Arapongas 2016
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM SAÚDE E PRODUÇÃO DE RUMINANTES
DIMAS BARTH NETO
DETECÇÃO DE PAPILOMAVIRUS E CARACTERIZAÇÃO
GENOTIPICA EM BOVINOS LEITEIROS
DIMAS BARTH NETO
DETECÇÃO DE PAPILOMAVIRUS E CARACTERIZAÇÃO
GENOTIPICA EM BOVINOS LEITEIROS
Orientador: Dr. Werner Okano
Arapongas 2016
Dissertação apresentada à UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Saúde e Produção em Ruminantes.
DIMAS BARTH NETO
DETECÇÃO DE PAPILOMAVIRUS E CARACTERIZAÇÃO
GENOTIPICA EM BOVINOS LEITEIROS
Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Saúde e
Produção em Ruminantes, área de concentração em Saúde de
Ruminantes como requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos
professores:
_________________________________________
Prof. Dr. Werner Okano
UNOPAR
_________________________________________
Prof. Dr. Alexey Leon Gomel Bogado
UNOPAR
_________________________________________
Prof. Dr. Luiz César da Silva
UNOPAR
Dedico este trabalho a meus pais Antônio Carlos e Sandra, meus irmãos Marcela e Mário e Minha namorada Elenise
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradecer a Deus pela vida.Aos meus pais Antônio Carlos e Sandra que incessantemente dedicaram suas vidas, não só para a minha formação acadêmica, mas principalmente para a minha formação como ser humano, sempre orientando e buscando a cada dia corrigir onde foi preciso e elogiar quando merecido.
A minha namorada Elenise, pela compreensão na falta de atenção e apoio na caminhada.
Aos meus irmãos Marcela e Mario pelo apoio.
Ao meu orientador professor Dr. Werner Okano, pelo tempo dedicado, pelos ensinamentos, auxilio, compreensão e palavras de conforto durante esse tempo em que se fez presente o período do Mestrado.
Aos professores, funcionários e acadêmicos da UNOPAR e da UEL por tudo que nos foi repassado em sala de aula e no convívio fora dela.
Aos colegas do mestrado, pelos momentos de aulas, pelos trabalhos dentro e fora da sala de aula, aos quais nos proporcionaram momentos muito importantes e amizades duradouras e para vida pessoal e profissional.
A Dra. Liria Okuda e toda a equipe do Laboratório de Viroses dos Bovídeos do Instituto Biológico de São Paulo, pelo auxilio na parte laboratorial.
A UNOPAR e a UEL, pela oportunidade dada, oferecendo suas instalações e profissionais para o sucesso de nosso curso.
A todos as pessoas envolvida, seja direta ou indiretamente, o meu mais sincero agradecimento.
BARTH NETO, DIMAS. DETECÇÃO DE PAPILLOMAVIRUS E CARACTERIZAÇÃO GENOTIPICA EM BOVINOS. 2016. 36p. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde e Produção de Ruminantes) – Universidade Norte do Paraná, Arapongas, 2016.
RESUMO
O objetivo do presente trabalho foi avaliar a ocorrência de p apilomavírus
e genotipagem das amostras sequenciadas em bovinos leiteiros,
correlacionando com a região e formato macroscópico, quantificar e identificar os diferentes tipos de papilomas presentes no rebanho em questão, localizado no Município de Candido de Abreu, Estado do Paraná. As amostras foram analisadas no laboratório de viroses dos bovídeos, no Instituto Biológico de São Paulo, pela técnica da PCR e posterior sequenciamento das amostras positivas. Das 38 amostras enviadas, oito foram detectadas pela PCR e duas encaminhadas ao sequenciamento. O BPV1 e BPV6 foram os resultados encontrados no sequenciamento.
BARTH NETO, DIMAS. DETECTION OF PAPILOMAVIRUS AND GENOTYPICAL CHARACTERIZATION IN BOVINE ANIMALS. 2016. 36p. Dissertation (Master's Degree in Health and Ruminant Production) - Northern University of Paraná, Arapongas, 2016.
ABSTRACT
The objective of the present work was to evaluate the occurrence of apilomavirus and genotyping of the sequenced samples in dairy cattle, correlating with the region and macroscopic format, quantify and identify the different types of papillomas present in the herd in the municipality of Candido de Abreu, State of Parana. The samples were analyzed in the laboratory of bovine viruses at the Biological Institute of São Paulo, by PCR technique and subsequent sequencing of the positive samples. Of the 38 samples sent, eight were detected by PCR and two were sent to the sequencing. BPV1 and BPV6 were the results found in the sequencing.
