Desenvolvimento de um método analítico para deteção e quantificação de Antidepressivos e Antipsicóticos, em sangue total, por UPLC-MS/MS.

FA CU LD A D E D E F A RM Á CI A

L

ara

S

ou

sa

. D

es

en

vo

lvim

en

to e v

alid

aç

ão d

e u

m m

étod

o a

na

líti

co p

ara d

eteç

ão e

qu

an

tifi

ca

çã

o d

e a

nti

de

pre

ssi

vo

s e a

nti

ps

icó

tic

os

, e

m s

an

gu

e t

ota

l, p

or U

PL

C-M

S/M

S

D

es

en

vo

lv

im

en

to e va

lid

aç

ão d

e u

m m

ét

od

o

an

alí

tic

o p

ar

a d

et

eç

ão e q

ua

nt

ifi

ca

çã

o d

e

an

tid

ep

re

ss

iv

os e a

nt

ip

sic

ót

ic

os

, e

m s

an

gu

e t

ot

al,

por

UP

LC

-M

S/M

S

La

ra S

ofi

a M

ari

nh

o d

e S

ou

sa

Desenvolvimento e validação de um

método analítico para deteção e

quantificação de antidepressivos e

antipsicóticos, em sangue total, por

UPLC-MS/MS

Lara Sousa

M

M

.FFUP

2017

Lara Sofia Marinho de Sousa

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO ANALÍTICO PARA DETEÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ANTIDEPRESSIVOS E ANTIPSICÓTICOS,

EM SANGUE TOTAL, POR UPLC-MS/MS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO REALIZADA SOB A ORIENTAÇÃO DE:

Professora Doutora Maria de Lourdes Bastos

COORIENTAÇÃO DE:

É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTE TRABALHO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE.

AGRADECIMENTOS

A concretização da presente dissertação foi possível graças à colaboração direta e indireta de diversas pessoas. A todas elas deixo aqui o meu sincero agradecimento.

À Professora Doutora Beatriz Oliveira, diretora de curso do mestrado em Controlo de Qualidade, agradeço pela simpatia e pela disponibilidade com que me recebeu desde o princípio.

À Professora Doutora Maria de Lourdes Bastos, orientadora desta dissertação, pela confiança e disponibilidade.

À Doutora Paula Guedes, pelos conhecimentos transmitidos, apoio constante, orientação e pela compreensão que, apesar de todas as alterações de planos que surgiram no decorrer deste mestrado, mostrou estar sempre disponível para me acompanhar.

À Mestre Paula Melo, coorientadora desta dissertação, pelos ensinamentos preciosos, apoio incondicional, encorajamento, paciência e total ajuda na superação dos obstáculos que surgiram ao longo deste trabalho.

Ao Eng. Pedro Costa, um agradecimento muito especial, por todo o empenho, elevada exigência, lições indispensáveis, paciência e por me ajudar a melhorar continuadamente as minhas competências, principalmente nas alturas mais difíceis deste trabalho.

À Dra.Maria José Quintas, pela revisão do inglês, pelas palavras de incentivo, apoio e companhia nos serões passados até tarde no SQTF-N.

Ao Mestre João Miguel Franco, diretor do SQTF, agradeço a oportunidade de realizar este trabalho no laboratório e a disponibilização dos meios e instrumentos necessários à sua concretização.

A todos os meus colegas do SQTF-N, pela cooperação, boa disposição e tolerância nos dias menos bons.

RESUMO

Em Portugal, na ultima década, verificou-se que o consumo de antidepressivos e antipsicóticos tem aumentado de forma significativa. Seja no contexto da monitorização da terapêutica medicamentosa, ou da toxicologia forense, a deteção e quantificação de fármacos antidepressivos e antipsicóticos apresenta bastante relevância, devido ao seu potencial abuso, efeitos secundários, intoxicações, suicídios e homicídios. Com o objetivo de detetar a presença destas substâncias, em amostras post-mortem e in vivo, foi desenvolvido um método analítico de UPLC-MS/MS para deteção e quantificação de 16 antidepressivos e 11 antipsicóticos em sangue total.

