UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
ASSOCIAÇÃO ENTRE AS VARIANTES GENÉTICAS NOS GENES MYH7,
MYBPC3 E TNNT2 E AS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS QUE CONFEREM
MAIOR RISCO DE MORTE SÚBITA CARDÍACA EM PACIENTES COM
CARDIOMIOPATIA HIPERTRÓFICA.
Augusto Akira Mori
Trabalho de Conclusão do Curso de Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.
Orientador (a):
Prof.(a). Dr.(a) Mário Hiroyuki Hirata Co-orientador(a): Dra. Gisele Medeiros Bastos
São Paulo 2018
LISTA DE ABREVIATURAS ... 1
ÍNDICE DE FIGURAS ... 2
ÍNDICE DE TABELAS ... 2
RESUMO... 3
Palavras-chave: Cardiomiopatia Hipertrófica, Morte Súbita Cardíaca, Análise Exômica. ... 3
1.1 A Morte Súbita Cardíaca ... 5
1.2 A Cardiomiopatia Hipertrófica ... 7
1.2.1 Bases bioquímicas e moleculares da CMH ... 9
1.3 A análise do exoma ... 18 2. OBJETIVO(S)... 21 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 21 3.1. Casuística ... 21 3.2. Características clínicas ... 21 3.3. Sequenciamento de DNA ... 21 3.4. Análise de Bioinformática ... 22 3.5. Análise de associação ... 23 4. RESULTADOS... 24 5. DISCUSSÃO ... 27 6. CONCLUSÃO(ÕES) ... 30 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 31 8. ANEXOS ... 34
LISTA DE ABREVIATURAS
CAVD Cardiomiopatia Arritmogênica do Ventrículo Direito CDAI Cardioversor desfibrilador automático interno CDI Dispositivo Cardíaco Interno
CMH Cardiomiopatia Hipertrófica CNV Copy Number Variation DSV DNA Sequence Variants
ECG Ecocardiograma
FE Fração de Ejeção
IMC Índice de Massa Corporal
ISFC International Society and Federation of Cardiology LoF Loss of Function
MAF Minor Allele Frequency MCP Marca-passo cardíaco MSC Morte Súbita Cardíaca MYBPC3 Myosin Binding Protein C MYH7 β-Myosin Heavy Chain NGS Next Generation Sequencing OMS Organização Mundial da Saúde PAD Pressão Arterial Diastólica PAS Pressão Arterial Sistólica
SAM Movimento Anterior Sistólico da Valva Mitral SV Structural Variation
TNNT2 Troponin T
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Divisão esquemática das causas da Morte Súbita Cardíaca. Fonte: Adaptado de (RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008) ... 6 Figura 2: Morfologia de um coração normal (A) e de um coração afetado pela CMH (B). Destaque para a hipertrofia ventricular esquerda representada no coração do indivíduo afetado (B). Adaptado de (ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014) ... 7 Figura 3: Representação esquemática do processo envolvido na contração do sarcômero. Fonte: (ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014) ... 12 Figura 4: Porcentagem dos genes relacionados com a CMH, em pacientes submetidos a testes genéticos. Fonte: (MARON; MARON; SEMSARIAN, 2012) ... 15 Figura 5: Representação do sarcômero. A figura demonstra o local de atuação das
principais proteínas envolvidas na CMH e seus respectivos genes. Fonte:... 16 Figura 6:Ilustração das etapas do processo de sequenciamento do DNA genômico. A ilustração demonstra as etapas de fragmentação do DNA genômico e a ligação aos
adaptadores, bem como o processo de hibridização, captura e enriquecimento das amostras de DNA. Fonte: (BAMSHAD et al., 2011) ... 20 Figura 7: Esquema simplificado do processo de análise e filtragem dos dados de
sequenciamento. ... 24 Figura 8: Diagrama de Venn representando a quantidade de pacientes que apresentaram variantes em cada um dos genes estudados. ... 25
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Fatores de risco para MSC em pacientes com CMH (CDAI - Cardioversor
desfibrilador automático interno). Adaptado de (MARIAN, 2010) ... 9 Tabela 2: Genes sarcoméricos envolvidos na CMH. Adaptado de (RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008) ... 14 Tabela 3: Relação dos genes candidatos que haviam sido selecionados para
sequenciamento. ... 22 Tabela 4: Resultados das predições in silico das cinco principais variatnes encontradas. ... 26 Tabela 5: Associação entre a presença das variantes genéticas e as variáveis clínicas
contínuas. ... 26 Tabela 6: Associação entre a presença das variantes genéticas e as variáveis clínicas
RESUMO
MORI, A.A. Associação entre as variantes genéticas nos genes MYH7,
MYBPC3 e TNNT2 e as características clínicas que conferem maior risco de morte súbita cardíaca em pacientes com cardiomiopatia hipertrófica. 2018.
Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018.
Palavras-chave: Cardiomiopatia Hipertrófica, Morte Súbita Cardíaca, Análise Exômica.
A Morte Súbita Cardíaca (MSC) se caracteriza por ser uma complicação clínica grave de uma ou mais doenças cardíacas prévias, que podem se manifestar uma única vez com a morte. Dentre suas principais causas destacam-se a Cardiomiopatia Hipertrófica (CMH) e a Cardiomiopatia Arritmogênica do Ventrículo direito (CAVD). A CMH é uma doença genética heterogênea caracterizada principalmente por hipertrofia ventricular esquerda na ausência de outros fatores que a justifiquem, apresentando um padrão de herança autossômico dominante e com incidência de 1 a cada 500 pessoas na população. Análises genéticas de pacientes com CMH demonstraram que dentre os diversos genes que podem estar relacionados à doença, os genes com maior percentagem de manifestação clínica são MYH7, MYBPC3 e TNNT2. O estudo tem por objetivo a associação entre as variantes genéticas encontradas durante o sequenciamento de alto rendimento dos três principais genes citados, e as características clínicas que conferem maior risco de MSC em pacientes com CMH. Foram incluídos no estudo 80 pacientes acompanhados no Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC), diagnosticados previamente com CMH baseado em critérios clínicos, ecocardiográficos e eletrocardiográficos.
Para a análise de associação foram consideradas as características clínicas obtidas a partir de prévia avaliação médica com análise do ecocardiograma, eletrocardiografia de repouso, e, em alguns pacientes de teste ergométrico, ressonância magnética e Holter 24h foram avaliadas em relação as variantes encontradas
Amostras de DNA foram extraídas a partir do sangue dos pacientes e preparadas para sequenciamento conforme protocolo Nextera® Enrichment Sample Preparation Guide (Illumina Inc., San Diego, EUA) e sequenciados utilizando a plataforma MiSeq (Illumina Inc., San Diego, EUA). A análise dos dados de sequenciamento foi realizada utilizando-se o software Real Time Analysis (Illumina Inc., San Diego, EUA) e os aplicativos disponíveis no BaseSpace Sequence Hub (Illumina Inc., San Diego, EUA). Os dados foram alinhados contra a sequência referência Homo Sapiens hg19 utilizando o aplicativo BWA Enrichment 2.1, e em seguida, as variantes genéticas foram identificadas utilizando o aplicativo GATK v.1.6. Para a anotação das variantes foi utilizado o programa Illumina VariantStudio 3.0 (Illumina Inc., San Diego, USA). Os resultados foram então filtrados segundo critérios de qualidade pré-estabelecidos, e associados com as variantes clínicas através de análises estatísticas.
Das 80 amostras de pacientes sequenciados, 64 (75%) apresentaram variantes em um dos três genes em estudo, sendo que 30 apresentaram variantes no gene MYBPC3 (37,5%), 43 no gene MYH7 (53,75%) e 5 no gene (6,25%). Dentre as diversas variantes encontradas, cinco se apresentaram com alta incidência na população estudada, sendo as variantes rs3729989 (c.706A>G p.Ser236Gly) e rs3729986 (c.472G>A p.Val158Met) do gene MYBPC3, rs17794387 (c.*113G>A) do gene MYH7 e rs3730238 (c.788A>G p.Lys263Arg) do gene TNNT2.