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 – Identificação Animal e Amostra... 18 QUADRO 2 – Primers utilizados na PCR para diagnóstico do Papilomavírus. 20 QUADRO 3 – Ciclo de amplificação da PCR para Papilomavírus... 21 QUADRO 4 – Preparo da mistura de reagentes para reação de ...sequenciamento... 22 QUADRO 5 – Ciclo de amplificação da reação de sequenciamento... 22 QUADRO 6 – Resultados PCR...24 QUADRO 7 - Matriz de identidade entre as sequências de nucleotídeos de um fragmento do gene L1 do BPV, obtidas a partida de lesões cutâneas em
bovinos e as sequências do BPV 1 a 13 (GenBank)...26
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Animais adultos acometidos pela papilomatose...17
. FIGURA 2 – Colheita de amostra de papiloma de um bovino leiteiro adulto...19
FIGURA 3 – Maceração dos papilomas em fluxo laminar...20
FIGURA 4 – Cuba de eletroforese (IB)...21
FIGURA 5 – Resultados Eletroforese ...25
FIGURA 6 – Animais cujas amostras foram sequenciadas ...27
FIGURA 7 – a árvore filogenética construída a partir das sequências do gene parcial L1 do papilomavírus bovino amplificado pela PCR com primers degenerados (FAP59 e FAP64), utilizando-se o método Maximum Likelihood e modelo evolutivo Kimura 2-parâmetro, mostrando a relação filogenética entre as estirpes padrão de papilomavírus bovino 1 a 13 e as duas sequências obtidas no presente estudo, norte do Paraná. Os gêneros Deltapapillomavirus, Epsilonpapillomavirus, Xipapillomavirus e Dyoxipapillomavirus aos quais as sequencias pertencem estão indicadas na árvore. Os números em cada um dos ramos representam as porcentagens de ocorrência dos agrupamentos com base em análises de bootstrap de 1000 repetições. A barra de escala indica o número de substituições por posição de nucleotídeo...28
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BPV – Papilomavírus Bovino DNA – Ácido Desoxirribonucleico
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético HEB – Hematúria Enzoótica Bovina
IB – Instituto Biológico
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MIN - Minuto
L - Microlitro
M- Micrometro Ng- Nanograma PB – Par de Bases
PCR – Reação em Cadeia de Polimerase PV – Papilomavírus
SEG – Segundo
TBE – Mistura de base T(tris), Ácido Bórico e EDTA USP – Universidade de São Paulo
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 12 2 OBJETIVOS ...13 2.1 OBJETIVO PRINCIPAL ...13 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...13 3 REVISÃO DE LITERATURA ...14 3.1 PAPILOMAVÍRUS BOVINO (BPV) ...14 4 MATERIAL E MÉTODOS ...17 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...24 6 CONCLUSÃO...30 7 REFERÊNCIAS ... 31
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1 INTRODUÇÃO
O rebanho bovino brasileiro chegou a 212,3 milhões de cabeças em 2014, sendo considerado o segundo maior rebanho do mundo, segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2016) desde 2004, o Brasil assumiu a liderança nas exportações de carne, com um quinto da carne comercializada internacionalmente e vendas em mais de 180 países.
Dentro deste cenário, há uma imensa necessidade nacional e mundial em se garantir, a sanidade animal, a qual está intimamente ligada a saúde pública. Dentre as enfermidades que acometem os bovinos, a papilomatose bovina, tem causado importantes prejuízos econômicos a produtores rurais.
O BPV é endêmico pelo mundo e sua transmissão pode se dar pela forma direta, onde se tem contato com animais infectados ou pela forma indireta por meio de áreas contaminadas, utensílios de ordenha, cercas, bebedouros e comedouros entre outros.
Existem atualmente descritos na literatura 13 tipos de BPV bem caracterizados, cada tipo de BPV pode causar diferentes lesões de acordo com o tipo de célula e/ou tecido e a região do corpo infectado.
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2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a presença do Papilomavirus bovino em neoformação cutânea de bovinos.
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Realizar a PCR das amostras colhidas, e
Realizar o sequenciamento para caracterização do genótipo e construção da árvore filogenética.
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3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 PAPILOMAVIRUS BOVINO (BPV)
De acordo com o MAPA (2016), o rebanho bovino brasileiro proporciona o desenvolvimento de dois segmentos lucrativos, as cadeias produtivas da carne e leite. O valor bruto da produção desses dois segmentos é estimado em R$ 67 bilhões, aliado a presença da atividade em todos os estados brasileiros, evidenciam a importância econômica e social da bovinocultura em nosso país.
Em 2014, a produção brasileira de leite foi de 35,2 bilhões de litros, um aumento de 2,7% sobre o ano anterior. Com isso, o Brasil ocupou a quinta posição no ranking mundial de produção de leite, atrás de União Europeia, Índia, Estados Unidos e China (MAPA, 2016).
Neste cenário, a papilomatose bovina tem grande importância, devido as perdas causadas com a condenação do couro no abate, de doenças ligadas a papilomatose, como exemplo a Hematúria Enzoótica Bovina (HEB) e com as perdas relacionadas a produção de leite. Apesar da alta incidência da infecção por BPV, a identificação de seus tipos em rebanhos brasileiros ainda é esporádica (CLAUS et al., 2007).
A papilomatose vem se destacando como uma das principais enfermidades, sobretudo pela dificuldade no processo da ordenha e transmissão entre animais na mesma propriedade. Araldi (2014), destaca a queda na produção leiteira, decorrente de quadros de mastite e obstrução dos tetos, dificultando a colocação de ordenhadeira, a desvalorização dos animais e a depreciação do couro. Segundo Pacheco (2006), a papilomatose bovina tem gerado importantes impactos econômicos aos produtores, afetando a produção nacional.
O Papilomavírus (PV) é um grupo de vírus de DNA fita dupla, oncogênicos pertencentes a família Papillomaviridae, que apresenta tropismo pelo tecido epitelial escamoso e mucoso (ARALDI, 2014; MONTEIRO et al., 2008). Causam lesões assintomáticas e também podem determinar lesões benignas ou malignas, em várias espécies de mamíferos (MONTEIRO et al., 2008).
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Santin e Britto (2003), descrevem as lesões como sendo topograficamente
especificas, que se caracterizam por uma estrutura macro e
microscopicamente particular, sendo causadas por tipos de PV distintos.