Após extração em fase sólida, com recurso a cartuchos Oasis HLB, a análise foi efetuada num cromatógrafo líquido de ultra eficiência, acoplado a um espectrómetro de massa do tipo triplo quadrupolo, com ionização por ESI. A separação dos compostos foi feita usando a fase móvel em modo de gradiente, a um fluxo de 0,5 mL/min, sendo o tempo total de corrida de 10 minutos. A deteção foi realizada em modo MRM, com monitorização de 2 transições por analito. Os padrões internos utilizados foram a paroxetina-d6, para a

paroxetina, e a risperidona-d4 para os restantes analitos.

O método demonstrou ser seletivo para todos os compostos e os limites de deteção e quantificação convencionados foram de 10 ng/mL para todos os analitos, exceto para a tiaprida, trazodona e venlafaxina, cujo limite de quantificação estabelecido foi de 100 ng/mL. O efeito matriz variou entre -38,4% e 91,8%, não ocorreram fenómenos de arrastamento e a média da eficiência de extração foi de 86,7%. O estudo dos dados experimentais revelou que estes apresentam um comportamento heterocedástico, para a gama de trabalho proposta, sendo, consequentemente, aplicados diferentes fatores de ponderação à regressão linear. A veracidade foi satisfatória face aos bons resultados obtidos em ensaios interlaboratoriais. Ao nível da precisão, o critério de aceitação do limite de repetibilidade (20%) foi globalmente respeitado pelos analitos. A incerteza total média foi de 49,8%, o que se revela compatível com o contexto analítico associado à Toxicologia Forense.

A aplicabilidade do método na análise de rotina foi demonstrada para os analitos estudados, medicamentos antidepressivos e antipsicóticos, por análise de amostras de controlo de qualidade externo (ensaios interlaboratoriais) e amostras reais de sangue total

post-mortem.

Palavras-chave: antidepressivos; antipsicóticos; sangue total; UPLC-MS/MS; validação

ABSTRACT

In Portugal, in the last decade, the consumption of antidepressants and antipsychotics has significantly increased. Whether in the context of therapeutic drug monitoring or forensic toxicology, the detection and quantification of antidepressant and antipsychotic drugs is highly relevant due to its potential abuse, side effects, intoxications, suicides and homicides. In order to detect and quantify the presence of these compounds in postmortem and invivo samples, an analytical method of UPLC-MS / MS was developed aiming 16 antidepressants and 11 antipsychotics in whole blood.

Analysis was performed on an ultra-efficient liquid chromatograph coupled to a triple quadrupole mass spectrometer with ESI ionization, following solid-phase extraction using Oasis HLB cartridges. Compounds separation was achieved with a gradient elution at 0.5 mL/min resulting in a 10 minutes run-time. Detection was carried out in MRM mode, monitoring 2 ions transitions per compound. Isotope labeled internal standards employed were paroxetine-d6 for paroxetine and risperidone-d4 for the remaining compounds.

This method proved to be selective for all compounds, and the settled detection and quantification limits were both 10 ng/mL for all analytes except tiapride, trazodone and venlafaxine, for whom the established quantitation limit was 100 ng/mL. Matrix effects ranged from -38.4% to 91.8%, carry-over wasn’t present, and average extraction recovery was 86.7%. Due to the wide calibration range and to compensate for heterocedasticity, weighting factors to linear regression had to be adopted.

Good quantitative performances were achieved concerning trueness and comparing results of proficiency tests. Regarding precision, the analytes meet largely repeatability limit criterion (20%). Average uncertainty was 49.8%, which is consistent with the analytical context associated to forensic toxicology.

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS ... iii

RESUMO ... iv

ABSTRACT ... v

ÍNDICE ... vi

ÍNDICE DE FIGURAS ... viii

ÍNDICE DE TABELAS ... ix

LISTA DE ABREVIATURAS ... xii

Parte I - Introdução Geral ... 1

1. ANTIDEPRESSIVOS ... 5

1.1. Introdução ... 5

1.2. Farmacodinâmica ... 6

1.2.1. Inibidores da recaptação de neurotransmissores ... 6

a) Antidepressivos tricíclicos ... 6

b) Inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS) ... 7

c) Inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina e da serotonina ... 8

1.2.2. Outros antidepressivos ... 8

a) Trazodona ... 8

b) Mirtazapina ... 9

c) Mianserina ... 9

1.3. Farmacocinética ... 9

1.3.1. Inibidores da recaptação de neurotransmissores ... 10

a) Antidepressivos tricíclicos ... 10

b) Inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS) ... 10

c) Inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina e da serotonina ... 10

