第５１卷 第２期
厦门大学学报（自然科学版）
Ｖｏｌ．５１ Ｎｏ．２ ２０１２年３月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） Ｍａｒ．２０１２·研究简报·
Ｓｍｕ
ｒ
ｆ
２ 单克隆抗体的制备与鉴定
丁宇婷，林志妙，李 振，李晓彤
＊ （厦门大学 生命科学学院，杂交瘤抗体技术中心，福建 厦门 ３６１００５） 收稿日期：２０１１－０７－２０ 基金项目：福建省自然科学基 金 项 目（２００９Ｊ０１１９７）；厦 门 市 科 技 计 划创新项目（３５０２Ｚ２０１０００８７） ＊通信作者：ｘｔｌｉ＠ｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 摘要：Ｓｍａｄ泛素调节因子家族的两个 Ｅ３泛素连接酶成员Ｓｍｕｒｆ１ 和Ｓｍｕｒｆ２（Ｓｍａｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ １ａｎｄ ２） 具有至 少 ８０％ 的 同 源 性．为 了 更 好 地 研 究 它 们 的 功 能，需 要 获 得 一 个 能 区 分 Ｓｍｕｒｆ１ 和 Ｓｍｕｒｆ２ 的 单 克 隆 抗 体 ．选 取 Ｓｍｕｒｆ２与 Ｓｍｕｒｆ１蛋白序列 中 仅 有 的 非 同 源 区 域 序 列 作 为 抗 原 免 疫 Ｂａｌ ｂ／Ｃ 小 鼠，成 功 制 备 若 干 株 能 稳 定 分 泌 抗 Ｓｍｕｒｆ２抗体的杂交瘤细胞株 ．对所获得的单克隆抗体的 效 价 和 特 异 性 等 进 行 一 系 列 检 测 ，结 果 表 明 该 抗 体 能 特 异 性 地 识别过表达及细胞内源 Ｓｍｕｒｆ２蛋白．此外该抗体能被应用于 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和免疫荧光实验，从而为 深 入 研 究 Ｓｍｕｒｆ２ 的 细胞生物学功能提供了良好的实验基础． 关键词：Ｓｍｕｒｆ１；Ｓｍｕｒｆ２；杂交瘤；单克隆抗体 中图分类号：Ｑ ２９１ 文献标志码：Ａ 文章编号：０４３８－０４７９（２０１２）０２－０２９２－０５ 泛素蛋白水解酶途径对蛋白质翻译后修饰和降解 起了关键作用，其通过特 异 性 的 泛 素 化 修 饰 与 靶 蛋 白 的结合，参与了细胞周期调控、信号传导、细胞代谢、分 化、增殖等各种 生 物 学 过 程［１－３］ ．泛 素 蛋 白 水 解 酶 途 径 由泛素、泛素活化酶（Ｅｌ）、泛素结合酶（Ｅ２）、泛 素－蛋白 连接酶（Ｅ３）、２６Ｓ 蛋 白 酶 体 和 泛 素 解 离 酶 等 组 成［４－５］ ． Ｅ３连接酶是其中最为关键的因子，它可以 对 不 同 的 底 物进行特异性的识别，呈现出蛋白降解的高度选择性， 最终使泛素化的蛋白质被２６Ｓ蛋白酶体所降解［６－７］ ． Ｓｍａｄ泛素调节因子１（Ｓｍａｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ １，Ｓｍｕｒｆ１）和 Ｓｍａｄ 泛 素 调 节 因 子 ２（Ｓｍｕｒｆ２） 都隶属于 Ｅ３连接酶［８］ ．两者具有 ８０％ 的 同 源 性，但 它 们具有不同的底物特异性和生物调控机制，如 Ｓｍｕｒｆ１ 与 Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５ 作 用，Ｓｍｕｒｆ２ 与 Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３ 作 用，通过不同的 调 控 机 制 引 发 这 些 Ｓｍａｄ蛋 白 以 及 与 这些 Ｓｍａｄ 蛋 白 相 互 作 用 的 蛋 白 质 的 泛 素 化 和 降 解［９－１１］，以达到相关功能的调控．