Os PV infectam células basais do epitélio, resultando em hiperplasia das células da camada espinhosa e acantose, acompanhadas de hiperqueratose, consequentemente, o tecido conjuntivo subjacente acompanha o mesmo processo que acontece no epitélio, tanto pela ação do estimulo viral, como para nutrir e suportar mecanicamente a hiperplasia do tecido epitelial (SANTIN e BRITTO, 2003).
Atualmente, 13 tipos diferentes de BPV’s foram identificados e agrupados em quatro gêneros: os BPV´s epiteliotrópicos, BPV´s 3, 4, 6, 9, 10, 11 e 12, são definidos como Xi-papilomavírus, os Delta-papilomavírus compreende os BPV´s 1, 2 e 13 e ao gênero Epsilon-papilomavírus pertencem os BPV´s 5 e 8, cujos genomas parecem partilhar semelhanças com ambos Xi e
Delta-papilomavírus (KUMAR et al., 2013, OGAWA et al., 2007). O BPV 7 foi
recentemente classificado em um novo gênero, Dyoxipapillomavirus (LUNARDI et al., 2016).
De acordo com Albuquerque (2012), os BPV’s produzem lesões em diferentes regiões do corpo do animal ocasionando diversas complicações. Os BPV’s 1 e 2 são os principais agentes de fibropapilomas cutâneos. O BPV 1 também pode causar fibropapilomas nos tetos e no pênis e o BPV 2 no trato digestório. O BPV 5 causa fibropapilomas em forma de grão de arroz no úbere e os BPV’s 3, 8, 4 e 6 papilomas epiteliais cutâneos, papilomas do epitélio do trato digestório e papiloma epitelial de tetas, respectivamente. Já os BPV’s 9 e 10 foram descritos como causadores de papilomas escamosos do úbere. São considerados carcinogênicos os BPV’s 1, 2 e 4, sendo os tipos 1 e 2 relacionados com o carcinoma de bexiga urinária e o BPV 4 com o carcinoma do trato digestório superior. BPV 7 foi detectado, principalmente, a partir de amostras de esfregaços de pele da teta saudável, e também foi identificado em apenas algumas lesões de tetas de vacas leiteiras no Japão (OGAWA et al., 2004; TOZATO et al., 2013).
Araldi (2014), descreve o BPV 11, como sendo associado a papilomas cutâneos, e o BPV 12 a papilomas epiteliais cutâneas e de língua e Lunardi et al. (2013), descrevem o BPV 13 associado a indução de fibropapilomas.
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A maioria das viroses patogênicas pode ser diagnosticada por meio de técnicas tradicionais de virologia como cultura de células, microscopia eletrônica ou sorologia. Entretanto nenhum desses métodos é aplicado rotineiramente. Para o diagnóstico dos PVS são frequentemente utilizadas técnicas que detectam o DNA viral, a PCR (VIVIAN, 2006).
Vivian (2006), descreve a PCR como uma técnica que permite a amplificação de segmentos específicos do DNA ou RNA in vitro. Após o seu desenvolvimento em 1985, a técnica foi rapidamente difundida à medida que se expandiram novos campos de aplicabilidade na biologia molecular também para o diagnóstico. Atualmente, devido à alta sensibilidade e especificidade, é considerada uma das técnicas mais importantes na biologia molecular. A capacidade de obter um aumento do número de sequências de DNA em poucas horas, a especificidade e a fidelidade à enzima utilizada, faz da PCR um instrumento versátil quando aplicada no campo diagnóstico. A sua aplicação em situações nas quais os agentes etiológicos envolvidos são difíceis e lentos de serem cultivados fazem desta estratégia a mais adequada para o diagnóstico etiológico, disponibilizando sequências de DNA para a análise filogenética. Devido à praticidade, sensibilidade e especificidade a PCR tem sido amplamente utilizada para o diagnóstico e caracterização molecular dos PVs de origem humana e animal em todo o mundo (WOSIACKI et al., 2005).
Dentre as formas de profilaxia e tratamento, a auto vacina espécie-específica apresenta a mais eficiente, com níveis de recuperação próxima a 50% (SILVA et al., 2004).
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4 MATERIAL E MÉTODOS
A coleta dos papilomas ocorreu em uma propriedade leiteira localizada no Município de Candido de Abreu (24º 34’ 01” S 51º 19’ 58” O), no estado do Paraná, em julho de 2015. O rebanho tinha predominância de animais da raça Holandês variedade preto e branco (Figura 1). Havia um alto grau de animais acometidos pela enfermidade, o que estava causando diversos problemas na produção de leite da propriedade, tais como dificuldade na ordenha a problemas estéticos.
Figura 1 - Animais adultos acometidos pela papilomatose.
A coleta foi realizada utilizando-se da contenção física dos animais, para posterior aplicação de anestésico local sem vaso constritor, para posteriormente se realizar a extração do papiloma, sendo utilizado para cada incisão uma lamina de bisturi n° 20, uma pinça anatômica e um par de luvas descartáveis para cada amostra (Figura 2). Foram coletadas amostras de de 18 animais de idade variável, sendo 17 fêmeas e 1 macho (Quadro 1).
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Quadro 1 - Identificação do animal e amostra
Identificação do Animal na Propriedade. N° Amostra. N° Amostra IB.