1.3.2. Outros antidepressivos ... 11 a) Trazodona ... 11 b) Mirtazapina ... 11 c) Mianserina ... 11 2. ANTIPSICÓTICOS ... 12 2.1. Introdução ... 12 2.2. Farmacodinâmica ... 12 2.2.1. Antipsicóticos tricíclicos ... 13 2.2.2. Antipsicóticos heterocíclicos ... 13 2.3. Farmacocinética ... 15

3. TÉCNICAS E MÉTODOS ANALÍTICOS ... 16

3.1. Metodologias analíticas de análise de antidepressivos e antipsicóticos ... 16

3.2. Métodos de preparação de amostras biológicas ... 23

3.2.1. Extração em fase sólida ... 24

3.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ... 25

3.3.1. Deteção por espetrometria de massa ... 27

Parte II - Âmbito e objetivos da dissertação ... 30

1. Padrões e reagentes ... 33

2. Soluções ... 34

3. Material ... 35

4. Equipamentos ... 35

5. Parâmetros instrumentais ... 37

5.1. Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência ... 37

5.2. Espectrometria de massa ... 38

6. Critérios de identificação de substâncias ... 40

7. Extração em fase sólida ... 41

7.1. Pré-tratamento da amostra ... 41

7.2. Metodologia da extração em fase sólida ... 41

8. Validação e Controlo de Qualidade ... 42

8.1. Método do padrão interno ... 43

8.2. Seletividade e Especificidade ... 44

8.3. Limite de deteção e quantificação ... 45

8.4. Efeito matriz ... 45

8.5. Arrastamento (carry-over) ... 47

8.6. Eficiência da extração ... 47

8.7. Gama de trabalho, linearidade e modelo de calibração ... 48

8.8. Exatidão ... 50

8.8.1. Justeza ou Veracidade ... 51

8.8.2. Fidelidade ou Precisão ... 53

8.9. Robustez ... 54

8.10. Incerteza ... 54

CAPÍTULO II – RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 57

1. Validação do Método Analítico ... 57

1.1. Seletividade e Especificidade ... 57

1.2. Limite de deteção e quantificação ... 61

1.3. Efeito matriz ... 62

1.4. Arrastamento (carry-over) ... 64

1.5. Eficiência da extração ... 67

1.6. Gama de trabalho, linearidade e modelo de calibração ... 68

1.7. Exatidão ... 71

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 - Evolução da utilização das principais substâncias ativas (antidepressivos) entre 2000 e 2012 ... 3

Figura 2 - Evolução da utilização das principais substâncias ativas (antipsicóticos) entre 2000 e 2012... 3

Figura 3 - Passos da Extração em Fase Sólida ... 25

Figura 4 - Esquema de um Cromatógrafo Liquido de Alta Eficiência ... 26

Figura 5 - Esquema de um triplo quadrupolo ... 28

Figura 6 - Esquema da interface da ionização por electrospray ... 29

Figura 7 - Cromatógrafo líquido Waters Acquity acoplado a espetrómetro de massa (UPLC-MS/MS) ... 36

Figura 8 - Evaporador sob corrente de azoto, modelo TurboVap® LV, da Caliper Life Sciences ... 36

Figura 9 - Câmara para extração em fase sólida manual com capacidade para 24 colunas, modelo de 24 canais de vácuo, associada a uma bomba de vácuo, modelo R-300 ... 36

Figura 10 - Relação entre exatidão, precisão e veracidade ... 50

Figura 11 - Cromatograma de pool 2 não fortificada (negativa) ... 59

Figura 12 - Cromatograma de pool 2 fortificada a 50 ng/mL ... 60

Figura 13 - Cromatograma de amostra a concentração elevada ... 65

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 - Critérios de diagnóstico para a depressão major, DSM ... 5

Tabela 2 - Espectro da esquizofrenia e outros transtornos psicóticos do DSM-5 ... 12

Tabela 3 - Antipsicóticos heterocíclicos ... 13

Tabela 4 - Métodos analíticos para a determinação de antidepressivos tricíclicos ... 16

Tabela 5 - Métodos analíticos para a determinação de Inibidores seletivos da recaptação da serotonina ... 18

Tabela 6 - Métodos analíticos para a determinação de Inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina e da serotonina ... 19