Tais dados permitem sugerir que as principais características clínicas relacionadas às cinco variantes que mais foram encontradas são a diminuição da pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD), diminuição da fração de ejeção (FE) e aumento do tamanho médio do septo cardíaco, fatores esses que podem contribuir significativamente para um maior risco de MSC em pacientes portadores de CMH.
Os resultados obtidos neste estudo permitem concluir que as variantes identificadas podem contribuir significativamente na identificação molecular precoce de pacientes portadores de CMH com um maior risco de MSC.
1. INTRODUÇÃO
1.1 A Morte Súbita Cardíaca
A Morte Súbita Cardíaca (MSC) é uma complicação trágica de uma série de desordens médicas, geralmente relacionadas a doenças cardíacas.
(RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008). No mundo ocidental é responsável por aproximadamente 800.000 mortes anualmente, acrescentando mais mortes do que as provocadas em geral pela AIDS, câncer de pulmão, câncer de mama e AVC, resultando em um grande impacto sobre nosso meio, tanto social quanto econômico. Embora a MSC afete principalmente pacientes com doença cardíaca prévia, em uma porcentagem significativa dos casos ocorrem em corações estruturalmente normais. Nestes casos, precisamente porque os indivíduos afetados são jovens e aparentemente saudáveis, o impacto psicológico na família e na comunidade é algo traumatizante (MARIAN, 2010, 2012).
Muitas das causas de MSC, especialmente em jovens (idade ≤ 35 anos) (INGLES; SEMSARIAN, 2007; NÚÑEZ et al., 2013), são devido a desordens genéticas cardíacas, que de modo geral podem ser divididos entre aquelas que apresentam anormalidades estruturais proeminentes, como a Cardiomiopatia Hipertrófica (CMH) e Cardiomiopatia Arritmogênica do Ventrículo Direito (CAVD); ou doenças onde há uma anormalidade arritmogênica primária, que inclui Síndrome do QT Longo, Síndrome de Brugada, Taquicardia Ventricular Catecolaminérgica Polimórfica e Síndrome do QT Curto (INGLES; SEMSARIAN, 2007; RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008), conforme demonstrado na Figura 1.
Figura 1: Divisão esquemática das causas da Morte Súbita Cardíaca. Fonte: Adaptado de
(RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008)
Uma das principais preocupações do médico mediante um paciente com cardiomiopatia associada à MSC é a variabilidade fenotípica da doença (INGLES; SEMSARIAN, 2007), uma vez que as manifestações clínicas podem variar significativamente entre os pacientes, havendo inclusive uma porcentagem de 3% a 30% de jovens com ausência completa dos sintomas (RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) e a Federação e Sociedade Internacional de Cardiologia (International Society and Federation of Cardiology - ISFC), as cardiomiopatias podem ser divididas em dois grupos principais: Cardiomiopatias Específicas e Cardiomiopatias Primárias, sendo esta última definida como doenças intrínsecas ao próprio miocárdio e fisiopatologicamente classificada em outros quatro grupos: Cardiomiopatia
Morte Súbita Cardíaca
Doenças do Miocárdio Canalopatias
Cardiomiopatia Hipertrófica (CMH) Displasia Arritmogênica do Ventrículo Direito Síndrome do QT Longo Síndrome de Brugada Taquicardia catecolaminérgica polimórfica ventricular Síndrome do QT Curto
Dilatada, Cardiomiopatia Hipertrófica, Cardiomiopatia Restritiva e Cardiomiopatia Arritmogênica do Ventrículo Direito (RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008).
A MSC muitas vezes pode ser a primeira manifestação da Cardiomiopatia Hipertrófica (CMH) e afeta principalmente jovens e atletas competitivos, apesar de poder ocorrer em qualquer idade (INGLES; SEMSARIAN, 2007; MARIAN, 2010).
1.2 A Cardiomiopatia Hipertrófica
As cardiomiopatias mais relacionadas com a MSC são a Cardiomiopatia Hipertrófica (CMH) e a Cardiomiopatia Arritmogênica do Ventrículo Direito (CAVD), sendo a CMH a causa mais comum de MSC em jovens. A CMH é caracterizada como uma patologia cardíaca hereditária primária dos miócitos cardíacos, clinicamente definida pela presença de hipertrofia cardíaca concêntrica, não adequadamente justificada e geralmente assimétrica, ausência de dilatação do ventrículo esquerdo com preservação ou aumento da função sistólica global, fração de ejeção normal ou alterada, (MARIAN, 2010; MARIAN; BRAUNWALD, 2017; ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014), quando não existem evidências de outras doenças cardiovasculares ou estímulo hemodinâmico suficiente que justifique o grau de hipertrofia (MARIAN; BRAUNWALD, 2017; MARON, 1997). A figura 2 representa, de forma esquemática, a morfologia de um coração afetado pela CMH.
A B
Figura 2: Morfologia de um coração normal (A) e de um coração afetado pela CMH (B). Destaque para a hipertrofia ventricular esquerda representada no coração do indivíduo afetado (B). Adaptado de
A CMH afeta 1 em cada 500 adultos da população geral (MARIAN; BRAUNWALD, 2017; MARON; ANAN; ROBERTS, 1981; MARON; GOTTDIENER; EPSTEIN, 1981; TEARE, 1957), variando aproximadamente de 1:344 a 1:625 indivíduos, e é a principal causa da MSC, o desfecho mais temido da CMH
(MARIAN; BRAUNWALD, 2017; ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014). Usualmente a hipertrofia é assimétrica e mais predominante na base do septo interventricular adjacente à válvula aórtica, em relação à parede livre do ventrículo (MATTOS et al., 2016; ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014). Apresenta-se nos adultos com uma espessura da parede diastólica final do ventrículo esquerdo ≥ 13 mm no ecocardiograma, apesar da Sociedade Europeia de Cardiologia recomendar um valor ≥ 15 mm; e consequente diminuição no tamanho da câmara do ventrículo esquerdo (MARIAN, 2010; RODRÍGUEZ; MCCUDDEN; WILLIS, 2009).
Muitos pacientes são assintomáticos ou levemente sintomáticos, sendo a dispneia e dor no peito os sintomas mais comuns (ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014). O primeiro pode ocorrer devido à alta pressão diastólica do ventrículo esquerdo decorrente da disfunção diastólica, principalmente durante exercícios físicos; enquanto o segundo pode ocorrer devido a hiperfusão miocárdica e aumento da demanda de oxigênio. Palpitações são comuns e geralmente associadas com tontura, vertigem e ocasionalmente com síncope. A síncope é infrequente, mas é um sintoma sério, considerando que geralmente é um anúncio de MSC (BAMSHAD et al., 2011).
Atualmente, estudos clínicos têm fornecido algumas informações úteis sobre preditores de risco, mas com limitações significativas, especialmente pela sua variabilidade ao longo do tempo. Dentre alguns fatores de risco associados à MSC, podemos destacar um histórico prévio de parada cardiorrespiratória, síncope causada por arritmias cardíacas, taquicardia ventricular repetitiva sustentada ou não sustentada, hipertrofia cardíaca severa e forte histórico familiar de MSC (MARIAN; BRAUNWALD, 2017). A tabela 1 apresenta um resumo dos fatores de risco associados à MSC.
