UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARIANA GONÇALVES DE OLIVEIRA TARANTO
POTENCIAL TERAPÊUTICO DO ATIVADOR DA GUANILATO CICLASE SOLÚVEL, BAY 58-2667, NA DISFUNÇÃO MICCIONAL ASSOCIADA À CISTITE INTERSTICIAL
EXPERIMENTAL
CAMPINAS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARIANA GONÇALVES DE OLIVEIRA TARANTO
POTENCIAL TERAPÊUTICO DO ATIVADOR DA GUANILATO CICLASE SOLÚVEL, BAY 58-2667, NA DISFUNÇÃO MICCIONAL ASSOCIADA À CISTITE INTERSTICIAL
EXPERIMENTAL
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Farmacologia.
ORIENTADOR: PROF. DR. EDSON ANTUNES
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA MARIANA GONÇALVES DE OLIVEIRA TARANTO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. EDSON ANTUNES.
CAMPINAS
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
MARIANA GONÇALVES DE OLIVEIRA TARANTO
ORIENTADOR: PROF. DR. EDSON ANTUNES
MEMBROS:
1. PROF. DR. EDSON ANTUNES
2. PROFª. DRª. SORAIA KÁTIA PEREIRA COSTA
3. PROF. DR. RICARDO MIYAOKA
4. PROFª.DRª. FERNANDA BRUSCHI MARINHO PRIVIERO
5.PROF.DR. CARLOS RENATO TIRAPELLI
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Aos meus familiares
Meus pais, Doraci e Fátima, minha irmã Aline, Matheus e Sophia
Meus sogros Luiz e Cleuza, e ao Lucas
Que sempre estiveram presentes, apoiando minhas escolhas e
torcendo por meu sucesso e felicidade em todos os momentos.
Acima de tudo, e como sempre, meus agradecimentos mais profundos ao
meu querido, paciente e incomparável esposo, Leonardo.
AGRADECIMENTOS
Ao meu querido orientador Professor Edson Antunes.
Agradeço imensamente por sua orientação, enorme paciência,
convivência diária e amizade, que certamente contribuiram muito para
minha formação pessoal e profissional.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me permitido realizar mais esta etapa em minha vida profissional.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnólogico, CNPq, e à
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, pelo apoio
financeiro, sem o qual este trabalho não poderia ser realizado.
Agradeço aos queridos amigos de laboratório: Julio Alejandro, Fabiano, Eduardo,
Fábio Henrique, Sandra, Luiz Ricardo, Rafael, Marcy Lancia, Camila Mendes,
Camila Pereira, Alberto, Diana, Edith e Cristiano. Obrigada por toda amizade,
disposição constante, pelos muitos cafézinhos, discussões científicas e momentos de
descontração.
A Glaucia, por sua amizade e auxílio técnico.
Às Professoras Fabíola Z. Mónica, Sisi Marcondes, Elen T. Landucci e aos
Professores Gabriel F. Anhê e Stephen Hyslop, pela amizade, apoio científico, e por
cederem seus laboratórios para a realização deste trabalho.
Aos amigos e funcionários do Departamento de Farmacologia. A Maísa e Cidinha,
sempre tão prestativas. Ao Sr. Miguel, Toninho, Aguinaldo e Ivani, pelo trabalho e
cuidado diário com os animais de experimentação.
A todos aqueles que talvez possa ter esquecido neste momento, mas que estão
presentes em meu coração.
RESUMO
A Cistite Intersticial/Síndrome da Dor Vesical (CI/SDV) é uma doença inflamatória crônica caracterizada por dor suprapúbica, desconforto, urgência e excessiva freqüência urinária, além de prejudicar profundamente a qualidade de vida dos pacientes. A cistite induzida por ciclofosfamida (CYP) é um modelo experimental amplamente utilizado para investigação da CI/SDV devido à sua similaridade com a doença humana. Estudos mostram que o estresse oxidativo excessivo durante a inflamação pode comprometer a função da bexiga ao prejudicar a sinalização óxido nítrico (NO)/ guanilato ciclase solúvel (GCs)/GMPc. Os ativadores GCs, NO e heme-independentes, têm elevada afinidade para a forma oxidada (insensível ao NO) desta enzima, sendo capazes de elevar a produção de GMPc, restaurando a sinalização. Este estudo teve como objetivo a padronização de um modelo de cistite induzida por CYP, com ênfase em determinar o melhor modelo experimental para o estudo das disfunções miccionais observadas na cistite induzida por CYP e avaliar as alterações na via de sinalização GCs/GMPc. Avaliou-se ainda, os efeitos protetores do ativador da GCs, BAY 58-2667, na disfunção miccional e processo inflamatório associado à cistite. Utilizaram-se camundongos C57BL/6, fêmeas, com 8 a 10 semanas de idade (20-25 g). A cistite foi induzida por injeção(ões) de CYP (75-300 mg/kg, i.p) e os animais avaliados após 4, 24 horas ou 10 dias. Para avaliação da prevenção da cistite por BAY 58-2667, os animais foram pré-tratados com BAY 58-2667 (1 mg/kg) ou o seu veículo (transcutol/cremophor/água, 1:2:7, v:v), por gavagem, 1 hora antes da indução de cistite, e os estudos foram realizados 24 horas após a administração de CYP. Os padrões de micção em animal acordado (micção em papel filtro) e anestesiado (cistometria), assim como as contrações
injeção de CYP reduziu o volume da micção e aumentou o número de manchas de micção. Os registros cistométricos de camundongos injetados com CYP revelaram aumentos significativos da freqüência de micção e contrações não miccionais (CNMs), juntamente com diminuições na capacidade da bexiga, intervalos de micção e complacência. Além da disfunção miccional, observou-se o desenvolvimento de processo inflamatório, evidenciado por aumento no peso vesical, na atividade de mieloperoxidase (MPO) e na expressão de ciclooxigenase-2 (COX-2), além de alterações histológicas que indicaram infiltrado inflamatório, desorganização tecidual e denudação do urotélio. O pré-tratamento dos animais com BAY 58-2667 preveniu significativamente as alterações miccionais observadas tanto em animais com movimento livre quanto na cistometria, e normalizou a redução da contração vesical induzida por carbacol. No tecido vesical, a expressão das subunidades α1 e β1 da GCs e os níveis de GMPc foram significativamente reduzidos no grupo CYP, alterações prevenidas pelo tratamento com BAY 58-2667. A exposição à CYP aumentou a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) tanto no detrusor quanto no urotélio, sendo esta alteração normalizada pelo BAY 58-2667. Os parâmetros inflamatórios avaliados nas bexigas do grupo CYP permaneceram inalteradas pelo pré-tratamento com BAY 58-2667. Em conclusão, os ativadores da GCs podem constituir uma nova e promissora abordagem terapêutica para o tratamento da cistite intersticial.