Tabela 7 - Métodos analíticos para a determinação de outros antidepressivos ... 20

Tabela 8 - Métodos analíticos para a determinação de antipsicóticos tricíclicos ou clássicos ... 21

Tabela 9 - Métodos analíticos para a determinação de antipsicóticos heterocíclicos ou atípicos ... 21

Tabela 10 - Gradiente utilizado na fase móvel ... 37

Tabela 11 - Valores da fonte ESI ... 38

Tabela 12 - Valores do analisador triplo quadrupolo ... 38

Tabela 13 - Descrição do método de massa: janela de aquisição, transições monitorizadas, cone e energia de colisão para cada substância ... 39

Tabela 14 - Intervalos máximos de aceitação para abundâncias relativas para garantir a identificação de um analito com confiança ... 40

Tabela 15 - Protocolo extrativo de SPE com Oasis® HLB ... 42

Tabela 16 - Substâncias a avaliar nos ensaios interlaboratoriais ... 52

Tabela 17 - Lista de amostras brancas de sangue total destinadas ao estudo da seletividade e especificidade ... 57

Tabela 18 - Resumo dos resultados referentes ao estudo dos LD e LQ em ng/mL ... 61

Tabela 19 - Resumo dos resultados obtidos para o efeito matriz ... 63

Tabela 20 - Resumo de valores de eficiência de extração por substância ... 67

Tabela 21 - Valores de PG para cada substância ... 69

Tabela 22 - Fatores de ponderação selecionados para cada analito e resultados quando aplicados a CQ a duas concentrações diferentes ... 70

Tabela 23 - Resultados obtidos na análise de ensaios interlaboratoriais em ng/mL... 71

Tabela 24 - Limite de repetibilidade e precisão intermédia para cada analito ... 73

Tabela 25 - Incerteza expandida combinada (k=2) ... 74

Tabela 26 - Informação relativa às amostras reais utilizadas ... 75

Tabela 27 - Amostras reais analisadas com o método SPE-UPLC-MS/MS e por SPE-GC-MS, com os respetivos analitos e concentrações obtidas ... 76

Tabela 28 - Resumo de características dos Antidepressivos Tricíclicos ... 98

Tabela 29 - Resumo de características dos Inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS) ... 99

Tabela 30 - Resumo de características dos Inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina e da serotonina, Inibidores da recaptação neuronial da dopamina e outros ... 100

Tabela 31 - Resumo de características dos Antipsicóticos Tricíclicos ou Clássicos ... 101

Tabela 32 - Resumo de características dos Antipsicóticos heterocíclicos ou atípicos ... 102

Tabela 33 - TRR de cada substância e respetivo intervalo de tolerância na pool 2... 103 Tabela 34 - Áreas relativas do ião diagnóstico selecionado para cada substância e respetivo intervalo de

Tabela 46 - Áreas relativas do ião diagnóstico selecionado para cada substância e respetivo intervalo de

tolerância na pool 8 ... 109

Tabela 47 - TRR de cada substância e respetivo intervalo de tolerância na pool 9... 110

Tabela 48 - Áreas relativas do ião diagnóstico selecionado para cada substância e respetivo intervalo de tolerância na pool 9 ... 110

Tabela 49 - TRR de cada substância e respetivo intervalo de tolerância na pool 10 ... 111

Tabela 50 - Áreas relativas do ião diagnóstico selecionado para cada substância e respetivo intervalo de tolerância na pool 10 ... 111

Tabela 51 - TRR de cada substância e respetivo intervalo de tolerância na pool 11 ... 112

Tabela 52 - Áreas relativas do ião diagnóstico selecionado para cada substância e respetivo intervalo de tolerância na pool 11 ... 112

Tabela 53 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a amissulprida ... 113

Tabela 54 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a amitriptilina ... 113

Tabela 55 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a ciamemazina ... 114

Tabela 56 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para o citalopram ... 114

Tabela 57 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a clomipramina ... 115

Tabela 58 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a cloropromazina ... 115

Tabela 59 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a Clozapina ... 116

Tabela 60 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a dosulepina ... 116

Tabela 61 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a fluoxetina ... 117

Tabela 62 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a fluvoxamina ... 117

Tabela 63 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para o haloperidol ... 118

Tabela 64 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a imipramina ... 118

