glutationa peroxidase glutationa oxidase glutationa redutase

HUBER, Paula C.; ALMEIDA, Wanda P. and FATIMA, Ângelo de. Glutationa e enzimas relacionadas: papel

Glutationa reduzida (GSH) é um dos principais antioxidantes do meio intracelular e está

implicada na prevenção de inúmeras doenças promovidas pelo excesso de radicais livres ou

espécies reativas oxigênio (câncer; aterosclerose, artropatias, diabetes e envelhecimento).

glutationa oxidase

glutationa redutase glutationa peroxidase

GSH apresentar elevada capacidade de doar e

-

_{(forte redutor), o que é evidenciado por seu elevado potencial redox}

negativo GSH/GSSH (E’0 = -0.33 V). Para seu efeito antioxidante é necessário sua oxidação à glutationa dissulfeto

(GSSG) via GO e GSH-Px

 GSH é abundante no interior das células (atingindo concentrações na ordem dos mM)

 O fígado é o órgão mais envolvido na destoxicação de xenobióticos e também é o local de maior

reserva de GSH (exportando GSH para outros órgãos).

 glutationa atinge a sua maior concentração intracelular nas células parenquimatosas (cerca de 10 mM)

do fígado saudável

 Os hepatócitos são as células mais especializadas na síntese de GSH a partir dos seus percursores, na

reciclagem de GSH a partir de GSSG

 A eliminação do conjugados de S-glutationa a partir da célula é um processo dependente de ATP

mediado por glicoproteínas membranares pertencentes à família MRP (mutidrug-resistance protein).

Logo, as proteínas da família MRP são essenciais no transporte de conjugados de S-glutationa para o

espaço extracelular

 A razão GSH/GSSG é normalmente utilizada para estimar o estado redox dos sistemas biológicos

 Em situações normais a GSSG representa apenas uma pequena fracção da glutationa total (<10%)

GSH synthesis. Synthesis of GSH occurs via a two-step ATP-requiring enzymatic

process. The first step is catalyzed by glutamate-cysteine ligase (GCL), which is

composed of catalytic and modifier subunits (GCLC and GCLM). This step conjugates

cysteine with glutamate, generating γ-glutamylcysteine. The second step is catalyzed

by GSH synthase, which adds glycine to glutamylcysteine to form

γ-glutamylcysteinylglycine or GSH. GSH exerts a negative feedback inhibition on GCL.

Shelly C. Lu, Glutathione synthesis Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects.

Volume 1830, Issue 5, May 2013, Pages 3143–3153

Lima, LM©

??

Estrógenos 

(androstenodiona) via adrenal e (androstenodiona e

testosterona) via tecidos periféricos  Pós-menopausa

Biossíntese de estrogênio por ação de Aromatases (Membro da família de enzimas monooxigenase CYP450, a qual converte andrógeno C-19 em estrogênio C-18 através de três hidroxilações sequenciais)

http://www.us.femara.com/info/page/about-assistance

Before therapy: Androgen (a hormone found in both men and women) is produced by fat, muscle, and adrenal glands. Aromatase enzyme is needed to convert androgen into estrogen, which results in tumor growth.

With therapy: FEMARA (Novartis) binds to the aromatase enzyme and blocks it from converting androgen to estrogen, thereby reducing growth of the tumor.

N N N

NC CN

CN CH₃ NC CH₃ CH₃ H₃C N N N

Anastrozole (Arimidex®)

N N N NC CN

Letrozole (Femara®)

Brodie, A. Trends in Endocrinology & Metabolism (2002) 13: 61-65

O CH₃ CH3 O H H H CH2

Exemestane (Aromasin®)

OH O CH3 CH₃ O H H H

Formestane (Formastat®)

N NH2 HO H s e rotonina M e diador Inflamatório Aume nto da Pe rme abilidade Vas cular

M e rck 1963

Scre e ning ca. 350 compos tos indólicos N H3CO OH O CH₃ O Cl Indometacina (Indocid®, 1963) N HO H O OH CH3 me tabólito ativo

Fase I

Hidrólise O-demetilação

áci do i ndol ilacé tico N HO H O OH

MAO

Similaridade estrutural Psicose, cefaléia frontal, depressão, Vertigem, alucinações, etc. “efeito orto” N OH O CH₃ H₃C O N OH O CH₃ O H₃C Cl Proteção metabólica

Proscrito 1983



Reações

anafiláticas

F CH3 OH O S H C sulindaco serotonina

N N CF₃ F S H3C O O protótipo Modificações Moleculares

inativo

IC₅₀> 100 mM (COX-1) IC₅₀= 0,1 mM (COX-2) Modificações Moleculares R CF₃ Cl F CH₃ OCH₃ SCH₃ NHCH₂ CO₂H 3-CH₃ 2-CH₃ IC₅₀ (COX-1) <100mM 17 mM 25 mM 15 mM 2,58 mM 1,19 mM 13,8 mM >250mM 33,9 mM 18,1 mM IC₅₀ (COX-2) 8,23 mM 0,01 mM 0,041 mM 0,04mM 0,008 mM 0,009 mM 0,016 mM 11,2mM 0,069mM 0,11mM R₁ SO₂NH₂ SO₂NH₂ SO₂NH₂ SO₂NH₂ SO₂NH₂ SO₂NH₂ SO₂NH₂ SO₂NH₂ SO₂NH₂ SO₂NH₂

Penning, TD et al. (1997) J. Med. Chem. 40: 1347-1365

N N CF3 S H3C O O F SC-58125 N N CF₃ R1 R e sque le to básico

t

_1/2

= 117h

N N CF₃ Cl S H₂N O O N N CF3 H3C S H2N O O ce le coxib COX-2 se le tivo IS=460 t_1/2 = 8 h

alpidem 2.250 N N Cl O N CH3 H3C Cl CYP1A2 GTS/GSH N N Cl O N CH3 H3C Cl SG 2.251 N N Cl Cl O HO 2.252 N N H3C O N CH3 H3C CH3 zolpidem 2.37 CYP3A4 ADH N N HO2C O N CH3 H3C CO2H 2.253 homólogo inferior

ansiolítico (agonista de receptores de serotonina); ↑efeito 1ª passagem; ↓ biodisponibilidade oral

N N N N N O O buspirona N N N N N O O buspirona-análogo F IC50 (5HT1A) = 0,025 t1/2 = 4,6 h IC50 (5HT1A) = 0,063 t1/2 = 52,3 h

ansiolíticos (antagonista receptores de taquicinina NK2) O N Cl Cl N CH3 OH Cl Cl N OH pA2 (NK2)= 9.5 t1/2 = < 10 min (HLM) N O pA2 (NK2)= 9.3 t1/2 = ~30 min (HLM) N-desalquilação Cl Cl N N O pA2 (NK2)= 8.5 t1/2 = <10 (HLM) LogD = 2.2 N N S CH3 O _O Cl N N O pA2 (NK2)= 8.5 t1/2 = <120 (HLM) LogD = 1,7 N N S NH2 O _O ↓ lipossolubilidade

Pró-Fármaco

:

Substância desprovida de atividade farmacológica intrínseca, termo

cunhado por Albert em 1958

.

Design Ad hoc x Post hoc

PRO-FÁRMACO

5% do total de

medicamentos disponíveis

são pro-fármacos

Posteriormente modificado para:

1) substância com nenhuma ou pouca atividade farmacológica, sofrendo biotransformação a metabólitos ativos

terapêuticamente.

2)

Derivado de um fármaco conhecido, de propriedades físico-químicas melhoradas, aumentando a

biodisponibilidade do fármaco original, e que mediante processo enzimático ou químico é transformado no

fármaco que lhe deu origem, antes de atingir o seu local de ação ou ainda no próprio local de ação (Korolkovas &

Burckhalter, 1988).

O processo de obtenção do pró-fármaco dá-se o nome de latenciação de fármacos

. Consiste

essencialmente em converter, mediante modificação química, um composto biologicamente ativo em forma de

transporte inativa que, após ataque enzimático ou químico, liberará o fármaco ativo.

cloranfenicol

amargo

Post- hoc

insípido

lipases pancreáticas (duodeno)

O

₂

N

OH

N

H

O

Cl

Cl

OH

_O

2

N

OH

N

H

O

Cl

Cl

OH

OH

CYP

₄₅₀

O

₂

N

OH

N

H

O

Cl

OH

O

-cloridrina

O

₂

N

OH

OPalmitato

N

H

O

Cl

Cl

Farmicetina® (Pfizer)

HO

HO

NH

₂

CO

₂

H

HO

HO

NH

₂ L-Levodopa/carbidopa (Doença de Parkinson)

Post- hoc

MAO/COMT dopamina

spontaneous

Lima, LM© N N N N H₂N HN HO 1' 2' 3' 5' 4' abacavir [t₁/₂ = 3h] adenosina fosfotransferase 4' 5' 3' 2' 1' N N N N H₂N HN O P O HO HO Monophosphato de abacavir desaminase citossólica O P O HO HO HN N N N H₂N O 1' 2' 3' 5' 4' Monophosphato de Carbovir [metabólito ativo t1/2 = 15~20h] quinases celulares Triphosphato de Carbovir 4' 5' 3' 2' 1' O P O O HO P O OH O P HO O OH HN N N N H2N O abacavir [t1/2 = 3h] 4' 5' 3' 2' N N N N H2N HN HO Fase 1

(Alc. desidrogenase= ADH hepática) Fase 2 (UDPGA) N N N N H2N HN O O HO2C HO OH OH 5' N N N N H2N HN HO O N N N N H₂N HN H O reações alérgicas e/ou tóxicas

adenine Adenine deaminase (ADE) hypoxanthine

D= Asp E= Glu

N N N N NH₂ O P CH3 O O O O O O O O O 1' 2' 3' 5' 4' Tenofovir disoproxilfumarato 5' N N N N NH₂ O P CH3 HO O HO N N N N NH₂ O P CH3 HO O O P O OH OH 5' adenilato quinase Tenofovir Tenofovir difosfato nucleosideo difosfoquinase N N N N NH₂ O P CH3 HO O O P O OH P O HO HO Esterase CYP(?)

OH H N OH HO Terbutalina OH H N O O O N O N _{Bambuterol (Pró-f'ármaco)}

Otimização de

Propriedades

farmacocinéticas

Hidrólise via colinesterases antiasmático antviral aumenta 87-94% a biod. oral da ampicilina Biodisponibilidade oral: 36-44% O NH2 N H N S O O OH ampicilina (uso oral) N H N S O O O O O N H N S O O O O O pivampicilina talampicilina

sulfenamida

ATPase inativada

CH3 CO₂H F S H₃C O R-sulindaco CH₃ CO2H F S H₃C O S-sulindaco CH₃ CO2H F S H₃C metabólito ativo (inibidor da COX, AINE) [H] CH₃ CO₂H F S H₃C O O metabólito inativo FMO [O] acumulado na urina e plasma metabolismo Estereoespecífico enantiômero S 70% da dose administrada CYP450

Hamman, M.A. et al. Biochem. Pharmacol. 2000, 60, 7

In vitro

:

Hepatócitos isolados

(humanos ou de espécies animais)

Microssoma hepático

(humanos ou de espécies animais)

CYP450 recombinantes

In vivo

:

Ratos, coelhos, primatas

e humanos (plasma e urina)

Animais transgênicos

In sillico

QSAR, docking,

Programas de predição

metabólica

(e.g. Pallas, Metasite e Meteor)

LC-MC; LC-MS-MS; LC-NMR; NMR-MS

HPLC-MS; HPLC-NMR

In vitro techniques for investigating drug metabolism

Liver

major site for the biotransformation

of xenobiotics

enzymes

Models of drug metabolism

Liver preparations

subcellular fractions

purified enzymes

S9

microsomes

cytosolic and

membrane-bound

enzymes

9,000 x g S9 + 100,000 x g

membrane-bound

enzymes

CYP450

storage at -80



C

Hepatocytes

Liver

enzymatic dissociation using collagenase perfusion

CYP450

Cellular system

contain many enzymes and cofactors not present in

short-term (4h) Undergo de-differentiation tissue homogenates differential centrifugation

Advantages:

Easy preparation and storage; contains cofactors; contains soluble and M bound

enzymes.

Disadvantages:

Crude preparation; High protein conc.

Predição Metabólica in Silico

• QSAR

• “Docking”

• Reatividade Química

• SoM

• Banco de dados de

transfor. metabólicas

 Qual(is) é (são) a posição mais provável (is) do metabolismo?

 Qual a transformação metabólica mais provável?

O O H H H H H H O O H H H H H H

Modelagem por homologia (estrutura cristalográfica do CYP2C5)]

 CYP1A1 e CYP2A6 O O H H H H H H O O H H H H H H CYP1A1 CYP2A6 CYP1A2 CYP2A6

In silico

In silico

Predição Metabólica in Silico

MetaSite

Predição Metabólica in Silico

Quais sítios?

Que isoformas?

MetaSite

Predição Metabólica in Silico

MetaSite3 calculations in aprindine substrate. The reactions predicted for aprindine were: N-dealkylation

Predição Metabólica in Silico

Long, A. Drug Discovery Today: Technologies 2013, 10, e-147 Partial SMARTCyp analysis of tramadol, acenocoumarol and MK445526 using the standard (CYP3A4), 2D6 and 2C9 models.

Green bars/circles represent sites of metabolism corresponding to confirmed experimental metabolites and red bars/circles sites of metabolism corresponding to unconfirmed experimental metabolites. The y-axis in each bar-chart represents the relative SMARTCyp scores for each isoform model applied to each compound. Scores are relative and specific to the model/compound combination and cannot be inter-compared.

Fígado

Preparação do fígado

1. Centrifugação a 900 g, 30 min, 4 °C 2. Centrifugação a 10.000 g, 1 h, 4 °C

3. (remoção restos celulares e fração nuclear)

Fração citosólica

Fração microssomal

Quantificação

de proteínas

Quantificação

de proteínas

Conservação a -80° C

Fração S9*

Ultracentrifugação 100.000 g, 1 h, 4 °C (sedimentar a fração microssomal)

Enzimas de

Fase I e II

Enzimas de Fase I:

CYP450, FMO e

Carboxilesterase

Glicuronil-transferase

In vitro

Fração microssomal + amostra

(Concentração final = 100 μM)

Incubação a 37 °C por

0, 60 e 120 minutos

Centrifugação

(13000 rpm, 15 min, t.a.)

Adição de 500 μL de

metanol gelado e 500 µL

de acetonitrila gelada

Análise do sobrenadante

por CLAE**

Cofatores:

• MgCl

₂

• NADPH*

• Glicose 6-fosfato

• Glicose 6-fosfato-deidrogenase

Controles:

• Fração microssomal na presença de

cofatores (com e sem amostra);

•

Fração microssomal na ausência de

cofatores (com e sem amostra);

•

Sem fração microssomal na presença de

cofatores (com e sem amostra).

Com cofatores

 Citocromo P450 (CYP450)

 Flavina-mooxigenase (FMO)

Sem cofatores

 Carboxilesterase (CES)

Oliveira, R. O. (2010) Dissertação de Mestrado, IQ-UFRJ.

Cromatogramas obtidos por CLAE-PDA para LASSBio-998 em fração microssomal hepática de ratos utilizando bifenil-4-carboxilato de metila (20 µM) como padrão interno: LASSBio-998 no tempo 0 (A) e incubado por 120 minutos (B) com fração microssomal na presença de cofatores; LASSBio-998 no tempo 0 (C) e incubado por 120 minutos (D) com fração microssomal na ausência de cofatores. A concentração de incubação da amostra com a fração microssomal foi de 100 µM, diluídas para 20 µM para leitura por CLAE-PDA [Shimadzu – LC20AD; coluna Kromasil 100-5C18 (4,6 mm x 250 mm); detector SPD-M20A (Diode Array) em UV 254 nm; fluxo: 1 mL/minuto; fase móvel: 70% de acetonitrila, 30% de água e 0,1% de TFA].

0

30

60

90

120

0

5

10

15

20

25

Sem Cofatores

Com Cofatotes

Tempo (min)

L

A

S

S

B

io

-9

9

8

(

m

M)

0

30

60

90

120

0

5

10

15

20

25

Sem Cofatores

Com Cofatotes

Tempo (min)

L

A

S

S

B

io

-9

9

8

(

m

M)

_t

_1/2

_{= 60,6 minutos}

Produtos t_1/2 sem cofatores (minutos) t_1/2 com cofatores (minutos) LASSBio-998 66 75,3 LASSBio-1494 407,6 533,1 LASSBio-1495 1155 138,6 LASSBio-1496 630 74,5 LASSBio-1497 59,7 32,7

In vitro

In vitro

Oliveira, R. O. (2010) Dissertação de Mestrado, IQ-UFRJ. N O O NH O NH O O CH₃

LASSBio-998

C₂₀H₂₃N₃O₅ PM = 385.41 N O OH NH O NH O O C₁₈H₁₉N₃O₅ PM = 357.36 N O O NH2 O O CH₃ C₁₃H₁₂N₂O₄ PM = 260.24 N O O NH O NH HO HO CH₃ hidrolases hidrolases CYP450 O-desalquilação hidrolases C₁₉H₂₃N₃O₅ PM = 373.40 N O OH NH₂ O O C₁₁H₈N₂O₄ PM =232.19 0 30 60 90 120 0 5 10 15 20 25 Sem Cofatores Com Cofatotes Tempo (min)

L

A

S

S

B

io

-9

9

8

(

m

M)

0 30 60 90 120 0 5 10 15 20 25 Sem Cofatores Com Cofatotes Tempo (min) L A S S B io -9 9 8 ( m M)

 Carboxilesterase (CES)

N O OH NH O NH O O C₁₈H₁₉N₃O₅ PM = 357.36

C

YP

1A2

C

YP

2C

9

C

YP

2D6

C

YP

3A4

C

YP

1A2

C

YP

2C

9

CYP2D6

C

YP

3

A4

In vitro

In vitro

O metabolismo do sildenafil na presença de enzimas CYP recombinantes

6x

MetaPrint2D

SMARTCyp

MetaSite

ACD

O OH N H CH₃ CH₃ propranolol O OH N H CH₃ CH₃ O H₃C metoprolol O OH N H CH₃ CH₃ O betaxolol O OH N H CH₃ CH₃ O O H₃C esmolol

Fármaco Biodisponibilidade oral (%) Tempo de meia vida (h)

Propranolol ca. 25 3-5