Palavras chave: bexiga urinária, cistometria, cistite, síndrome da dor vesical, GMP
ABSTRACT
Interstitial Cystitis/Bladder Pain Syndrome (IC/BPS) is a chronic inflammatory disease characterized by suprapubic pain, discomfort, urgency, and excessive urinary frequency, and profoundly impairs patient’s quality of life. Cyclophosphamide (CYP)-induced cystitis is a widely used experimental model for IC/BPS research because of its similarity with the human disease. Studies show that excessive oxidative stress during inflammation affect the bladder function by impairing the nitric oxide (NO) / soluble guanylate cyclase (sGC) / cGMP signaling pathway. NO- and heme-independent sGC activators have high affinity for the oxidized, NO-insensitive, form of this enzyme, being able to raise cGMP production, restoring the signaling. This study aimed to standardize a CYP-induced cystitis animal model, with an emphasis on determining the better experimental model for the study of voiding dysfunctions observed in CYP-induced cystitis and also evaluate the changes in sGC/cGMP signaling pathway. The protective effects of BAY 58-2667 (sGC activator) on voiding dysfunction and inflammatory process associated with cystitis were also evaluated. Female C57BL/6 mice, 8-10 weeks old (20-25g) were used. Cystitis was induced by an injection(s) of CYP (75-300 mg/kg, i.p.) and the animals were evaluated after 4, 24 hours or 10 days. For evaluation of the prevention of cystitis by BAY 58-2667, the animals were pretreated with BAY 58-2667 (1 mg/kg) or its vehicle (transcutol/cremophor/water, 1:2:7, v:v) by gavage 1 hour prior cystitis induction and studies were performed 24 hours after CYP administration. The patterns of micturition in both awake (micturition in filter paper; free movement) and anesthetized (cystometry), as well as in vitro bladder contractions were determined. In mice with free movement, CYP injection reduced the volume of micturition and increased the number of micturition spots. Cystometric records of mice injected with
CYP revealed significant increases in urinary frequency and non-voiding contractions (NVCs), along with decreases in bladder capacity, micturition intervals and compliance. In addition to voiding dysfunction, the development of an inflammatory process was evidenced by an increase in bladder weight, myeloperoxidase activity (MPO) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression, as well as histological changes, indicating inflammatory infiltrate, tissue disorganization and urothelium denudation. Pretreatment of the animals with BAY 58-2667 significantly prevented the micturition changes observed in both free-moving and cystometry, and normalized the reduction of carbachol-induced bladder contraction. In the bladder tissue, the expression of α1 and β1 subunits of GCs and the cGMP levels in the CYP group were marked reduced, which were all prevented by BAY 58-2667 treatment. Exposure to CYP increased the generation of reactive oxygen species (ROS) in both detrusor and urothelium, which was normalized by BAY 58-2667. The inflammatory parameters evaluated in the bladders of the CYP group remained unchanged by pre-treatment with BAY 58-2667. In conclusion, GCs activators may constitute a new and promising therapeutic approach for the treatment of interstitial cystitis.
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Anatomia e histologia do trato urinário inferior... 22
Figura 2. Desenho esquemático sobre o ciclo de micção... 23
Figura 3. Controle neural do trato urinário inferior... 24
Figura 4. Possíveis mecanismos envolvidos na etiologia da Cistite Intersticial/Síndrome da Dor Vesical... 29
Figura 5. Estimuladores e ativadores da enzima guanilato ciclase solúvel.... 33
Figura 6. Peso corporal, alterações macroscópicas, razão peso da bexiga/peso corporal e atividade da MPO... 47
Figura 7. Perfil histológico de animais controles... 48
Figura 8. Alterações histológicas induzidas pela ciclofosfamida (CYP)... 49
Figura 9. Registro do perfil de micção de animais controle e com cistite... 51
Figura 10. Traçados cistométricos representativos de um animal por grupo.... 52
Figura 11. Resposta contrátil ao carbacol em detrusor isolado de animais controles e com cistite... 53
Figura 12. Resposta contrátil ao cloreto de potássio (KCl, 80mM) em detrusor isolado de animais controles e com cistite... 54
Figura 13. Resposta contrátil à estimulação elétrica em detrusor isolado de animais controles e com cistite... 55
Figura 14. Alterações induzidas pela injeção de ciclofosfamida (CYP, 300 mg/kg) sobre expressão protéica e gênica das subunidades da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs)... 56
Figura 15. Níveis de GMPc em bexigas de animais com cistite induzida pela injeção de CYP (300 mg/kg) ao longo de 24 horas... 57
Pág. Figura 16. Registro do perfil de micção de animais controle e com cistite,
pré-tratados ou não com BAY 58-2667 (1 mg/kg)... 59 Figura 17. Análise cistométrica de animais controle e com cistite pré-tratados
ou não com BAY 58-2667 (1 mg /kg)... 60 Figura 18. Estudo funcional in vitro com detrusor isolado de animais controle
e com cistite, pré-tratados ou não com BAY 58-2667(1 mg/kg)... 61 Figura 19. Efeito do tratamento com BAY 58-2667 na expressão das
subunidades α1 (A) e β1 (B) da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs) em animais submetidos à cistite por ciclofosfamida (CYP)... 62 Figura 20. Efeito do tratamento com BAY 58-2667 (1 mg/kg) sobre os níveis
de GMPc... 63 Figura 21. Determinação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO)
no detrusor e urotélio em bexigas de animais controle e com cistite, tratados ou não com BAY 58-2667 (1 mg/kg)... 64 Figura 22. Efeitos do pré-tratamento com BAY 58-2667 (1 mg/kg) sobre os
LISTA DE TABELAS
Pág. Tabela 1. Alterações nos parâmetros cistométricos dos animais controles e
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACh, acetilcolina
A.U., unidades arbitrárias ANOVA, análise de variância
ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATP, adenosina trifosfato
AMPc, monofosfato cíclico de adenosina cDNA, ácido desoxirribonucléico complementar CI/SDV, Cistite Intersticial/Síndrome da Dor Vesical CNMs, contrações não miccionais
COX-2, ciclooxigenase 2 CTRL, controle
CYP, ciclofosfamida DAG, diacilglicerol DHE, diidroetídio D.O., densidade óptica Emax, resposta máxima
eNOS, sintase de óxido nítrico endotelial ELISA, Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ERO, espécies reativas de óxigênio
ESSIC, Sociedade Européia para o Estudo da Cistite Intersticial GCs, guanilato ciclase solúvel
GMPc, monofosfato cíclico de guanosina GTP, trifosfato de guanosina
HTAB, brometo de hexadecil-trimetil ammonium ICS, Sociedade Internacional de Continência i.p., intraperitoneal
iNOS, sintase de óxido nítrico induzível L-NAME, N-nitro L-arginina metil éster MPO, mieloperoxidase
NANC, não-adrenérgico/não colinérgico nNOS, sintase de óxido nítrico neuronal NO, óxido nítrico
NOS, sintase de óxido nítrico
ODQ, 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one PDE-5, fosfodiesterase-5
pEC50, potência PLC, fosfolipase C
PKA, proteína quinase dependente de AMPc PKC, proteína quinase dependente de cálcio PKG, proteína quinase dependente de GMPc RNA, ácido riboxinucléico
RT-PCR, reação em cadeia da polimerase em tempo real SDS, dodecil sulfato de sódio
LISTA DE REAGENTES E FORNECEDORES
Anticorpo primário Anti-GCsα: Novus Biologicals, Colorado, EUA Anticorpo primário Anti-GCsβ: Novus Biologicals, Colorado, EUA Anticorpo primário Anti-COX2: Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA Anticorpo primário Anti-β-actin: Sigma Aldrich, Missouri, EUA
Anticorpo secundário Anti-rabbit: Cell Signaling, Massachusetts, EUA Anticorpo secundário Anti-goat: Cell Signaling, Massachusetts, EUA
BAY 58-2667: i.e.,[4-[((4-carboxybutyl2-[(4-phenethylbenzyl)oxy]phenetyl]amino) methyl[benzoic]-acid] : AdipoGen, Liestal, Suiça
Bradford: Biorad, Califórnia, EUA
Brometo de hexadecil-trimetil ammonium (HTAB): Sigma Aldrich, Missouri, EUA Carbacol: Sigma Aldrich, Missouri, EUA
Cremophor: Sigma Aldrich, Missouri, EUA
Ciclofosfamida (CYP): Sigma Aldrich, Missouri, EUA Diidroetídio (DHE): Sigma Aldrich, Missouri, EUA
Kit para dosagem de GMP cíclico: Cayman Chemical, Michigan, EUA Laemmli buffer: Biorad, Califórnia, EUA
Primers para -actina de camundongo: IDT DNA, Iowa, EUA
Primers para subunidade β da GCs de camundongo: IDT DNA, Iowa, EUA SuperScript III transcriptase reversa: Invitrogen, Califórnia, EUA
Tetrametilbenzidina: Sigma Aldrich, Missouri, EUA TRIzol: Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, EUA
SUMÁRIO
Pág.