1786 1 17235 1787 2 17236 1787 3 17237 5003 4 17238 5034 5 17239 5038 6 17240 5050 7 17241 5054 8 17242 5054 9 17243 5054 10 17244 5054 11 17245 5055 12 17246 5055 13 17247 5055 14 17248 5056 15 17249 5056 16 17250 5056 17 17251 5057 18 17252 5057 19 17253 5057 20 17254 5061 21 17255 5061 22 17256 5061 23 17257 5075 24 17258 5075 25 17259 5077 26 17260 5077 27 17261 5086 28 17262 5086 29 17263 5086 30 17264 5090 31 17265 5090 32 17266 5091 33 17267 5091 34 17268 5804 35 17269 5804 36 17270 5804 37 17271 Macho 38 17272
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Os diversos tipos de papilomas foram coletados de vários locais do corpo dos animais, perfazendo um total de 38 amostras diferente, as quais foram devidamente identificadas e acomodadas em sacos plásticos individuais identificados e acondicionados em caixa isotérmica com gelo reciclável.
Figura 2 - Colheita de amostra de papiloma de um bovino leiteiro adulto.
Após a coleta, o material foi enviado para o laboratório da Unopar – Arapongas para congelamento a temperatura de – 20º C e posteriormente encaminhado para o Laboratório de Viroses dos Bovídeos, pertencente ao Instituto Biológico (IB) de São Paulo, para a realização das análises da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) e sequenciamento do DNA viral.
No Laboratório de Viroses dos Bovídeos as amostras foram processadas conforme descrito a seguir.
Cerca de 100 mg de papilomas foram macerados individualmente para extração do DNA utilizando o reagente Trizol® (FIGURA 3) conforme as orientações do fabricante.
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Figura 3 - Maceração dos papilomas em fluxo laminar.
A amplificação do segmento de DNA realizou-se empregando oligonucleotídeos iniciadores (primers) genéricos para BPV (gene L1) descritos por Forslund et al. (1999) conforme quadro 02. Como controle positivo foi utilizado papilomas cutâneos, cedidos pela Universidade de São Paulo (USP), confirmados pela PCR e sequenciamento no Laboratório de Viroses de Bovídeos.
Quadro 02 - Primers utilizados na PCR para diagnóstico do papilomavírus.
Primers Sequência de nucleotídeos Autor e ano
FAP59 FAP64
5’-TAA CWG TIG GIC AYC CWT ATT-3’ 5’-CCW ATA TCW VHC ATI TCI CCA TC-3’
Forslund et
al. (1999)
Para volume total de 25 L de reação, a mistura de reagentes para amplificação compreendeu 100 ng do DNA da amostra extraída, 12.5L do tampão do kit comercial PCR Master Mix™ Promega® e 0,75 M de cada primer.
O ciclo de amplificação está descrito no quadro 03 e seguiu as instruções descritas por Forslund et al. (1999).
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Quadro 03 – Ciclo de amplificação da PCR para Papilomavírus.
Procedimento Temperatura Tempo (min)
Desnaturação Inicial 94⁰C 10 Desnaturação 94⁰C 1 Anelamento 49,5⁰C 1 Extensão 72⁰C 1 Extensão Final 72⁰C 5 4⁰C HOLD
A análise dos produtos amplificados foi realizada por eletroforese (100V/60min) em gel de agarose a 1,5%, em tampão TBE 1X e evidenciada com Gel Red diluído 1:150 (FIGURA 4). O tamanho dos fragmentos de DNA foi comparado com um padrão de peso molecular de 100 pb (DNA ladder de 100 pb – Thermo Scientific®). O tamanho esperado foi de aproximadamente de 431 pb.
Figura 4 - Cuba de eletroforese (IB).
As amostras positivas foram submetidas ao sequenciamento de Sanger, conforme descrito abaixo:
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O produto da PCR foi purificado usando o kit Wizard DNA and PCR Clean-up da Promega® seguindo instruções do fabricante.
Os primers utilizados para a reação de sequenciamento foram FAP59 e FAP64. Para volume total de 10 L de reação de sequenciamento utilizou-se o kit BigDye 3.1 Xterminator kit® (Applied Biosystems), conforme demonstrado no quadro 4.
Quadro 4 – Preparo da mistura de reagentes para a reação de sequenciamento
REAGENTE 1 Amostra (µl) Big Dye v. 3.1 2 Sequencing Buffer 5 x 2 Primer (3.2 pmol/µl) 1,5 DNA purificado 4,5 TOTAL 10
Para reação de sequenciamento adotou-se o seguinte ciclo:
Quadro 5 – Ciclo de amplificação da reação de sequenciamento
N° de ciclos Temperatura (°C) Tempo
1 ciclo 95 01 min 35 ciclos 95 30 seg 50 15 seg 60 04 min Hold 4
Em seguida, os produtos foram precipitados utilizando o kit BigDye Xterminator para remoção de reagentes não incorporados, como primers, dideoxinucleotídeos marcados (TAMURA et al., 2011).
As sequências de nucleotídeos pertencentes ao gene parcial L1 foram submetidas ao alinhamento múltiplo utilizando a ferramenta ClustalW presente no software BioEdit 7.0.5 (Ibis Therapeutics, Carlsbad, CA, EUA) (HALL, 1999). Foram determinadas sequências referências dos 13 genótipos do
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do presente estudo. O número de acesso (n.a.) do GenBank das sequências usadas foram: BPV-1 (n.a. X02346; KU736826; KU728468; KF284141; KC595244; JX678969; AB626705; JX046508 e PPB1P), BPV-2 (n.a. PPB2CG), BPV-3 (n.a. NC_004197), BPV-4 (n.a. X05817), BPV-5 (n.a. AJ620206), BPV-6 (n.a. AJ620208; HM245430; KU865634 e JX046513), BPV-7 (n.a. DQ217793), BPV-8 (n.a. DQ098913), BPV-9 (n.a. AB331650), BPV-10 (n.a. AB331651), BPV-11 (n.a. AB543507), BPV-12 (n.a. JF834523), and BPV-13 (n.a. JQ798171).