因此，得到特异性强、 纯度和 效 价 高 的 抗 Ｓｍｕｒｆ１ 或 Ｓｍｕｒｆ２ 的 单 克 隆 抗 体 显得尤为关键和重要．我们选取 Ｓｍｕｒｆ２与 Ｓｍｕｒｆ１蛋 白序 列 中 仅 有 的 非 同 源 区 域 序 列，即 Ｓｍｕｒｆ２ 蛋 白 的 第１５３～２３３位氨基酸片段（图１），制备重组蛋白作为 抗原免疫 Ｂａｌ ｂ／Ｃ 小 鼠．用 细 胞 融 合 技 术 将 经 抗 原 致 敏且能分泌 Ｓｍｕｒｆ２抗体的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓 瘤细胞 ＳＰ２／０ 融 合，筛 选 融 合 成 功 的 杂 交 瘤 细 胞．经 过反复 的 酶 联 免 疫 吸 附 反 应 （ＥＬＩＳＡ）、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测，得 到 ９ 株 能 稳 定 分 泌 抗 Ｓｍｕｒｆ２ 的 单 克 隆 抗 体 的杂交瘤细 胞 株；将 其 注 射 小 鼠 腹 腔，收 集 腹 水 并 纯 化，最终得到特异性强、效价高的抗 Ｓｍｕｒｆ２的单克隆 抗体，并对该抗体进行一系列的鉴定及初步应用．１ 材料与方法
１．１ 材 料 １．１．１ 主要试剂 牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、ＨＡＴ 培 养 基 ［含 有 次 黄 嘌 呤（Ｈ）、氨基蝶呤（Ａ）、胸腺嘧啶核苷（Ｔ）的完全培养 基］、ＨＴ 培 养 基 ［含 有 次 黄 嘌 呤 （Ｈ）、胸 腺 嘧 啶 核 苷 （Ｔ）的完全培养基］、福氏 完 全 佐 剂、福 氏 不 完 全 佐 剂、 聚乙二醇（ＰＥＧ）、抗 体 亚 类 鉴 定 试 剂 盒 均 为 Ｓｉｇｍａ产 品；ＰＲＭＩ１６４０ 培 养 基、ＤＭＥＭ 培 养 基、胎 牛 血 清 （ＦＢＳ）为 Ｇｉｂｃｏ产品；其他化学 试 剂 均 为 分 析 纯．辣 根 过氧化物酶（ＨＲＰ）标记山羊抗小鼠ＩｇＧ、四甲基异氰 酸罗达明（ＴＲＩＴＣ）标记山羊抗小鼠ＩｇＧ、增强型化学 发光（ＥＣＬ）显色液、聚乙烯亚胺（ＰＥＩ）、抗体 Ｆｌａｇ均为 中杉金桥产品；脱脂奶粉为完达山乳业有限公司产品． １．１．２ 仪器与耗材 酶标 仪 （Ｏｍｅｇａ，４２５－０６５５）；ＣＯ２ 培 养 箱 （Ｔｈｅｒ－ ｍｏ，３１１１）；去 污 剂 十 二 烷 基 硫 酸 钠－聚 丙 烯 酰 氨 凝 胶 电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）电 泳 仪 、转 膜 仪 （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）；荧 光 倒图１ Ｓｍｕｒｆ２和 Ｓｍｕｒｆ１ 蛋白序列的非同源区域序列比对 Ｆｉｇ．１ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓｍｕｒｆ２ａｎｄ Ｓｍｕｒｆ１ｐｒｏｔｅｉｎ 置显微 镜 （Ｎｉｋｏｎ １０２４）；快 速 蛋 白 液 相 色 谱 （ＦＰＬＣ） 纯化系统 （ＧＥ ＵＰＣ１０）；９６ 孔 酶 标 板、９６ 孔／２４ 孔／６ 孔 细 胞 培 养 板、６０ ｍｍ／１００ ｍｍ 细 胞 培 养 皿 均 为 ＮＵＮＣ 产品． １．１．