Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – NUPEB
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
Avaliação do perfil de IgG e subclasses de IgG de pacientes portadores
de infecção chagásica do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha,
Minas Gerais
Autora: Lílian da Silva Santos
Orientadora: Profª. Drª Marta de Lana
Co-Orientador: Dr. Pedro Albajar Viñas
Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – NUPEB
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
Avaliação do perfil de IgG e subclasses de IgG de pacientes portadores
de infecção chagásica do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha,
Minas Gerais
Autora: Lílian da Silva Santos
Orientadora: Profª. Drª. Marta de Lana
Co-Orientador: Dr. Pedro Albajar Viñas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração: Imunobiologia de Protozoários
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br
S237a Santos, Lílian da Silva.
Avaliação do perfil de IgG e subclasses de IgG de pacientes portadores de infecção chagásica do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais [manuscrito] / Lílian da Silva Santos. – 2008.
xix, 132 f.: graf., tabs., mapas.
Orientadora: Profa. Dra. Marta de Lana.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Área de concentração: Imunobiologia de protozoários.
1. Imunoglobulinas - Teses. 2. Chagas, Doença de - Teses. 3. Berilo (MG) - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
Aceita a própria vida Buscando melhorá-la.
Abraça os que te cercam, Doando-lhes auxílio.
Nada exijas. Trabalha. Não condenes. Constrói.
Se a provação chegou, Acata-lhe os ensinos.
Sê fiel a ti mesmo, Serve, segue e não temas.
Se te aceitas como és Deus te fará feliz
Aos meus amados pais, Maria e Wilson.
A todos os milhões de infectados pelo Trypanosoma cruzi
No estalla como las bombas, ni suena como los tiros. Como el hambre, mata callando. Como el hambre, mata a los callados: a los que viven condenados al silencio
y mueren condenados al olvido. Tragedia que no suena, enfermos que no pagan, enfermedad que no vende. El mal de Chagas no es negocio que atraiga a la industria farmacéutica,
ni es tema que interese a los políticos ni a los periodistas. Elige a sus víctimas en el pobrerío.
Las muerde y lentamente, poquito a poco, va acabando con ellas. Sus víctimas no tienen derechos,
ni dinero para comprar los derechos que no tienen. Ni siquiera tienen el derecho de saber de qué mueren.
Agradeço a Deus por tudo que Ele proporciona em minha vida....
À Prof. Marta de Lana pela oportunidade de ingressar em um mundo até então desconhecido por mim. Obrigada pela confiança e pelo empenho despendido para que tudo desse certo.
Ao Dr. Pedro Albajar Viñas, agradeço pela sua colaboração em meu trabalho, por sempre estar disponível a me ouvir, e me aconselhar com suas sábias palavras em momentos decisivos e difíceis. Obrigada pelas longas conversas!
À Drª. Rosália agradeço não apenas pela colaboração em meu trabalho, mas pela presença sempre alegre e amigável.
Ao Dr. Olindo, por ter cedido seus reagentes em um momento crucial do meu trabalho, pelos soros disponibilizados e por toda a atenção dada a esse estudo.
A todos os professores do NUPEB.
À querida Cida, pessoa esplêndida, que com muito carinho, atenção e alegria sempre me
recebeu.
Aos meus colegas de Mestrado, em especial a turma da “Parasitologia”, Alexandra, Alekson, Léo, Elisângela, Rafaela e Dani, que esteve unida em todos os momentos com alegria e bom humor.
A todos do Laboratório de Doença de Chagas, em especial ao Auffy, Jaquelline, Lílian, Arnaldo, Maykon, Rodrigo, Marcela, Érika, Rafaela, Gláucia, pela amizade, alegria e por todos os favores pedidos, a Dani Sorriso, e ao Vítor pelo cuidado com as hemoculturas.
Ao Prof. André Talvani pela oportunidade de compartilhar de suas aulas, pelas idéias e discussões, que muito acrescentaram no meu conhecimento.
À Helen, que me ajudou prontamente em tudo que precisei, demonstrando seriedade, competência e discernimento, em momentos de importância na minha jornada.
A todos de Berilo que direta ou indiretamente participaram desse projeto, em especial aos funcionários do Hospital Municipal, da Secretaria de Saúde e dos PSFs.
Ao Padre Nuno, que com toda sua força luta em benefício dos pacientes com doença de Chagas de Berilo.
Á querida Beth, por nos acolher em Berilo com tanto carinho e alegria.
Ao Nem, Tuca e Dona Araci, por nos oferecerem um ambiente agradável e uma comida deliciosa, nos momentos de muito trabalho.
A todos os pacientes que participaram desse trabalho, especialmente a três deles que perderam a vida durante esse estudo. É para evitar que mortes tão precoces aconteçam que nos empenhamos nessa batalha.
Há pessoas que em nossas vidas surgem como um bálsamo em momentos difíceis, e que nos aconselham, nos ouvem, sofrem junto, e estão sempre lá, do nosso lado, mesmo à distância...
Agradeço a minha querida amiga Dani, porque sem ela esses anos não teriam sido os
mesmos. Agradeço por sempre me ajudar em todos os momentos, e por fazer crescer entre nós uma amizade que ultrapassa qualquer fronteira.
As minhas queridas irmãs por terem paciência e entenderem o momento vivido por mim, e ao meu querido Arthur que deixa nossos dias repletos de alegria.
Ao querido Vitório, companheiro em todos os momentos, por sempre me dar apoio, e acreditar em mim, e a sua linda família que me recebeu de coração e portas abertas.
A cidade de Ouro Preto, por ter sido o cenário dos momentos iniciais da minha vida adulta.
A Escola de Farmácia, pela oportunidade de fazer parte de sua história.
A todos que de qualquer maneira participaram desse trabalho, muito obrigada.
... E eu digo que a vida é mesmo escuridão exceto quando existe necessidade, E toda a necessidade é cega exceto quando existe sabedoria.
E toda a sabedoria é vã exceto quando existe trabalho, E todo o trabalho é vazio exceto se houver amor;
E quando trabalhais com amor vocês estão se ligando a vocês mesmos, e uns aos outros, e a Deus.