Com o mesmo software foi também calculado o percentual de identidade entre as sequências. A árvore filogenética foi construída com as sequências supracitadas e as obtidas no presente trabalho com o auxílio do software MEGA v.7, (KUM et al., 2016) utilizando o método maximum-likelihood e modelo evolutivo Kimura 2-parâmetro. Os números em cada um dos ramos representam as porcentagens de ocorrência dos agrupamentos com base em análises de bootstrap de 1000 repetições.
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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir das análises das PCR das 38 amostras, obtivemos os resultados positivos em oito amostras, 21,05% (8/38) descritos no quadro 6.
Quadro 6 – Resultados PCR Identificação do Animal na Propriedade. Resultado 1786 Negativo 1787 Negativo 1787 Negativo 5003 Negativo 5034 Negativo 5038 Negativo 5050 Positivo 5054 Negativo 5054 Negativo 5054 Negativo 5054 Positivo 5055 Negativo 5055 Negativo 5055 Positivo 5056 Negativo 5056 Negativo 5056 Negativo 5057 Positivo 5057 Negativo 5057 Positivo 5061 Negativo 5061 Negativo 5061 Positivo 5075 Negativo 5075 Negativo 5077 Negativo 5077 Negativo 5086 Negativo 5086 Negativo 5086 Negativo 5090 Negativo 5090 Negativo 5091 Negativo 5091 Negativo 5804 Negativo 5804 Positivo 5804 Negativo Macho Positivo
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O quadro 6 nos traz as informações contidas no relatório de ensaio LVB RE 2016/0001539, Triagem n° 02473/15, emitido pelo IB de São Paulo em 09 de setembro de 2016.
Os resultados obtidos na Eletroforese estão ilustrados na Figura 5.
Figura 5 – Resultados Eletroforese.
As amostras positivas foram avaliadas e duas foram encaminhadas para o sequenciamento genético, as quais foram obtidos os resultados descritos no Quadro 7. A amostra positiva e sequenciada para o BPV 6, é a identificada como LVB 17245, oriunda do animal n°5054, conforme Figura 6. Já a amostra positiva e sequenciada para o BPV 1, é a LVB 17272, oriunda da colheita do macho, também apresentada na Figura 6.
A sequência do BPV 6 apresentou 100% de identidade com as amostras padrões utilizadas para a análise, enquanto a sequência do BPV 1 apresentou identidade entre 93 e 94,4% com as amostras padrões utilizadas para a análise.
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Quadro 7 - Matriz de identidade entre as sequências de nucleotídeos de um fragmento do gene L1 do BPV, obtidas a partida de lesões cutâneas em bovinos e as sequências do BPV 1 a 13 (GenBank).
Sequências do GenBank Amostras sequenciadas UNOPAR-BR BPV-1 UNOPAR-BR BPV-6 BPV-1 (KU736826) 94,4 55,8 BPV-1 (KU728468) 94,4 55,8 BPV-1 (KF284141) 93,8 56 BPV-1 (KC595244) 94,4 55,8 BPV-1 (JX678969) 93 57,1 BPV-1 (X02346) 93,8 56 BPV-1 (AB626705) 93,8 56 BPV-1 (JX046508) 94,4 55,8 BPV-1 (PPB1P) 93,8 56 BPV-2 (PPB2CG) 80,5 56,9 BPV-3 (NC_004197) 51,3 67,4 BPV-4 (X05817) 50,8 66,5 BPV-5 (AJ620206) 61,6 53,8 BPV-6 (AJ620208) 52,2 100 BPV-6 (HM245430) 52,2 100 BPV-6 (KU865634) 52,2 100 BPV-6 (JX046513) 52,2 100 BPV-7 (DQ217793) 45,3 62,2 BPV-8 (DQ098913) 60,5 54,4 BPV-9 (AB331650) 51,1 71 BPV-10 (AB331651) 54,1 66 BPV-11 (AB543507) 51,9 67,7 BPV-12 (JF834523) 51,9 65,4 BPV-13 (JQ798171) 81,1 57,4
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Figura 6 – Animais cujas amostras foram sequenciadas.
No final, o presente trabalho foi possível identificar dois genótipos de BPV’s de dois diferentes gêneros, presentes no rebanho problema, apesar do alto grau de infestação e das diferentes localizações das lesões.
Deve-se considerar também, para tal resultado, a questão do tempo de congelamento e conservação das amostras, as quais ficaram por mais de um ano conservadas antes de se iniciar as análises, o que pode ter comprometido em partes a extração de DNA, diminuindo a sua qualidade e interferindo nos resultados da PCR, uma vez que apenas oito amostras de 38 foram positivas.