1. INTRODUÇÃO... 21
1.1. Fisiologia da micção... 21
1.1.1 Anatomia do trato urinário inferior... 21
1.1.2 Ciclo miccional, inervação e mecanismos contráteis e relaxantes... 23
1.2. Disfunções do trato urinário inferior... 26
1.2.1 Cistite Intersticial e Síndrome da Dor Vesical (CI/SDV)... 27
1.2.2 Cistite induzida por ciclofosfamida (CYP)... 30
1.3. Sinalização NO/GCs/GMPc... 30 1.3.1 Estimuladores e ativadores de GCs... 32 1.4 Justificativa e relevância... 35 2. OBJETIVOS... 37 2.1. Objetivo geral... 37 2.2. Objetivos específicos... 37 3. MATERIAIS E MÉTODOS... 38 3.1. Animais de experimentação... 38 3.2. Desenho experimental... 38
3.2.1 Padronização do modelo de cistite induzida por CYP... 38
3.2.2 Avaliação do potencial preventivo do BAY 58-2667... 39
3.3. Avaliação do perfil miccional... 39
3.3.1 Técnica de mancha de micção em papel de filtro... 39
3.3.2 Análise cistométrica... 40
3.4. Ensaio funcional in vitro... 40
3.4.1 Isolamento e montagem dos tecidos... 41
3.4.2 Respostas contráteis ao agonista muscarínico, carbacol, e ao KCl... 41
3.4.3 Respostas contráteis à estimulação elétrica de campo (EFS)... 42
3.5. Avaliação de edema e análise histológica... 42
3.6. Determinação da atividade da mieloperoxidase (MPO)... 42
3.7. Western blotting... 43
3.8. Determinação dos níveis de GMPc... 43
3.9. Real time PCR... 44
3.10. Determinação dos níveis de espécies reativas de oxigênio... 44
Pág.
4. RESULTADOS... 46
4.1. Caracterização da cistite induzida por CYP... 46
4.1.1 Alterações macroscópicas, razão peso vesical/corporal e atividade da MPO... 46
4.1.2 Análise histológica... 48
4.1.3 Caracterização do perfil de micção dos animais com cistite... 50
4.1.3.1 Mancha de micção em papel filtro... 50
4.1.3.2 Análise cistométrica... 51
4.1.4 Avaliação funcional in vitro de animais controle e com cistite... 53
4.1.4.1 Curva concentração-resposta ao carbacol... 53
4.1.4.2 Contração induzida por KCl... 54
4.1.4.3 Curva frequência-resposta... 54
4.1.5 Avaliação das alterações na sinalização GCs/GMPc na cistite induzida por CYP... 55
4.2. Potencial preventivo do BAY 58-2667 na cistite induzida por CYP... 58
4.2.1 Efeito do pré-tratamento com BAY 58-2667 sobre as as alterações miccionais... 58
4.2.2 Efeito do pré-tratamento com BAY 58-2667 na hipocontratilidade vesical induzida por CYP... 61
4.2.3 Expressão protéica e atividade da enzima GCs em bexigas isoladas de animais tratados com BAY 58-2667... 62
4.2.4 Níveis de EROS no detrusor e urotélio em animais com cistite e prevenção pelo BAY 58-2667... 63
4.2.5 Efeito do pré-tratamento com BAY 58-2667 na atividade de MPO e expressão de COX-2... 64
5. DISCUSSÃO... 66
6. CONCLUSÃO... 74
7. REFERÊNCIAS... 75
1. INTRODUÇÃO
1.1 Fisiologia da Micção
O armazenamento e eliminação periódica da urina, denominada micção, requer um controle neural complexo para coordernar as atividades da bexiga urinária, uretra e esfíncteres uretrais1. A seguir, descrevemos a anatomia do trato urinário inferior, inervação autonômica e somática, e sinalização intracelular.
1.1.1 Anatomia do trato urinário inferior
O trato urinário inferior é constituído por bexiga urinária, uretra e esfíncteres uretrais (Figura 1). A bexiga urinária apresenta duas regiões distintas, uma ampla região localizada acima dos orifícios uretrais, denominada corpo da bexiga, e formada pelo músculo liso detrusor; e uma região menor, abaixo dos orifícios uretrais, denominada base da bexiga, e formada pelo músculo liso trígono e junção uretrovesical. A uretra, por sua vez, estende-se do orifício uretral interno ao externo, sendo formada por três camadas musculares, duas mais internas de músculo liso, de disposição longitudinal e circular, e uma camada mais externa de músculo estriado, também chamada de rabdoesfíncter2.
Histologicamente, o corpo da bexiga pode ser dividido em quatro camadas distintas: 1) a túnica adventícia, também denominada serosa, que reveste externamente a bexiga; 2) a túnica muscular, constituída pelo detrusor; 3) a lâmina própria, ou suburotélio, onde se encontram células intersticiais e 4) o urotélio, que reveste internamente a bexiga3 (Figura 1). O músculo detrusor é formado por três camadas de fibras musculares,
dispostas em orientação longitudinal nas camadas externa e interna, e circular na camada intermediária.
O urotélio é um epitélio transicional composto por ao menos três camadas: uma camada basal de células, aderidas à lâmina própria, uma camada intermediária e uma superficial (ou apical) composta por células largas e hexagonais, conhecidas como células guarda-chuva (“umbrella cells”). A superfície dessas células expressa múltiplas proteínas, como ocludinas, claudinas e uroplaquinas, que contribuem para a formação da barreira urotelial. Uma camada de glicosaminoglicanos recobre as células guarda-chuva, sugerindo que a mesma contribui para barreira urotelial3. O urotélio não é somente uma barreira impermeável à íons, solutos e patógenos, mas parte integral de um sistema sensorial que recebe, amplifica e transmite sinais sobre o ambiente, interagindo com fibras nervosas, músculo liso, células intersticiais e vasos sanguíneos. O urotélio é hábil em responder à uma gama de estímulos mecânicos, químicos, térmicos, entre outros; liberando e sendo alvo de diversos neurotransmissores4.
Figura 1. Anatomia e histologia do trato urinário inferior. Adaptado de Birder & Anderson (2013).3
1.1.2 Ciclo miccional, inervação e mecanismos contráteis e relaxantes
A dinâmica da micção depende de complexas interações entre a bexiga, uretra e esfíncteres, assim como da inervação autonômica e somática e da liberação neurotransmissores, os quais no conjunto determinarão a continência urinária1. Na fase de enchimento vesical, as fibras musculares do detrusor são capazes de relaxar ao mesmo tempo em que uretra e a base da bexiga se contraem, permitindo o aumento do volume da bexiga, sem elevação da pressão intravesical1,5. Na fase de esvaziamento vesical, o detrusor se contrai de modo coordenado ao relaxamento da uretra, gerando pressão suficiente para ejetar a urina1,5. O esfíncter uretral externo acompanha a atividade da uretra, permanecendo contraído durante o enchimento, mas relaxando durante o esvaziamento vesical, permitindo assim o fluxo de urina1. A saída de urina pela uretra facilita o esvaziamento, pois também estimula a contração do detrusor5 (Figura 2).
Figura 2. Desenho esquemático sobre o ciclo de micção. Adaptado de Fowler et al (2008).1
O trato urinário inferior é inervado pelos nervos pélvico, hipogástrico e pudendo. Os nervos pélvico e hipogástrico originam-se nas regiões sacral (S2-S4) e lombar (T10-L2), respectivamente, e o nervo pudendo tem sua origem no núcleo de Onuf, no corno ventral do segmento sacral da medula (S2-S4)1 (Figura 3).
Figura 3. Controle neural do trato urinário inferior. Fowler et al (2008).1 Ach, acetilcolina; NA, noradrenalina; IMP, plexo mesentérico inferior; SHP, plexo hipogástrico superior; SN, nervo ciático; HGN, nervo hipogástrico; PEL, nervo pélvico; PP, plexo pélvico; L1, primeiro segmento lombar; S1, primeiro segmento sacral; T9, nono segmento torácico.
O nervo pélvico conduz fibras parassimpáticas para o detrusor, sendo sua atividade relacionada, sobretudo, à fase de esvaziamento. A ativação dessas fibras leva à liberação de acetilcolina (ACh), a qual interage com receptores muscarínicos, dos subtipos M2 (70-80% do total) e M3 (20-30% do total), promovendo a contração da musculatura lisa detrusora6,7. Apesar de se apresentarem em menor densidade, estudos mostram que o muscarínico M3 é o principal subtipo responsável por mediar as respostas contráteis do detrusor6,7. Em relação ao muscarínico M2, no detrusor este receptor acarreta a inibição do relaxamento mediado por nervos simpáticos, aumentando assim a contração e
eficácia do esvaziamento vesical8,9. O mecanismo intracelular clássico de contração do detrusor decorrente da ativação de receptores M3 envolve o acoplamento à proteína Gq, a qual ativa a fosfolipase C (PLC) com consequente geração de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG), resultando na liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático e na ativação da proteína quinase C (PKC). O cálcio liberado liga-se à calmodulina, que ativa a miosina quinase de cadeia leve, induzindo a contração da bexiga através da fosforilação da miosina de cadeia leve. A PKC ativada, por sua vez, inibe a miosina fosfatase de cadeia leve, aumentando a contração do músculo liso, e permitindo assim a abertura de canais de cálcio do tipo L da membrana celular10,11.
