Estrutura Molecular
dos Ácidos Nucléicos e
1953 – Watson e Crick (
segredo da vida
)
Descobrem a estrutura de dupla-hélice do DNA: “Notamos que o pareamento específico que postulamos sugere um
possível mecanismo de cópia para o material genético”.
Início da década de 1940 –
Chargaff
(na foto em 1963)
descobre a proporção 1x1
entre adenina e timina, e
guanina e citosina,
fundamental para o
A dupla hélice é realmente uma molécula
extraordinária. O homem moderno tem talvez 50
mil anos, a civilização existe há apenas 10 mil
anos. Mas o DNA e o RNA existem há pelo
menos vários bilhões de anos. Durante todo esse
tempo, a dupla hélice esteve por aí, ativa. No
entanto, somos as primeiras criaturas sobre a
Terra a nos tornarmos conscientes da sua
existência.
Francis Crick
Decifrando o genoma - A corrida paraO termo Biologia Molecular até recentemente
vinha sendo aplicado quase que exclusivamente
à
Química de Ácidos Nucleicos
Ácido Desoxiribonucleico - DNA
A Biologia Contemporânea está dirigida para o entendimento da interação de moléculas dentro das células e das interações entre células que permitem a
construção de um organismo multicelular.
No atual milênio duas grandes forças irão remodelar a Biologia Celular Molecular:
Genomas: o conhecimento da seqüência completa de DNA de muitos organismos
Início da década de 90
- ambicioso
programa internacional -
o Projeto Genoma
Humano
(3 bilhões de dólares), para determinar o
completo manual de instruções do homem pela
leitura da seqüência precisa de bases químicas
(A, C, G e T) no DNA humano.
Término - junho de 2000
Desenvolvimento da bioinformática tem sido
absolutamente essencial para a Biologia
As técnicas
envolvendo a
identificação de
moléculas de
ácidos nucleicos
tornou-se a
maneira mais
fácil de se chegar
Os ácidos nucleicos são moléculas muito mais
simples que as proteínas
Os ácidos nucleicos são formados de apenas
4 tipos de monômeros
(alfabeto de 4 letras)
Proteínas - alfabeto de 20 letras
Nucleotídeos
:
Unidades constitutivas dos ácidos
nucléicos com função de armazenamento da
Informação Genética
Bases Nitrogenadas
2o anel de 5 carbonos fundido
Nucleotídeos do DNA
1’ 2’ 3’ 4’ 5'uridylic acid (UMP) uridine
Uracil
Nucleotide
adenylic acid (dAMP) guanylic acid (dGMP) cytidylic acid (dCMP) thymidylic acid dTMP
O DNA sempre tem duas fitas de ácidos
nucleicos enroladas em hélice
• As duas fitas se mantêm juntas por PONTES DE HIDROGÊNIO
• Para que o pareamento ocorra, ambas as FITAS têm que ser ANTIPARALELAS
Pareamento de Bases
Pirimidinas com Purinas
As fitas da
molécula de DNA (dupla hélice) podem ser separadas. Esse processo é denominado desnaturação. A renaturação
ocorre quando se volta às condições
Desnaturação e Renaturação do DNA
(1961 - Marmur e Doty descobriram a RENATURAÇÃO do DNA)
• As duas fitas da dupla hélice podem ser
reversivelmente separadas quando as PONTES DE HIDROGÊNIO são rompidas
:
Aumento de
temperatura ou
Extremos de pH
(usamos pH
alcalino para
Separação das fitas é denominada
“FUSÃO”da molécula de
DNA - “MELTING”MELTING POINT:
TEMPERATURA NA QUAL É
Tm e % de GC
Quanto maior a
porcentagem de
As cadeias dos ácidos nucleicos são sintetizadas a partir de nucleotídeos trifosfatados - dNTPs (ricos em energia),
por reações de polimerização
(liberando pirofosfato
inorgânico) durante a formação da
LIGAÇÃO
As ligações fosfodiésteres ligam covalentemente os
nucleotídeos e conferem uma polaridade química às
fitas de DNA = extremidades 3’ e 5’
Cada par de bases (purina x pirimidina) apresenta uma largura semelhante, mantendo
os esqueletos fosfato-açúcar com uma mesma
distância ao longo da molécula de DNA.
3,34 nm = corresponde a 10 pares de bases por volta (360°) da dupla hélice
As fendas MAIOR e
MENOR são geradas pela posição de rotação das bases em torno do eixo da
(d) C e T em uma fita; A e G na outra
“targeted by poly(C+T)” Dextrógira Dextrógira Levógira
Estruturas de
dupla-hélice
determinadas
por
cristalografia
de raio X
(a) 10 bases por volta completa
B-DNA = sob condições fisiológicas (Sol. com baixa concentração de sal), maioria do DNA das células; A-DNA = sob altas concentrações de sais ou em estado parcialmente desidratado. Hélice mais curta e larga. Não existe “in vivo”; Z-DNA = polímeros ricos em G:C, com purinas e pirimidinas alternadas na mesma fita, hélice
menos torcida com movimento em zig-zag do esqueleto fosfato-açúcar. Forma encontrada “in vitro”.