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A Figura 7 apresenta a árvore filogenética construída a partir das sequências do gene parcial L1 do papilomavírus bovino amplificado pela PCR com primers degenerados (FAP59 e FAP64), utilizando-se o método Maximum
Likelihood e modelo evolutivo Kimura 2-parâmetro, mostrando a relação
filogenética entre as estirpes padrão de papilomavírus bovino 1 a 13 e as duas sequências obtidas no presente estudo, norte do Paraná. Os gêneros
Deltapapillomavirus, Epsilonpapillomavirus, Xipapillomavirus e
Dyoxipapillomavirus aos quais as sequencias pertencem estão indicadas na
UNOPAR-BR BPV-1 KU736826 BPV-1 KU728468 BPV-1 KC595244 BPV-1 JX046508 BPV-1 KF284141 BPV-1 X02346 BPV-1 AB626705 BPV-1 PPB1P BPV-1 JX678969 BPV-1 PPB2CG BPV-2 JQ798171 BPV-13 Delta AJ620206 BPV-5 DQ098913 BPV-8 Epsilon Dyoxi DQ217793 BPV-7 JX046513 BPV-6 KU865634 BPV-6 HM245430 BPV-6 AJ620208 BPV-6 UNOPAR-BR BPV-6 Xi AB331650 BPV-9 AB543507 BPV-11 X05817 BPV-4 AB331651 BPV-10 NC 004197 BPV-3 Xi Xi JF834523 BPV-12
29
árvore. Os números em cada um dos ramos representam as porcentagens de ocorrência dos agrupamentos com base em análises de bootstrap de 1000 repetições. A barra de escala indica o número de substituições por posição de nucleotídeo.
Vivian (2006) também trabalhando com rebanho bovino no Paraná isolou três tipos de BPV, sendo 1, 2 e 6 diferentemente do presente estudo que isolou BPV1 e BPV6.
Segundo Bam et al. (2013) o BPV1 é responsável pelos fibropapilomas, Bloch et al. (1994) relatam a regressão espontânea deste tipo de BPV, fato este não observado na presente pesquisa. Apesar do BPV1 estar ligado a neoplasia urinária acarretando a hematúria enzootica bovina (BAM et al., 2013; PATHANIA et al., 2011) em nenhum dos animais do plantel havia relato de hematúria.
BPV6 pode ocasionar a neoplasia cutânea, sendo descritas com aspecto plano, achatado ou redondo em tetos (JARRET et al., 1984; SMITH, 1990), fato este observado na presente pesquisa.
30
6 CONCLUSÃO
Identificou-se dois genótipos de BPV’s de dois diferentes gêneros, presentes no rebanho problema, apesar do alto grau de infestação e das diferentes localizações das lesões, sendo eles BPV1 e 6.
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ANEXOS – GRÁFICOS DE ALINHAMENTO BPV 1 E BPV 6.
Gráfico alinhamento BPV1
10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
17272 Consensus TATAGGGTATTTAAAATACAACTACCTGATCCCAATCAATTTGCMCTWCCTGACAGGACTGTTCACAACC AB626705 BPV 1 (Japan) TATAGGGTATTTAAAATACAACTACCTGATCCCAATCAATTTGCACTACCTGACAGGACTGTTCACAACC JX046508 BPV 1 (Croatia) TATAGGGTATTTAAAATACAACTACCTGATCCCAATCAATTTGCACTACCTGACAGGACTGTTCACAACC JX678969 BPV 1 (United Kingdom TACAGGGTATTTAAAATACAACTACCTGATCCCAATCAATTTGCACTACCTGACAGGACTGTTCACAACC KC595244 BPV 1 (Brazil) TATAGGGTATTTAAAATACAACTACCTGATCCCAATCAATTTGCACTACCTGACAGGACTGTTCACAACC KF284141 BPV 1 (Poland) TATAGGGTATTTAAAATACAACTACCTGATCCCAATCAATTTGCACTACCTGACAGGACTGTTCACAACC KU728468 BPV 1 (Brazil-RS) TATAGGGTATTTAAAATACAACTACCTGATCCCAATCAATTTGCACTACCTGACAGGACTGTTCACAACC KU736826 BPV 1 (Brazil) TATAGGGTATTTAAAATACAACTACCTGATCCCAATCAATTTGCACTACCTGACAGGACTGTTCACAACC 80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 17272 Consensus CAAGTAAAGAGCGGCTGGTGTGGGCAGTCATAGGTGTGCAGGTGTCCAGAGGGCAGCCTCTTGGGGGTAC