O nervo pélvico também conduz fibras não adrenérgicas-não colinérgicas (NANC), e libera neurotransmissores como o adenosina trifosfato (ATP) e óxido nítrico (NO) . O ATP leva à contração da musculatura lisa pela capacidade de interagir com duas famílias de receptores purinérgicos: P2X, ligado canal iônico e que promove o influxo de cálcio extracelular; e P2Y, receptor acoplado à proteína-G e que atua via PLC/IP3 e liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático12. Entretanto, em situações fisiológicas, a via purigérgica é menos importante para a contração do detrusor que a colinérgica13. O NO, por sua vez, promove o relaxamento desta musculatura lisa, mediado pela estimulação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), elevando os níveis de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc)14. Detalhes desta via de sinalização serão dados no item 1.3.
O nervo hipogástrico conduz fibras simpáticas para parte do detrusor e para a base da bexiga e uretra. A atividade deste nervo está relacionada à fase de armazenamento, mediada pela liberação de noradrenalina. Este neurotrasmissor interage com receptores β-adrenérgicos, predominantemente do subtipo β3, promovendo o relaxamento deste tecido no detrusor. Interage ainda com receptores α-adrenérgicos do subtipo α1A no
trígono e uretra, promovendo a contração da musculatura lisa15-17. O mecanismo intracelular clássico de relaxamento do detrusor mediado pela ativação de receptores β3-adrenérgicos envolve a ativação da enzima adenilato ciclase, induzindo acúmulo de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), que ativa a proteína quinase A (PKA). Esta, por sua vez, promove a fosforilação da miosina quinase de cadeia leve, inativando-a, processo este que resulta na recaptação de cálcio pelo retículo sarcoplasmático18,19. Outros mecanismos independentes de AMPc, resultantes da ativação do receptor β3-adrenérgico, envolvem a ativação de canais de potássio20. Com relação à sinalização do receptor α1A no trígono e uretra, de forma similar à ativação de receptores muscarínicos, envolve a ativação da PLC via proteína-G, e formação de IP3 e DAG, resultando na liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático e na ativação da PKC.
Por fim, o nervo pudendo conduz fibras somáticas ao esfíncter uretral externo e contribui para a contenção urinária através da liberação de ACh resultando na contração dessa musculatura estriada. Este mecanismo envolve a ativação de receptores nicotínicos, que são receptores ionotrópicos e cuja ativação resulta na despolarização e consequente contração das células musculares1.
1.2. Disfunções do trato urinário inferior
Os sintomas do trato urinário inferior, também referidos pela sigla inglesa LUTS (“Lower Urinary Tract Symptoms”), são condições de alta prevalência, comuns tanto em homens quanto mulheres, em todas as faixas etárias, mas principamente entre 40 e 60 anos. Os LUTS prejudicam profundamente a qualidade de vida dos pacientes, não deixando de mencionar os elevados custos para tratamento dessas doenças21,22.
De acordo com as definições da Sociedade Internacional de Continência (ICS), os
(aumento da freqüência urinária, noctúria, urgência e incontinência urinária), de micção (fluxo lento ou intermitente durante a micção, esforço ou hesitação) e pós-miccionais (sensação de esvaziamento incompleto ou gotejamento pós-micção)21.
A dor, desconforto ou pressão são parte de um espectro de sensações anormais, normalmente sentida na região suprapúbica ou retropúbica, aumentando com o enchimento vesical, mas pode persistir mesmo após a micção21.
Dentre o amplo espectro dos LUTS, o foco deste trabalho é direcionado à Cistite Instersticial/Síndrome da Dor Vesical (CI/SDV), uma doença inflamatória crônica da bexiga, não infecciosa, aonde observa-se um quadro de hipersensibilidade vesical, no qual um pequeno acúmulo de urina na bexiga proporciona sensação exagerada de dor ou pressão, que resulta em urgência, aumento da frequência miccional e noctúria23-25.
1.2.1 Cistite intersticial e Síndrome da Dor Vesical (CI/SDV)
A CI/SDV foi originalmente descrita na literatura científica por Alexander Skene, em 1887, como uma condição inflamatória, caracterizada por lesões da mucosa da bexiga, atingindo também a camada muscular23. Desde então, esta doença tem sido descrita por seus sintomas, que inclui a dor pélvica, constante necessidade de micção (frequência), além da resistência a terapias convencionais24,25. Atualmente, a Sociedade Européia para o Estudo da Cistite Intersticial (ESSIC), em concordância com a ICS, define a CI/SDV como “dor pélvica crônica, com duração superior a 6 meses, pressão ou desconforto associado à bexiga urinária, acompanhada de outro sintoma urinário, como urgência ou excessiva frequência, na ausência de infecção urinária ou outra patologia óbvia”21,26-28.
Síndrome da dor vesical (SDV) é a nomenclatura proposta para substituir o antigo termo “cistite intersticial” (CI), já que a dor é o sintoma primordial desta doença. Hoje, reserva-se o termo cistite intersticial apenas para pacientes com diagnóstico confirmado por achados típicos em exame citoscópicos e histológicos; entretanto, ambos os termos são cambiáveis, já que não há uma definição que claramente separe a CI da SDV28,29.
O diagnóstico de CI/SDV é normalmente por exclusão de outras patologias, como, por exemplo, bexiga hiperativa e infecção urinária. Além da dor e excessiva frequência urinária, sintomas secundários incluem sensação de esvaziamento vesical incompleto, hesitação, perda urinária insensível, urge-incontinência, incapacidade de interromper o fluxo urinário e micção em dois tempos. Ulcerações na mucosa, conhecidas como lesões de Hunner, hematúria, glomerulações (pequenas, porém múltiplas, rupturas da mucosa com hemorragia sub-urotelial), intenso infiltrado inflamatório e mastocitose são também observados nesta doença29.
A prevalência de CI/SDV na população geral tem sido difícil de estimar, em particular, devido aos critérios de diagnóstico inconsistentes e pela falta de biomarcadores específicos para a doença. Apesar das limitações de diagnóstico, estudos epidemiológicos demonstram que a prevalência de SDV clinicamente confirmada é aproximadamente de 300 para cada 100.000 mulheres29-31. No Brasil, ainda não existem dados oficiais disponíveis sobre a incidência da SDV.
Apesar dos esforços direcionados ao entendimento da etiologia da CI/SDV, os mecanismos que levam à esta condição ainda não estão bem esclarecidos, sendo a doença considerada de origem multifatorial. Mecanismos subjacentes comumente mencionados são dano do epitélio vesical e consequente aumento da permeabilidade vesical, inflamação neurogênica, ativação de mastócitos e alterações na função neuronal
e imune, que podem contribuir para a progressão da doença e ao desenvolvimento de dor crônica29 (Figura 4).
Figura 4. Possíveis mecanismos envolvidos na etiologia da Cistite Intersticial/Síndrome da Dor Vesical. Adaptado de Rodrigues et al (2011).32
Como consequência, nenhum tratamento plenamente eficaz foi desenvolvido até o momento, ainda que um grande número de alternativas tenham sido avaliadas. Tratamentos farmacológicos incluem medicação oral para controle da dor, como analgésicos, antidepressivos tricíclicos, anti-histamínicos, imunossupressores e pentosan-polissulfato de sódio. Injeções intra-detrusoras de toxina botulínica e tratamentos intravesicais com dimetil sulfóxido (DMSO), heparina ou ácido hialurônico são também utilizadas. A maioria dos pacientes com CI/SDV necessita de mais de uma abordagem terapêutica, a fim de se encontrar a mais eficiente e que ofereça maior
alívio33. Entre os tratamentos não-farmacológicos, incluem-se alterações na dieta, fisioterapia e modificação de comportamento, visando principalmente a redução de estresse e ansiedade33.