３ 蛋白、细胞与实验动物 原核 表 达 纯 化 的 重 组 蛋 白 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ１、ＧＳＴ－ Ｓｍｕｒｆ２ 和 重 组 质 粒 ｐＣＭＶ ６－Ｆｌａｇ－Ｓｍｕｒｆ１ 以 及 ｐＣ－ ＭＶ ６－Ｆｌａｇ－Ｓｍｕｒｆ２ 由 厦 门 大 学 生 命 科 学 学 院 王 洪 睿 教授实验室提供；鼠骨髓瘤细胞 ＳＰ２／０ 为本实验室存 种；Ｂａｌ ｂ／Ｃ 小鼠 由 厦 门 大 学 医 学 院 实 验 动 物 中 心 提 供；人 胚 胎 肾 细 胞 ２９３Ｔ、人 乳 腺 癌 细 胞 系 ＭＤＡ－ＭＢ－ ２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＺＲ－７５－３０、ＳＫ－ＢＲ－３ 和 人 结 肠 癌 细胞系 ＤＬＤ－１、ＳＷ６２０、ＨＣＴ－１１６ 为本实验室保种． １．２ 方 法 １．２．１ 单克隆抗体制备 １）动 物 免 疫：以 纯 化 后 的 原 核 表 达 重 组 蛋 白 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２作为抗 原，与 等 体 积 的 弗 氏 佐 剂 混 合 乳 化，免疫４只６周 龄 雌 性 Ｂａｌ ｂ／Ｃ 小 鼠．共 免 疫 ３ 次， 初免使用弗氏完全佐剂，二 免 和 三 免 使 用 弗 氏 不 完 全 佐剂．在三免７ｄ 后 对 小 鼠 眼 眶 采 血，间 接 ＥＬＩＳＡ 法 检测抗血清水平． ２）细胞融合：选择抗血清效价最好的１号小鼠，在 细胞融合前３ｄ尾静脉加强免疫．融合当天，无菌条件 下分离 小 鼠 脾 脏 细 胞，在 ＰＥＧ 作用 下，使 其 与 ＳＰ２／０ 细胞融合．置３７ ℃、体积分数为５％ ＣＯ２培养箱培养， ＨＡＴ 培养基选择培养．定期观察，适时换液． ３）阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆：融 合 后 １０ｄ 左右，ＥＬＩＳＡ 检测 细 胞 培 养 上 清 中 的 抗 体 水 平．以 重 组蛋白 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２ 和 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ１ 为 ＥＬＩＳＡ 检 测 的包被抗原，以融合前处死小鼠的血清为阳性对照，未 免疫小鼠的血清为阴性对照．因 Ｓｍｕｒｆ１和 Ｓｍｕｒｆ２同 源性 过 高，为 保 证 筛 选 得 到 的 抗 Ｓｍｕｒｆ２ 抗 体 的 特 异 性，即 Ｓｍｕｒｆ２ 抗 体 只 识 别 Ｓｍｕｒｆ２ 蛋 白，不 识 别 Ｓｍｕｒｆ１蛋白，有必要排除可能出现的抗 Ｓｍｕｒｆ１抗体． 选择 ＥＬＩＳＡ 检测结果为 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２ 包被显 阳 性反应，ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ１ 包 被 显 阴 性 反 应 的 克 隆 为 阳 性 克隆．运用有限稀释法对阳性孔细胞作连续 ３ 次以上 的亚克隆，直至所有克隆化细胞孔阳性率为１００％时， 即可确定获得稳定分泌 单 克 隆 抗 体 的 杂 交 瘤 细 胞．选 取状态良好的单克隆细胞扩大培养，冻存保种，同时制 备单抗腹水． ４）腹水制备与抗体纯化：选取石蜡致敏的 Ｂａｌ ｂ／ Ｃ 小鼠，每只小鼠腹 腔 接 种 合 适 数 量 的 阳 性 杂 交 瘤 细 胞悬液．７～１０ｄ 后 脱 颈 处 死 小 鼠，收 集 腹 水，采 用 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ 层析柱分 离 纯 化 腹 水，检 测 效 价、鉴 定 该 抗 体的性质及其应用． １．