AB626705 BPV 1 (Japan) CAAGTAAAGAGCGGCTGGTGTGGGCAGTCATAGGTGTGCAGGTGTCCAGAGGGCAGCCTCTTGGAGGTAC JX046508 BPV 1 (Croatia) CAAGTAAAGAGCGGCTGGTGTGGGCAGTCATAGGTGTGCAGGTGTCCAGAGGGCAGCCTCTTGGGGGTAC JX678969 BPV 1 (United Kingdom CAAGTAAAGAGCGGCTGGTGTGGGCAGTCATAGGTGTGCAGGTGTCCAGAGGGCAGCCTCTTGGAGGTAC KC595244 BPV 1 (Brazil) CAAGTAAAGAGCGGCTGGTGTGGGCAGTCATAGGTGTGCAGGTGTCCAGAGGGCAGCCTCTTGGGGGTAC KF284141 BPV 1 (Poland) CAAGTAAAGAGCGGCTGGTGTGGGCAGTCATAGGTGTGCAGGTGTCCAGAGGGCAGCCTCTTGGAGGTAC KU728468 BPV 1 (Brazil-RS) CAAGTAAAGAGCGGCTGGTGTGGGCAGTCATAGGTGTGCAGGTGTCCAGAGGGCAGCCTCTTGGGGGTAC KU736826 BPV 1 (Brazil) CAAGTAAAGAGCGGCTGGTGTGGGCAGTCATAGGTGTGCAGGTGTCCAGAGGGCAGCCTCTTGGGGGTAC 150 160 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 17272 Consensus TGTAWCTGGGCWCCCCACTTTTAATGCTTTGCTTGATGCAGAAAATGTGAATAGAAAAGTCACCACCCAW AB626705 BPV 1 (Japan) TGTAACTGGGCACCCCACTTTTAATGCTTTGCTTGATGCAGAAAATGTGAATAGAAAAGTCACCACCCAA JX046508 BPV 1 (Croatia) TGTAACTGGGCACCCCACTTTTAATGCTTTGCTTGATGCAGAAAATGTGAATAGAAAAGTCACCACCCAA JX678969 BPV 1 (United Kingdom TGTAACTGGGCACCCCACTTTTAATGCTTTGCTTGATGCAGAAAATGTGAATAGAAAAGTCACCACCCAA KC595244 BPV 1 (Brazil) TGTAACTGGGCACCCCACTTTTAATGCTTTGCTTGATGCAGAAAATGTGAATAGAAAAGTCACCACCCAA KF284141 BPV 1 (Poland) TGTAACTGGGCACCCCACTTTTAATGCTTTGCTTGATGCAGAAAATGTGAATAGAAAAGTCACCACCCAA KU728468 BPV 1 (Brazil-RS) TGTAACTGGGCACCCCACTTTTAATGCTTTGCTTGATGCAGAAAATGTGAATAGAAAAGTCACCACCCAA KU736826 BPV 1 (Brazil) TGTAACTGGGCACCCCACTTTTAATGCTTTGCTTGATGCAGAAAATGTGAATAGAAAAGTCACCACCCAA 220 230 240 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 17272 Consensus ACMACAKATGACMGGAAACAAACAGGMCTAGATGCTAAGCAACAACAGATTCTGTTGCTAGGMTGTACCC AB626705 BPV 1 (Japan) ACAACAGATGACAGGAAACAAACAGGCCTAGATGCTAAGCAACAACAGATTCTGTTGCTAGGCTGTACCC JX046508 BPV 1 (Croatia) ACAACAGATGACAGGAAACAAACAGGCCTAGATGCTAAGCAACAACAGATTCTGTTGCTAGGCTGTACCC JX678969 BPV 1 (United Kingdom ACAGCAGATGACAGGAAACAAACAGGCCTAGATGCTAAGCAACAACAGATTCTGTTGCTAGGCTGTACCC KC595244 BPV 1 (Brazil) ACAACAGATGACAGGAAACAAACAGGCCTAGATGCTAAGCAACAACAGATTCTGTTGCTAGGCTGTACCC KF284141 BPV 1 (Poland) ACAACAGATGACAGGAAACAAACAGGCCTAGATGCTAAGCAACAACAGATTCTGTTGCTAGGCTGTACCC KU728468 BPV 1 (Brazil-RS) ACAACAGATGACAGGAAACAAACAGGCCTAGATGCTAAGCAACAACAGATTCTGTTGCTAGGCTGTACCC KU736826 BPV 1 (Brazil) ACAACAGATGACAGGAAACAAACAGGCCTAGATGCTAAGCAACAACAGATTCTGTTGCTAGGCTGTACCC 290 300 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 17272 Consensus CTGCTGAAGGGGAATATTGGACAACAGCCCGTCCATGTGTTACTGATCGYCCAGAAAATGGCGCCTGCCC AB626705 BPV 1 (Japan) CTGCTGAAGGGGAATATTGGACAACAGCCCGTCCATGTGTTACTGATCGTCTAGAAAATGGCGCCTGCCC JX046508 BPV 1 (Croatia) CTGCTGAAGGGGAATATTGGACAACAGCCCGTCCATGTGTTACTGATCGTCCAGAAAATGGCGCCTGCCC JX678969 BPV 1 (United Kingdom CTGCTGAAGGGGAATATTGGACAACAGCCCGTCCATGTGTTACTGATCGTCCAAATAATGGCGCCTGCCC KC595244 BPV 1 (Brazil) CTGCTGAAGGGGAATATTGGACAACAGCCCGTCCATGTGTTACTGATCGTCCAGAAAATGGCGCCTGCCC KF284141 BPV 1 (Poland) CTGCTGAAGGGGAATATTGGACAACAGCCCGTCCATGTGTTACTGATCGTCTAGAAAATGGCGCCTGCCC KU728468 BPV 1 (Brazil-RS) CTGCTGAAGGGGAATATTGGACAACAGCCCGTCCATGTGTTACTGATCGTCCAGAAAATGGCGCCTGCCC KU736826 BPV 1 (Brazil) CTGCTGAAGGGGAATATTGGACAACAGCCCGTCCATGTGTTACTGATCGTCCAGAAAATGGCGCCTGCCC 360 370