A pesquisa de técnicas sorológicas de alta especificidade e sensibilidade que sejam capazes de avaliar a morbidade da doença de Chagas é de grande interesse. O maior objetivo desse trabalho foi realizar uma avaliação sorológica pesquisando IgG total e suas subclasses IgG1, IgG2 e IgG3, em diluições sucessivas de soro, em pacientes do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais, infectados pelo
Trypanosoma cruzi com diagnóstico sorológico positivo e previamente avaliados do
The research of serological tests of high specificity and sensibility that could be able to evaluate the morbidity of Chagas disease is of great interest. The major objective of this work was to carry out a serological evaluation searching to total IgG and its subclasses IgG1, IgG2 and IgG3 in successive dilutions of serum in patients from Berilo municipality, Jequitinhonha Valley, Minas Gerais state, Brazil, infected by
Trypanosoma cruzi, with positive serological diagnosis and previously evaluated
Figura 1 - Localização do município de Berilo no Estado de Minas Gerais. ... 26
Figura 2 - Padronização da técnica de ELISA não comercial para a pesquisa de IgG total, IgG1,
IgG2 e IgG3, utilizando antígeno alcalino de epimastigotas da cepa Y de T. cruzi
... 35
Figura 3 - Curva ROC das diluições de soro 1:40 e 1:160 para a pesquisa de IgG1 ... 38
Figura 4 - Gráfico de dispersão para IgG1 na diluição de 1:10, construído a partir da técnica de
ELISA não comercial, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado
anti-IgG1 diluído a 1:500 e HRP-estreptavidina a 1:1.000... 39
Figura 5 - Porcentagem de hemocultura positiva nos diferentes grupos clínicos de pacientes do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, portadores de infecção por Trypanosoma cruzi
... 47
Figura 6 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, nas diluições de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanososma cruzi, conjugado IgG total diluído a 1:10.000,
anti-IgG1 diluído a 1:500, anti-IgG2 diluído a 1:2.500, anti-IgG3 diluído a 1:1.000 e HRP-estreptavidina a 1:1.000 ... 49
Figura 7 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG total construídas a partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não infectado) e CH (com infecção chagásica) nas diluições de soro de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280... 51
Figura 8 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG1, construídas a partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não infectado) e CH (com infecção chagásica) nas diluições de soro de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 e 1:160 ... 53
Figura 9 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG2 construídas a partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não infectado) e CH (com infecção chagásica) nas diluições de soros de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280 ... 56
Figura 10 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG3 construídas a partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não infectado) e CH (com infecção chagásica) nas diluições de soros de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280 ... 59
Figura 11 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320,
1:640 e 1:1.280, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado
anti-IgG total diluído a 1:10.000 e HRP-estreptavidina a 1:1.000 ... 61
Figura 12 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10, 1:20 e 1:40, utilizando
antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG1 diluído a 1:500 e
Figura 13 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10 , 1:20 e 1:40, utilizando
antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG2 diluído a 1:2.500 e
HRP-estreptavidina a 1:1.000 ... 63
Figura 14 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320,
utilizando antígeno alcalino de cepa Y de T. cruzi, conjugado anti-IgG3 diluído a 1:1.000 e
HRP-estreptavidina a 1:1.000 ... 64
Figura 15 - Gráficos de dispersão e curvas ROC de IgG total para os soros de indivíduos do grupo controle não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção chagásica (CH) nas diluições de soro 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320, construídos a partir da técnica de ELISA não comercial utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG total diluído a 1:10.000 e HRP-estreptavidina a 1:1000 ... 67
Figura 16- Gráfico de dispersão e curva ROC de IgG1 para os soros de indivíduos do grupo controle não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção chagásica (CH) diluídos a 1:10, construídos a partir da técnica de ELISA não comercial utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG1 diluído a 1:500 e
HRP-estreptavidina a 1:1.000 ... 68
Figura 17 - Gráfico de dispersão e curva ROC de IgG2 para os soros de indivíduos do grupo controle não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção chagásica (CH) diluídos a 1:10 e 1:20, construídos a partir da técnica de ELISA não comercial
utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG2 diluído a 1:2.500 e
HRP-estreptavidina a 1:1.000 ... 70
Figura 18 - Gráficos de dispersão e curvas ROC de IgG3 para os soros de indivíduos do grupo controle não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção chagásica (CH) diluídos a 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320, construídos a partir da técnica
de ELISA não comercial utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG3
diluído a 1:1.000 e HRP-estreptavidina a 1:1.000 ... 73
Figura 19 - Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio da técnica de ELISA não comercial para a pesquisa de IgG total na diluição 1:10.000, IgG1 1:500, IgG2 1:2.500, IgG3 1:1.000, HRP-estreptavidina a 1:1.000, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de
Trypanosoma cruzi, em soros de pacientes não infectados (CONT), e com infecção chagásica
(CH) do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, e outras doenças infecto-parasitárias: HIV, hepatite C (HCV), sífilis (SIF), leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT) ... 74
Figura 20 - ELISA não comercial para a pesquisa de IgG total na diluição 1:10.000, IgG1 1:500, IgG2 1:2.500, IgG3 1:1.000, e HRP-estreptavidina a 1:1.000, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, em soros de pacientes com diferentes formas clínicas
da doença de Chagas do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG ... 76
Figura 21 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, nas diluições que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO dos grupos com diferentes formas clínicas da doença de Chagas (1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280), utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG
Figura 22 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, nas diluições que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO dos grupos com diferentes formas clínicas da doença de Chagas (1:10 e 1:20), utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG1 diluído a 1:500 e HRP-estreptavidina
1:1.000
...78
Figura 23 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, nas diluições que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO dos grupos com diferentes formas clínicas da doença de Chagas (1:10, 1:20, 1:40 e 1:80), utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG3 diluído a 1:1.000 e
HRP-estreptavidina 1:1.000 ... 79
Figura 24 – Análise de correlação de IgG total e as formas clínicas IND, CARD1, CARD 2 e DIG/MIS, nas diluições de soro 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280... 80
Figura 25 - Análise de correlação de IgG2 e as formas clínicas IND, CARD1, CARD 2 e DIG/MIS, na diluição de soro 1:160... 81
Tabela I - Estadiamento do comprometimento miocárdico na cardiopatia chagásica crônica... 9
Tabela II - Aspectos epidemiológicos avaliados dos pacientes com infecção chagásica (CH) e grupo controle não infectado (CONT), do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais... 44
Tabela III - Relação entre o número de homens e mulheres na população estudada no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG... 46
Tabela IV - Relação entre número de tubos apresentando resultado positivo e o período de positivação destes na hemocultura em pacientes do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, portadores de infecção por Trypanosoma cruzi... 48
AATV - Anticorpos anti-tripomastigotas vivos ASC - Área sob a curva
BHC – Hexaclorociclobenzeno
CARD 1 - Forma Cardíaca Leve a Moderada CARD 2 - Forma Cardíaca Avançada
CONT - Grupo controle não reativo CRA -Antígenos citoplásmicos
Curva ROC - Receiver Operating Characteristic Curve CH - Pacientes com infecção chagásica
DIG/MIS - Forma Digestiva e/ou Mista DO - Densidade óptica
ECG - Eletrocardiograma
ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay (Ensaio imunoenzimático) Espec - Especificidade