1.2.2 Cistite induzida por ciclofosfamida
A ciclofosfamida (CYP) é um agente antineoplásico, da classe dos agentes alquilantes de DNA, utilizado no tratamento de certas formas de câncer, entretanto, um de seus principais efeitos adversos é o de causar cistite nos pacientes. Estima-se que entre 10 a 40% dos pacientes tratados com altas doses de CYP (> 20 mg/kg) ou por períodos prolongados desenvolvem a cistite asséptica34,35. Diante disso, pesquisadores têm utilizado a CYP como um agente para induzir cistite experimental, um modelo animal plenamente estabelecido e amplamente utilizado para esta doença36-38. O exato mecanismo pelo qual a CYP induz cistite ainda não está claro, mas usualmente é atribuído ao contato de um de seus metabólito secundários, a acroleína, com o urotélio39,40.
Modelos animais alternativos para a cistite incluem a cistite espontânea felina, cistite neurogênica (pela estimulação de nervos aferentes), além do uso de agentes químicos irritantes, como lipopolissacarídeo e o ácido acético41.
1.3. Sinalização NO/GCs/GMPc
O NO é um dos mais importantes neurotrasmissores do organismo. É formado pela catálise do aminoácido L-arginina com o oxigênio molecular por uma família de enzimas denominadas sintases de óxido nítrico (NOS), um processo que resulta na formação de outro aminoácido, a L-citrulina, e no próprio NO42. Existem três isoformas
de NOS, denominadas endotelial (eNOS), neuronal (nNOS), e induzível (iNOS), sendo a eNOS e nNOS denominadas NOS constitutivas, pois são normalmente expressas nas células. A iNOS é expressa em macrófagos, hepatócitos e músculo liso vascular, sendo estimulada em condições inflamatórias e capaz de produzir elevadas concentrações de NO por longos períodos de tempo42.
De modo geral, em situações fisiológicas, o mecanismo de ação do NO envolve a ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), uma proteína heterodimérica que consiste de duas subunidades, α e β, sendo que na porção N-terminal de ambas as subunidades encontra-se o domínio catalítico responsável pela conversão de trifosfato de guanosina (GTP) em GMPc43,44. Na subunidade β, ligado a um resíduo de histidina, encontra-se um grupamento heme prostético formado por um átomo de ferro, em estado reduzido (Fe2+), o qual é coordenado a quatro átomos de nitrogênio, sendo este essencial para a atividade da enzima43. A ligação do NO permite uma mudança conformacional na enzima induzindo a formação de GMPc e posterior ativação da proteína quinase dependente de GMPc (PKG), capaz de regular diversos processos fisiológicos, incluindo o relaxamento do músculo liso43,44. Estudos anteriores demonstraram que fármacos atuantes nessa via de sinalização, como inibidores de PDE-5 e estimuladores da GCs causam relaxamento do detrusor e da uretra45-47. A inativação do GMPc ocorre pela ação da enzima fosfodiesterase-5 (PDE5)44.
A estimulação inapropriada ou a insensibilidade da GCs ao NO tem sido relacionada a patogênese de doenças vasculares associadas a aumento de estados oxidativos, o que pode ser melhorado por ativadores da GCs48-51. O estado oxidativo do íon ferro do grupamento heme implica à enzima uma regulação redox-dependente, tendo em vista que quando o íon ferro encontra-se oxidado (Fe3+) a enzima torna-se insensível ao NO43.
1.3. 1 Estimuladores e Ativadores da GCs
Nas últimas duas décadas, iniciou-se o desenvolvimento de agentes farmacológicos capazes de ativar diretamente a GCs e aumentar a síntese de GMPc, de forma independente do NO. O protótipo do grupo foi um composto benzil indazol, chamado YC-1,52,53 que posteriormente deu origem a vários compostos sintéticos com estrutura similar. Atualmente, esta classe de drogas compreende dois grandes grupos, chamados “estimuladores” e “ativadores” de GCs54,55 (Figura 5). Estes compostos, além de oferecer um grande potencial clínico, têm permitido uma melhor compreensão da via de sinalização NO/GCs/GMPc em condições fisiológicas e patológicas54,56.
Similarmente ao ligante endógeno NO, os estimuladores da GCs, como o BAY 41-2272, BAY 63-2521 e o A-350619, aumentam a atividade da GCs somente quando o íon ferro do grupamento heme encontra-se no estado reduzido (Fe2+); assim, são classificados como NO-independentes, porém heme-dependentes. Estudos mostram um forte sinergismo quando estas drogas são combinadas ao NO54. Por outro lado, os ativadores da GCs, como o BAY 58-2667, BAY 60-2770 e HMR-1766, são classificados como NO- e heme-independentes, e ativam a enzima preferencialmente quando o íon ferro do grupamento heme encontra-se no estado oxidado (Fe3+) ou mesmo ausente57-59.
Figura 5. Estimuladores e ativadores da enzima guanilato ciclase solúvel. Adaptado de: Evgenov et al (2006).54 ERO, espécies reativas de oxigênio; GCs, guanilato ciclase solúvel; NO, óxido nítrico.
Uma caracteristítica diferencial dos ativadores de GCs, e que os torna ferramentas valiosas para aplicação na clínica, é sua seletividade em ativar a forma oxidada da GCs (insensível ao NO) da GCs.60 Adicionalmente, os ativadores da GCs têm ao menos outras duas vantagens em relação aos doadores de NO, inibidores de PDE-5, e até mesmo aos estimuladores da GCs, que são: 1) na ausência de NO, a potência e a eficácia dos ativadores não é alterada e 2) a oxidação da GCs aumenta a eficácia e a potência dos ativadores de GCs.61 Entretanto, em condições onde a biodisponibilidade do NO está reduzida devido, por exemplo, ao aumento do estresse oxidativo, ou em condições em que os inibidores de PDE-5 não são mais efetivos, os estimuladores e ativadores de GCs podem constituir alternativa.54 Hoje, as agências regulatórias,
incluindo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), aprovam o BAY 62-2521 (riociguat) para o tratamento de pacientes com hipertensão pulmonar.62
Nosso grupo foi o primeiro a caracterizar os efeitos dos estimuladores e ativadores de GCs no trato urinário inferior.63-65 Em condições fisiológicas, mostrou-se que o BAY 41-2272 produz relaxamento dependente da concentração em uretra de coelho66, bexigas de rato, camundongo e coelho47, ureter humano67, e corpo cavernoso de coelho e humano.68-69 O relaxamento induzido por este composto é significativamente reduzido quando há oxidação da GCs pela presença de ODQ. Recentemente, mostramos que tanto o estimulador (BAY 41-2272) quanto o ativador de GCs (BAY 60-2770) reduzem a contração in vitro de próstata de coelho e humano65. Em corpo cavernoso de humano, coelho e camundongo in vitro, demonstrou-se que tanto o estimulador da GCs, BAY 41-2272, quanto o ativador, BAY 60-2770, induzem relaxamento dependente da concentração e de maneira sinérgica ao NO endógeno68,70, sendo, portanto, capazes de aumentar a amplitude e duração da resposta erétil.69,71,72
A oxidação da GCs e prejuízo na sinalização NO/GCs/GMPc são características comuns a condições patológicas como hipertensão, a obesidade e o diabetes50. Dessa forma, o desenvolvimento de drogas direcionadas à esta via representa uma abordagem interessante para o tratamento de doenças relacionadas ao estresse oxidativo50. Como todos os componentes da sinalização do NO são encontrados em bexiga, uretra, próstata e corpo cavernoso73, têm se investigado o potencial dos estimuladores e ativadores de GCs para o tratamento de complicações do trato geniturinário. Por exemplo, no modelo murino de obesidade, que classicamente é associado a estresse oxidativo elevado74, estudos prévios de nosso grupo de pesquisa mostraram que os ativadores de GCs são capazes de normalizar a função vesical63,64. Demonstrou-se que o tratamento com BAY 60-2770 restaurou as alterações cistométricas em animais anestesiados (aumento da
frequência de micções e de CNMs), normalizou a hipercontratilidade da bexiga e a redução do relaxamento uretral63,64. Em termos moleculares, a expressão das subunidade α1e β1 da GCs, bem como a produção de GMPc apresentavam-se diminuídas na bexiga e na uretra do animal obeso, alterações totalmente restauradas pelo tratamento com BAY 60-2770, confirmando a eficácia dos ativadores de GCs em restaurar a sinalização da via GCs/GMPc63,64. Outro estudo mostrou que o tratamento com BAY 41-2272 é eficaz em reduzir a hiperatividade do detrusor em modelo animal de hipertensão arterial75. Em modelo de obstrução da bexiga em ratos, o BAY 41-2272 e o BAY 60-2770 aumentaram o intervalos entre micções e reduziram a pressão máxima de micção.76
1.4. Justificativa e relevância
A despeito dos esforços para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na CI/SDV, estes permanecem pouco compreendidos, implicando em dificuldades para o diagnóstico e tratamento da doença. Nas últimas décadas, o NO destacou-se como um importante neurotransmissor no âmbito das disfunções do trato urinário inferior, seja por sua ação direta como neurotransmissor, seja pela ação inibitória na neurotransmissão eferente77. Sendo a enzima GCs o principal alvo biológico do NO, a compreensão da via GCs/GMPc em condições patológicas parece-nos fundamental. Até o momento, nenhum estudo descreveu alterações nesta via de sinalização na cistite induzida por CYP. Além disso, ativadores da GCs, como o BAY 58-2667, supostamente restauram a sinalização desta enzima, preferencialmente em condições oxidativas50,78. Por isso, estes agentes têm se mostrado promissores na terapêutica de diferentes disfunções, e podem ser uma nova alternativa para o tratamento da CI/SDV. Acreditamos que o modelo proposto de cistite induzida por CYP
em camundongos submetidos ao tratamento prévio com o ativador da GCs (BAY 58-2667) nos possibilitará avançar na compreensão da fisiopatologia da CI/SDV bem como contribuir para a melhora da terapêutica e prevenção da doença.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Este estudo teve como objetivo geral investigar o papel da via de sinalização GCs/GMPc na disfunção miccional induzida por CYP em camundongos, assim como os efeitos protetores do BAY 58-2667 na prevenção da cistite.
