realizada por tabulação cruzada e teste de qui-quadrado. O nível de significância adotado foi de 5% (p≤0,05).
4.4.6 Análise do valor prognóstico das proteínas alvo na saliva de pacientes com CEC oral
Para acessar a utilidade prognóstico das proteínas significativamente alteradas, valores de abundância de proteína foram atribuídos aos pacientes N0 e N+ e a análise da curva ROC foi utilizada. Esta abordagem permite criar um relatório completo de sensibilidade e especificidade, sendo uma ferramenta fundamental para avaliação de teste preditivo. Em uma curva ROC, a taxa positiva verdadeira (Sensibilidade) é plotada em função da taxa de falso positivo (Especificidade) para diferentes pontos de corte de um parâmetro (onde valores de corte ótimo foram definidos em relação a abundância da proteína). Cada ponto na curva ROC representa um par de sensibilidade/especificidade correspondente a um limite de decisão específico. A área sob a curva ROC (AUC) é uma medida de quão bem um parâmetro pode distinguir entre dois grupos (neste caso N0 e N+) (Goksuluk et al., 2016). O intervalo de confiança de 95% da AUC foi determinado. Os pontos de corte ótimos para todas as proteínas também foram calculados usando o índice de Youden (Ruopp et al., 2008).