FRA - Antígenos flagelares HAI - Hemaglutinação Indireta HBV - Hepatite B
HCV - Hepatite C
HIV - Vírus da Imunodeficiência humana
HRP-estreptavidina - Streptavidin and horseradish peroxidase HTLV -Vírus Linfotrópico de células T Humanas
IFI - Imunofluorescência Indireta IgG - Imunoglobulina G
IgG1 - Imunoglobulina G1 IgG2 - Imunoglobulina G2 IgG3 - Imunoglobulina G3
IgG total - Imunoglobulina G total IgM - Imunoglobulina M
IND - Forma Indeterminada
NCH – Grupo controle não infectado e portadores de outras infecções NK - Natural Killer
OMS - Organização Mundial de Saúde PC - Ponto de Corte
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase PSF - Programa de Saúde da Família rpm - rotações por minuto
RV - Razão de Verossimilhança
RV+ - Razão de Verossimilhança Positiva RV- - Razão de Verossimilhança Negativa Sens - Sensibilidade
SFB - Soro Fetal Bovino SIF - Sífilis
SNA - Sistema Nervoso Autônomo
SST-Tween - Solução Salina Tamponada com 0,5% de Tween 20 SST - Solução Salina Tamponada
EPÍGRAFE ... III DEDICATÓRIA ... IV
AGRADECIMENTOS ... V RESUMO ... VIII ABSTRACT ... IX LISTA DE FIGURAS ... X LISTA DE TABELAS ... XIII LISTA DE ABREVIATURAS ... XIV
1. INTRODUÇÃO... 1
1.1 Histórico e aspectos epidemiológicos da doença de Chagas... 2
1.2 Formas clínicas da doença de Chagas... 5
1.3 Diagnóstico da doença de Chagas... 11
1.3.1 Fase aguda... 11
1.3.2 Fase crônica... 12
1.4 Resposta Imune humoral na doença de Chagas... 15
1.5 Doença de Chagas no município de Berilo... 19
1.6 Justificativa... 21
2. OBJETIVOS ... 22
2.1 Objetivo geral... 23
2.2 Objetivos específicos... 23
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS.... 24
3.1 Área do estudo... 25
3.1.1 Berilo... 25
3.2 Triagem da população estudada... 26
3.2.1 Diagnóstico sorológico... 27
3.2.1.1 Reação de Hemaglutinação indireta... 27
3.2.1.2 ELISA convencional... 27
3.3 Avaliação de aspectos epidemiológicos... 30
3.4 Avaliação clínica... 30
3.5 Avaliação ecocardiográfica... 32
3.6.1 Hemocultura... 33
3.7 Análise de IgG e subclasses de IgG por meio do ensaio imunoenzimático não comercial ... 34
3.7.1 Padronização do ensaio imunoenzimático não comercial para dosagem de IgG total, IgG1, IgG2 e IgG3... 34
3.7.2 Detecção da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas ... 35
3.7.2.1 Seleção inicial das diluições de soro para IgG e subclasses de IgG capazes de discriminar indivíduos com infecção chagásica dos não infectados ... 35
3.7.2.2 Avaliação do desempenho da técnica de ELISA não comercial por meio da construção das curvas ROC de IgG e subclasses de IgG nas diluições previamente selecionadas ... 36
3.7.2.3 Seleção das diluições mais aplicáveis a distinção entre indivíduos com infecção chagásica e não infectados através do cálculo da diferença entre a mediana de DO do grupo com infecção chagásica e a DO do grupo controle ... 38
3.7.3 Detecção da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas numa população que inclui portadores de outras doenças infecto-parasitárias de interesse médico ... 39
3.8 Pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do ensaio imunoenzimático não comercial aplicado a monitoração de morbidade da doença de Chagas ... 40
3.8.1 Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio da mediana de DO de cada grupo clínico nas diluições de soro avaliadas ... 40
3.8.2 Análise individual da reatividade de IgG e subclasses de IgG em pacientes com diferentes formas clínicas da doença de Chagas ... 41
3.8.2.1 Análise de correlação entre o perfil de imunoglobulinas de pacientes e as diferentes formas clínicas ... 41
3.9 Análise Estatística ... 42
4. RESULTADOS... 43
4.1 Diagnóstico sorológico da população estudada... 44
4.3 Avaliação clínica... 45
4.4 Avaliação parasitológica... 46
4.4.1 Hemocultura... 46
4.5 Detecção da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas ... 48
4.5.1 Seleção inicial das diluições de soro para IgG e subclasses de IgG capazes de discriminar indivíduos com infecção chagásica dos não infectados ... 48
4.5.2 Avaliação do desempenho da técnica de ELISA não comercial por meio da construção das curvas ROC de IgG e subclasses de IgG nas diluições previamente selecionadas ... 49
4.5.2.1 Curvas ROC de IgG total ... 50
4.5.2.2 Curvas ROC de IgG1 ... 51
4.5.2.3 Curvas ROC de IgG2 ... 53
4.5.2.4 Curvas ROC de IgG3 ... 56
4.5.3 Seleção das diluições mais aplicáveis a distinção entre indivíduos com infecção chagásica e não infectados através do cálculo da diferença entre a mediana de DO do grupo com infecção chagásica e a DO do grupo controle ... 60
4.5.3.1 Gráficos de dispersão de IgG total ... 60
4.5.3.2 Gráficos de dispersão de IgG1 ... 61
4.5.3.3 Gráficos de dispersão de IgG2 ... 62
4.5.3.4 Gráficos de dispersão de IgG3 ... 63
4.6 Avaliação da aplicabilidade do ELISA não comercial na segregação sorológica de indivíduos com infecção chagásica e portadores de outras doenças infecto-parasitárias de interesse médico ... 64
4.6.1 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG total ... 65
4.6.2 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG1 ... 67
4.6.3 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG2 ... 68
4.6.4 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG3 ... 70
4.7 Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG em pacientes portadores de infecção chagásica com diferentes formas clínicas ... 74
4.7.2 Análise individual da reatividade de IgG e subclasses de IgG em pacientes com
diferentes formas clínicas da doença de Chagas ... 76
4.7.2.1 Pesquisa de IgG total ... 76
4.7.2.2 Pesquisa de IgG1 ... 78
4.7.2.3 Pesquisa de IgG3 ... 78
4.7.2.4 Análise de correlação entre as formas clínicas classificadas e as imunoglobulinas avaliadas ... 79
5. DISCUSSÃO ... 83
5.1 Avaliação de aspectos epidemiológicos ... 84
5.2 Avaliação parasitológica ... 87
5.3 Avaliação do perfil sorológico ... 90
5.3.1 Pesquisa da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas ... 90
5.3.2 Pesquisa da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio do ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas em soro de pacientes portadores de outras doenças infecto-parasitárias ... 94
5.3.3 Aplicabilidade da pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi detectada por meio do ensaio imunoenzimático não comercial na monitoração de morbidade da doença de Chagas ... 97
6. CONCLUSÕES ... 107
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 110
1.1 Histórico e aspectos epidemiológicos da doença de Chagas
O Trypanosoma cruzi, parasita hemoflagelado da família Tripanosomatidae, foi
descoberto em 1909, pelo médico e cientista brasileiro Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas, que o caracterizou como o causador de uma moléstia até então desconhecida, a doença de Chagas. Esse brilhante pesquisador não apenas identificou o agente etiológico da infecção, como também seu vetor, os insetos da família Reduviidae e seus reservatórios, descrevendo ainda os efeitos da infecção no organismo humano (CHAGAS, 1909; 1911).
Àquela época, Carlos Chagas já observara que o principal elo da cadeia epidemiológica da doença seria o inseto vetor, e que sua eliminação poderia interromper a transmissão da infecção. Em seu admirável trabalho (CHAGAS, 1909), Chagas sugeriu que o controle da transmissão seria a melhor estratégia e também a mais difícil de ser alcançada na luta contra a doença.
A infecção chagásica abrange desde os Estados Unidos até a Argentina, sendo uma das doenças parasitárias com maior impacto social e econômico na América Latina. Nos últimos anos, devido a intensificação das migrações internacionais, a doença de Chagas pode ser encontrada com maior frequência em regiões não endêmicas, como Europa, Japão e nos Estados Unidos, onde é estimado um contingente de 500 a 650 mil imigrantes infectados pelo T. cruzi (XAVIER et al., 2006; SZTAJZEL
et al., 1996). A presença de imigrantes infectados em países não endêmicos gera dois problemas potenciais: a dificuldade no diagnóstico e no manuseio terapêutico da doença de Chagas, pelo desconhecimento da comunidade médica local dos aspectos peculiares da doença, e a possibilidade de transmissão da infecção através da transfusão de sangue ou do transplante de órgãos de um doador infectado (XAVIER et al., 2006).
Caracterizada como uma moléstia resultante da intervenção do homem no meio ambiente, a doença de Chagas acomete principalmente indivíduos de classes econômicas mais pobres, que possuem condições de habitação precárias, possibilitando o abrigo e a colonização dos vetores.
Os primeiros esforços sistemáticos no combate à infecção foram iniciados em 1943 com a criação do Centro de Estudos do Instituto Oswaldo Cruz em Bambuí, Minas Gerais, onde dezenas de casos agudos foram diagnosticados. A criação desse centro de estudos representou a primeira iniciativa institucional para promover o controle da infecção (DIAS & SCHOFIELD, 1999).
