A PROTEÍNA VICILINA (Vigna radiata L.) DO FEIJÃO
MUNGO VERDE COMO COMPOSTO FUNCIONAL:
EVIDÊNCIAS “IN VITRO” DAS ATIVIDADES
HIPOCOLESTEROLÊMICA E ANTIMICROBIANA
A.L.S. Amaral
1, M.A.S. Ramos
2, T.M. Bauab
3, Demonte, A.
41-Departamento de Alimentos e Nutrição – Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita
Filho, Faculdade de Ciências Farmacêuticas – CEP: 14800-903 – Araraquara – SP – Brasil,
Telefone: 55 (16) 98158-4056 - e-mail: (analuciasamaral@yahoo.com.br)
2-Departamento de Ciências Biológicas– Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita
Filho, Faculdade de Ciências Farmacêuticas – CEP: 14800-903 – Araraquara – SP – Brasil,
Telefone: 55 (16) 3301-4670 - e-mail: (matheusramos_91@hotmail.com)
3-Departamento de Ciências Biológicas – Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita
Filho, Faculdade de Ciências Farmacêuticas – CEP: 14800-903 – Araraquara – SP – Brasil,
Telefone: 55 (16) 3301-4670 - e-mail: (tmbauab@gmail.com)
4- Departamento de Alimentos e Nutrição – Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita
Filho, Faculdade de Ciências Farmacêuticas – CEP: 14800-903 – Araraquara – SP – Brasil,
Telefone: 55 (16) 3301-6900 - e-mail: (demontea@fcfar.unesp.br)
RESUMO – O conhecimento sobre a homologia estrutural da vicilina (8S) do feijão mungo verde (Vigna radiata L.) com as vicilinas da soja e de outros feijões e a ausência de estudos sobre os possíveis efeitos funcionais desta leguminosa nos levou a buscar um método de isolamento da fração vicilina do feijão mungo verde e a conferir sua possível ação inibitória sobre a HMG CoAr, enzima responsável pela síntese de colesterol endógeno, e sobre microrganismos patogênicos em testes in vitro. Os resultados mostram a eficácia nos métodos de isolamento e caracterização da fração proteica, além do efeito hipocolesterolêmico e antimicrobiano do hidrolisado da 8S do feijão mungo verde.
ABSTRACT – Knowledge about the structural homology of vicilin (8S) of green mung bean (Vigna radiata L.) with vicilins soy and other beans and the absence of studies on the possible functional effects of the legume has led us to seek a method of isolation of vicilin fraction of green mung beans and check their possible inhibitory action on HMG CoAr, enzyme responsible for endogenous cholesterol synthesis, and on pathogenic microorganisms in vitro tests. The results show the effectiveness of the methods of isolation and characterization of the protein fraction, and the hypocholesterolaemic and antimicrobial effect of the hydrolyzate of the green mung bean.
PALAVRAS-CHAVE: feijão mungo verde; vicilina; efeito hipocolesterolêmico; ação antimicrobiana
KEYWORDS: green mung bean; vicilin; hypocholesterolaemic effect; antimicrobial action
O feijão mungo verde é originário da Índia, sendo que cerca de 90% da sua produção atual acontece no sul, leste e sudeste da Ásia. No Brasil, sua produção ainda é pequena, porém bastante promissora já que a demanda deste feijão tem aumentado visando à produção de brotos de feijão (Vieira et al., 2002; Nair et al., 2013). As proteínas do feijão mungo verde (Vigna radiata L.) correspondem a 17 a 26% de seu conteúdo total (Mendoza et al., 2001), sendo constituídas por 62% de globulinas, 16,3% de albuminas, 13,3% de glutelinas e 0,9% prolaminas (Tsou et al., 1979). As vicilinas ou 8S correspondem a 89% das globulinas totais, seguidas por 7,6% de leguminas e 3,4% de 7S básicas e o peso molecular de suas subunidades correspondem a 60, 48, 32 e 26 kDa, não possuindo ligações dissulfeto entre si (Mendoza et al., 2001).