Tabela 1: Fatores de risco para MSC em pacientes com CMH (CDAI - Cardioversor desfibrilador automático interno). Adaptado de (MARIAN, 2010)
Impacto Alto (recomendação de uso de CDAI – Cardioversor/Desfibrilador Automático Interno)
Episódios anteriores de MSC
Histórico de síncope recorrente (suspeito devido a arritmias do miocárdio)
TVNS, sustentada e repetitiva
Impacto Moderado (quando o fator sozinho não é suficiente para indicar CDAI, mas recomenda-se o uso quando presente em conjunto com outros fatores de risco).
Histórico familiar de MSC (mais de uma vítima de MSC)
Variantes causais, incluindo variantes duplas
Genes Modificadores
Severa hipertrofia cardíaca
Impacto Modesto (efeitos incertos de risco de MSC) Obstrução do fluxo de saída do ventrículo esquerdo
Pressão sanguínea anormal em resposta a exercícios
Desenvolvimento precoce de manifestações clínicas
Isquemia do miocárdio
Desarranjo/Fibrose intersticial
Tem sido relatado também que a idade de apresentação é um fator importante no desenvolvimento da CMH, estando a doença presente em aproximadamente metade dos pacientes que possuem as variantes genéticas, à época dos 30 anos de vida, e em aproximadamente em um quarto dos pacientes à época dos 60 anos (INGLES, 2005; MARIAN; BRAUNWALD, 2017; RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008). Além disso, o grau de hipertrofia, a gravidade dos sintomas e o prognóstico também estão relacionados pelo menos em parte, com a variante genética responsável. Portanto, o diagnóstico genético torna-se uma ferramenta muito útil.
1.2.1 Bases bioquímicas e moleculares da CMH
A CMH é uma doença monogenética devido a variantes em um único gene em células germinativas, heterogênea geneticamente (MARIAN, 2010; MARON;
MARON; SEMSARIAN, 2012; RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008; ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014), que geralmente tem uma apresentação familiar transmitida com herança autossômica dominante (MARON; MARON; SEMSARIAN, 2012), onde uma única variante genética pode ser suficiente para causar a doença, apesar de possuir penetrância e expressões variáveis.
As variantes envolvidas na patologia da CMH são variantes raras que tipicamente afetam domínios em genes codificantes para proteínas do sarcômero (NÚÑEZ et al., 2013), responsável pela geração de força para contração do miócito (MARIAN; BRAUNWALD, 2017; MONTAG et al., 2018; ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014). Aproximadamente 50% dos pacientes com CMH apresentam variantes principalmente nos genes myosin heavy chain 7 (MYH7) e myosin binding protein C (MYBPC3) (locus 14q11.2-q12 e locus 11p11.2, respectivamente) (MARIAN; BRAUNWALD, 2017); enquanto variantes nos genes troponina T2 (TNNT2) e troponina T3 (TNNI3) (locus 1q32 e 19p13.4, respectivamente), apesar de possuírem menor frequência entre a população, também estão envolvidas no processo de contração muscular e são responsáveis por aproximadamente 10% dos casos (RODRÍGUEZ; MCCUDDEN; WILLIS, 2009).
Estudos demonstraram que variantes no gene TNNT2 estão associados com menor grau de hipertrofia e fibrose, apesar da maior incidência de morte prematura e MSC com hipertrofia ventricular esquerda moderada ou mesmo ausente (ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014). A proteína cMyBP-C, codificada pelo gene MYBPC3 já foi associada a regulação sistólica e diastólica da função cardíaca. Em estudos pré-clínicos, ratos com deleção do gene MYBPC3 desenvolveram hipertrofia miocárdica e dilatação ventricular (ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014).
Na CMH, o estado de contração miocárdico é comprometido pela hipertrofia, desarranjo e aumento da fibrose miocárdica, apresentando miócitos com núcleo distorcido e miofibrilas desorganizadas, resultando, portanto, em consequências negativas para o relaxamento muscular que podem levar a arritmias e falha do coração (ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014).
Nos últimos anos, têm sido reconhecidos que defeitos genéticos nos canais iônicos dos miócitos levam a distúrbios rítmicos, anormalidades no Eletrocardiograma (ECG) e risco de MSC, apesar de não haver alteração morfológica no coração, de forma que cálcio e proteínas envolvidas na liberação do mesmo tem sido de grande interesse na patogênese da CMH (ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014).
Em corações de não portadores da CMH, a excitação elétrica dos miócitos resulta em aumento do fluxo intracelular de Ca2+, e consequente aumento da liberação de Ca2+ do retículo endoplasmático (SERCA) para o citoplasma. O aumento da concentração desse íon na região citossólica induz a ligação do Ca2+ à troponina C, possibilitando a contração do músculo pela projeção das moléculas de miosina sobre os filamentos de actina em um processo dependente de ATP (ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014).
Após a contração, ocorre diminuição dos níveis de Ca2+ citossólicos, desacoplamento do íon da troponina C e consequente desacoplamento da miosina sobre a actina. Variantes genéticas que podem levar ao desenvolvimento da CMH geralmente estão relacionadas a um uso excessivo ou inadequado do ATP, cuja deficiência energética causa um impacto na homeostase do Ca2+ (ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014) e, portanto, sobre a sensibilidade dos complexos de troponina a esse íon, gerando um impacto sobre o deslocamento da miosina sobre as fitas de actina, e comprometendo assim a capacidade de relaxamento dos miócitos. A figura 3 demonstra de forma esquemática o processo envolvido na contração do sarcômero em portadores de CMH.
Figura 3: Representação esquemática do processo envolvido na contração do sarcômero. Fonte:
(ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014)
A variabilidade nos níveis de expressão e incorporação das proteínas mutadas nos sarcômeros e miofilamentos resulta em diversos defeitos funcionais, podendo estes defeitos serem diferentes entre os indivíduos devido às diferenças nas variantes e nos miócitos de portadores da mesma variante genética. Tal heterogeneidade na expressão e incorporação das proteínas mutantes no nível do miócito pode explicar, em parte, as diferenças fenotípicas da CMH (MARIAN, 2010).
Estudos de Marian et al. (MARIAN, 2010) têm sugerido que variantes da CMH reduzem a sensibilidade da dissociação do complexo actina-miosina em resposta ao ATP. Assim, moléculas de actina e miosina manter-se-iam ligadas, diminuindo a disponibilidade das mesmas na conformação dissociada. Além disso, variantes nas proteínas do sarcômero também parecem exercer influência na
síntese de colágeno, resultando em fibrose miocárdica que, aliado ao aumento do tamanho dos cardiomiócitos, pode explicar a hipertrofia ventricular esquerda característica dos portadores da CMH (RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008).
O efeito de variantes sobre a contração do músculo cardíaco depende do gene envolvido, da posição da variante dentro do respectivo gene, e consequentemente da proteína e da abundância da proteína mutada dentro dos miócitos (MARIAN; BRAUNWALD, 2017).
Comparado com a CMH causada por variantes em proteínas componentes dos miofilamentos grossos, como o MYH7 e MYBPC3, a CMH causada por variantes nos miofilamentos finos, como no gene TNNT2, exibem uma hipertrofia cardíaca mais branda e um risco aumentado de disfunção sistólica. Contudo, o risco de arritmia cardíaca séria e MSC não parecem diferir entre os dois grupos (MARIAN; BRAUNWALD, 2017).
Assim, apesar das variantes que exercem grande efeito serem decorrentes de variantes monogênicas autossômicas dominantes (MARIAN; BRAUNWALD, 2017), como nos genes MYH7 e MYBPC3, também devem ser considerado as variantes genéticas nos demais genes que exercem efeitos menores, como o TNNT2, que apesar de exibir um CMH moderado, apresenta um risco aumentado de disfunção sistólica (MARIAN; BRAUNWALD, 2017; RODRÍGUEZ; MCCUDDEN; WILLIS, 2009; ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014).