Em 1950, o controle nacional da transmissão vetorial foi institucionalizado pelo Serviço Nacional de Malária e posteriormente continuado pelo Departamento Nacional de Endemias Rurais (DNERu) (SILVEIRA & REZENDE, 1994). Entretanto, programas de controle em larga escala não foram iniciados até o começo dos anos 60 devido à ausência de decisão política e de uma estrutura capaz de implementar tais programas em nível nacional. Naquele momento, apenas o estado de São Paulo desenvolveu ações contínuas. A partir de 1977-1978, foi estabelecida a sistematização das ações de controle vetorial com alcance nacional (DIAS & SCHOFIELD, 1999).
Um inquérito sorológico nacional realizado entre 1975-1980, demonstrou uma prevalência da infecção chagásica no Brasil de 4,22%. O estado de Minas Gerais apresentou nesse inquérito, uma prevalência da infecção de 8,8%. Dentro deste estado, o Vale do Jequitinhonha era uma das regiões mais afetadas, apresentando um índice de infecção de 35,5% (CAMARGO et al., 1984).
A realização de um inquérito entomológico nacional nesse mesmo período identificou 17 espécies de insetos vetores com variados graus de colonização e infecção natural pelo T. cruzi. Destas, cinco espécies foram consideradas de grande importância
na transmissão da infecção ao homem: Triatoma infestans, T. brasiliensis, T. pseudomaculata, T. sordida ePanstrongylus megistus (SILVEIRA et al., 1984).
Os dados obtidos através dos dois inquéritos demonstraram as áreas onde havia maior risco de infecção, indicando os locais onde as medidas de controle deveriam ser prioritárias.
Após os primeiros ciclos de borrifações de inseticida, houve uma redução das taxas de infestação do T. infestans e, atualmente, este vetor está praticamente eliminado
do país, sendo encontrado apenas em focos residuais. Em 1993, verificou-se uma redução nas taxas de infestação de 30,4% para 7,6%, significando uma drástica queda do número de municípios com essa espécie de vetor (RAMOS-JÚNIOR & CARVALHO, 2001).
eliminação de vetores domésticos (particularmente o T. infestans) em conjunto com
triagem de doadores em bancos de sangue para a redução da transmissão transfusional e com o acompanhamento de gestantes chagásicas e recém-nascidos visando a redução da infecção congênita. Esta iniciativa foi seguida por países do Pacto Andino (Colômbia, Equador, Peru e Venezuela) e da América Central (El Salvador, Guatemala, Honduras e Nicarágua), em 1997, e em 2004, foi lançada a iniciativa de vigilância nos nove países da bacia Amazônica (SCHOFIELD et al., 2006). Para que houvesse sucesso, a expansão dessa estratégia para diversas áreas foi acompanhada de adaptações em decorrência das diferentes realidades locais encontradas (MONCAYO, 2003).
As medidas de controle vetorial e transfusional adotadas têm apresentado um impacto na prevalência, morbidade e mortalidade da doença de Chagas no Brasil. Esse controle certamente tem tido seu sucesso acompanhado pela redução nas taxas de transmissão por outras vias de infecção como a congênita e a oral.
Segundo a extinta FUNASA (Fundação Nacional de Saúde), para a avaliação das medidas de controle é recomendada a realização de inquéritos sorológicos para a infecção em todos os municípios que se encontram na fase de vigilância epidemiológica visando a detecção de casos novos na população nascida após o combate vetorial. Esta vigilância baseia-se na permanente atenção em busca de possíveis focos de vetores em locais já atendidos pelas medidas de ataque aos insetos, além de atenção aos casos já existentes.
Os benefícios médicos das iniciativas de controle têm sido, entre outros, a diminuição de hospitalizações decorrentes da doença de Chagas, uma vez que tem havido uma redução de casos agudos, e aparentemente um declínio na severidade de casos crônicos decorrente da interrupção de re-infecções (SCHOFIELD et al., 2006).
Em junho de 2006, a Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS) certificou o Brasil como livre da transmissão da doença pelo vetor T. infestans. Além do Brasil, a
transmissão por esse vetor foi efetivamente eliminada no Uruguai (1997), Chile (1999) e em áreas significativas da Argentina, Bolívia, Paraguai e partes da América Central (SCHOFIELD et al., 2006).
foram prevenidas, mas a transmissão ainda ocorre em alguns países, e há evidências de sua elevação em partes da Argentina (GURTLER, 2005), Venezuela (FELICIANGELI et al., 2003), México, Peru, Colômbia, Costa Rica e provavelmente na região Amazônica (SCHOFIELD et al., 2006). Nesta última, há a possibilidade de dispersão da doença em humanos, uma vez que existe ampla circulação do parasito em focos silvestres compostos por várias espécies de vetores e reservatórios (COURA et al., 2002).
1.2 Formas clínicas da doença de Chagas
A doença de Chagas é caracterizada por um curso clínico variado, apresentando-se em duas fases: aguda e crônica, com várias formas clínicas.
Após um período de incubação de cerca de quatro a dez dias, inicia-se a fase aguda da infecção caracterizada pela ausência de sintomatologia em cerca de 98,0% dos casos e, ocasionalmente, pelos sinais de porta de entrada (sinal de Romaña e chagoma de inoculação). Este período que dura em média dois meses, apresenta parasitemia patente, podendo ocorrer febre e inflamação ganglionar, entre outros (RASSI et al., 2000; WHO, 2002). Esta fase pode ser mais grave em crianças abaixo de dois anos, especialmente se interrompido o aleitamento materno, nas quais a mortalidade pode chegar a 10,0% na ausência do tratamento etiológico (RIBEIRO et al., 1998).
Por outro lado, certas alterações podem ter valor prognóstico para antecipar a detecção de uma possível evolução para formas cardíacas, e nesses casos uma adequada intervenção terapêutica e de adaptação de estilo de vida devem ser instituídas para tentar impedir a progressão da doença.
Em áreas endêmicas, um diagnóstico sorológico positivo sem a adequada avaliação clínica do paciente pode acarretar um sério problema social, uma vez que esse indivíduo pode ser discriminado por empresas que contratam mão de obra operária, alegando doença quando esta só se apresenta numa porcentagem minoritária dos pacientes. A uma pessoa com a forma indeterminada da doença não está contra-indicada a prática de atividades físicas, sendo dessa forma o seu afastamento do trabalho não justificado, além de ilegal.
Diversos são os fatores que possivelmente influenciam a evolução da doença de Chagas, já que uma porcentagem dos pacientes permanece assintomática durante toda a vida, enquanto outros evoluem para formas graves após 10 a 30 anos de infecção. Os possíveis fatores de risco associados à progressão da cardiopatia na doença de Chagas são: o tempo de duração da doença, sexo masculino, atividade física intensa, a cepa do parasito, exposição à re-infecções, fatores genéticos, etnia, idade, severidade da infecção aguda, status nutricional, alcoolismo e outras doenças concomitantes (PRATA, 2001; RIBEIRO et al., 1998). Estima-se que cerca de 27,0% dos infectados, após vários anos na forma indeterminada, desenvolverão manifestações cardíacas, 6,0% evoluirão para forma digestiva e 3,0% apresentarão comprometimento nervoso periférico (MONCAYO, 1999).
tomadas para retardar tal progressão, assim como para garantir qualidade de vida para essas pessoas.
A forma cardíaca da doença de Chagas é responsável pela elevada morbi-mortalidade ocorrida na infecção, gerando grande impacto social pela produção de aposentadorias precoces e gastos onerosos em atendimento médico especializado, mas, sobretudo, pela morte de pessoas, especialmente jovens adultos em idade produtiva.