Tabela 65 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para levomepromazina ... 119

Tabela 66 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para maprotilina ... 119

Tabela 67 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a melperona ... 120

Tabela 68 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a mianserina ... 120

Tabela 69 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a mirtazapina ... 121

Tabela 70 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a nortriptilina ... 121

Tabela 71 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a olanzapina ... 122

Tabela 72 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a paroxetina ... 122

Tabela 73 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a quetiapina ... 123

Tabela 74 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a risperidona ... 123

Tabela 75 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a sertralina ... 124

Tabela 76 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a tiaprida ... 124

Tabela 77 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a trazodona ... 125

Tabela 78 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a trimipramina ... 125

Tabela 79 - Resultados obtidos nos testes de LD e LQ para a venlafaxina ... 126

Tabela 80 - Resultados obtidos na avaliação do efeito matriz ... 127

Tabela 81 - Avaliação da homocedasticidade ... 134

Tabela 82 - Eficiência de extração da Amissulprida ... 137

Tabela 83 - Eficiência de extração da Amitriptilina ... 137

Tabela 84 - Eficiência de extração da Ciamemazina ... 138

Tabela 85 - Eficiência de extração do Citalopram ... 138

Tabela 86 - Eficiência de extração da Clomipramina ... 139

Tabela 87 - Eficiência de extração da Cloropromazina ... 139

Tabela 88 - Eficiência de extração da Clozapina... 140

Tabela 89 - Eficiência de extração da Dosulepina ... 140

Tabela 90 - Eficiência de extração da Fluoxetina ... 141

Tabela 91 - Eficiência de extração da Fluvoxamina ... 141

Tabela 92 - Eficiência de extração do Haloperidol ... 142

Tabela 93 - Eficiência de extração da Imipramina ... 142

Tabela 94 - Eficiência de extração da Levomepromazina ... 143

Tabela 95 - Eficiência de extração da Maprotilina ... 143

Tabela 96 - Eficiência de extração da Melperona ... 144

Tabela 97 - Eficiência de extração da Mianserina ... 144

Tabela 98 - Eficiência de extração da Mirtazapina ... 145

Tabela 99 - Eficiência de extração da Nortriptilina ... 145

Tabela 100 - Eficiência de extração da Olanzapina ... 146

Tabela 103 - Eficiência de extração da Risperidona ... 147

Tabela 104 - Eficiência de extração da Sertralina ... 148

Tabela 105 - Eficiência de extração da Tiaprida ... 148

Tabela 106 - Eficiência de extração da Trazodona... 149

Tabela 107 - Eficiência de extração da Trimipramina ... 149

Tabela 108 - Eficiência de extração da Venlafaxina ... 150

Tabela 109 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da amissulprida ... 151

Tabela 110 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da amitriptilina ... 152

Tabela 111 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da ciamemazina ... 152

Tabela 112 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação do citalopram ... 153

Tabela 113 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da clomipramina ... 153

Tabela 114 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da cloropromazina ... 154

Tabela 115 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da Clozapina ... 154

Tabela 116 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da dosulepina ... 155

Tabela 117 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da fluoxetina ... 155

Tabela 118 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da fluvoxamina ... 156

Tabela 119 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação do haloperidol ... 156

Tabela 120 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da imipramina ... 157

Tabela 121 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da levomepromazina ... 157

Tabela 122 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da maprotilina ... 158

Tabela 123 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da melperona ... 158

Tabela 124 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da mianserina ... 159

Tabela 125 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da mirtazapina ... 159

Tabela 126 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores} de ponderação da nortriptilina ... 160 Tabela 127 - Resumo dos valores do r2 _{e do somatório dos resíduos para as diferentes regressões e fatores}

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT Serotonina ou 5 - Hidroxitriptamina

CAS Chemical Abstracts Service

CHSJ - SIH Centro Hospitalar São João – Serviço de Imunohemoterapia CQ Controlo de Qualidade

DSM Manual Diagnóstico e Estatístico (do inglês, Diagnostic and Statistical Manual)

DP Desvio-padrão

EM Efeito Matriz

ESI Ionização por electrospray (do inglês, Electrospray Ionization)

eV Eletro-volt

F Feminino

FL Fluorescência

FP Fator de ponderação

GC Cromatografia gasosa (do inglês, Gas Chromatography)