....|....|....|....|....|.. 17272 Consensus TCCTCTTGAATTAAAAAACAAGMACAT AB626705 BPV 1 (Japan) TCCTCTTGAATTAAAAAACAAGCACAT JX046508 BPV 1 (Croatia) TCCTCTTGAATTAAAAAACAAGCACAT JX678969 BPV 1 (United Kingdom TCCTCTTGAATTAAAAAACAAGCACAT KC595244 BPV 1 (Brazil) TCCTCTTGAATTAAAAAACAAGCACAT KF284141 BPV 1 (Poland) TCCTCTTGAATTAAAAAACAAGCACAT KU728468 BPV 1 (Brazil-RS) TCCTCTTGAATTAAAAAACAAGCACAT KU736826 BPV 1 (Brazil) TCCTCTTGAATTAAAAAACAAGCACAT
Gráfico alinhamento BPV6 10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 17245 Consensus AGTCATTGTGCCCAAGGTTTCTGGCAGTCAATTCAGGGTGTTCAGACTTCAATTACCAGATCCAAACAAA AJ620208 BPV 6 AGTCATTGTGCCCAAGGTTTCTGGCAGTCAATTCAGGGTGTTCAGACTTCAATTACCAGATCCAAACAAA HM245430 BPV 6 (Brazil-UEL) AGTCATTGTGCCCAAGGTTTCTGGCAGTCAATTCAGGGTGTTCAGACTTCAATTACCAGATCCAAACAAA JX046513 BPV 6 (Croatia) AGTCATTGTGCCCAAGGTTTCTGGCAGTCAATTCAGGGTGTTCAGACTTCAATTACCAGATCCAAACAAA KU865634 BPV 6 (Brazil) AGTCATTGTGCCCAAGGTTTCTGGCAGTCAATTCAGGGTGTTCAGACTTCAATTACCAGATCCAAACAAA 80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 17245 Consensus TTTACTTTCCAAACACCAAATGTGTACAATCCTGAAACTCAGCGCCTTGTTTGGGCCTTAAAAGGCATTG AJ620208 BPV 6 TTTACTTTCCAAACACCAAATGTGTACAATCCTGAAACTCAGCGCCTTGTTTGGGCCTTAAAAGGCATTG HM245430 BPV 6 (Brazil-UEL) TTTACTTTCCAAACACCAAATGTGTACAATCCTGAAACTCAGCGCCTTGTTTGGGCCTTAAAAGGCATTG
36 JX046513 BPV 6 (Croatia) TTTACTTTCCAAACACCAAATGTGTACAATCCTGAAACTCAGCGCCTTGTTTGGGCCTTAAAAGGCATTG
KU865634 BPV 6 (Brazil) TTTACTTTCCAAACACCAAATGTGTACAATCCTGAAACTCAGCGCCTTGTTTGGGCCTTAAAAGGCATTG 150 160 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 17245 Consensus AAATCTGCAGGGGACAGCCATTGGGAATAGGTGTTACTGGCCACCCTTCTTTCAACAAATTTAGAGATGC AJ620208 BPV 6 AAATCTGCAGGGGACAGCCATTGGGAATAGGTGTTACTGGCCACCCTTCTTTCAACAAATTTAGAGATGC HM245430 BPV 6 (Brazil-UEL) AAATCTGCAGGGGACAGCCATTGGGAATAGGTGTTACTGGCCACCCTTCTTTCAACAAATTTAGAGATGC JX046513 BPV 6 (Croatia) AAATCTGCAGGGGACAGCCATTGGGAATAGGTGTTACTGGCCACCCTTCTTTCAACAAATTTAGAGATGC KU865634 BPV 6 (Brazil) AAATCTGCAGGGGACAGCCATTGGGAATAGGTGTTACTGGCCACCCTTCTTTCAACAAATTTAGAGATGC 220 230 240 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 17245 Consensus AGAAAACTTAAATAACAATCAGCCATCTCAAGGAGAAGATGATAGGGTTAATACAGCACTAGATCCAAAG AJ620208 BPV 6 AGAAAACTTAAATAACAATCAGCCATCTCAAGGAGAAGATGATAGGGTTAATACAGCACTAGATCCAAAG HM245430 BPV 6 (Brazil-UEL) AGAAAACTTAAATAACAATCAGCCATCTCAAGGAGAAGATGATAGGGTTAATACAGCACTAGATCCAAAG JX046513 BPV 6 (Croatia) AGAAAACTTAAATAACAATCAGCCATCTCAAGGAGAAGATGATAGGGTTAATACAGCACTAGATCCAAAG KU865634 BPV 6 (Brazil) AGAAAACTTAAATAACAATCAGCCATCTCAAGGAGAAGATGATAGGGTTAATACAGCACTAGATCCAAAG 290 300 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 17245 Consensus CAAGTTCAGCTTTTCATTGTTGGTTGCACCCCCTGTGAAGGTGAACACTGGGATGTAGCTGAATCATGCC AJ620208 BPV 6 CAAGTTCAGCTTTTCATTGTTGGTTGCACCCCCTGTGAAGGTGAACACTGGGATGTAGCTGAATCATGCC HM245430 BPV 6 (Brazil-UEL) CAAGTTCAGCTTTTCATTGTTGGTTGCACCCCCTGTGAAGGTGAACACTGGGATGTAGCTGAATCATGCC JX046513 BPV 6 (Croatia) CAAGTTCAGCTTTTCATTGTTGGTTGCACCCCCTGTGAAGGTGAACACTGGGATGTAGCTGAATCATGCC KU865634 BPV 6 (Brazil) CAAGTTCAGCTTTTCATTGTTGGTTGCACCCCCTGTGAAGGTGAACACTGGGATGTAGCTGAATCATGCC 360 370 380 ....|....|....|....|....|....|....| 17245 Consensus AACCATTAGAAATTGGGGCATGCCCTCCATTACAG AJ620208 BPV 6 AACCATTAGAAATTGGGGCATGCCCTCCATTACAG HM245430 BPV 6 (Brazil-UEL) AACCATTAGAAATTGGGGCATGCCCTCCATTACAG JX046513 BPV 6 (Croatia) AACCATTAGAAATTGGGGCATGCCCTCCATTACAG KU865634 BPV 6 (Brazil) AACCATTAGAAATTGGGGCATGCCCTCCATTACAG