De maneira geral, os eventos da CMH podem ser divididos em quatro grupos (MARIAN; BRAUNWALD, 2017):
Fenótipo Inicial ou Proximal: Estão relacionados às consequências diretas das variantes sobre a estrutura e função das proteínas do sarcômero;
Fenótipo Intermediário ou Secundário: Estão relacionados às mudanças moleculares resultantes que ocorrem em resposta às alterações estruturais ou funcionais das proteínas do sarcômero, como alteração na expressão gênica e a ativação e vias de sinalização como MAPK e TGFB1;
Efeitos Terciários: São os efeitos fenotípicos patológicos e histológicos subsequentes, que são consequência de uma infinidade de eventos
moleculares secundários no miocárdio, como a ativação das vias de sinalização;
Efeito Quaternário: Fenótipo clínico da CMH decorrente das alterações patológicas e histológicas da fase terciária.
Os fenótipos clínicos, morfológicos e histológicos da CMH são consequência de interações complexas entre um grande número de determinantes, variando desde variantes genéticas causais a fatores ambientais. A variante causal é pré-requisito e o maior determinante do fenótipo. Contudo, as variações fenotípicas são devidas não somente às variantes nos dois principais genes, mas também às variantes causais dos demais genes relacionados, que apesar de poderem não apresentar relevância clínica quando analisadas individualmente, possuem a capacidade de gerar um efeito cumulativo sobre a CMH (MARIAN; BRAUNWALD, 2017).
Uma inserção/deleção da variante no gene ACE (angiotensin-1 converting enzyme – Enzima conversora de angiotensina 1), por exemplo, que está associado com os níveis plasmáticos de ACE, tem revelado modificar, apesar de modestamente, a expressão da hipertrofia cardíaca e o risco de MSC em pacientes com CMH (MARIAN; BRAUNWALD, 2017). Além disso, outros fatores não genéticos, como a obesidade, por exemplo, também pode exercer forte impacto sobre a doença (RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008). A Tabela 2 demonstra a frequência dos principais genes envolvidos na CMH.
Tabela 2: Genes sarcoméricos envolvidos na CMH. Adaptado de (RODRÍGUEZ-CALVO et al., 2008)
Gene Proteína Locus Frequência (%) MYH7 Cadeia Pesada da Miosina β 14q11.2-q12 15-25 MYBPC3 Proteína C ligadora da Miosina 11p11.2 15-25 TNNT2 Troponina Cardíaca T 1q32 5-15 TPM1 α-Tropomiosina 15q22.1 5-15
TNNI3 Troponina Cardíaca I
19p13.4 <5
MYL2 Cadeia Leve Regulatória
12q23-q24.3 <1
MYL3 Cadeia Leve Essencial 3p21.2-p21.3 <1 MYH6 Cadeia Pesada da Miosina α 14q11.2-q12 <0.5 TNNC1 Troponina Cardíaca C 3p21-p24 <0.5 ACTC α-Actina 15q14 <0.5 TTN Titina 2q24.3 <0.5
Legenda 1: MYH7 – cadeia pesada da miosina 7; MYBPC – proteína C ligadora da miosina; TNNT2 - troponina T2; TPM1 - tropomiosina α; TNNI3 – troponina I3; MYL2 – cadeia leve da miosina 2; MYL3 –cadeia leve da miosina 3; MYH6 – cadeia leve da miosina 6; TNNC1 –troponina C1; ACTC – actina, alpha, músculo cardíaco 1; TTN – Titina.
Estudos realizados por Maron et al (MARON; MARON; SEMSARIAN, 2012) reforçam as informações da tabela 2, onde demonstraram a distribuição dos genes relacionados com a CMH em pacientes submetidos a exames genéticos, conforme demonstrado na figura 4:
Figura 4: Porcentagem dos genes relacionados com a CMH, em pacientes submetidos a testes genéticos. Fonte: (MARON; MARON; SEMSARIAN, 2012)
Considerando que os principais genes envolvidos na CMH são genes sarcoméricos, a figura 5 demonstra uma visão esquemática do sarcômero, e a região de atuação de cada um dos genes mencionados, podendo estes serem divididos em genes que codificam para as proteínas finas (actina) e grossas (miosina) do miofilamento, e também para as proteínas do disco-Z.
Figura 5: Representação do sarcômero. A figura demonstra o local de atuação das principais proteínas envolvidas na CMH e seus respectivos genes. Fonte:
Legenda 2: MYH7 – cadeia pesada da miosina 7; MYBPC – proteína C ligadora da miosina; TNNT2 - troponina T2; TPM1 - tropomiosina α; TNNI3 – troponina I3; MYL2 – cadeia leve da miosina 2; MYL3 –cadeia leve da miosina 3; MYH6 – cadeia leve da miosina 6; TNNC1 –troponina C1; ACTC – actina, alpha, músculo cardíaco 1; TTN – Titina.
Contradizendo a definição clássica de que a CMH é definida como variante de um único gene, pesquisas com os principais genes envolvidos com a doença revelaram que cerca de 5% a 10% dos pacientes com hipertrofia ventricular mais pronunciada, apresentam dois (digênico) ou mais (poligênicos) variantes no mesmo gene ou em genes diferentes (MARIAN, 2010; MARON; MARON; SEMSARIAN, 2012). Pacientes com duplas variantes apresentam, portanto, um quadro mais severo da HCM que pacientes com uma única variante, sendo
especialmente válido para pacientes homozigotos (BAMSHAD et al., 2011; RODRÍGUEZ; MCCUDDEN; WILLIS, 2009).
Apesar dos genes relacionados ao desenvolvimento da CMH já terem sido amplamente estudados, o mecanismo de desenvolvimento e evolução da doença ainda não estão completamente definidos, havendo duas hipóteses para a mesma: a primeira hipótese defende que a maioria das variantes causais na CMH são variantes missense,de forma que exerceriam um efeito dominante negativo, resultando na formação de proteínas mutadas incorporadas no sarcômero, e com consequências danosas na função do mesmo (MARIAN; BRAUNWALD, 2017; MARSIGLIA et al., 2013).
Devido ao fato do gene MYBPC3, contudo, exibir uma predileção para variantes do tipo frameshift ou de truncagem (MARON; MARON; SEMSARIAN, 2012), de forma que geralmente anulam a expressão proteica, a segunda hipótese defende que nos indivíduos heterozigotos, apenas o alelo selvagem é expresso (BAMSHAD et al., 2011; RODRÍGUEZ; MCCUDDEN; WILLIS, 2009), e o resultado, portanto, é uma haploinsuficiência, que é mecanismo incomum na CMH uma vez que a maioria das variantes é do tipo missense. Assim, comparado com outros genes causadores da CMH, a haploinsuficiência seria mais comum em indivíduos com variantes no gene MYBPC3 (MARIAN, 2012).
Uma das principais dificuldades relacionadas ao diagnóstico da CMH está relacionada à presença de fenocópias da doença, que podem representar cerca de 5 a 10% dos diagnósticos de CMH em crianças. Estudos tem demonstrado a presença de demais condições patológicas que podem levar a hipertrofia do ventrículo esquerdo, sem motivo prévio, mas que não estão relacionados aos principais genes sarcoméricos encontrados até o momento. Doenças relacionadas ao armazenamento de glicogênio, doença de Fabry e doença de Danon (variantes nos genes LAMP2 e PRKAG2) são algumas das doenças que mimetizam as características clínicas da CMH, e que por consequência dificultam o diagnóstico clínico correto (MARIAN, 2010). Contudo, a forma assimétrica do ventrículo com grande hipertrofia basal do septo interventricular associado a testes genéticos podem ajudar no melhor diagnóstico (MARIAN, 2012).
1.3 A análise do exoma
A estrutura do genoma humano, apesar de aparentemente simples por ser composta de apenas quatro tipos de nucleotídeos diferentes, é ainda uma estrutura excessivamente longa e complexa, com 3,3 bilhões de nucleotídeos. Apesar de seu tamanho, os genes, compostos por regiões reguladoras, exons e introns, ocupam aproximadamente apenas 5% desse total, sendo os exons codificantes de proteínas responsáveis por aproximadamente 1% do genoma (BAMSHAD et al., 2011; MARIAN, 2012).