GC-MS Cromatografia gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês, Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry)

HILIC Cromatografia líquida de interação hidrofílica (do inglês, Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)

HPLC Cromatografia Liquida de Elevada Performance (do inglês, High Performance Liquid Chromatography)

ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of _{Pharmaceuticals for Human Use} ISRS Inibidores Seletivos da Recaptação da Serotonina

ISRN Inibidores Seletivos da Recaptação da Noradrenalina IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

LC Cromatografia Líquida (do inglês, Liquid Chromatography)

LC-MS Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês, Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry)

LD Limite de deteção

LQ Limite de Quantificação

LLE Extração líquido-líquido (do inglês, Liquid - liquid extraction)

LPME Microextração em fase líquida (do inglês, Liquid – Phase Microextraction)

M Masculino

MAE Extração assistida por micro-ondas (do inglês, Microwave – Assisted Extraction)

MAO Monoaminoxídase

MEPS Microextração por sorvente empacotado (do inglês, Micro Extraction by Packed Sorbent) MRC Materiais de Referência Certificados

MS Espectrometria de Massa (do inglês, Mass Spectrometry)

m/z Razão massa/carga

ND Não definido

PI Padrão Interno

PO-SQTF-N-021 Procedimento operacional do Serviço de Química e Toxicologia Forenses, número 21, _{“Validação de Procedimentos de Ensaio”}

PO-SQTF-N-030 Procedimento operacional do Serviço de Química e Toxicologia Forenses, número 30, _{“Estimativa da incerteza dos resultados”}

PP Precipitação proteica

QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe

r Coeficiente de correlação

r2 _{Coeficiente de determinação}

s Desvio-padrão

SC Sangue Cardíaco

SALLE Extração líquido-líquido assistida por Salting-out (do inglês, Salting-Out Assisted Liquid-Liquid Extraction)

SIM Monitorização de Iões Selecionados (do inglês, Selected ion monitoring) SNC Sistema Nervoso Central

SP Sangue Periférico

SPE Extração em Fase Sólida (do inglês, Solid - Phase Extration) SQTF-N Serviço de Química e Toxicologia Forenses, da delegação do Norte

TDM Monitorização da Terapêutica Medicamentosa (do inglês, Therapeutic Drug Monitoring)

Tr Tempo de retenção

TrR Tempo de retenção relativo

UA-DLLME Microextração Líquido-Líquido Dispersiva Assistida por Ultrassons (do inglês, Ultrasounds _{Assisted – Dispersive Liquid Liquid Microextraction)}

UPLC Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (do inglês, Ultra Performance Liquid Chromatography)

UHPLC Cromatografia Líquida de Ultraelevada Eficiência (do inglês, Ultra - High Performance Liquid Chromatography)

VIM Vocabulário Internacional de Metrologia

Parte I

Introdução geral

As perturbações mentais são um dos principais desafios de saúde pública na Europa, afetando cerca de 25% da população[1]_{. Estudos em países europeus revelam que as}

prevalências destes distúrbios se situam entre os 30 - 40%, sendo superiores nos países do Sul[2]_{. Os transtornos mentais compreendem uma ampla gama de problemas, com}

diferentes sintomas, sendo geralmente caracterizados pela combinação de emoções, pensamentos, comportamento e relacionamentos atípicos com os outros. Exemplos disso são a esquizofrenia, depressão, incapacidades intelectuais e transtornos decorrentes da toxicodependência, sendo que a maior parte destes distúrbios se podem tratar com sucesso[3]_.

É importante salientar que os problemas de saúde mental (depressão, psicose) e os problemas de saúde física estão associados a um grande número de comportamentos e fatores de risco, nomeadamente ao consumo de álcool e tabaco e a violência[1]_.

Segundo a Organização Mundial de Saúde, a depressão é um transtorno mental comum e uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo. Globalmente, estima-se que 350 milhões de pessoas são afetadas pela depressão, na sua maioria mulheres.

A depressão é caracterizada por tristeza, perda de interesse ou prazer, sentimentos de culpa ou baixa autoestima, distúrbios do sono e/ou do apetite, cansaço e falta de concentração. Quem sofre desta doença poderá também ter múltiplas queixas físicas sem uma causa física aparente. Na sua forma mais grave, a depressão pode levar ao suicídio. Os programas de prevenção têm demonstrado evidências na redução do número de depressões, tanto em crianças (por exemplo, através da proteção e apoio psicológico após abusos físicos e sexuais) como em adultos (por exemplo, através de assistência psicossocial após desastres e conflitos).