1,9 nm 2,3 nm, 1,8 nm
O DNA no núcleo:
• Um cromossomo : uma molécula de DNA
• Genoma: o conjunto de cromossomos de
uma dada espécie
• Genoma Humano: 46 cromossomos
• 22 CROMOSSOMOS AUTOSSÔMICOS (X2) • 2 CROMOSSOMAS SEXUAIS
Composição química dos Cromossomos Eucarióticos
2 H2a : 2H2b 2H3 : 2 H4
Subunidade estrutural básica da cromatina
Cromatina = DNA e Proteínas associadas (Histonas e
Modelo da Dupla Hélice do DNA
alguns postulados...
8 A complementaridade dos 2 filamentos torna o DNA unicamente adequado a ESTOCAR e TRANSMITIR a informação genética
8 Cada fita de DNA contém uma cópia desta informação (codificada pela seqüência de nucleotídeos complementares)
8 Importante para a REPLICAÇÃO DO DNA
8 Os GENES carregam a informação biológica que deve ser
precisamente COPIADA e TRANSMITIDA durante a divisão celular
8 A seqüência linear de nucleotídeos em um gene codifica a ordem de aminoácidos em uma proteína
8 GENOMA = conjunto completo de informações no DNA de um
Demonstração experimental da
Replicação
Semi-Conservativa
(Meselson & Stahl, 1958)
• Após várias gerações de crescimento em meio contendo
Nitrogênio pesado (N15), células de E.coli foram
transferidas para meio contendo o isótopo normal “leve” (N14)
• Periodicamente amostras foram removidas das culturas e analisadas por centrifugação de equilíbrio em gradiente de CsCl2 separação dos duplexes em bandas distintas
A enzima DNA-polimerase sintetiza a nova
fita de DNA na direção 5’ 3’
DNA pol III de E. coli envolvida no processo de
DUPLICAÇÃO DO DNA NA CÉLULA:
• Os genes que regulam o ciclo celular
ativam os elementos que irão iniciar a
REPLICAÇÃO
• Cada
“
REPLICON
”
é ativado uma
Local denominado “origem de replicação”, em
bactérias, leveduras e alguns vírus, é uma seqüência
de nucleotídeos com ~ 300 pb (ricas em A - T)
1 forquilhas replicação 2
1
2
Genoma bacteriano (1 ori ); Genoma humano (~10.000 ori ), o que permite a célula humana replicar seu DNA
Forquilha de Replicação é Assimétrica
Fita Líder ou Leading
strand
Fita Tardia ou Lagging
Primase sintetiza o RNA iniciador
~10
nucleotídeos
Fragmentos de Okazaki: Remoção dos primers de
RNA e ligação dos segmentos de DNA
Papel das diferentes DNA polimerases no
processo de duplicação
Síntese da fita Tardia E. coli = Primase
pol III
Eucariotos: 5 Polimerases (α,β,γ,δ,ε)
γ = replicação nas mitocôndrias
β , ε = reparo do DNA nuclear
Procariotos: Três
Polimerases ( I e II de reparo; pol III)
Proteína dímera da E.coli sliding-clamp junção primer + template
Proteínas acessórias da
Polimerase: aumentam
a sua atividade e
estabilizam a ligação
ao DNA “template”
Sliding-clamp protein
proteína β (E. coli)
PCNA (eucariotos)
e
Brace protein
complexo γ (E. coli)
Forquilha de replicação em
procariotos
A estrutura detalhada ainda não é totalmente conhecida em eucariotos
Forquilha de replicação dos eucariotos
(RFA)
À medida que as fitas de DNA se desenrolam, o DNA a frente da forquilha é forçado a enroscar, eventualmente
bloqueando a replicação
Fidelidade da Replicação
Se a polimerase não pudesse corrigir erros haveria a inserção de 1 base errada a cada 104 nucleotídeos incorporados.
Atividade proof-reading
das enzimas pol I e III de
E. coli;
pol
δ
e
ε
de
eucariotos
(exonuclease 3’ ->5’):
Reduz a taxa de erro para
1 base errada a cada 10
9.
Sistema de reparo reduz
a taxa de erro para 1 base
Seqüências repetidas em tandem
Telômeros e Telomerases
Mecanismos especiais são necessários para replicar as
seqüências terminais dos cromossomos.
Telomerase é uma transcriptase reversa: uma classe de DNA polimerase que sintetiza DNA a partir de um “template” de RNA.
A telomerase carrega seu próprio “template” de RNA, que é