A cardiopatia chagásica crônica é caracterizada, do ponto de vista anatomopatológico, por áreas de fibrose substituindo a massa muscular cardíaca e ocasionando a interrupção das fibras do coração, destruição do sistema nervoso autônomo (SNA) simpático e parassimpático e pela presença de um exsudato inflamatório ativo. A hipertrofia, dilatação e alteração da arquitetura do músculo cardíaco induzem ao aumento do tamanho do coração caracterizado pela cardiomegalia. Em casos avançados de cardiomegalia, fenômenos tromboembólicos e sinais de congestão passiva são os principais achados patológicos. O aneurisma cardíaco apical é um achado freqüente e é patognomônico da cardiopatia chagásica crônica (WHO, 2002). Em áreas endêmicas essa lesão ocorre em 19,0% dos pacientes com infecção chagásica, estando sua freqüência diretamente relacionada à severidade da cardiomiopatia (PRATA, 2001).
Clinicamente os indivíduos podem apresentar manifestações de diferentes níveis de gravidade, variando de anormalidades assintomáticas identificadas através de exames complementares mais sensíveis, a formas graves. A cardiomiopatia é a forma mais comum da doença de Chagas na fase crônica, manifestando-se como cardiomiopatia dilatada, insuficiência cardíaca congestiva, tromboembolismo, arritmias, transtornos de condução intraventricular, síncope e morte súbita (CAROD-ARTAL, 2006).
O exame físico em fases mais precoces da cardiopatia pode revelar irregularidade do ritmo cardíaco devido a extra-sístoles isoladas. Em fases mais avançadas podem ser observados sinais de cardiomegalia com o desvio do ictus cordis.
Os sinais e sintomas mais frequentemente associados à cardiopatia chagásica são os seguintes:
- Sintomas de insuficiência cardíaca como dispnéia de esforço, dor no hipocôndrio direito, ortopnéia e dispnéia paroxística noturna;
- Sintomas secundários a fenômenos tromboembólicos venosos e sistêmicos como trombose venosa profunda, embolias pulmonares sistêmicas e acidente vascular cerebral;
- Alterações microvasculares como dor precordial ou retroesternal (GASCON et al., 2006).
Nas fases iniciais da cardiopatia chagásica crônica, são detectadas alterações discretas e inespecíficas no ECG. Algumas alterações eletrocardiográficas têm sido associadas à cardiopatia chagásica, apesar de não haver um padrão eletrocardiográfico patognomônico. A alteração mais frequentemente detectada na cardiopatia chagásica é o bloqueio de ramo direito isolado ou associado ao hemibloqueio anterior esquerdo.
As alterações eletrocardiográficas na cardiopatia chagásica em ordem de maior a menor freqüência são as seguintes:
- Extra-sístoles ventriculares isoladas ou repetitivas;
- Alteração primária da repolarização ventricular, que pode simular cardiopatia isquêmica;
- Zonas eletricamente inativas; bloqueios aurículo-ventriculares; bloqueio de ramo esquerdo por disfunção sinusal e taquiarritmia supraventricular (GASCON et al., 2006; XAVIER et al., 2006).
Em casos mais avançados da cardiopatia, tais alterações, além de serem mais graves podem se sobrepor, constituindo um conjunto de anormalidades.
Radiografias de tórax são relevantes no manejo dos pacientes nessa forma, pois permitem uma categorização mais precisa através da análise do tamanho do coração e da circulação pulmonar. Em fases mais avançadas da cardiopatia chagásica, observa-se aumento acentuado da silhueta cardíaca, identificado através da observação do cálculo do índice cardio-torácico. As radiografias que apresentam sinais de hipertensão venocapilar, crescimento de cavidades ou um índice cardio-torácico superior a 0,60 são consideradas alteradas.
chagásicos crônicos. Essa normatização colabora para o manejo do paciente em nível prognóstico e terapêutico (Consenso Brasileiro em doença de Chagas, 2005) (Tabela I).
Tabela I - Estadiamento do comprometimento miocárdico na cardiopatia chagásica crônica
Estádios Eletrocardiograma Ecocardiograma Insuficiência Cardíaca
A Alterado Normal Ausente
B1 Alterado Alterado FEVE>45% Ausente
B2 Alterado Alterado FEVE<45% Ausente
C Alterado Alterado Compensável
D Alterado Alterado Refratária
*FEVE- Fração de Ejeção Ventricular Esquerda
A forma digestiva da doença de Chagas caracteriza-se por alterações de motilidade do esôfago e do cólon, e pelo aumento do diâmetro resultando em megaesôfago e megacólon. O megaesôfago é de evolução mais precoce ocorrendo entre 20 e 40 anos de idade, manifestando-se mais frequentemente na forma de disfagia, especialmente com alimentos frios e secos, regurgitação, dores retroesternais esofagianas, singulto, pirose, obstipação intestinal, desnutrição, hipertrofia das glândulas salivares e manifestações pulmonares em fases avançadas (LANA & TAFURI, 2000; VAZ et al., 1995).
Para a detecção de esofagopatia chagásica aconselha-se a realização de radiografia de tórax em posição oblíqua anterior após 1 minuto da ingestão de 150 mL de contraste de sulfato de bário. As seguintes observações são suficientes para o diagnóstico de acometimento esofágico:
- Esvaziamento incompleto do esôfago, com permanência de contraste de sulfato de bário com um nível horizontal
- Presença de coluna de ar acima do nível de contraste
Essa técnica pode não revelar todos os casos de esofagopatia, mas, sua vantagem é a identificação de casos da ausência de dilatação, que podem ser manifestações iniciais da forma esofágica.
A classificação radiográfica proposta por REZENDE em 1960 subdividiu as manifestações esofágicas em quatro grupos:
Grupo I - Esôfago apresenta calibre aparentemente normal ao exame radiológico, com trânsito lento e pequena retenção na radiografia tomada um minuto após a ingestão de sulfato de bário.
Grupo II - Esôfago com pequeno a moderado aumento no calibre, apreciável retenção de contraste e presença de ondas terciárias, associadas ou não a hipertonia do esôfago.
Grupo III - Esôfago com grande aumento no diâmetro, atividade motora reduzida, hipotonia do esôfago inferior e grande retenção de contraste.
Grupo IV - Dólicomegaesôfago, esôfago com grande capacidade de retenção, atônico, alongado, dobrando-se sobre a cúpula diafragmática.
O megacólon é de evolução mais tardia do que o megaesôfago, sendo observado em adultos entre 30 a 60 anos de idade, caracterizando-se por obstipação intestinal, meteorismo e disquesia (LANA & TAFURI, 2000; REZENDE et al., 1976). A detecção de pacientes com megacólon pode ser realizada através de um estudo de triagem colônica que não requer preparo com dieta prévia, utilizando-se 300 mL de contraste baritado diluídos em 900 mL de água colocados em recipiente situado um metro acima da mesa radiológica, e deixado cair como enema, por gravidade. O resultado é positivo no adulto se na radiografia abdominal se constata uma dilatação superior a 6 cm.
A forma mista da infecção, compreendida por manifestações cardíacas e digestivas simultaneamente acomete uma pequena proporção dos indivíduos infectados crônicos, compreendendo cerca de 8,0% dos infectados na fase crônica.
1.3 Diagnóstico da doença de Chagas
1.3.1 Fase aguda
O diagnóstico laboratorial da doença de Chagas deve ser direcionado de acordo com a fase da doença em que o paciente se encontra, baseando-se na busca direta ou indireta do parasito e na detecção de anticorpos anti-T. cruzi.
A doença de Chagas aguda caracteriza-se pelo surgimento de imunoglobulinas de classes específicas. Em geral ocorre uma produção inicial de IgM com pico perto do 17º dia após a infecção, seguido de queda dos níveis até o 66º dia, não retornando aos níveis basais até o 93º dia após a infecção. Níveis específicos de IgG também se elevam após uma ou duas semanas de infecção, alcançando pico de produção no 30º dia, perdurando por toda fase crônica caso não haja tratamento e cura parasitológica (GRAUERT et al., 1993).