2.2 Objetivos específicos
1. Padronização da disfunção miccional induzida pela CYP;
2. Avaliação da expressão das subunidades α1 e β1 da enzima GCs e os níveis de GMPc no tecido vesical;
3. Avaliação dos efeitos do BAY 58-2667 na prevenção da disfunção miccional induzida por CYP, bem como das alterações funcionais in vitro do músculo detrusor;
4. Avaliação dos efeitos do pré-tratamento com BAY 58-2667 sobre marcadores inflamatórios, como atividade da mieloperoxidase (MPO) e expressão protéica da ciclooxigenase-2 (COX-2), e estresse oxidativo local, por determinação dos níveis de ERO.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais de experimentação
Todos os procedimentos e protocolos experimentais estão de acordo com os princípios éticos de experimentação animal adotados pelo Conselho Nacional de Experimentação Animal (CONCEA) e previamente aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), sob protocolo número 3508-1. Foram utilizados camundongos fêmeas, isogênicas, da linhagem C57BL/6/JUnib, fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB/UNICAMP), com idade entre 8 a 10 semanas e peso médio 20 a 25 gramas. Os animais foram acondicionados no Biotério do Departamento de Farmacologia, em gaiolas apropriadas, com maravalha, máximo cinco animais por gaiola, ração padrão Nuvilab e água filtrada ad libitum, em ambiente com temperatura controlada (24 ºC) e iluminação diária de 12 horas.
3.2 Desenho experimental
3.2.1 Padronização do modelo de cistite induzida por CYP
A cistite foi induzida por injeção intraperitoneal de CYP dissolvida em solução salina, e as doses determinadas em concordância com estudos anteriores36-38,79. Os seguintes grupos experimentais foram constituídos:
1) Controle: animais que receberam injeção i.p. de salina (10 mL/kg);
2) Cistite aguda: animais que receberam injeção i.p. de CYP (300 mg/kg) e avaliados após 4 horas de indução;
3) Cistite intermediária: animais que receberam injeção i.p. de CYP (300 mg/kg) e avaliados após 24 horas de indução;
4) Cistite crônica: animais que receberam injeções i.p. de CYP (75 mg/kg), durante 10 dias, em intervalos de 72 horas, e avaliados após 24 horas da última injeção.
3.2.2 Avaliação do potencial preventivo do BAY 58-2667
Após a padronização do modelo e após avaliação dos resultados obtidos, o grupo cistite intermediária (24 h) foi designado como modelo para avaliação do BAY 58-2667 na prevenção da cistite induzida por CYP. Os animais foram pré-tratados por gavagem com BAY 58-2667, na dose 1 mg/kg,63 ou com seu respectivo veículo (transcutol/cremophor/água, 1:2:7, vol/vol, 5 ml/kg). Após 1 hora os animais foram injetados via i.p. com CYP (300 mg/kg) ou salina. Desta forma, os animais foram distribuídos entre os quatro grupos abaixo:
1) pré-tratamento com veículo + injeção de salina; 2) pré-tratamento com BAY 58-2667 + injeção de salina; 3) pré-tratamento com veículo + injeção de CYP;
4) pré-tratamento com BAY 58-2667 + injeção de CYP.
3.3 Avaliação do perfil miccional
3.3.1 Técnica de mancha de micção em papel de filtro
Os animais foram acondicionados individualmente em gaiolas forradas com papel filtro (26 x 16 cm; 80 g/m2) durante 3 horas, com água ad libitum, para a coleta da urina79. Após este período, os papéis foram secos naturalmente por 24 horas. As imagens foram obtidas em fotodocumentador (Chemi-Doc, Bio Rad, Califórnia, EUA) através da exposição do papel à luz ultravioleta. O número de micções foi avaliado e a área de micção foi quantificada utilizando-se o programa ImageJ (ImageJ Software,
NIH, Maryland, EUA). Para determinação do volume de micção, realizou-se curva de calibração com volumes conhecidos de urina aplicados no papel filtro e relativizados com a área obtida.
3.3.2 Análise cistométrica
Os animais foram anestesiados com uretana (1,8 g/kg, i.p.). A bexiga urinária foi exposta e cateterizada utilizando um scalp nº 25. Este scalp era acoplado à uma torneira de 3 vias, que permitia simultaneamente a conexão a uma bomba de infusão de salina, uma seringa para esvaziamento da bexiga, e um transdutor de pressão acoplado à um sistema PowerLab 4/30 de aquisição de dados (ADInstruments, Sidney, AU). Após canulação, a bexiga foi esvaziada, estabilizada por cinco minutos, iniciando-se a infusão de salina a temperatura ambiente, velocidade constante de 0,6 mL/h, por 45 minutos63. Os parâmetros cistométricos avaliados foram: pressão basal, pressão limiar (pressão intravesical imediatamente antes da primeira micção), capacidade (volume intravesical até a primeira micção), complacência (razão entre a capacidade e a pressão durante o enchimento vesical), pressão de micção (pressão máxima atingida durante a micção), pressão pós-miccional (pressão imediatamente após os fim do esvaziamento vesical), frequência de micções, intervalo de micções (média dos intervalos de tempo entre as micções durante 45 minutos) e frequência de contrações não miccionais (contrações involuntárias da bexiga, de amplitude maior que 4 mmHg, e que não resultaram em micção)63.
3.4 Ensaio funcional in vitro
Os protocolos funcionais in vitro foram realizados em concordância com estudo anterior do grupo63.
3.4.1 Isolamento e montagem dos tecidos
As bexigas foram removidas imediatamente após a eutanásia dos animais. Duas tiras longitudinais de músculo detrusor com o urotélio íntegro foram obtidas de cada bexiga. Os tecidos foram montados em banho para órgãos isolados (cuba 10 mL), preenchido de solução de Krebs-Henseilet (117 mM NaCl; 4,7 mM KCl; 2,5 mM CaCl2; 1,2 mM MgSO4; 1,2 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 e 11 mM Glicose, pH 7,4), gaseificadas continuamente com mistura carbogênica (5% CO2 e 95% de O2) e com temperatura controlada à 37 ºC. Cada tira de tecido foi acoplada a um transdutor de força, sob tensão inicial de 5 mN, e a um sistema PowerLab 4/30 de aquisição de dados. Foram realizados os protocolos experimentais descritos abaixo.
