Aula- Extração e purificação de ácidos nucleicos (2017)

BIOTECNOLOGIA BACHARELADO EM

Métodos de Extração e Purificação

de

Ácidos Nucleicos

 Reação em cadeia da polimerase (PCR); Clonagem;

 Transcritos (RT)

Digestão com enzimas de restrição; Construção de bibliotecas genômicas; Diagnósticos;

Análises forenses, clínicas, de solo e ambientais.

Aplicações na Biologia Molecular?

Quantidade Qualidade – pureza e integridade 02 A T C C G T A C G C Nucleotídeos Sequências _específicas

Ligação fosfodiéster

Características físico-químicas

Extração e Isolamento

de

DNA

Tipos de DNA

Etapas básicas p/ extração de DNA

1. Lise celular → métodos físicos, químicos e enzimáticos.

2. Remoção de lipídios, membrana e restos celulares → detergentes /

centrifugação.

3. Desproteinização do extrato celular → proteases.

4. Remoção de RNA → nucleases (RNases).

5. Precipitação/agregação/eluição → DNA

6. Quantificação e análise

06

Escolha do método de extração de DNA

Critérios:

Tipo de material biológico; Eficiência do método de extração; Rendimento → processos downstream; Capacidade de remoção de contaminantes; Qualidade e pureza;

Custo; Tempo.

07

Amostras para a extração de DNA

Cuidados: Escolha Manuseio Limpeza Acondicionamento Estocagem Uso 08

Equipamentos básicos

09

Principais componentes utilizados nos

protocolos de extração do DNA

 Soluções tamponantes:

 Sílica

10

Tampões

 Lise e extração:

• TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM) • STES ou STET→ SDS ou Triton X-100 (0.5-5%)

 Solubilização:

• Tampão TE ou H2O ultrapura estéril

 pH ideal:

• Manutenção → integridade molecular • Estabilidade

• Inibição → desoxirribonucleases

11

EDTA

 Ácido etileno diaminotetracético → agente quelante

–Cátions bivalentes → Ca2+ _{e Mg}2+

–Nucleases, metaloproteases, serino e cisteinoproteases. – Estável

–< 1 mM

Detergentes

Lise → permeabilizando / desarranjando a membrana

[5-10%]

Interagem e removem proteínas → DNA

Sais

•

Acetato de sódio /amônio e Hidróxido/Cloreto de sódio

–Íons + (Na) → neutralizam cargas – (grupos P). –Repulsão → agregação molecular

–Neutralização/estabilização de cargas → ↓ solubilidade em H2O

–Dissociação de proteínas 14

Proteases

 ligação peptídica adjacente→ grupo carboxílico de aa:

 28,9 KDa

 Ca2+ _{→ estabilidade enzimática}

 pH 8,0 (Estável → 4-12)  ↑Atividade 50-60o_C

 Compatibilidade: SDS, EDTA, Triton; Características: 15 Polipeptídeo Fragmentos R = aromático ou alifático

Ribonucleases

RNA hibridizado DNA (RNA:DNA duplex) 16  4 pb → atividade catalítica.  Mg+ .  17,9 KDa.  1 folha β e 4 hélices .  37 °C. Estável ↑ temperaturas.  pH → 7,6 - 9,1.

 Rnases H comerciais → E. coli.

Características:

Ribonucleases

17

Ribonuclease A (Rnase A) → Ligações fosfordiéster do RNA:

• 13,7 KDa;

• Íons →atividade catalítica • 60 °C. (Estável → 100 °C) • pH 7,6. (Atividade → pH 6 à 10) • Extração e isolamento de DNA; • Rnases A comerciais → pancreas bovino. Características:

Fenol

•Desnaturação/Precipitação → Proteínas •Precipitação → Lipídeos

•DNA → fase aquosa (pH neutro/básico) •Tamponado (pH 8) → Danos pela ação oxidante

Separação DNA/RNA Fase aquosa Interfase Fase orgânica 18 Proteínas Proteínas Lipídeos

Clorofórmio

•Desnaturação/precipitação → Proteínas, lipídios, polissacarídeos • Somente clorofórmio → Remoção do fenol residual

• Uso em conjunto → Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico (25:24:1 v/v)

19 Proteína+DNA

Precipitado

Álcoois

Álcool isoamílico

• Desidratação

• Contaminantes → fase orgânica • Redução → espuma

Etanol

• Etanol 70% → Contaminantes residuais (ex.:fenol)

Polifenois  β-mercaptoetanol ou Ditiotreitol  Polivinilpirrolidona (PVP)  Polivinilpolipirrolidona (PVPP)

Antioxidantes

Passos básicos da extração de DNA

1. Lise celular → métodos físicos, químicos e enzimáticos. 2. Remoção de lipídios, membrana e restos celulares 3. Desproteinação do extrato celular

4. Remoção de RNA 5. Precipitação/agregação 6. Eluição/solubilização → DNA

7. Quantificação e análise

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Métodos de lise mais utilizados para E. coli

•

Lise enzimática

– Lisozima (250 U/L)→ 20-30 min, 37 o_C.

– Tampão Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM – SDS ou Triton X-100 5%

•

Lise enzimática + Lise mecânica

•

Lise mecânica

– Ultrassom→ Pulsos alternados (10-15 seg)

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Passos básicos da extração de DNA

químicos e enzimáticos).