Na infecção aguda são utilizados testes sorológicos para a pesquisa de IgM. Atualmente há dificuldades para o diagnóstico sorológico de fase aguda devido a escassez de kits comercialmente disponíveis e carência de controles positivos para IgM. Uma possibilidade de diagnóstico já comercializada e que apresenta a vantagem de ser rápida e de fácil execução, é o Simple CHAGASWB (Operon, S.A), que consiste em um teste imunocromatográfico que utiliza antígenos recombinantes para a detecção de anticorpos anti-T. cruzi.
que esta técnica pode ser uma alternativa aos testes sorológicos convencionais (UMEZAWA et al., 1996 a).
Em casos de suspeita de fase aguda, em decorrência da alta parasitemia, devem ser priorizados os exames parasitológicos diretos, que são realizados rapidamente e apresentam resultado imediato. O exame do sangue periférico a fresco devido a sua simplicidade e elevado índice de resultados satisfatórios deve ser o método de escolha nessa fase. Porém, para sua realização é necessário que haja treinamento específico quanto à preparação da lâmina e identificação do parasito (LUQUETTI & RASSI, 2000). Em caso de negatividade do exame a fresco e forte suspeita de doença aguda, como na presença de sintomas por mais de trinta dias, métodos de concentração como micro-hematócrito, teste de Strout, Quantitative Buffy Coat (QBC), gota espessa, e lâmina com esfregaço corado devem ser priorizados (Consenso Brasileiro em doença de Chagas, 2005). Esses métodos apresentam sensibilidade entre 80 a 90%, entretanto devido ao alto custo do QBC, atualmente recomenda-se o uso do micro-hematócrito ou teste de Strout como método de concentração escolhido.
Se os exames parasitológicos diretos forem negativos, métodos parasitológicos indiretos, como o xenodiagnóstico (BRUMPT, 1914) e a hemocultura (CHIARI et al., 1989), devem ser utilizados. Apesar da possibilidade desses exames apresentarem 100% de positividade na fase aguda, estas metodologias são indicadas para o diagnóstico da fase crônica da infecção dada à complexidade para sua realização, que exige condições de laboratório muito especializadas, como também pela demora de obtenção dos resultados.
1.3.2 Fase crônica
Os baixos níveis de parasitemia nessa fase da infecção indicam a sorologia como escolha para o diagnóstico confirmatório. Para tal, é essencial a aplicação de um teste de elevada sensibilidade associado a outro com alta especificidade, como os testes de Imunofluorescência Indireta (IFI), Imunoensaio Enzimático (ELISA), e Hemaglutinação Indireta (HAI). Entretanto, apesar da alta sensibilidade e especificidade, esses testes podem gerar resultados não conclusivos ou conflitantes, devido aos diferentes procedimentos empregados nas suas preparações antigênicas.
O emprego de antígenos de T. cruzi secretados ou excretados em técnicas
a técnicas de sorologia convencional. Em um trabalho recente realizado em uma área endêmica da Bolívia, foi demonstrada a aplicabilidade dos testes baseados no TESA (Antígenos de T. cruzi secretados ou excretados) em relação aos testes aplicados na
sorologia convencional. De 742 amostras de soro coletadas, 329 foram positivas pelo TESA, que detectou 9 indivíduos infectados não diagnosticados pela sorologia convencional (ZARATE-BLADES et al., 2006). Esse achado é um indicativo de que testes baseados no TESA podem ser uma alternativa aos extratos antigênicos utilizados na sorologia convencional.
Entretanto, a sorologia convencional realizada por ELISA, IFI e HAI, baseada na pesquisa de anticorpos IgG anti-T.cruzi, permanece ainda como a escolha para a
rotina diagnóstica. A OMS recomenda para o diagnóstico da doença de Chagas a utilização de duas técnicas sorológicas com princípios distintos, que, se discordantes, devem ser repetidas. Se houver ainda discordância, é recomendada a realização de uma terceira técnica sorológica, e caso esta persista uma quarta técnica deve ser aplicada ou outro método diagnóstico não sorológico deve ser realizado (WHO, 1991; 2002, MS, 2000).
Os anticorpos detectados na sorologia convencional são classificados como não protetores, já aqueles capazes de induzir lise de formas tripomastigotas na presença do Complemento são classificados como protetores, sendo denominados como anticorpos líticos (KRETTLI, 1982). Esses anticorpos reconhecem uma proteína de 160KD localizada na superfície da membrana de tripomastigotas vivos.
Os anticorpos líticos são detectados através de duas técnicas, a lise mediada pelo Complemento (KRETTLI & BRENER, 1982) e a citometria de fluxo (MARTINS-FILHO et al., 1995). Essas técnicas têm ampla aplicabilidade para a realização de controle de cura, considerando-se que os anticorpos da sorologia convencional podem ser detectados por vários anos após o tratamento da infecção, não distinguindo os curados dos não curados. Os anticorpos líticos só reconhecerão formas vivas do parasito, e sua detecção em soros de pacientes já tratados é um indicativo da infecção ativa, sendo por isto sua pesquisa empregada como critério de cura (KRETTLI, 1982; GALVÃO et al., 1993).
Na fase crônica da infecção, a parasitemia é em geral baixa e variável, o que torna os métodos parasitológicos diretos não aplicáveis. Nessa fase, os métodos de diagnóstico parasitológico indireto geralmente não ultrapassam 50,0% de positividade.
Desde a década de 50, a técnica de hemocultura vem sendo aplicada, inicialmente com resultados inferiores aos obtidos com o xenodiagnóstico. Com o objetivo de aumentar sua sensibilidade, algumas modificações foram introduzidas na técnica tais como: a remoção do plasma contendo anticorpos (MOURÃO & MELLO, 1975), a coleta de um volume maior de sangue (30mL) (CHIARI et al., 1989) e maior período de cultivo e observação (MINTER-GOELDBLOED, 1978).
CHIARI et al. (1989) obtiveram uma taxa de hemocultura positiva de 55,08% com a aplicação de modificações como a lavagem das células com meio LIT ou PBS e remoção imediata por centrifugação, incubação das culturas a 28ºC e exames no 15o, 30o, 45o e 60o dias de cultivo. Quando não era possível o imediato processamento, o plasma era removido, ao sedimento era acrescentado meio LIT, e o material preservado a 4ºC até processamento de toda técnica.
LUZ et al. (1994) demonstraram a importância do rápido processamento à baixa temperatura na sensibilidade da técnica. Utilizando a metodologia proposta por CHIARI et al. (1989), reduzindo o tempo de processamento da amostra e usando uma centrífuga refrigerada foi possível alcançar 94,0% de positividade quando três hemoculturas foram realizadas no mesmo paciente.
A PCR (GONZALEZ et al., 1984; ASHALL et al., 1988) apresenta resultados promissores, indicando que no futuro esta técnica poderá ser utilizada como teste confirmatório e de rotina, apesar de sua complexidade e necessidade de laboratórios especializados com protocolos definidos e técnicas padronizadas para sua execução (Consenso Brasileiro em doença de Chagas, 2005; WHO, 2002). O uso da técnica de PCR está indicado em algumas situações como em indivíduos com testes sorológicos não conclusivos, em controle de cura pós-tratamento, em estudos comparativos com outras técnicas sorológicas ou parasitológicas, na detecção do nível de parasitemia em imunossuprimidos e em transplantados (PORTELA-LINDOSO et al., 2003).
1.4 Resposta imune humoral na doença de Chagas
A resposta imune que se segue à infecção pelo T. cruzi é essencial para a
resistência do hospedeiro, mas também é responsável em parte pelas diversas manifestações patológicas observadas na doença de Chagas. O parasito sensibiliza diferentes setores do sistema imune, produzindo resposta celular e humoral específicas (BRODSKYN & BARRAL-NETO, 2000). A identificação dos mecanismos relacionados à indução da resposta imune durante a infecção é essencial para a compreensão da história natural da doença de Chagas.