２．２ 单克隆抗体特性鉴定 １）单抗亚类鉴定：按照单抗 亚 类 鉴 定 试 剂 盒 说 明 书进行． ２） 单 抗 效 价 测 定：将 检 测 用 重 组 蛋 白 ＧＳＴ－ Ｓｍｕｒｆ２包被９６ 孔酶标 板，４ ℃ 过 夜；质 量 分 数 为 ２％ ＢＳＡ ３７ ℃封闭２ｈ，将纯化后 的 抗 体 做 适 当 的 倍 比 稀 释，加入 ＥＬＩＳＡ 反应孔，３７ ℃ 孵 育 ２ｈ；洗 涤 后，二 抗 ３７ ℃孵育４５ ｍｉｎ；显 色，终 止，酶 标 仪 测 定 ４５０ｎｍ 时 的吸光值（ＯＤ 值）．同时设 定 空 白 对 照 和 标 准 阴、阳 性 血清对照．若 Ｐ／Ｎ（一定稀释度的纯化抗体 ＯＤ４５０－空 白对照 ＯＤ４５０）／（阴性对照 ＯＤ４５０－空白对照ＯＤ４５０）≥ ２．１，则判断为阳性．其中，最大稀释度为其效价． ３）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检 测：ＰＥＩ 转 染 法 将 质 粒 转 入 ２９３Ｔ 细胞中，４８ｈ后裂解细 胞；制 样、装 胶、点 样、电 泳；将海绵、滤纸、凝胶与硝酸纤维膜组成夹层组合，置 于４００ｍＡ 电场中１．５ｈ，将 蛋 白 转 移 至 膜 上；质 量 分 数为 ５％ 脱 脂 奶 粉 封 闭 膜 后，加 入 抗 Ｓｍｕｒｆ２ 的 单 克 隆抗体及抗体 Ｆｌａｇ孵育，洗膜，再加入 ＨＲＰ 标记的 羊抗鼠二抗，洗膜，加入 ＥＣＬ 显色液，曝光． ４）内源 Ｓｍｕｒｆ２ 蛋 白 的 检 测：收 集 本 实 验 室 存 种 的若 干 种 细 胞 株 的 细 胞 裂 解 液，制 样，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测，一抗加抗 Ｓｍｕｒｆ２的单克隆抗体． ５）免疫荧光检测：６ 孔 细 胞 培 养 板 中 放 入 洁 净 盖 玻片，接 种 细 胞；细 胞 贴 壁 后，质 量 分 数 为 ４％ 多 聚 甲 醛室温固定 １０～１５ ｍｉｎ；洗涤后，质量分数为 ０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００室温渗透 ５ ｍｉｎ；质 量 分 数 为 １０％ ＢＳＡ 封闭后，以合适浓度的抗 Ｓｍｕｒｆ２的单克隆抗体孵育２ · ３ ９ ２ · 第２期 丁宇婷等：Ｓｍｕｒｆ２ 单克隆抗体的制备与鉴定
ｈ，避光 条 件 下，ＴＲＩＴＣ 标 记 羊 抗 鼠 二 抗 孵 育 １ｈ，封 片，观察．
２ 实验结果
２．
１ 重 组 蛋 白 ＧＳＴ－Ｓｍｕ
ｒ
ｆ
１、ＧＳＴ－Ｓｍｕ
ｒ
ｆ
２ 的
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 检测
免疫小鼠前，将 提 取 和 纯 化 后 的 重 组 蛋 白 ＧＳＴ－ Ｓｍｕｒｆ１、ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２ 取 样 进 行 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电 泳，考 马斯亮蓝染色后观察，结果表明两种重组蛋白纯度高， 达到了免疫用和检测用的要求（图２）． １．ＧＳＴ；２．ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ１；３．ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２；Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ． 图２ 重组蛋白 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ１和 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２蛋白检测 Ｆｉｇ．２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ１ａｎｄ ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２ ２．２ 免疫小鼠的效价检测 将纯 化 后 的 重 组 蛋 白 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２作为抗原，免 疫４只 Ｂａｌ ｂ／Ｃ 小鼠，３ 次 免 疫 后，小鼠眼眶采血 进 行 抗血清的效价检测．结果表明，４ 只 小 鼠 均 产 生 了 良 好 的免疫反应，抗血清的效价都达到了２５ ６００以上，取１ 号小鼠做后续的细胞融合实验． ２．３ 杂交瘤细胞株制备 本次单抗制备最终获 取 ９ 株 稳 定 分 泌 抗 Ｓｍｕｒｆ２ 的单克隆抗体的杂 交 瘤 细 胞 株，依 次 标 记 为 Ｓｍｕｒｆ２－ １、Ｓｍｕｒｆ２－２、…… 、Ｓｍｕｒｆ２－９．ＥＬＩＳＡ 检 测 各 个 单 克 隆杂交瘤细胞 株 上 清，细 胞 上 清 效 价 均 可 以 达 到２× １０３～３×１０３．各 细 胞 株 扩 大 培 养 后 冻 存 保 种 备 用，同 时选 取 其 中 的 Ｓｍｕｒｆ２－１ 和 Ｓｍｕｒｆ２－９ 两 株 细 胞 打 腹 水，制备腹水抗体． ２．４ 单抗腹水纯化 腹水样品预处理后，使用 ＦＰＬＣ 系统以 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ 进行亲和纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 检 测 Ｓｍｕｒｆ２－１ 和 Ｓｍｕｒｆ２－ ９纯化后的抗体纯度，结果表 明 所 纯 化 的 抗 体 纯 度 高， 浓度大．２．
５ 纯化后的抗Ｓｍｕ
ｒ
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２单克隆抗体效价测定
产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂 交瘤细胞分泌的单克隆 抗 体，这 种 抗 体 的 效 价 往 往 高 于培养细胞上清液的１００～１ ０００倍．ＥＬＩＳＡ 检测纯化 后的抗体效价，这２株单克隆所分泌的抗体其效价均 达到１０６以上（图３）． 图３ 纯化后抗 Ｓｍｕｒｆ２ 单克隆抗体的效价 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ－Ｓｍｕｒｆ２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ２．６ 抗 Ｓｍｕｒｆ２单克隆抗体亚类鉴定 将纯化后的 Ｓｍｕｒｆ２－１和 Ｓｍｕｒｆ２－９抗体分别利用 试剂盒＂ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ＂ 进行亚类鉴定．结果表明，获得的２个单克隆抗体细胞 株均属于ＩｇＧ１． ２．７ 抗 Ｓｍｕｒｆ２ 单克隆抗体特异性检测 分别用 ＥＬＩＳＡ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验验 证 Ｓｍｕｒｆ２ 单克 隆 抗 体 的 特 异 性．