Estudos genéticos visam detectar e quantificar os riscos de uma doença, a efetividade de uma terapia específica ou ainda os eventos adversos em nível individual. Tais tipos de estudo têm se focado em analisar variantes na sequência de DNA (DNA Sequence Variants – DSV) entre indivíduos, que são responsáveis tanto por atuarem na susceptibilidade a doenças e desfechos clínicos, como também por definirem as características individuais, tornando os indivíduos geneticamente diversos. Apesar da maioria das DSVs serem polimorfismos de uma base única (Single Nucleotide Polymorphism – SNP), variações estruturais (Structural Variation – SV) como deleções, inserções, duplicações e rearranjos podem aumentar ou diminuir o numero de cópias dessas sequências, sendo assim chamados de variações no número de cópias (Copy Number Variation - CNV). Qualquer que seja o tipo de variante, as que possuírem a capacidade de alterar a função e/ou a estrutura das proteínas são previstas de possuírem efeito funcional (MARIAN, 2012).
Os seres humanos se diferem um do outro por aproximadamente 0,1% do genoma, onde cada genoma contêm aproximadamente 4 milhões de DSVs que afetam metade dos genes em cada genoma, e de 50 a 100 CNVs que tem sido associados a doenças hereditárias (BAMSHAD et al., 2011). O avanço do conhecimento e da compreensão do comportamento dos ácidos nucleicos, associado aos avanços tecnológicos, possibilitou que as técnicas iniciais de sequenciamento genético evoluíssem para as técnicas conhecidas como Sequenciamento de Próxima Geração (Next Generation Sequencing – NGS).
Desde 2005, plataformas dessa tecnologia se tornaram amplamente disponíveis, de maneira a reduzir o custo de sequenciamento de DNA e possibilitar o desenvolvimento de tecnologias para captura da região alvo e sequenciamento em massa (BAMSHAD et al., 2011). Contudo, estudos genéticos também elucidaram a necessidade de uma abordagem que utilizasse não somente informações genéticas, mas também dados clínicos e moleculares no diagnóstico e estratificação de risco (BAMSHAD et al., 2011).
Baseando-se no fato das variantes em regiões exônicas e sequências afetadas de proteínas serem mais propensas a serem patogênicas do que as variantes localizadas em regiões intrônicas ou intergenes, o sequenciamento do exoma tem se mostrado a técnica provavelmente mais utilizada para identificar causas genéticas de doenças Mendelianas raras e não mendelianas comuns. Os usos das técnicas de sequenciamento exômico irão facilitar a precisão dos diagnósticos de indivíduos com doenças mendelianas que se apresentem com manifestações atípicas, que são difíceis de confirmar usando critérios clínicos ou laboratoriais isolados, ou que necessitem de avalições custosas ou extensivas (BAMSHAD et al., 2011).
Nas técnicas de sequenciamento por NGS, as etapas principais envolvem: fragmentação do DNA genômico, ligação dos fragmentos em adaptadores, captura dos fragmentos de interesse por sondas biotiniladas por hibridização, enriquecimento por amplificação dos fragmentos capturados e sequenciamento usando a plataforma NGS, como demonstrado na figura 6. Assim, seus múltiplos fragmentos de DNA são sequenciados simultaneamente, e os resultados são alinhados contra o genoma referência, de forma que quanto maior for a quantidade de “leituras” (reads) de cada fragmento, maior o sinal por ele gerado
Figura 6:Ilustração das etapas do processo de sequenciamento do DNA genômico. A ilustração demonstra as etapas de fragmentação do DNA genômico e a ligação aos adaptadores, bem como o processo de hibridização, captura e enriquecimento das amostras de DNA. Fonte: (BAMSHAD et al.,
2011)
A análise exômica possibilita a adoção da estratégia de sequenciar apenas um número modesto de indivíduos afetados, seguido da aplicação de filtros para reduzir o número de genes e de variantes para um número mínimo de variantes de alto potencial. As variantes encontradas podem então ser categorizadas em diferentes classes baseadas na frequência do menor alelo (Minor Allele Frequencies – MAF) na população. Variantes comuns são aquelas que apresentam MAF>5%, variantes raras possuem MAF<1% e as variantes muito raras possuem MAF<0,1% (BAMSHAD et al., 2011). Variantes que apresentam 1%<MAF<5% são consideradas incomuns ou infrequentes (BAMSHAD et al., 2011).
Apesar disso, os MAFs das variantes genéticas variam significativamente entre diferentes populações étnicas, de forma que populações com diferentes bagagens étnicas podem não compartilhar os mesmos alelos de risco ou necessitam de diferentes fatores de interação para expor o risco de um alelo, e os
resultados obtidos de um grupo étnico podem não refletir em outro (MARIAN, 2012).
Assim, considerando os avanços advindos das técnicas de sequenciamento exônico e a característica de herança genética da CMH, o sequenciamento tem se mostrado como um exame laboratorial útil no diagnóstico correto e em melhores respostas em terapias farmacológicas personalizadas.
2. OBJETIVO(S)
Avaliar a associação entre as variantes genéticas encontradas nos genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2 durante o sequenciamento de alto rendimento, e as características clínicas em pacientes com CMH.
3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Casuística
Para a realização do presente estudo, foram utilizados os dados clínicos e do sequenciamento de DNA de 80 pacientes com diagnóstico de cardiomiopatia hipertrófica e, que foram incluídos em um estudo prévio do nosso grupo de pesquisa intitulado “Análise Exômica Em Pacientes Portadores De Cardiomiopatia Hipertrófica”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do IDPC sob o parecer nº4008 (Anexo A). Na época do estudo, todos os pacientes receberam informações sobre a pesquisa e após a autorização voluntária e assinatura do termo de consentimento informando sobre o estudo proposto (TCLE) de acordo com o CEP (Comissão de Ética em Pesquisa), foram submetidos à coleta de sangue periférico para exames laboratoriais e para obtenção do DNA.
3.2. Características clínicas
Para a análise de associação foram consideradas as características clínicas obtidas a partir de prévia avaliação clínica, ecocardiográfica, eletrocardiográfica de repouso, e, em alguns pacientes de teste ergométrico, ressonância magnética e Holter 24h. Todos esses dados foram coletados durante a realização do estudo “Análise Exômica Em Pacientes Portadores De Cardiomiopatia Hipertrófica”.
Durante a realização do estudo “Análise Exômica Em Pacientes Portadores De Cardiomiopatia Hipertrófica”, utilizou-se o sequenciamento de alto rendimento, analisando-se um painel de 82 genes candidatos, conforme tabela 3. O DNA foi obtido a partir de sangue total utilizando o kit DNA QIAamp DNA Blood (Qiagen Inc., Valencia, EUA), seguindo a orientação do fabricante. Para o preparo da biblioteca foi utilizado o protocolo Nextera® Enrichment Sample Preparation Guide (Illumina Inc., San Diego, EUA). Com intuito de validar a biblioteca, realizou-se a quantificação final por qPCR utilizando o protocolo KAPA Library Quantification Kits (KAPA Biosystems, Inc., Wilmington, EUA). O sequenciamento foi realizado utilizando a plataforma MiSeq (Illumina Inc., San Diego, EUA).
Tabela 3: Relação dos genes candidatos que haviam sido selecionados para sequenciamento.