A ativação policlonal de linfócitos B no início da infecção induz a produção de imunoglobulinas pertencentes a várias classes. Na fase aguda da doença em humanos, grande parte da resposta humoral induzida está direcionada a glicosilfosfatidilinositol ancorados em mucinas (GPI mucinas) localizadas na superfície de tripomastigotas. Nessa fase, anticorpos IgM e IgG são amplamente detectados. A maior parte desses anticorpos reconhece epitopos de galactosyl 1-3galactose (Gal 1,3Gal), que estão presentes nas GPI mucinas.
ANTAS et al. (1999) classificaram a fase aguda da doença de Chagas como inicial, intermediária e tardia em crianças de 2 a 15 anos de idade, verificando os níveis de anticorpos anti-Gal 1,3Gal IgG (Gal), IgM e IgG específicos anti-T. cruzi por meio da técnica de ELISA. A fase inicial da infecção aguda apresentou reatividade apenas para IgM, enquanto na fase intermediária três possibilidades foram encontradas: (i) IgM e Gal reativos e IgG não reativo; (ii) IgM e IgG reativos e Gal não reativo; e (iii) IgM, IgG e Gal reativos. Na fase tardia IgG e Gal foram reativos e IgM não reativo. A associação do anticorpo IgG anti-Gal com a sorologia específica possibilitou a detecção mais precisa da fase aguda da doença de Chagas, sugerindo a possibilidade do uso desse anticorpo na detecção de infecções recentes, pelo menos em áreas endêmicas.
UMEZAWA et al. (1996 a) utilizaram soros de pacientes com infecção chagásica nas fases aguda e crônica testando quatro frações antigênicas de T. cruzi para
assim como IgM, produzindo 100% de positividade quando antígenos de superfície, íntegros e secretados foram utilizados.
Nos seres humanos, quatro subclasses de imunoglobulina G (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) são produzidas, e tal produção parece ser induzida por diferentes citocinas (KAWANO et al., 1994). Alguns estudos indicam que a produção das subclasses IgG1 e IgG3 é auxiliada pela indução de citocinas anti-inflamatórias (IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-ß), enquanto citocinas com perfil inflamatório (IL-12, INF- , TNF- ) induziriam a produção de IgG2 (BRIERE et al., 1994; REED & SCOTT, 1993). Experimentos in vitro já demonstraram que IFN-γ inibe a produção de IgG1 e eleva a secreção de IgG2 por antagonizar a síntese de IgG1 mediada por IL-6 e auxiliar IL-6 na produção de IgG2 (KAWANO et al., 1994). Estes dados corroboram o trabalho de FINKELMAN et
al. (1990), que descreveram que o IFN-γ pode suprimir IgG1 e estimular IgG2a, mas IL-4 parece não ser requerida para a produção de IgG1 in vivo.
Quantitativamente, as concentrações relativas de tais imunogobulinas nos soro são IgG1>IgG2>IgG3>IgG4. Essas quatro subclasses apresentam mais de 95,0% de homologia nas suas seqüências de aminoácidos das cadeias pesadas, sendo encontradas suas principais diferenças estruturais na região de dobradiça. A subclasse IgG2 pode apresentar como função a opsonização de parasitos, levando a sua destruição seja pelo mecanismo de lise mediada por Complemento ou pela fagocitose feita por macrófagos tendo, portanto, uma participação importante nos mecanismos de proteção humoral ao longo da infecção. As subclasses IgG1 e IgG3 parecem não ativar o Complemento, mas podem se ligar a receptores de células fagocitárias, sendo envolvidas na defesa dos hospedeiros mediada por célula.
A utilização de preparações antigênicas derivadas de formas epimastigotas de
T. cruzi para avaliar a reatividade de subclasses de IgG revelou títulos elevados de IgG1
e IgG3 em soros de pacientes na fase crônica de infecção classificados em diferentes formas clínicas (CERBAN et al., 1993; MORGAN et al., 1996).
CERBAN et al. (1993) não observaram diferença nos níveis de IgG1, IgG2 e IgG3 entre indivíduos portadores de diferentes formas clínicas da doença utilizando duas fontes antigênicas distintas. Foi observada em todos os diferentes grupos de pacientes, a predominância de níveis mais elevados de IgG1 e IgG3, seguidos de níveis mais baixos de IgG2 e IgG4 quando epimastigotas foram usados como antígenos. Para a fração antigênica citosólica de T. cruzi os níveis de IgG1 foram mais elevados em todos
Entretanto, MORGAN et al. (1996) utilizando formas epimastigotas como antígeno na técnica de ELISA, ao avaliarem 73 pacientes de uma área endêmica de Minas Gerais, que apresentavam as formas clínicas indeterminada, cardíaca, digestiva e mista, com idades variando entre 20 e 84 anos, obtiveram níveis mais elevados de anticorpos IgG2 nos soros dos pacientes portadores de formas clínicas cardíaca e cardio-digestiva quando comparados com indivíduos não infectados e com aqueles apresentando forma indeterminada da doença.
Expandindo o estudo anterior, MORGAN et al. (1998) avaliaram os mesmos pacientes infectados cronicamente com diferentes manifestações clínicas da doença de Chagas através de uma análise feita por western blot. Foi observado que a ligação de alguns antígenos particulares pelos isotipos de anticorpos era mais prevalente em alguns grupos de formas clínicas, quando comparado com outros. Os perfis de antígenos reconhecidos pelos anticorpos eram distintos, considerando IgG1, IgG2, IgG3, IgM e IgA. Um grande número de bandas distintas foi encontrado para o isotipo IgG1 nos grupos com diferentes manifestações clínicas. Entretanto poucas bandas foram detectadas para os outros anticorpos. Foi ainda verificada uma predominância de IgG3 nas formas indeterminada e digestiva, IgG2 na forma cardíaca e IgM na forma indeterminada.
A avaliação de pacientes na fase crônica da infecção por ZAUZA et al. (2001) evidenciou uma associação direta entre os níveis de IgG e a progressão de cardiopatia chagásica, indicando que a resposta imune humoral está diretamente relacionada à evolução dessa forma clínica da doença.
A análise da reatividade de subtipos de IgG anti-T. cruzi em cardiopatas
chagásicos crônicos, indicou que os níveis de IgG1 e IgG2 foram consideravelmente mais elevados, seguidos de IgG3 e de níveis ainda mais baixos de IgG4. No grupo de pacientes avaliado foi possível verificar uma tendência de associação entre níveis de IgG2 mais elevados e presença de cardiomegalia severa (HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001).
IgG1 e IgG3 foram predominantes na pesquisa de AATV. Os baixos níveis de IgG1 e IgG3 na pesquisa de AATV estavam associados aos pacientes com a forma CARD e os elevados níveis de IgG1 na pesquisa de AATV foram detectados principalmente, em pacientes apresentando a forma IND da doença. A reatividade de IgG2 anti-epimastigotas foi mais elevada em pacientes com a forma indeterminada e cardíaca.
MICHAILOWSKY et al. (2003) utilizaram antígenos de proteínas de flagelos de T. cruzi para avaliar a resposta imune humoral e celular em pacientes com doença de
Chagas crônica apresentadores de diferentes formas clínicas, e verificaram que IgG1 e IgG3 foram as principais imunoglobulinas detectadas. Em relação à resposta celular, os resultados do estudo indicaram que os linfócitos T CD4+ são as principais fontes de IFN- quando estimulados por antígenos do parasito in vitro.