Além da importância nutricional das proteínas do feijão mungo verde, suas características físico químicas parecem estar relacionadas com o desempenho de suas propriedades funcionais, o que possibilita o seu uso na indústria alimentícia (Dzudie, Hardy,1996; Akaerue, Onwuka, 2010; Tang, Sun, 2010). Os efeitos fisiológicos das proteínas do feijão mungo verde também têm sido alvo de pesquisas. Yao, Zhu e Ren (2014) e Tachibana et al. (2013) identificaram a ação hipolipidêmica in vivo do isolado proteico do feijão mungo verde. Peptídeos derivados da fração globulínica 8S do feijão mungo verde desempenharam papel anti-hipertensivo ao inibir a atividade da enzima conversora de angiotensina (Viernes et al., 2012) ao passo que o peptídeo VrCRP, isolado a partir do feijão mungo verde tem ação antimicrobiana, podendo ser usado no combate de uma espécie de larva, a Callosobruchus maculatus. Dentro da perspectiva atual e relevante da pesquisa com compostos funcionais presentes em alimentos, este trabalho buscou caracterizar a fração vicilina e identificar sua bioatividade em ensaios in vitro.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Isolamento e caracterização da globulina 8S do feijão mungo verde
O isolamento da fração proteica vicilina foi realizado a partir do método de Sun, Hall (1975) e as subunidades das frações proteicas foram analisadas e seus pesos moleculares identificados por eletroforese em gel de acordo com procedimento descrito por Laemmli (1970). O perfil cromatográfico da vicilina foi traçado a partir de sua eluição em coluna contendo resina Sepharose CL-6B (100 x 2,5 cm) previamente equilibrada com tampão fosfato de potássio 10 mmol/L, pH 7,5, contendo 0,5 mol/L de NaCl e 0,01% de azida sódica. O fracionamento foi registrado pela coleta de 5,5 mL/tubo e absorbância a 280 nm. A estimativa de peso molecular foi calculada a partir da eluição de uma alíquota da vicilina isolada aplicada em coluna Sephadex G-200 (100 x 1,7 cm), previamente equilibrada com tampão fosfato de potássio 20 mM, pH 7,5, contendo 0,5 M de NaCl e em seguida realizada a leitura das frações coletadas em absorbância de 280 nm. Citocromo C (12400 Da), inibidor de tripsina (21500 Da) e ferritina (480000 Da) foram as proteínas utilizadas como padrão de peso moleculares.2.2 Obtenção e caracterização do hidrolisado da 8S do feijão mungo
verde
A 8S isolada foi submetida à hidrólise sequencial com as enzimas pepsina-pancreatina de acordo com o método de Akeson e Stahmann (1964) e realizada a determinação de seu grau de hidrólise pela metodologia descrita por Spadaro et al. (1979), tendo a L-leucina como padrão na absorbância de 420 nm. O hidrolisado obtido, referente ao tempo 300’, foi eluído em coluna Sephadex G-25 e caracterizado por eletroforese SDS-Page Tricina (Haider et al., 2012).
2.3 Quantificação do percentual de inibição da HMG-CoAr
A atividade hipocolesterolêmica da fração 8S do feijão mungo verde foi verificada através do percentual de capacidade inibitória da enzima CoAr utilizando-se o kit comercial
HMG-CoAr (HMGR) Assay (Sigma®), com o uso de Pravastatina® como controle positivo da atividade inibitória.
2.4 Quantificação da inibição da atividade antimicrobiana
Para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foram empregadas três cepas bacterianas: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Helicobacter pylori ATCC 43504. A CIM foi determinada pela técnica de diluição em microplacas (96 orifícios) de acordo com a metodologia descrita segundo a norma M7-A6 do Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006a) para as bactérias aeróbicas e adaptado para as fastidiosas, seguindo suplemento M100-S16 do CLSI (2006b). A CIM foi considerada como a menor concentração do hidrolisado vegetal capaz de inibir o crescimento de 90% das cepas (HÖRNER et al., 2008).
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O perfil cromatográfico visualizado na Figura 1A refere-se ao conteúdo proteico final da fração vicilina obtida da extração do feijão mungo verde, após a eluição em coluna Sepharose CL-6B. A presença de um único pico mostra que o protocolo de extração utilizado no presente trabalho foi eficaz quanto ao seu isolamento. A eluição em Sephadex G-200 (Figura 1B) permitiu a verificação de seu peso molecular aproximado (158,23±10 kDa), estando estes resultados condizentes com Kimura et al. (2008) e Viernes et al. (2012).
Figura 1 - Perfil cromatográfico do isolado proteico da 8S do feijão mungo verde em Coluna Sepharose CL 6B (A) e em Sephadex G-200 (B).
Fonte: Figura confeccionada pela própria autora.
A SDS Page ilustrada na Figura 2 mostra que a globulina 8S é composta por 4 bandas correspondentes a polipeptídeos de 61, 48, 29 e 26 kDa. Estes dados estão de acordo com Mendoza et al (2001), Tang e Sun (2010) e Viernes et al (2012).
Figura 2 - SDS Page das frações proteicas do feijão mungo verde. P. Padrão, 1. Globulina total, 2. 8S isolada, 3. Pico cromatográfico na Coluna Sepharose CL 6B, 4. Pico cromatográfico na Coluna Sephadex G-200.