Sarcômero Disco Z
Outros genes relacionados à
CMH
Outros genes não sarcoméricos
MYH7 ACTN2 JPH2 ABCC9 DSP KCNJ2 RYR2
MYBPC3 CSRP3 PLN ACTA2 EYA4 KCNJ5 SCN1B
TNNT2 MYOZ2 MYLK2 ACTB FBN1 KCNJ8 SCN3B
TNNI3 TCAP CASQ2 AKAP9 FHL1 KCNQ1 SCN4B
TTN VCL SLC25A4 ANK2 FKTN LDB3 SCN5A
TPM1 LAMP2 ANKRD1 GPD1L LMNA SDHA
ACTC1 PRKAG2 BAG3 HCN4 NEBL SGCD
MYL2 GLA CACNA1C JUP NEXN SNTA1
MYH6 CACNA2D1 KCND3 NOS1AP TAZ
TNNC1 CACNB2 KCNE1 PKP2 TGFB3
MYL3 CALR3 KCNE1L PSEN1 TGFBR1
DES DMD KCNE2 PSEN2 TGFBR2
CAV3 DSC2 KCNE3 RANGRF TMEM43
DSG2 KCNH2 RBM20 TMPO
3.4. Análise de Bioinformática
Após a etapa de sequenciamento, a análise primária dos dados foi realizada utilizando o software Real Time Analysis (Illumina Inc., San Diego, EUA), enquanto a análise secundária foi realizada utilizando-se os aplicativos disponíveis no BaseSpace Sequence Hub (Illumina Inc., San Diego, EUA). Para a análise secundária, inicialmente, os dados foram alinhados contra a sequência referência Homo Sapiens hg19 utilizando o aplicativo BWA Enrichment 2.1, e em seguida, as variantes genéticas foram identificadas utilizando o aplicativo GATK v.1.6.
Uma vez determinada a posição da variante encontrada, utilizou-se as sequências de referência dos genes em estudo disponíveis no banco de dados Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) para se determinar o éxon que continha a região mutada.
Para a anotação das variantes foi utilizado o programa Illumina VariantStudio 3.0 (Illumina Inc., San Diego, USA). Para cada uma das variantes, avaliou-se através do programa IGV (Illumina Inc., San Diego, USA) a quantidade de “leituras” (reads) encontradas que estavam de acordo com a sequência referência, bem como a quantidade da mesma encontrada no sentido positivo. A mesma análise foi realizada para as leituras que possuíam a variante.
A partir dessas informações foram estabelecidos filtros para eliminação de variantes sinônimas e em regiões intrônicas, e a avaliação patogênica das variantes restantes foi realizada utilizando programas de predição in silico como PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), SIFT (http://sift.jcvi.org/), Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/) e PROVEAN (http://provean.jcvi.org/index.php)..
3.5. Análise de associação
Inicialmente, os pacientes foram agrupados de acordo com as características clínicas que conferem maior risco para MSC (item 3.2) e, em seguida, foi realizada a análise de associação com a presença das variantes dos genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2 com maior probabilidade de serem patogênicas (item 3.4). A análise estatística foi realizada utilizando-se o software SPSS versão 22.0 (SPSS Inc., Chicago Illinois, USA). Para as variáveis categóricas foi utilizado o teste de exato de Fisher, enquanto para as não categóricas foi utilizado o teste exato de Mann-Whitney, adotando-se um nível de significância de p<0,15. Esse nível de significância (valores borderline) foi adotado para o presente estudo com a finalidade de posteriormente se realizar a análise combinada dessas variantes, duas a duas, com o intuito de avaliar a influência da combinação dessas variantes sobre as características clínicas.
4. RESULTADOS
A análise inicial do sequenciamento identificou um total de 2393 variantes genéticas distribuídas entre 82 genes candidatos. Dessas variantes, 77 não possuíam registro prévio no dbSNP (ausência de rs). As variantes encontradas foram então submetidas à etapa de filtros com o objetivo de:
a) Eliminar as variantes cuja frequência do alelo mutado foi inferior a 20%; b) Selecionar apenas as que se apresentassem na região exômica, em
regiões 5’UTR ou em regiões de splicing;
c) Selecionar as variantes: frameshift, inframe, missense e nonsense.
Após a etapa de filtros, restaram 604 variantes distribuídas entre 77 genes e, 59 dessas variantes não possuíam identificação no dbSNP (sem rs). Destas 604 variantes restantes, foram então selecionadas apenas àquelas relacionadas aos três genes em estudo, totalizando 28 variantes, dentre as quais 4 não possuíam identificação pelo dbSNP. Assim, restaram 24 variantes já previamente descritas, conforme demonstrado na figura 7.
Dos 80 pacientes sequenciados, 64 pacientes (75%) apresentaram variantes em pelo menos um dos três genes em estudo, sendo 30 pacientes que apresentaram variantes no gene MYBPC3 (37,5%), 43 no gene MYH7 (53,75%) e 5 no gene TNNT2 (6,25%). A figura 8 demonstra a distribuição desses pacientes conforme os genes em que as variantes foram encontradas.
80 pacientes sequenciados; 2393 variantes em 82 genes.
Etapas de Filtragem: 604 variantes em 77 genes
28 variantes nos três genes de estudo: MYBPC3, MYH7 e TNNT2.
Variantes já descritas no dbSNP: MYBPC3 (11 variantes), MYH7 (9 variantes) e TNNT2 (4 variantes).
Figura 7: Esquema simplificado do processo de análise e filtragem dos dados de sequenciamento.
Figura 8: Diagrama de Venn representando a quantidade de pacientes que apresentaram variantes em cada um dos genes estudados.
Dentre as diversas variantes encontradas nos pacientes que apresentaram alguma variação nos genes em estudo, algumas se destacaram devido a sua incidência nos pacientes. Dos 43 pacientes que apresentaram variantes no gene MYH7, 9 (21%) apresentaram a variante rs17794387 (c.*113G>A). Para o gene MYBPC3, dos 30 pacientes que apresentaram alguma variação nesse gene, 16 (53,3%) apresentaram a variante rs3729989 (c.706A>G p.Ser236Gly) e 8 (26,7%) apresentaram a variante rs3729986 (c.472G>A p.Val158Met). Para o gene TNNT2, apenas 2 pacientes (40%) entre 5, apresentaram a variante rs3730238 (c.788A>G p.Lys263Arg).
A tabela 4 apresenta os resultados de predição in silico dessas variantes utilizando as ferramentas PROVEAN, Mutation Taster, PolyPhen e SIFT. Essas ferramentas permitem predizer as possíveis consequências funcionais para a proteína decorrentes de cada uma das variantes genéticas supracitadas.
TNNT2
MYH7
MYBPC3
3
17
31
0
1
11
1
64
Tabela 4: Resultados das predições in silico das cinco principais variatnes encontradas.
Mutation Taster Provean Sift PolyPhen MYBPC3 rs3729989 Polimorfismo Neutro (2155) Tolerado
(1)
Benigno (0)
rs3729986 Polimorfismo Neutro (-1362) Prejudicial
(0)
Possivelmente danoso (0.634)
MYH7 rs17794387 Não encontrado Não encontrado Não encontrado
Não encontrado
TNNT2 rs3730238 Polimorfismo Neutro (-1523) Tolerado (0.13)
Benigno (0.008) Legenda 3: MYBPC3 - proteína C ligadora da miosina; MYH7 - Cadeia pesada da miosina 7; TNNT2 - Troponina T2
A tabela 5 e 6 apresentam os resultados da análise de associação entre a presença das variantes genéticas identificadas na tabela 4 e as variáveis clínicas contínuas e categóricas, respectivamente. Para essa etapa, foram selecionadas as associações com nível de significância de 15% (valores borderline) para posterior análise de associação entre as combinações dessas variantes e as variáveis clínicas.
Tabela 5: Associação entre a presença das variantes genéticas e as variáveis clínicas contínuas.