2. Remoção de lipídios, membrana e restos celulares 3. Desproteinação do extrato celular

4. Remoção de RNA 5. Precipitação/agregação 6. Eluição/solubilização → DNA 7. Quantificação e análise Método do Fenol/Clorofórmio 24

Passos básicos da extração de DNA

químicos e enzimáticos).

2. Remoção de lipídios, membrana e restos celulares 3. Desproteinação do extrato celular

4. Remoção de RNA 5. Precipitação/agregação

6. Eluição/solubilização → DNA

7. Quantificação e análise

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Solubilização e armazenagem do DNA

•

Após a remoção do álcool

–Secagem do DNA→ T.A.

•

Água ultrapura ou Tampão TE

–Tampão TE→ Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM – Estéril / DNAse-free → livre de contaminantes – Colunas de desalinização

•

Armazenamento

–Freezer → - 20 o_C

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Kits comerciais para a extração

de DNA

27

Extração de DNA (E. coli) - convencional

2) Lise celular →Ressuspensão (pellet) tampão STE c/ SDS + lisozima (10 mg/mL) 3) Adição → proteinase K (20 mg/mL).

4) Incubação → 37°C (2-3 H) ou 56 a 65°C (1 h) sem agitação. Centrifugação. 5) Tratamento c/ RNAse A → 37°C

6) Adição → Feno/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), 7) Coleta e transferência da Fase aquosa → DNA

8) Adição → solução NaCl 5 M ou acetato de sódio 3 M (pH 5,2) 9) Precipitação c/ isopropanol → -20°C por 3 h,

10)Centrifugação → à 12000×g por 10 mim; 11) Lavagem do precipitado → Etanol 70% 12) Reidratação → agua estéril ou tampão TE

Referência: Sambrook and Russel, 2001

Tempo total

> 4 horas

Escolha do kit de Extração de DNA

Critérios:

 Origem do material biológico;  Método de preparação da amostra;  Intenção de uso→ processos downstream;  Quantidade da amostra;  Rendimento;  Automatização do processo; Custo; Tempo;  Simplicidade do processo. 29

Kits de extração de DNA baseados na

extração orgânica

Solventes → fenol, colorofórmio, etanol Sais ou agentes caotrópicos → [NaCl] ↑ Resíduos → afetar processos downstreams Easy-DNA (Invitrogen)

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Extração de DNA (E. coli) - Kit

Wizard Genomic DNA Purification kit Lise celular

Precipitação de proteínas e remoção de macromolécula Precipitação do DNA Remoção do etanol e Reidratação Clareamento /peletização

Tempo total

~ 50 min

Kits de extração baseados em matrizes de

sílica

Adsorção → membranas/superfícies/partículas de sílica Colunas mini-spin

Vantagens → rapidez, rendimento, automatização

DNeasy Mini Spin Column (Qiagen)

Matrizes de Sílica - Princípio

[Na

_]↑

Ligação

Eluição

[Na

_]↓

DNeasy Kit (Mini spin Colunm)

DNA bacteriano Lise celular, homogenização e adição do etanol Tempo total ~ 40 min Ligação do DNA a membrana DNeasy (Mini spin colunm)

Lavagem da coluna

Eluição do DNA

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Kits baseados na separação magnética

Etanol ou isopropanol

Vantagens → rapidez, rendimento, automatização

Magnetic Beads Genomic DNA Extraction Kit (Geneaid)

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Magnetic Beads Genomic DNA extraction

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Lise celular Interação

Remoção Campo magnético Eluição Análise da purificação

Kits de extração baseados na troca iônica

Gradiente salino → [NaCl] Isolamento de plasmídios

PureLink® HiPure Plasmid DNA Purification kit (Invitrogen)

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Extração de DNA plasmidial

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Que fator é determinante para diferenciar a extração do DNA gênômico da extração do DNA plamidial em bactérias?

Pergunta

A intensidade do método de lise:

Total Parcial

DNA plasmidial DNA genômico

DNA plasmidial

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Kits utilizados para extração do DNA

plasmidial e suas vantagens

Extração de RNA

Tipos de RNA

Extração de RNA

Passos básicos para a extração de RNA

2. Inativação das nucleases → agentes químicos e desnaturação das proteínas com fenol e clorofórmio;

3. Remoção dos restos celulares e precipitação das proteínas desnaturadas por centrifugação.

4. Recuperação dos ácidos nucleicos por precipitação com etanol;

5. Fracionamento do DNA e RNA por solubilização diferencial sob alta concentração de sal. Vários métodos empregam a precipitação seletiva usando cloreto de lítio (LiCl).

Métodos para a extração de RNA

2. Extração de RNA o reagente Trizol (Invitrogen®)

3. Extração de RNA utilizando o reagente Brazol® (LGC Biotecnologia) 4. Extração de RNA utilizando os kits de purificação como: Wizard

Isolation RNA System (Promega®)

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Extração de RNA com fenol

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Solução monofásica →Fenol-isotiocianato de guanidina  Clorofómio;  Isopropanol;  H2O RNase-free

TRIZOL

Extração de RNA com TRIZOL

Coluna de sílica – mini-spin Ponte catiônica

[Na

_]↑

pH<7

Ligação

Eluição

[Na

_]↓

Extração de RNA com Kits

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Solubilização e armazenagem do RNA

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O que diferencia a purificação de DNA e RNA em colunas de sílica já que o princípio de ligação a matriz é o mesmo?

Perguntas

O tratamento prévio com DNases e RNases: