Biologia Molecular e Genética das Síndromes Mielodisplásicas

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Biologia Molecular e Genética das Síndromes Mielodisplásicas

Workshop de Biologia Molecular Hospital Israelita Albert einstein

Fabíola Traina, MD PhD

Hemocentro Unicamp

Hospital Israelita Albert einstein 20 junho 2012

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• Mecanismos envolvidos na fisiopatologia das SMD

• Métodos utilizados para a identificação de alterações moleculares

Objetivos

• Relevância das alterações moleculares recentemente descritas em SMD

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• Grupo heterogêneo de doença clonal hematopoética caracterizada por hematopoese ineficaz e risco de evolução para LMA

• Presença de atipias na medula óssea e citopenias no

Síndrome Mielodisplásica (SMD)

• Presença de atipias na medula óssea e citopenias no sangue periférico

• % blastos < 20%

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MDS

FAB WHO IPSS

RA RCUD Low

RARS RARS Int-1

RAEB RCMD Int-2

RAEB-t RAEB-1 High

MDS/MPN WHO CMML Atypical CML JMML MDS/MPN-U Classificação FAB Morfologia % blastos % sideroblastos em anel

Monócitos no sangue periférico Classificação WHO Morfologia e citogenética

Síndrome Mielodisplásica (SMD)

CMML RAEB-2 MDS-U Del(5q) Morfologia e citogenética

Score prognóstico IPSS % blastos

Número de citopenias Citogenética

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SMD alto risco LMA AREB-1 AREB ≥_{20% blastos}

Síndrome Mielodisplásica

Progressão Normal SMD baixo risco

Nolte et al. Ann Hematol 2008 87: 777-795

AR ARSA RCMD RCMD-RS del5q AR ARSA AREB-1 AREB-2 AREB AREB-t Baixo Int-1 Int-2 Alto

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SMD alto risco LMA

Síndrome Mielodisplásica

Redução da apoptose Alteração da diferenciação Químicos Radiação Idade Alterações Iniciais Ciclo celular Transcrição Alterações adicionais Supressores de tumor Oncogenes Hipermetilação Progressão Normal

SMD baixo risco Alteração da diferenciação

Aumento da proliferação Aumento da apoptose Displasias Citopenia Displasias Citopenias Expansão de blastos Idade

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Inibição da hematopoiese

Heterogeneidade de alterações moleculares em SMD

Escape ao sistema Aumento da proliferação Redução da diferenciação Aumento da capacidade de auto renovação SMD Resposta ao tratamento História Natural da Doença Manifestações Clinicas Morfologia

Grupo heterogêneo de doenças

sistema imune Desregulação da apoptose diferenciação Instabilidade genômica SMD

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Inibição da hematopoiese

Escape ao sistema Aumento da proliferação Redução da diferenciação Aumento da capacidade de auto renovação A lt e ra ç õ e s n o e s tr o m a d a m e d u a ó s s e a A lt e ra ç õ e s m o le c u la re s n a c é lu la t ro n c o SMD Resposta ao tratamento História Natural da Doença Manifestações Clinicas Morfologia

sistema imune Desregulação da apoptose diferenciação Instabilidade genômica A lt e ra ç õ e s n o e s tr o m a d a m e d u a ó s s e a A lt e ra ç õ e s m o le c u la re s n a c é lu la t ro n c o SMD

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• Melhorar o diagnóstico e a classificação da doença • Melhor entender a fisiopatologia da doença

• Identificar alvos terapêuticos

Importância da identificação de alterações moleculares em Síndromes Mielodisplásicas

• Identificar marcadores preditores de sobrevida

• Identificar marcadores preditores de resposta ao tratamento

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Mecanismos moleculares que resultam em alteração da função gênica

Alterações Genéticas

Alterações Epigenéticas

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Translocação

Alterações genéticas Trissomias

Normal

Mutação somática

Deleção

Perda de heterozigose Loss of Heterozigozity (LOH)

Uniparental Dissomy UPD

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Translocação

Alterações genéticas Trissomias

Normal

Mutação somática

Deleção

Perda de heterozigose Loss of Heterozigozity (LOH)

Uniparental Dissomy UPD

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Metilação de promotores Desacetilação de histonas Alterações epigenéticas

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del 5q -7 +8 del 20q

Método Resolução Detecção

UPD Células divisão Detecção de clones Novas lesões Translocação

Citogenética Baixo Não Sim Sim Sim Sim

FISH Baixo Não Não Sim Não Sim

Detecção de alterações moleculares em Síndrome Mielodisplásicas

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Alterações citogenéticas em

Síndrome Mielodisplásicas (n=2124)

Haase D et al. Blood 2007;110:4385-4395 Traina F Workshop Biol. Mol. HIAE 2012

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Impacto do risco citogenético na sobrevida de pacientes com Síndromes Mielodisplásicas

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Mapeamento da região 5q comumente deletada em SMD

Mohamedali A et al. BJH 2008, 144: 157-168 Traina F Workshop Biol. Mol. HIAE 2012

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Identificação do RPS14 como o gene responsável pela Síndrome

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Eventos moleculares envolvidos na patogênese da Síndrome

5q-Boultwood J et al. Blood 2010;116:5803-5811 Traina F Workshop Biol. Mol. HIAE 2012

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Lenalidomida para SMD com del5q

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Lenalidomida para SMD com del5q

Degrada MDM2 Estabiliza p53

Parada ciclo celular Apoptose

Progenitores eritroides

Haploinsuficiência RPS14

Rami S. Komrokji and Alan List. Semin Oncol 2011; 38:648-657

Ativa MDM2 Degrada p53

Proliferação

Progenitores eritroides

Lenalidomida PP2A

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Método Resolução Detecção UPD Células divisão Detecção de clones Novas lesões Translocação

Citogenética Baixo Não Sim Sim Sim Sim

FISH Baixo Não Não Sim Não Sim

CGH-A Alto Não Não Não Sim Não

Detecção de alterações moleculares em Síndrome Mielodisplásicas

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Comparative Genomic Hybridization Array CGH-A

Maciejewski et al. BJH 2009; 146: 479–488 Traina F Workshop Biol. Mol. HIAE 2012

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Single Nucleotide Hybridization Array SNP-A

(25)

Single Nucleotide Hybridization Array SNP-A

Sato-Ptsubo et al., Seminars in Onclology 2012; 39: 13-23

Deleção Normal UPD

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Distribuição de alterações cromossômicas Detectadas por SNP-A em pacientes com SMD

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Acquired Uniparental Dissomy (UPD) Marcador molecular de mutação somática

Dunbar A J et al. Cancer Res 2008;68:10349-10357

Identificação de mutação em CBL (11q23.3)

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JAK2 (9p)

Acquired Uniparental Dissomy (UPD) Marcador molecular de mutação somática

Dunbar A J et al. Cancer Res 2008;68:10349-10357

FLT3 (13)

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Second generation Sequencing

Whole genome sequencing/Exome sequencing

Meyerson M et al. Nature Reviews 2010; 11: 685-696 Traina F Workshop Biol. Mol. HIAE 2012

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Histórico da descoberta de mutações em doenças mieloides 1980 1990 2000 2010 2012 RUNX1 1999 RAS 1987 p53 1993 JAK2 2005 CBL MPL 2008 TET2 ASXL1 2009 EZH2 IDH1/2 DNMT3A UTX 2010 SF3B1 U2AF1 SRSF2 2011

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Histórico da descoberta de mutações em doenças mieloides 1980 1990 2000 2010 2012 RUNX1 1999 RAS 1987 p53 1993 JAK2 2005 CBL MPL 2008 TET2 ASXL1 2009 EZH2 IDH1/2 DNMT3A UTX 2010 SF3B1 U2AF1 SRSF2 2011