用 重 组 蛋 白 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２ 和 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ１分 别 包 被 酶 标 板，一 抗 同 时 孵 育 Ｓｍｕｒｆ２ 单克隆抗体；同时用 ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２包被，一抗孵育融合 前处死小 鼠 的 血 清，作 阳 性 对 照；ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２ 包 被， 一抗孵育未免 疫 小 鼠 的 血 清，作 阴 性 对 照．如 图 ４（ａ） 所 示 ，对Ｓｍｕｒｆ２单 克 隆 抗 体 ，ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ２包 被 时 显 阳性反应，ＧＳＴ－Ｓｍｕｒｆ１包被时显阴性反应．此 ＥＬＩＳＡ 结 果 说 明 抗 Ｓｍｕｒｆ２ 单 克 隆 抗 体 只 特 异 性 地 识 别 Ｓｍｕｒｆ２蛋白． 将成 功 构 建 在 真 核 表 达 载 体 ｐＣＭＶ６－Ｆｌａｇ 上 的 重 组 质 粒 ｐＣＭＶ６－Ｆｌａｇ－Ｓｍｕｒｆ１ 和 ｐＣＭＶ６－Ｆｌａｇ－ Ｓｍｕｒｆ２分别 转 染 ２９３Ｔ 细 胞，４８ｈ 后 制 备 细 胞 裂 解 液，制样，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检 测，同 时 用 未 转 染 任 何 质 粒 的２９３Ｔ 细 胞 裂 解 液 和 转 染 ｐＣＭＶ６－Ｆｌａｇ 空 载 体 的 ２９３Ｔ 细 胞 裂 解 液 上 样，作 阴 性 对 照，一 抗 用 我 们 自 产 的抗 Ｓｍｕｒｆ２单克 隆 抗 体，抗 体 分 装 质 量 浓 度 为 ０．２ μｇ／μＬ，使用时稀释２ ０００倍；同时用从中杉金桥公司 买来的抗体 Ｆｌａｇ孵育相同的膜，作阳性对照．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结 果 表 明 （图 ４（ｂ）），抗 Ｓｍｕｒｆ２ 单 克 隆 抗 体 能 特异 地 识 别 过 表 达 的Ｓｍｕｒｆ２蛋 白 ，而 不 识 别Ｓｍｕｒｆ１ · ４ ９ ２ · 厦门大学学报（自然科学版） ２０１２年图４ 抗 Ｓｍｕｒｆ２单克隆抗体特异性检测 Ｆｉｇ．４ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－Ｓｍｕｒｆ２ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ 蛋白，尽管 Ｓｍｕｒｆ１ 和 Ｓｍｕｒｆ２ 蛋白序列高度同源．
２．
８ 抗Ｓｍｕ
ｒ
ｆ
２单克隆抗体可检测到细胞内 源
性Ｓｍｕｒｆ２蛋白
有文献报道，Ｓｍｕｒｆ２ 在 乳 腺 癌 中 高 表 达［１２］ ．我 们 随机用实验 室 现 有 的 几 株 肿 瘤 细 胞 系 制 成 细 胞 裂 解 液，总 蛋 白 定 量 后 上 样，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检 测，用 抗 Ｓｍｕｒｆ２ 单 克 隆 抗 体 孵 育，同 时 上 样 转 染 ｐＣＭＶ６－ Ｆｌａｇ－Ｓｍｕｒｆ２质粒的２９３Ｔ 细胞裂解 液 作 阳 性 对 照．结 果表明，抗 Ｓｍｕｒｆ２ 单克隆抗体可以在 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、 ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＺＲ－７５－３０ 和 ＳＫ－ＢＲ－３ 等 乳 腺 癌 细 胞 株中 检 测 到 内 源 性Ｓｍｕｒｆ２蛋 白（图５），验 证 了 我 们 制 ＋．