Gene rs Característica
N sem variante
Média Mediana Desvio Padrão Mínimo Máximo 1 Quartil 3 Quartil Valor p (*)
N com variante MYBPC3 rs3729986 PAS 69 115,26 118 13,22 80 140 110 130 0,077673 6 103,33 95 17,51 90 130 90 115 PAD 69 74,33 70 10,82 50 100 70 80 0,104475 6 66,67 60 10,33 60 80 60 75 Septo 64 20,47 20 6,74 6 42 16 24,25 0,105549 6 25,83 26 7,57 17 33 20 32,75 MYBPC3 rs3729989 Idade 60 51,45 53,5 17,33 12 80 43,25 64 0,065146 11 40,45 40 18,16 7 61 31 56,5 TNNT2 rs3730238 IMC 76 26,56 26,43 5,24 15,38 39,82 23,06 29,3 0,141565 2 30,52 30,52 1,85 29,21 31,83 29,86 31,17 PAS 73 113,88 110 13,69 80 140 100 120 0,126641 2 130 130 14,14 120 140 125 135 PAD 73 73,27 70 10,59 50 100 70 80 0,083265 2 90 90 14,14 80 100 85 95
Legenda 4: MYBPC3 - proteína C ligadora da miosina; TNNT2 - troponina T2. (*) Análise estatística realizada pelo teste de Mann-Whitney.
Tabela 6: Associação entre a presença das variantes genéticas e as variáveis clínicas categóricas.
Característica Presença Não_N Não_% Sim_N Sim_% Valor p (*) MYBPC3 rs3729986 Síncope Não 36 50 6 100 0,028 Sim 36 50 0 0 0,028 Esp>30 Não 54 87,1 2 40 0,0283 Sim 8 12,9 3 60 0,0283 MCP Não 52 94,5 4 66,7 0,0713 Sim 3 5,5 2 33,3 0,0713 CDI Não 36 50 6 100 0,028 Sim 36 50 0 0 0,028 MYBPC3 rs3729989 Etnia Etnia A 2 2,9 2 18,2 0,0908 Etnia AF 7 10,3 1 9,1 0,0908 Etnia B 27 39,7 3 27,3 0,0908 Etnia C 10 14,7 4 36,4 0,0908 Etnia N 1 1,5 0 0 0,0908 Etnia P 21 30,9 1 9,1 0,0908 MYH7 rs17794387 SAM Não 37 67,3 1 20 0,0557 Sim 18 32,7 4 80 0,0557 Sim 12 27,3 12 50 0,0702 CDI Não 31 60,8 11 40,7 0,1019 Sim 20 39,2 16 59,3 0,1019 TNNT2 rs3730238 Etnia Etnia A 4 5,2 0 0 0,123 Etnia AF 8 10,4 0 0 0,123 Etnia B 30 39 0 0 0,123 Etnia C 12 15,6 2 100 0,123 Etnia N 1 1,3 0 0 0,123 Etnia P 22 28,6 0 0 0,123 SAM Não 38 65,5 0 0 0,1305 Sim 20 34,5 2 100 0,1305
Legenda 5: MYBPC3 - proteína C ligadora da miosina; MYH7 - cadeia pesada da miosina; TNNT2 - troponina T2. (*) Análise estatística realizada pelo teste exato de Fisher.
A variante rs17794387 foi associada à presença de Movimento Anterior Sistólico da Valva Mitral (SAM), presente em 5 pacientes, dos quais apenas um não apresentou SAM.
5. DISCUSSÃO
A CMH, apesar de ser uma doença cardíaca com apresentação familiar hereditária que pode ser causada por diferentes genes, estudos da literatura sugerem que os principais genes causadores da doença são MYH7, MYBPC3 e TNNT2. Assim, o presente estudo visou analisar as variantes encontradas nesses três genes citados, e a suas relações com as características clínicas da CMH.
O nível de significância de p<0,15 foi adotado com a finalidade de, posteriormente, se realizar a análise da influência combinada dessas variantes que apresentaram valores borderline, sobre as características clínicas dos pacientes. Apesar disso, as variantes que apresentaram níveis de significância p<0,15, foram analisadas individualmente neste estudo.
Para a variante rs3729989 (c.706A>G p.Ser236Gly) do gene MYBPC3, os pacientes que possuíam tal variante apresentavam menor idade de desenvolvimento da doença, com média de idade de 40,45 anos, enquanto os que não possuíam a variante apresentavam média de 51,45. Tais dados podem sugerir que a presença dessa variante pode levar a um desenvolvimento precoce da CMH, conforme demonstrado também em um estudo realizado com uma população chinesa, para variantes encontradas no mesmo gene (ZHOU et al., 2018). Estudos prévios já haviam demonstrado resultado semelhante para o gene MYH7, sugerindo que a doença se manifestava mais precocemente em pacientes que apresentavam variações genéticas nesse último gene (MARSIGLIA et al., 2013; SEDAGHAT-HAMEDANI et al., 2018).
A variante rs3729986 (c.472G>A p.Val158Met) do gene MYBPC3 presente em 8 pacientes, foi associada a menor PAS e PAD, com médias de 103,33 e 66,67,respectivamente, contra médias de 115,26 e 74,33, respectivamente, entre os pacientes que não apresentaram a variante. Tais valores podem ser explicados, pelo menos em parte, devido ao fato dos pacientes com a variante possuírem média de septo maior, de 25,83 mm, enquanto os que não possuíam a variante possuírem média de 20,47. Considerando que os miócitos cardíacos apresentam-se mais fortemente acoplados em pacientes com CHM (MARIAN,
2010), então o maior tamanho do septo indicaria menor capacidade de contração dos músculos, justificando a queda na PAS e PAD.
Além disso, nenhum dos pacientes com a variante rs3729986 (c.472G>A p.Val158Met) do gene MYBPC3 fez uso de CDI ou apresentaram episódios de síncope. Segundo estudos, a variante foi classificada como polimórfica e, considerando esta classificação, tal fato sugere que esta variante pode exercer certo efeito benéfico sobre a não necessidade do uso de CDI (TOBITA et al., 2018). Por outro lado, a variante rs376897125 (c.958G>A p.Val320Met) do gene MYH7, presentes em 23 e 3 pacientes respectivamente, além de outros dois pacientes que apresentavam as duas variantes simultaneamente, foi associada à maior necessidade do uso do dispositivo, indicando portanto, maior propensão ao risco de desenvolver CMH e MSC.
As variantes rs376897125 (c.958G>A p.Val320Met) e rs121913625 (c.1357C>T, p.Arg453Cys), ambas do gene MYH7, apesar de não terem sido encontrados em grandes proporções, apresentaram resultados interessantes. A primeira, apesar de ter sido identificada em apenas 5 dos pacientes em estudo, todos os pacientes que apresentaram a variante pertenciam ao gênero feminino. Dados opostos, relacionados ao gênero, já haviam sido encontrados para os genes MYBPC3 e TNNT2, apresentando, contudo, uma prevalência de pacientes do gênero masculino (SEDAGHAT-HAMEDANI et al., 2018). Para a segunda variante, apesar de apenas 2 pacientes terem-na apresentado, os resultados demonstraram significativa redução na PAS e PAD em aproximadamente 20%, e redução de FE em aproximadamente 11% quando comparados aos indivíduos que não apresentaram a variante. A redução nesses valores pode ser explicada devida à relação da variante com fenótipo de hipertrofia severa e maior risco associado à MSC, impossibilitando a contração dos miócitos cardíacos (CASTRANOVA et al., 2016).
A variante rs3730238 (c.788A>G p.Lys263Arg) do gene TNNT2 foi associado a um pequeno aumento nos níveis de PAS e PAD, apresentando valores médios de 130 e 90, respectivamente, contra 113,88 e 73,27,
uma relação com o IMC, onde os pacientes com a variante possuíam média de IMC de 30,52 kg/m2, enquanto os que não possuíam a variante possuíam média de 26,56 kg/m2. O aumento no valor de IMC pode estar associado à obesidade, uma vez que estudos anteriores já haviam demonstrado uma maior propensão à CMH em pacientes obesos (ROMA-RODRIGUES; FERNANDES, 2014).