Bejar R et al. NEJM 2011;364:2496-2506 Traina F Workshop Biol. Mol. HIAE 2012

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Metilação do DNA

•TET2 •IDH1/2 •DNMT3A

Modificação das Histonas

•ASXL1 •EZH2 •UTX

Fatores de Transcrição

•RUNX1

SMD Transdução de Sinal •RAS •JAK2 •CBL •RUNX1 •TP53 Resposta ao tratamento História Natural da Doença Manifestações Clinicas Morfologia

Spliceossome

•SF3B1 •U2AF1 •SRSF2

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Função de cada gene

Alterações moleculares na célula tronco

Incidência das mutações em SMD Significado biológico de cada mutação

Impacto na sobrevida SMD Resposta ao tratamento História Natural da Doença Manifestações Clinicas Morfologia

53rd_{ASH Annual Meeting Abstract No. 457 Visconte V et al.}

Impacto terapêutico

?

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*

letal

Mutação em Fatores de Transcrição

Runt-related transcription factor 1 - RUNX1 (AML1, CBFA2)

• Subunit of the core-binding factor (CBF) transcriptional factor complex • Liga-se ao DNA, onde atua como fator de transcrição

• Regula a expressão de genes envolvidos na hematopoese

Watanabe-Okochi N et al. Blood 2008;111:4297-4308

RUNX1

*

Knock out RUNX1

*

TMO RUNX1 mutado Fenótipo SMD

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Mutação em Fatores de Transcrição RUNX1

Sobrevida Global _{Transformação para LMA}

Gene Cromossomo % mutação

SMD % mutação SMD/NMP Efeito na função do gene Impacto prognóstico

RUNX1 21q22.12 4-14 9-29 Inibe função Negativo

Chen C et al. BJH 2007;139, 405–414

Christiansen D H et al. Blood 2004;104:1474-1481 Traina F Workshop Biol. Mol. HIAE 2012

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Mutação em Fatores de Transcrição TP53

Lesão no DNA

TP53 17p13.1 10-18 1 Inibe função Negativo

Christiansen D H et al. Blood 2004;104:1474-1481 Alberts et al., Biologia Molecular da Célula

p53

Parada do ciclo celular

Senescência _Apoptose

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Genes envolvidos em transdução de sinal C-cbl E3 ubiquitin ligase (CBL)

• Enzima envolvida na degradação de tirosina-quinases

• Inativação de CBL resulta no acúmulo de receptores tirosina-quinase

CBL 11q23.3 1 17-22 Inibe função Indefinido SMD

Negativo LMMC CBL

*

Acúmulo de células progenitoras Knock out Esplenomegalia Hematopoese anormal CBL

*

Mutant cells ↑ formação tumor Ativação PI3K/AKT

Sanada M et al. Nature. 2009;460:904-908

↑ formação colônia

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• IDH1/IDH2 wild-type produz α_KG

• IDH1/IDH2 mutado produz 2HG (oncometabólito)

Genes envolvidos em metilação DNA Isocitrate Dehydrogenase - IDH1, IDH2

SMD % mutação SMD/NMP Efeito na função do gene Impacto prognóstico IDH1/ IDH2 2q33.3/ 15q26.1 4-11 5-9 Ganho de função Controverso

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Genes envolvidos em metilação DNA IDH1, IDH2, TET2

Jankowska AM et al. Semin Oncol 2012; 39:80-96 Traina F Workshop Biol. Mol. HIAE 2012

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Cromossomo % mutação SMD % mutação SMD/NMP Efeito na função do gene Impacto prognóstico

4q24 11-26 37-44 Inibe função Controverso

Genes envolvidos em metilação DNA Ten Eleven Translocation (TET2)

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TET2

*

Hepatomegalia Esplenomegalia Bloqueio na diferenciação mieloide e eritroide Knock out

(42)

(43)