Em um trabalho recente realizado em nosso laboratório, foi verificado que diferentes níveis de IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b em camundongos infectados com diferentes clones de T. cruzi, estavam associados ao genótipo do parasito presente e com
a fase da infecção. De forma geral, a infecção com T. cruzi I induziu altos níveis de
todas as subclasses em ambas as fases da infecção, em comparação a linhagem de T. cruzi II (SANTOS, 2007).
O uso de antígenos flagelares (FRA) e citoplásmicos (CRA)de T. cruzi para a
1.5Doença de Chagas no município de Berilo
Entre o final dos anos 40 e início dos anos 50, foi realizado pelo Serviço Nacional de Malária, o primeiro estudo entomológico no Vale do Jequitinhonha. Na década de 60 foram iniciados os primeiros combates aos triatomíneos vetores da doença de Chagas nessa região pelo DNERu. Entre 1970 e 1980, o combate aos vetores na região esteve sob a direção da Coordenação do Desenvolvimento do Vale do Jequitinhonha (CODEVALE) e do Centro Regional de Saúde de Diamantina.
Em um levantamento triatomínico realizado pela SUCAM em 1982, constatou-se que 69,5% das espécies de vetores capturadas eram Panstrongylus megistus,e 15,8%
eram Triatoma infestans (MS, 1982).
No inquérito sorológico nacional realizado entre 1975 e 1980, o então município de Berilo, hoje municípios de José Gonçalves de Minas e Berilo, localizado no Vale do Jequitinhonha, apresentou 35,5% de prevalência para a infecção chagásica (CAMARGO et al., 1984). Em 1982, esses dados foram confirmados com a obtenção de 35,1% de prevalência da infecção em uma amostra de 3.730 indivíduos (DIAS et al., 1985).
Foram realizados entre 1985 e 1986, ataques aos insetos vetores utilizando BHC (Hexaclorociclobenzeno), e em 1987, verificou-se o benefício destas ações com a redução significativa do número de insetos capturados nos domicílios (MACHADO DE ASSIS, 2006).
Em 1988, AGUILAR avaliou 1.150 indivíduos em Berilo, constatando que 12,69% dessa amostra apresentavam sorologia reativa para T. cruzi. Esse resultado
evidenciou um decréscimo em relação à prevalência obtida no inquérito de 1982.
Em 1997, MONTOYA realizou um inquérito sorológico em Berilo utilizando uma amostra de 2.261 indivíduos para avaliar a prevalência da infecção chagásica. Verificou-se uma prevalência da infecção na população geral de 18,7%. Em indivíduos acima de 30 anos de idade essa taxa foi de 50,0%, e em menores de 10 anos, de 0,17%. Nesse trabalho um grupo de 226 indivíduos sororeativos para a infecção pelo T. cruzi
estudo realizado em 1987 por AGUILAR, (1988). MONTOYA verificou que a mortalidade geral entre os pacientes com a infecção foi de 1,9% ao ano, sendo 5,6 vezes maior do que no grupo soronegativo, com 21 mortes ocorridas nos 10 anos de intervalo entre os estudos. Dos pacientes incluídos no estudo de 1987, 134 (67 com infecção chagásica e 67 não infectados) foram reavaliados clínica e eletrocardiograficamente. A doença de Chagas evoluiu progressivamente em 28,0% dos indivíduos com sorologia reativa, sendo um fenômeno mais freqüente entre os pacientes que já apresentavam eletrocardiogramas alterados previamente (MONTOYA, 1998).
Mais recentemente o nosso grupo (BORGES et al., 2006) realizou um inquérito sorológico em crianças de 7 a 14 anos nos municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, que desde 1997 são administrativamente independentes. A prevalência da infecção na faixa etária avaliada foi de 0,4% (6 crianças). A prevalência por município foi de 0,35% (3 crianças) em Berilo, e 0,53% (3 crianças) em José Gonçalves de Minas. Os resultados de prevalência da infecção na faixa etária de 0 a 7 anos de idade na pesquisa realizada por MONTOYA, (1998) e de sete a 14 anos por BORGES et al. (2006), sugerem que houve interrupção da transmissão da infecção na região.
Nossa equipe realizou no ano seguinte (MACHADO DE ASSIS, 2006), uma pesquisa triatomínica integral no município de Berilo, vistoriando todos os domicílios rurais e urbanos. A pesquisa resultou na captura de 391 insetos, os quais não apresentavam infecção pelo T. cruzi, pertencentes às espécies P. megistus (72,0%) e T. pseudomaculata (28,0%). O peridomicílio (galinheiro) foi o principal local das capturas.
Ressalta-se que pela primeira vez no estado de Minas Gerais foi encontrado um grande foco intradomiciliar de T. pseudomaculata. Os moradores das residências onde os
vetores foram encontrados foram submetidos a testes sorológicos para o diagnóstico da doença de Chagas. A infecção pelo T. cruzi foi detectada em 31 indivíduos (25,0%),
destes, 97,0% eram maiores de 30 anos indicando que estes tenham sido infectados antes da instalação da vigilância epidemiológica, período no qual a transmissão vetorial era presente.
Diante do numeroso contingente de indivíduos infectados e doentes no município, estudos abordando diferentes aspectos da infecção chagásica não apenas contribuirão para o aperfeiçoamento do conhecimento a respeito da doença, seu diagnóstico e tratamento, como também para a melhoria da qualidade de vida da população.
1.6 Justificativa
2.1 Objetivo geral
Avaliar o desempenho da pesquisa de IgG e subclasses de IgG
anti-Trypanosoma cruzi por meio de um ensaio imunoenzimático não comercial, aplicado ao
diagnóstico e monitoração de morbidade da doença de Chagas.
2.2 Objetivos específicos
Realizar o diagnóstico sorológico da infecção pelo Trypanosoma cruzi e após a
confirmação da infecção:
1- Avaliar alguns aspectos epidemiológicos dos pacientes, realizar o diagnóstico parasitológico através da coleta de hemocultura, associando com as formas clínicas dos mesmos;
2- Estabelecer critérios de interpretação para a reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi detectada por meio do ensaio imunoenzimático não comercial
aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas;
3- Estabelecer critérios de interpretação para a reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi detectada por meio do ensaio imunoenzimático não comercial
aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas em amostras de soro de pacientes portadores de outras doenças infecto-parasitárias de interesse médico, como HIV, hepatite C (HCV), sífilis, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar;
4- Avaliar a aplicabilidade da pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi
3.1 Área do estudo
3.1.1 Berilo
O município de Berilo está situado no nordeste do estado de Minas Gerais, a 760 Km de Ouro Preto (Figura 1), na meso-região do Vale do Jequitinhonha. Seu surgimento está associado à exploração de ouro ocorrida no início do século XVIII com a ida de bandeirantes para a região. Por volta de 1727, foram descobertas minas de ouro na área por dois bandeirantes, Sebastião Leme do Prado e Domingos de Abreu Vieira, originando o primeiro núcleo populacional denominado Água Suja. Em 1877, a área passou a se chamar Água Limpa e em 1923, Vila Berilo. Em 1962, o distrito se desligou politicamente de Minas Novas, elevando-se á categoria de município, então denominado Berilo. Em 1963, uma nova divisão ocorreu, levando a separação entre Berilo e José Gonçalves de Minas, este último até então considerado distrito de Berilo e elevado à categoria de município em 1997.
Berilo possui uma extensão territorial de 586 quilômetros quadrados limitando-se com os municípios de José Gonçalves de Minas, Francisco Badaró, Virgem da Lapa, Chapada do Norte, Cristália e Grão Mogol.
O município não apresenta qualquer atividade de processamento de matéria-prima, necessitando ser abastecido por produtos industrializados. Sua economia está baseada em atividades agropecuárias, como o cultivo de diversas lavouras e criação de rebanho leiteiro.