As características do único paciente a apresentar variantes nos três genes em estudo foram PAS e PAD dentro dos valores normais (120:80), apesar de apresentar IMC de 31,84 e ser classificado como Obeso de grau I. Possuía fração de ejeção (FE) de 69, sendo considerada normal os valores > 50 (ZHOU et al., 2018), e septo de 30 mm, sendo a faixa normal variando entre 6 a 12 mm (ZHOU et al., 2018). Assim, apesar desse paciente ter apresentado variantes nos três principais genes envolvidos com a CMH, observou-se que os valores de PAS e PAD não foram influenciados pela quantidade de variantes. Os valores elevados do IMC deste paciente podem ser explicados devido à presença da variante rs3730238 (c.788A>G p.Lys263Arg) do gene TNNT2, conforme explicado anteriormente.
Apesar dos grandes benefícios que podem ser gerados a partir dos diagnósticos de doenças genéticas através do sequenciamento em larga escala, grandes desafios ainda precisam ser superados. Além da necessidade de treinar os prestadores dos serviços de saúde para incorporar informações genéticas em suas práticas (MARIAN; BRAUNWALD, 2017), pode-se citar ainda os efeitos sociais que o conhecimento das informações genéticas podem gerar. Em 2003, testes genéticos entraram no escopo dos sistemas de saúde americano, mas apenas em 2008 foi criada uma proteção legislativa para impedir que prestadores de serviços de saúde e empresas privadas utilizassem tais informações como critérios de decisão, no que ficou conhecido como Genetic Information Non-Discrimination Act (GINA) (ZHOU et al., 2018).
6. CONCLUSÃO
Conforme um estudo prévio do nosso grupo de pesquisa intitulado “Análise Exômica Em Pacientes Portadores De Cardiomiopatia Hipertrófica”, os resultados encontrados nos 80 pacientes sequenciados apresentaram prevalência de
variantes genéticas nos genes MYBPC3 (37,5%), MYH7 (53,75%) e TTNT2 (6,25%)
As principais variantes genéticas encontradas no presente estudo foram as variantes rs17794387 (c.*113G>A) do gene MYH7, rs3729989 (c.706A>G p.Ser236Gly) e rs3729986 (c.472G>A p.Val158Met) do gene MYBPC3 e rs3730238 (c.788A>G p.Lys263Arg) do gene TNNT2. A variante rs3729989 apresentou relação com um desenvolvimento precoce da doença.
A variante rs3729986 (c.472G>A p.Val158Met) do gene MYBPC3 e rs121913625 (c.1357C>T, p.Arg453Cys) do gene MYH7, apresentaram indícios de relação de diminuição da PAS, PAD e FE, além de aumento do tamanho médio do septo cardíaco.
Apesar de diversas variantes terem apresentado indícios que poderiam estar relacionados à certas características clínicas (p<0,15), a variante rs3729986 foi a única que apresentou níveis de significância p<0,05 com as características síncope, espessura do septo>30 e uso de CDI.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BAMSHAD, M. J. et al. Exome sequencing as a tool for Mendelian disease gene discovery. Nature Reviews Genetics, v. 12, n. 11, p. 745–755, 27 nov. 2011. CASTRANOVA, V. et al. HHS Public Access. v. 7, n. 3, p. 1922–2013, 2016. INGLES, J. Compound and double mutations in patients with hypertrophic cardiomyopathy: implications for genetic testing and counselling. Journal of
Medical Genetics, v. 42, n. 10, p. e59–e59, 1 out. 2005.
INGLES, J.; SEMSARIAN, C. Sudden cardiac death in the young: a clinical genetic approach. Internal Medicine Journal, v. 37, n. 1, p. 32–37, jan. 2007.
MARIAN, A. J. Hypertrophic cardiomyopathy: From genetics to treatment.
European Journal of Clinical Investigation, v. 40, n. 4, p. 360–369, 2010.
MARIAN, A. J. Molecular genetic studies of complex phenotypes. Translational
Research, v. 159, n. 2, p. 64–79, fev. 2012.
MARIAN, A. J.; BRAUNWALD, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation
MARON, B. J. Hypertrophic Cardiomyopathy. The Lancet, v. 350, n. 9071, p. 127– 133, 1997.
MARON, B. J.; ANAN, T. J.; ROBERTS, W. C. Quantitative analysis of the distribution of cardiac muscle cell disorganization in the left ventricular wall of patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation, v. 63, n. 4, p. 882–894, 1 abr. 1981.
MARON, B. J.; GOTTDIENER, J. S.; EPSTEIN, S. E. Patterns and significance of distribution of left ventricular hypertrophy in hypertrophic cardiomyopathy. The
American Journal of Cardiology, v. 48, n. 3, p. 418–428, set. 1981.
MARON, B. J.; MARON, M. S.; SEMSARIAN, C. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy after 20 years: clinical perspectives. Journal of the American
College of Cardiology, v. 60, n. 8, p. 705–15, 21 ago. 2012.
MARSIGLIA, J. D. C. et al. Screening of MYH7, MYBPC3, and TNNT2 genes in Brazilian patients with hypertrophic cardiomyopathy. American Heart Journal, v. 166, n. 4, p. 775–782, 2013.
MATTOS, B. P. E et al. Prevalence and Phenotypic Expression of Mutations in the MYH7, MYBPC3 and TNNT2 Genes in Families with Hypertrophic Cardiomyopathy in the South of Brazil: A Cross-Sectional Study. Arquivos Brasileiros de
Cardiologia, p. 257–265, 2016.
MONTAG, J. et al. Successful knock-in of Hypertrophic Cardiomyopathy-mutation R723G into the MYH7 gene mimics HCM pathology in pigs. Scientific Reports, v. 8, n. 1, p. 4786, 2018.
NÚÑEZ, L. et al. Somatic MYH7, MYBPC3, TPM1, TNNT2 and TNNI3 mutations in sporadic hypertrophic cardiomyopathy. Circulation journal : official journal of
the Japanese Circulation Society, v. 77, n. 9, p. 2358–65, 2013.
RODRÍGUEZ-CALVO, M. S. et al. Molecular genetics of sudden cardiac death.
Forensic Science International, v. 182, n. 1–3, p. 1–12, nov. 2008.
RODRÍGUEZ, J. E.; MCCUDDEN, C. R.; WILLIS, M. S. Familial hypertrophic cardiomyopathy: Basic concepts and future molecular diagnostics. Clinical
Biochemistry, v. 42, n. 9, p. 755–765, jun. 2009.
cardiomyopathy: Advances and pitfalls in molecular diagnosis and therapy.
Application of Clinical Genetics, v. 7, p. 195–208, 2014.
SEDAGHAT-HAMEDANI, F. et al. Clinical outcomes associated with sarcomere mutations in hypertrophic cardiomyopathy: a meta-analysis on 7675 individuals.
Clinical Research in Cardiology, v. 107, n. 1, p. 30–41, 2018.
TEARE, D. ASYMMETRICAL HYPERTROPHY OF THE HEART IN YOUNG ADULTS. 1957.
TOBITA, T. et al. Genetic basis of cardiomyopathy and the genotypes involved in prognosis and left ventricular reverse remodeling. Scientific Reports, v. 8, n. 1, p. 1–11, 2018.
ZHOU, N. et al. Whole-exome sequencing identifies rare compound heterozygous mutations in the MYBPC3 gene associated with severe familial hypertrophic cardiomyopathy. European Journal of Medical Genetics, n. October 2017, p. 0– 1, 2018.
8. ANEXOS