Fonte: Figura confeccionada pela própria autora. 8S Mungo Verde
A análise eletroforética do hidrolisado total da vicilina do feijão mungo verde obtido da digestão com pepsina e pancreatina indicou que a maioria de seus peptídeos possuem pesos moleculares entre 6,5 a 18 kDa. Considerando as evidências de que peptídeos de baixo peso molecular parecem ser mais efetivos ao desempenharem atividade fisiológica por atravessarem a barreira intestinal passivamente Kou et al (2013), o hidrolisado total foi eluído em Coluna Sephadex G-25 para separação dos peptídeos menores de 5 kDa.
Figura 3 – SDS Tricina da 8S do feijão mungo verde após hidrólise com pepsina e pancreatina. P. Padrão, 1. Hidrolisado total da 8S do feijão mungo verde após 300 minutos (A). Perfil cromatográfico do hidrolisado total da 8S do feijão mungo verde após eluição em coluna de filtração em gel G 25 (B).
Fonte: Figura confeccionada pela própria autora.
Na execução do teste de inibição da HMG CoAr, a pravastatina®, medicamento padrão utilizado no tratamento da hipercolesterolemia, provocou uma redução de 78% na atividade da enzima, enquanto que o hidrolisado proteico da 8S foi responsável por 67,8% de inibição da enzima HMG CoAr (Figura 4). A ação hipocolesterolêmica através da inibição da HMG CoAr tem sido verificada em outras espécies de leguminosas e o possível mecanismo de ação parece estar relacionado com a regulação alostérica desta enzima, em que a baixa concentração de substrato permite aos peptídeos entrarem em contato direto com o sítio ativo da enzima, oxidando NADPH enquanto que em altas concentrações de substrato, os peptídeos, em especial as porções hidrofóbicas, se ligam na enzima através do local de inserção do NADPH (Marques et al., 2015, Lammi et al., 2015)
Figura 4 - Perfil de inibição da HMG CoAr ocasionado pela presença do hidrolisado total da
8S isolada do feijão mungo verde.
Fonte: Figura confeccionada pela própria autora.
Não há nenhum relato sobre a ação antimicrobiana de peptídeos da vicilina deste feijão. Desta maneira, o presente trabalho verificou que os peptídeos derivados do hidrolisado total do feijão mungo verde apresentaram ação antibacteriana frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli e principalmente, a Helicobacter pylori (Tabela 1). Em seu estudo, Niehues et al. (2010) verificaram que peptídeos de 10 kDa derivados do isolado proteico de ervilha (Pisum sativum L.) provocaram uma redução de 53% na aderência da H. pylori na mucosa gástrica usada em teste in vitro. Os autores sugerem que este efeito é consequência da interação destes peptídeos com proteínas presentes na parte
A B
externa da membrana. A homologia entre as vicilinas de feijões, ervilhas e soja foi relatada por Doyle et al. (1985), assim, a ação antimicrobiana diante da H. pylori observada neste trabalho e no estudos de Niehues et al. (2010) pode ser associada, pelo menos em parte, à fração vicilina presente nestas leguminosas.
Tabela 1 - Ação antimicrobiana da 8S do feijão mungo verde frente a diferentes microrganismos.
Microrganismo Cepa Controle CIM (µg/mL) - controle
CIM (µg/mL) - hidrolisado 8S mungo verde
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ampicilina 3,12 250
Escherichia coli ATCC 25922 ampicilina 12,5 250
Helicobacter pylori ATCC 43504 amoxicilina 31,2 7,03
Fonte: Tabela confeccionada pela própria autora.
4 CONCLUSÕES
Os métodos de extração e isolamento proteico foram eficazes quanto à obtenção da vicilina do feijão mungo verde. Os testes realizados com o hidrolisado mostraram a ação biológica desta fração proteica apesar dos mecanismos de ação envolvidos nas atividades anticolesterolêmica e antibacteriana não estarem totalmente elucidados. A identificação dos efeitos benéficos da vicilina do feijão mungo verde demonstrados neste trabalho indicam que a fração proteica vicilina é um composto funcional.
5 AGRADECIMENTOS
PADC-FCF-UNESP-Araraquara6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Akaerue, B. I., Onwuka, G. I. (2010). Evaluation of the yield, protein content and functional properties of mungbean [ Vigna radiate (L.)] protein isolates as affected by processing. Pakistan Journal of Nutrition, 9(8), 728-735.
Akeson, W. R., Stahmann, M. A. A pepsin pancreatin digest index of protein quality evaluation. Journal of Nutrition, 83(3), 257 - 261, 1964.
CLSI. Manual Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standards- 6ª ed. Document M7-A6 performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA., 2006a.
CLSI. Manual Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically: approved standards- 6ª ed. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Sixteenth informational supplement M100-S16 (tab 2J). Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA., 2006b.
Doyle, J.J., Ladin, B.F., Beachy, R.N. (1985). Antigenic relationship of legume seed storage proteins to the 7S storage protein of soybean. Biochemical Systematics and Ecology, 13(2), 123-132.