Genes envolvidos em metilação DNA TET2, IDH1, IDH2

(44)

DNMT3A 2p23.3 8 10 ? Inibe função Negativo Genes envolvidos em metilação DNA

DNA cytosine methyltransferase 3 alpha isoform (DNMT3A)

DNMT3A

*

letal

Knock out

Catalisa a metilação de grupos CpG

Knock out

Mutação DNMT3A

Redução na atividade de metilação do DNA (mutantes Arg882) (E coli) Impacto na metilação de genes controverso

HSC DNMT3A-

*

↑ auto-renovação

↓ diferenciação Inibição HSC

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ASXL1 20q11.21 11-15 33-41 Inibe função Controverso Genes envolvidos na modificação das histonas

Additional sex combs like 1 (ASXL1)

Membro da família Enhancer of Trithorax and Polycomb gene

Interage com LSD1 e inibe transcrição através da modificação de H3K4

ASXL1

*

↓ diferenciação progenitores linfoides Knock out ↓ diferenciação progenitores mieloides Ausência de SMD Ausência de LMA

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7q36.1 2-6 3-12 Inibe função Controverso

Negativo SMD/NMP

Membro da famíla de Polycomb trithorax complex Atua na metilação de histona H3

Genes envolvidos na modificação das histonas Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2)

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Genes envolvidos em splicing de RNA SF3B1, U2AF1, SRSF2

U2 snRNP

U2AF1: U2 small nuclear RNA auxillary factor 1

U2AF1 liga-se 3’AG splice site intron

small nuclear ribonucleoprotein particle

U2AF1, U2AF2

SF3B1: splicing factor 3b, subunit 1

Componente do U2 snRNP

SF3B1 SF3A1

SRSF2: splicing factor, arginine/serine-rich 2 SR

SRSF2

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Cromossomo % mutação SMD % mutação SMD/NMP Efeito na função do gene Impacto prognóstico SF3B1 2q33.1 15-20 % SMD 65-85% SMD-SA

31-55 Inibe função Positivo

U2AF1 21q22.3 9 8 ? ? Negativo

SRSF2 17q25.2 6-12 28 ? Controverso

Genes envolvidos em splicing de RNA SF3B1, U2AF1, SRSF2

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↑ splicing

Genes envolvidos em splicing de RNA

U2 small nuclear RNA auxillary factor 1 (U2AF1)

↑ proporção de transcritos com skipped exon 293T cells

U2AF1 mutado

Graubert TA et al. Nat Genet 2012; 44: 53-58

Mutação U2AF1

Ganho de função

↓ proliferação celular HeLa cells

U2AF1 mutado Mutação U2AF1

Perda de função

↑ apoptose

U2AF1

*

↓ reconstituição hematopoese

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Epigenética e SMD

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Epigenética e SMD

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Mecanismos moleculares que resultam em alteração da função gência

Mutação em genes envolvidos com metilação do DNA

TET2/DNMT3AIDH1/IDH2

Alterações na função e expressão gênica

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Impacto da mutação TET2 na resposta ao tratamento com azacitidina em SMD

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Impacto da mutação TET2 na resposta ao tratamento com azacitidina em SMD

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Alterações citogenéticas foram as primeiras evidências da

participação das alterações moleculares em SMD, auxiliam na classificação, estratificação de risco e decisão terapêutica

A elucidação da participação dos mecanismos epigenéticos em SMD permitiu o uso de drogas hipometilantes, que induzem resposta citogenética e melhoram a sobrevida

Conclusões

A descoberta recente de diversas mutações somáticas em SMD tem auxiliado no entendimento da fisiopatologia e provavelmente

resultará em um revisão dos critérios diagnósticos, prognósticos e terapêuticos

O impacto da maioria das novas mutações na fisiopatologia, sobrevida e resposta terapêutica dos pacientes com SMD ainda

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Obrigada

fabiolat@unicamp.br fabiolat@unicamp.br