转染 ｐＣＭＶ－Ｆｌａｇ－Ｓｍｕｒｆ ２质粒的２９３Ｔ 细胞裂解液； １．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１；２．ＭＤＡ－ＭＢ－４５３；３．ＺＲ－７５－３０； ４．ＳＫ－ＢＲ－３；５．ＤＬＤ－１；６．ＳＷ６２０；７．ＨＣＴ－１１６；８．２９３Ｔ． 图５ 内源性 Ｓｍｕｒｆ２蛋白的检测 Ｆｉｇ．５ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｍｕｒｆ２ 备的 Ｓｍｕｒｆ２单克隆抗体可以识别乳腺癌细胞株中的 内源性 Ｓｍｕｒｆ２蛋白． ２．９ 抗 Ｓｍｕｒｆ２单克隆抗体应用于免疫荧光 本文通过 ＳＫ－ＢＲ－３细胞来观察抗 Ｓｍｕｒｆ２ 单克隆 抗体是否适用于细胞免疫荧光实验，同时用鼠ＩｇＧ 作 阴性对 照．免 疫 荧 光 结 果 显 示，鼠ＩｇＧ 孵 育 组 没 有 检 测到 荧 光，而 Ｓｍｕｒｆ２ 抗 体 孵 育 组 可 以 检 测 到 很 强 的 荧光信号（图６）．说明我们的抗 Ｓｍｕｒｆ２ 单克隆抗体可 以适用于细胞免疫荧光检测． 图６ 抗 Ｓｍｕｒｆ２ 单克隆抗体应用于免疫荧光 Ｆｉｇ．６ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－Ｓｍｕｒｆ２ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ３ 讨 论
目 前 研 究 表 明 ，Ｓｍｕｒｆ ２在 转 化 生 长 因 子 －β （ＴＧＦβ）、肿瘤坏 死 因 子－α（ＴＮＦα）等 信 号 通 路 中 具 有 重要的调控作用，在骨关节炎的发生发展、神经元细胞 极性的维持、细胞周 期 的 调 控、肿 瘤 的 浸 润 和 转 移、细 胞衰老机制等方 面 都 有 重 要 的 影 响［１３－１４］ ．其 功 能 研 究 的主要进展是近十年获得的，了解还不深入；同时研究 多关注功能研究，对于其 活 性 调 控 研 究 才 刚 刚 开 始 不 久，因此是一个崭新的研究领域． 这些研究工作的 开 展 得 益 于 特 异 性 强、灵 敏 度 高 的抗 Ｓｍｕｒｆ２单克隆抗体的大量获得．由于 Ｓｍｕｒｆ２与 Ｓｍｕｒｆ１蛋白序列高 度 同 源，一 般 地，选 择 其 他 位 点 区 域作 抗 原 制 备 的 抗 Ｓｍｕｒｆ２ 抗 体 特 异 性 不 好，两 种 蛋 白都能识别．我们选择两者仅有的的非同源区域序列， 即 Ｓｍｕｒｆ２ 蛋 白 的 第 １５３～２３３ 氨 基 酸 位 点 表 达 的 重 组蛋白作为抗原，通过细胞融合技术，进行多轮反复筛 选，并用 ＥＬＩＳＡ 检 测 方 法 排 除 了 对 Ｓｍｕｒｆ１ 的 特 异 性，最 终 获 得 了 稳 定 分 泌 抗 Ｓｍｕｒｆ２ 单 克 隆 抗 体 的 杂 交瘤细胞株，能源源不断地产生研究所需抗体．一系列 的检 测 和 验 证 表 明，该 单 克 隆 抗 体 只 识 别 Ｓｍｕｒｆ２ 蛋 白，而不识别 Ｓｍｕｒｆ１蛋白，特异性强、效价高，并且可 以特异性识别细胞内源性的 Ｓｍｕｒｆ２蛋白．另外，研究 结果还表明乳腺癌细胞中内源性的 Ｓｍｕｒｆ２蛋白表达 · ５ ９ ２ · 第２期 丁宇婷等：Ｓｍｕｒｆ２ 单克隆抗体的制备与鉴定量较高．该抗体还能被应用于免疫荧光实验，为进一步 研究和认识 Ｓｍｕｒｆ２的功能及其精细的活性调控机制 提供了极为有利的实验工具．