Dzudie, T., Hardy, J. (1996). Physicochemical and functional properties of flours prepared from common beans and green mung beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(10), 3029 - 3032.
Haider, S. R., Reid, H. J., Sharp, B. L. (2012). Tricine –SDS-Page. Protein electrophoresis: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology, 869, 81 – 91.
Hörner, M., Giglio, V. F.; Santos, A. J. R. W. A., Westphalen, A. B., Inglesias, B. A., Martins, P. R., Amaral, C. H., Michelot, T. M., Reetz, L. G. B., Bertoncheli, C. M., Paraginski, G. L., Horner, R.(2008). Triazenos e atividade antibacteriana. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 44(3), 441- 449.
Kimura, A.; Fukuda, T.; Zhang, M.; Motoyama, S.; Maruyama, N.; Utsumi, S. (2008). Comparison of physicochemical properties of 7S and 11S globulins from pea, fava bean, cowpea and french bean with those of soybeans french bean 7S globulin exhibits excellent properties. Journal of Agricultural and Food Chemistry., 56(21), 10273–10279.
Kou, X.; Gao, J.; Xue, Z.; Zhang, Z.; Wang, H.;Wang, X. (2013). Purification and identification of antioxidant peptides from chickpea (Cicer arietinum L.) albumin hydrolysates. Food Science and Technology., 50, 591 – 598.
Laemlli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4, Nature. 227(5259), 680 - 684.
Lammi, C., Zanoni, C., Arnoldi, A., Vistoli, G. (2015). Two peptides from soy β‑Conglycinin induce a hypocholesterolemic effect in HepG2 cells by a statin-like mechanism: comparative in vitro and in silico modeling studies. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63(36), 7945 − 7951.
Marques, M. R., Freitas, R. A. M. S., Carlos, A. C. C., Siguemoto, E. S.; Fontanari, G. G., Arêas, J. A. G. (2015). Peptides from cowpea present antioxidant activity, inhibit cholesterol synthesis and its solubilisation into micelles. Food Chemistry, 168, 288 – 293.
Mendonza, E. M. T., Adachi, M.; Bernardo, A. E. N., Utsumi, S. (2001). Mungbean [ Vigna radiata ( L.) Wilczek] globulins: purification and characterization.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(3), p. 1552 – 1558.
Nair, R. M., Yang, R.Y., Easdown, W. J., Thavarajah, D., Thavarajah, P., Hughes, J., Keatinge, J. D. (2013). Biofortification of mungbean (Vigna radiata) as a whole food to enhance human health. Journal of the Science of Food and Agriculture, 93(8), 1805-1813.
Niehues, M.; Euler, M.; Georgi, G.; Mank, M.; Stahl, B.; Hensel, A. (2010). Peptides from Pisum sativum L. enzymatic protein digest with anti-adhesive activity against Helicobacter pylori: Structure– activity and inhibitory activity against BabA, SabA, HpaA and a fibronectin-binding adhesion. Molecular Nutrition & Food Research, 54(12), 1851 – 1861.
Sun, S. M.; Hall, T.C. (1975) Solubility characteristics of globulins from Phaseolus seeds in regard to their isolation and characterization. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 23(2), 184 – 189. Vieira, R.F., Oliveira, V.R., Vieira, C., Pinto, C.M.F. (2002). Ouro Verde MG2: nova cultivar de mungo-verde para Minas Gerais. Horticultura Brasileira, 20(1), 119-120.
Viernes, L. B. G., Garcia, R. N.; Torio, M. A. O., Angelia, M. R. N.(2012). Antihypertensive peptides from vicilin, the major storage protein of mung bean [Vigna radiata ( L.) Wilczek]. Journal of Biological Sciences, 12(7), 393 – 399.
Tang, C., Sun, X. (2010). Physicochemical ans structural properties of 8S and/or 11S globulins from mungbean [Vigna radiata ( L.) Wilczek] with various polypeptides constituents. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(10), 6395 – 6402.
Tachibana, N., Wanezaki, S., Nagata, M., Motoyama, T., Kohno, M., Kitagawa, S. (2013). Intake of mung bean protein isolate reduces plasma triglyceride level in rats. Functional Foods in Health and Disease, 3(9), 365-376.
Tsou, C. S., Hsu, M. S., Tan, S.T., Park, H.G. (1979). The protein quality of mungbean and its improvement. In: Proceedings of the Symposium on Quality of Vegetables. Lund, Sweden, 279 - 288. Yao, Y., Zhu, Y., Ren, G. (2014). Mung bean protein increases plasma cholesterol by up-regulation of hepatic HMG-CoA reductase, and CYP7A1 in mRNA levels. Journal of Food and Nutrition Research, 2(11), 770 – 775.