3.4.2 Respostas contráteis ao agonista muscarínico carbacol e ao KCl
Após o período de estabilização de 1 hora, realizamos curvas concentração-resposta ao agonista muscarínico pleno carbacol (0,001 – 30 µM). Após lavagem do tecido, realizamos a contração induzida por KCl (80 mM).
As respostas contráteis foram determinadas em mN e expressas pela razão mN/peso da respectiva tira de tecido (mg). Os valores de potência (pEC50) e respostas máximas (Emáx) foram calculados pela seguinte equação: E = Emax/[(1+(10c/10x)N + Ф], onde E é elevação do tônus basal, Emax é a máxima resposta que o agonista pode produzir, “c” é o logarítimo da EC50, que é a contração do agonista que produz 50% da resposta máxima; “x” é o logaritmo da concentração do agonista, o expoente, “N”, significa a inclinação da curva concentração-resposta e Ф é a resposta observada na ausência do agonista. As análises de regressões não lineares para determinar os parâmetros Emax, logEC50 e o “n” foram feitas utilizando-se o software GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., Califórnia, EUA), considerando o parâmetro Ф como zero.
3.4.3 Respostas contráteis à estimulação elétrica de campo (EFS)
Para a EFS, os tecidos foram montados entre dois eletrodos de platina dispostos de forma paralela e conectados à um estimulador S88 (Grass Telefactor; Rodhe Island, EUA). Os tecidos foram estimulados eletricamente a uma voltagem de 80V, com duração dos pulsos de 1 milisegundo (ms), intervalo entre os pulsos de 0,2 ms, duração de estimulação de 10 segundos, nas frequências de 1, 2, 4, 8, 16 e 32 Hz, com intervalo de 2 minutos entre os estímulos.
3.5 Avaliação de edema e análise histológica
Ao fim do período de indução da cistite, os animais foram pesados, eutanasiados em câmara de gás carbônico, seguido de deslocamento cervical. As bexigas urinárias foram então removidas e pesadas. Para a avaliação de edema, determinou-se a razão entre peso úmido da bexiga e peso total do animal. Para a análise histológica, os tecidos foram fixados em solução de paraformaldeído a 4%, embebidos em parafina, cortados em secções de 5 µm e corados com hematoxilina e eosina. As imagens foram obtidas em microscópio óptico equipado com câmera digital (Leica DM2000, Leica Microsystems, Wetzlar, DE), sob objetivas de 10 à 100x.
3.6 Determinação da atividade da MPO
Como descrito anteriormente80, para avaliação da atividade de MPO as bexigas foram removidas, congeladas em nitrogênio líquido, pulverizadas e homogeneizadas em tampão de brometo de hexadecil-trimetil ammonium (HTAB). Após centrifugação por 2 minutos a 8000 g, o sobrenadante foi utilizado para determinação da atividade de MPO através da reação com 1,6 mM de tetrametilbenzidina, 80 mM NaPO4 e 0,3 mM de peróxido de hidrogênio. A concentração protéica de cada amostra foi determinada por
ensaio de Bradford81. A absorbância da reação foi determinada a 460 nm e os resultados expressos como densidade óptica (D.O.) por mg de proteína.
3.7 Western blotting
Avaliamos a expressão da enzima GCs em períodos de 1, 2, 4, 6, 12 e 24 horas após a exposição à CYP ou veículo. Após cada intervalo de tempo, os animais foram eutanaziadas e as bexigas foram removidas. Seguindo protocolo descrito anteriormente64, os tecidos foram congelados em nitrogênio líquido e imediatamente pulverizadas e homogeneizadas em tampão de extração de SDS por 30 minutos à 4 ºC. Após centrifugação para obtenção do sobrenadante, foi realizada a dosagem de proteína pelo método de Bradford, e as amostras foram tratadas com tampão Laemmli contendo 10% de β–mercaptoetanol. As proteínas foram separadas em gel de 10% de poliacrilamida e eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose. Após bloqueio de marcações inespecíficas, a detecção foi realizada pela incubação de anticorpos específicos para Anti-GCsα1, anti-GCsβ1, COX-2 e anti-β-actina, anticorpos secundários HRP-conjugados e solução de luminol. As imagens foram obtidas em fotodocumentador (Chemi-Doc, Bio Rad, Califórnia, EUA) e a intensidade das bandas, como uma medida da expressão da proteína, foi determinada por análise densitométrica mediante uso do software Image Lab (Biorad, Califórnia, EUA).
3.8 Determinação dos níveis de GMPc
Avaliamos alterações na atividade da enzima GCs induzidas pela CYP também através de um time course ao longo de 24 horas de exposição. Neste caso, os animais foram tratados com CYP (300 mg/kg) e eutanasiados após 1, 2, 4, 6, 12 ou 24 horas. As bexigas foram removidas, congeladas em nitrogênio líquido e imediatamente pulverizadas e então processadas para determinação dos níveis de GMPc, de acordo
com as instruções do fabricante do kit (Cayman Chemicals, Michigan, EUA) e experiência prévia do grupo63,64. Os experimentos foram realizados em duplicata e normalizados pelo peso úmido da respectiva bexiga. Os resultados foram expressos como picomol/mg de tecido.
3.9 Real time PCR
Após 24 horas da indução de cistite por CYP, os animais foram eutanaziados e as bexigas removidas. De acordo com protocolo descrito anteriormente82, o RNA total foi extraído de bexigas inteiras em TRIzol de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA). Para a transcrição do RNA à cDNA, utilizou-se kit com a enzima transcriptase reversa SuperScript III (Thermo Fisher Scientific), e a quantificação e pureza do cDNA obtida em espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Foram utilizados iniciadores (primers) construídos especificamente para os genes da subunidade β1 da GCs e -actina, o controle endógeno. As respectivas sequências foram: GCs β-F
5’-CATACAGGTGTCTCATGTCTCCA-3’; GCs β-R
5’-GAACCCAACCGACGTTCTCT-3’; -actina-F 5’-ACTGCCGCATCCTCTTCCT-3’; -actina-R 5’-GAACCGCTCGTTGCCAATA-3’, e a concentração utilizada foi 150 nM. A detecção de amplificação em tempo real utilizou o equipamento StepOnePlus PCR System (Applied Biosystems, Califórnia, EUA).
3.10 Determinação dos níveis de espécies reativas de oxigênio
O corante fluorescente diidroetidio (DHE) foi utilizado para avaliação da geração de ERO in situ. As bexigas foram removidas e embebidas em meio de congelamento (Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek, Califórnia, EUA). Secções transversas
de 12 µm foram obtidas em criostato, coletadas em lâminas, equilibradas por 10 minutos em solução de Hank’s (17,1 mM NaCl; 0,7 mM KCl; 0,05 mM KH2PO4; 0,04 mM NaH2PO4; 0,7 mM Glicose; pH 7,4). Em seguida, solução de DHE (2 µM) foi aplicada a cada amostra e as lâminas foram incubadas à 37 ºC por 30 minutos em câmara úmida. As imagens foram obtidas em microscópio equipado para imunofluorescência e com câmera digital (Eclipse80i/DS-U3, Nikon Instruments Inc., Tóquio, JPN), sob magnificação de 200 x. A fluorescência foi detectada a 585 nm e o número de núcleos marcados com DHE no músculo detrusor e no urotélio foram detectados usando o software ImageJ, como descrito anteriormente64. Os resultados foram expressos como núcleos marcados/mm2.
3.11 Análise estatística
Os resultados foram apresentados com médias ± erro padrão das médias (EPM) de um número experimental (n). Para comparações múltiplas foi utilizado o teste de análise de variância (ANOVA) de duas vias, seguido pelo pós-teste de Bonferroni. O teste t de Student foi utilizado para análises de um mesmo parâmetro entre dois grupos experimentais. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos. O software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., California, EUA) foi utilizado para as análises.
4. RESULTADOS
4.1 Caracterização da cistite induzida por CYP
4.1.1 Alterações macroscópicas, razão peso vesical/corporal e atividade da MPO.
A injeção intraperitoneal de CYP induziu alterações macroscópicas na bexiga urinária em 4 h, 24 h e 10 dias, sendo visível o aumento de tamanho do órgão, além de sinais de hemorragia (Figura 6B). Quando analisamos a razão entre peso da bexiga e peso corporal (mg/g), notamos um aumento significativo dos três grupos cistite em relação ao grupo controle (P < 0,05; Figura 6C). No grupo cistite intermediário (24 h), esta proporção foi maior em relação ao controle a todos os grupos, notando-se um aumento de mais de três vezes em relação ao grupo controle. No grupo cistite crônico (10 dias) observamos um aumento visível no tamanho das bexigas em relação ao grupo intermediário, entretanto, tais bexigas não apresentavam maior peso e o aumento do tamanho sugere remodelamento tecidual. Destacamos que a injeção de CYP não induziu alterações significativas no peso corporal dos animais expostos em relação aos controles (Figura 6A).
Com relação a MPO, sua atividade intracelular correlaciona-se ao conteúdo de neutrófilos no tecido sendo, portanto, utilizada como marcador para infiltração neutrofílica na cistite83. A atividade desta enzima se mostrou marcantemente elevada nos grupos cistite (P < 0,05), especialmente no grupo cistite intermediário (24 h) (Figura 6D).
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Figura 6. Peso corporal, alterações macroscópicas, razão peso da bexiga/peso corporal e atividade de mieloperoxidase (MPO). (A) Peso corporal dos animais controles e injetados com ciclofosfamida (CYP; 300 mg/kg para 4 h e 24 h; e 75 mg/kg para 10 dias) ou salina. (B) Imagem representativa das bexigas isoladas (C) Proporção entre o peso da bexiga e corpo dos animais e (D) atividade da MPO em bexigas isoladas de animais controles e com cistite. ANOVA de duas vias, pós-teste de Bonferroni, n = 5-8 animais/grupo, *P < 0,05 vs controle (CTRL); P< 0,05 vs 4 horas; #P < 0,05 vs 10 dias. CTRL, controle; O.D., densidade óptica.
CTRL 4h 24h 10 dias
A) B)
4.1.2 Análise histológica
A figura abaixo destaca a bexiga urinária de animais controles. Observamos que as fibras musculares do detrusor são organizadas, e o urotélio encontra-se íntegro, contínuo e bem delimitado, sem reação inflamatória evidente (Figura 7A-D).
Figura 7. Perfil histológico de animais controle. Secções histológicas das bexigas urinárias isoladas de animais controle (A-D) e corados com hematoxilina e eosina. D, detrusor; S, sub-urotélio; U, urotélio; L, lúmen.
A injeção intraperitoneal de CYP produziu edema inflamatório nos fascículos do detrusor e na camada suburotelial da bexiga nos três grupos cistite, além de denudação celular na camada urotelial (Figura 8A-F). Qualitativamente, não observamos diferenças entre os grupos cistite de 4 h, 24 h e 10 dias.
40x A B C D A 100x 20x 10x D S U L D U L U
Cistite aguda (4 h):
Cistite intermediária (24 h):
Cistite crônica (10 dias):
Figura 8. Alterações histológicas induzidas pela ciclofosfamida (CYP). Secções histológicas das bexigas urinárias de animais injetados com CYP (300 mg/kg para 4 h e 24 h; e 75 mg/kg para 10 dias) após 4 h (A, B), 24 h (C, D) ou 10 dias (E, F), e corados com hematoxilina e eosina. D, detrusor; S, sub-urotélio; U, urotélio; L, lúmen.
20x 40x A B D S U L L U 20x 40x C D D U ; L S U L 20x 40x E F D S U L L U
4.1.3 Caracterização do perfil de micção de animais com cistite 4.1.3.1.Mancha de micção em papel filtro
Através da técnica de mancha de micção em papel filtro avaliamos in vivo, sem a necessidade de anestesia ou contenção do animal, a função miccional de animais controles e com cistite. Observamos que o número de micções nos grupos cistite foi significativamente maior comparado ao grupo controle (P < 0,05; Figura 9A,B). Enquanto os animais controles produziam em média de 3-4 manchas de micção no período de três horas, os animais do grupo cistite intermediária produziam mais de 100 manchas de micção no mesmo período, sendo esta diferença significativa em relação aos demais grupos (P < 0,05). Nos grupos cistite de 4 horas e 10 dias observamos uma média de 70 e 20 micções, respectivamente, sendo também significativos em relação ao controle (P < 0,05). Também verificamos uma redução significativa no volume de micção nos grupos cistite em relação ao controle (P < 0,05). Não notamos diferenças significativas entre os grupos 4 h, 24 h e 10 dias para este parâmetro (Figura 9C).
Figura 9. Registro do perfil de micção de animais controle e com cistite. (A) Papéis filtro representativos dos perfis de micção de animais controle (CTRL) e injetados com CYP (300 mg/kg para 4 h e 24 h; e 75 mg/kg para 10 dias) e (B) número de micções e (C) volume de micção obtidos durante 3 horas de marcação no papel filtro. ANOVA de duas vias, pós-teste de Bonferroni, n = 5 animais/grupo, *P < 0,05 vs CTRL. P< 0,05 vs 4 horas; #P < 0,05 vs 10 dias. CYP, ciclofosfamida.
4.1.3.2 Análise cistométrica
Verificamos que o perfil cistométrico de animais com cistite nos três grupos avaliados foi irregular quando comparado ao controle (Figura 10). Observamos reduções significativas na capacidade, complacência e pressão de micção, além de elevação na frequência de micções e de CNMs (P < 0,05; Tabela 1). Dentre os grupos
Controle 4 h 24 h 10 dias
A)
cistite, observamos que a frequência de CNMs entre os grupos cistite 4 horas e 10 dias foi menor em relação ao grupo 24 horas (Tabela 1).
Figura 10. Traçados cistométricos representativos de um animal por grupo. Setas indicam micções. CYP, ciclofosfamida.
Tabela 1. Alterações nos parâmetros cistométricos dos animais controles e com cistite CYP CTRL 4 h 24 h 10 dias Capacidade (mL) 0,09 ± 0,01 0,05 ± 0,01* 0,02 ± 0,012* 0,06 ± 0,01* Complacência (mL/mmHg) 0,02 ± 0,03 0,01 ± 0,003* 0,01 ± 0,01* 0,01 ± 0,01* Pressão de micção (mmHg) 27,60 ± 1,7 22,33 ± 2,0 20,03 ± 2,5* 21,23 ± 2,2
Frequência de micção (nº/min) 0,27 ± 0,05 0,77 ± 0,12* 0,64 ± 0,07* 0,49 ± 0,08*
Frequência de CNMs (nº/min) 0,23 ± 0,07 1,02 ± 0,17* 2,39 ± 0,32*# 0,82 ± 0,27*
Valores expressos como médias ± E.P.M, n = 5-8 animais por grupo. *P < 0,05 vs CTRL; #P < 0,05 vs 4 h; P < 0,05 vs 10 dias. CTRL, controle; CYP, ciclofosfamida.
Controle CYP 4h 1 0 m mH g
4.1.4 Avaliação funcional in vitro do detrusor isolado de animais controle e com cistite
4.1.4.1 Curva concentração-resposta ao carbacol
O carbacol causou resposta contrátil dependente da concentração em todos os grupos (Figura 11A). Entretanto, a resposta máxima ao carbacol foi significativamente menor nos grupos cistite de 4 e 24 horas comparada ao controle (P < 0,05; Figura 11B). Não observamos diferenças significativas na potência (pEC50) ao carbacol em nenhum dos grupos avaliados (5,97 ± 0,09 para grupo controle; 6,28 ± 0,03; 5,80 ± 0,11 e 6,06 ± 0,09 para os grupos cistite de 4 h, 24 h e 10 dias, respectivamente).
Figura 11. Resposta contrátil ao carbacol em detrusor isolado de animais controles e com cistite. (A) Curva concentração-resposta e (B) resposta máxima ao agonista muscarínico carbacol. Valores expressos como média ± E.P.M. ANOVA de duas vias, pós-teste de Bonferroni, n = 5-8 animais/grupo, *P < 0,05 vs CTRL. CTRL, controle; CYP, ciclofosfamida.