Para a depressão moderada a grave, existem também tratamentos farmacológicos bastante eficazes, através do uso de antidepressivos, mas não são a primeira linha de

Introdução geral

Em Portugal, verificou-se entre 2000 e 2012 um aumento no consumo de psicofármacos em todos os seus subgrupos, mas com maior evidência nos antidepressivos (+240%) e antipsicóticos (+171%).

No que concerne aos antidepressivos, a substância mais prescrita pelo Sistema Nacional de Saúde no ano 2000 foi a fluoxetina, contudo, entre 2000 e 2012, o consumo de sertralina e de escitalopram tiveram uma maior tendência de aumento, sendo, neste estudo, a sertralina o fármaco líder de mercado do seu subgrupo terapêutico (Figura 1)[5]_.

.

Figura 1 - Evolução da utilização das principais substâncias ativas (antidepressivos) entre 2000 e 2012[5]

Quanto aos antipsicóticos, no ano 2000, o consumo de haloperidol e ciamemazina era superior a todos os outros antipsicóticos, mas a partir deste ano, notou-se um aumento do consumo de fármacos de 2ª geração, nomeadamente da risperidona e da olanzapina. A quetiapina apresentou um crescimento acentuado e, em 2012, foi a substância com maior utilização, provavelmente devido a um elevado conjunto de indicações terapêuticas (como a esquizofrenia e a perturbação bipolar) que foram aprovadas, explicando assim o seu elevado consumo (Figura 2)[5]_.

Introdução geral

Para justificar o aumento dos antipsicóticos em geral, foram identificadas algumas explicações como o aumento da prevalência de perturbações psicóticas, o aumento da duração do tratamento, o alargamento das indicações terapêuticas dos fármacos de 2ª geração e a utilização off-label[5]_{. O termo off-label é utilizado para descrever o uso de um}

medicamento de uma forma diferente daquela que é recomendada pelo titular da sua introdução no mercado. Esta utilização pode variar ao nível da indicação terapêutica, dose, idade, via de administração ou contraindicação[6]_.

Seja no contexto da monitorização da terapêutica medicamentosa (TDM), ou da toxicologia forense, a deteção e quantificação de fármacos antidepressivos e antipsicóticos, em sangue total, apresenta bastante interesse devido ao seu potencial abuso, efeitos secundários, intoxicações e suicídios[7]_.

Introdução geral

1. ANTIDEPRESSIVOS

1.1. Introdução

A depressão tem sido descrita desde há milhares de anos. O termo melancolia foi usado pela primeira vez por Hipócrates em aproximadamente 400 aC. Desde os anos 60 que a depressão tem sido diagnosticada como “depressão major” com base em critérios sintomáticos estabelecidos no Manual Diagnóstico e Estatístico (Diagnostic and Statistical Manual, DSM) (Tabela 1). Como é possível verificar, a partir destes critérios, o diagnóstico da depressão, ao contrário do diagnóstico de outras doenças orgânicas, não é baseado em testes de diagnóstico objetivos, mas sim num conjunto variável de sintomas. Assim, a depressão não deve ser vista como uma doença única, mas como uma síndrome heterogénea, composta por doenças com distintas causas e fisiopatologias[8]_.

Tabela 1 - Critérios de diagnóstico para a depressão major, DSM[8]

Critérios de diagnóstico para a “depressão major” Humor deprimido

Irritabilidade Baixa autoestima

Sentimentos sem esperança, de inutilidade e culpa Diminuição da capacidade de se concentrar e pensar Aumento ou diminuição do apetite

Perda ou ganho de peso Insónia ou hipersónia

Pouca energia, cansaço, ou maior agitação

Diminuição do interesse em estímulos agradáveis (exemplo: alimentos, interações sociais) Pensamentos recorrentes de suicídio e morte

O diagnóstico da depressão major é realizado quando um determinado número de sintomas descritos acima são verificados por um período superior a 2 semanas e quando estes sintomas perturbam o funcionamento social e ocupacional normal.

Estudos epidemiológicos mostraram que 40 - 50% do risco de ter uma depressão é genético, o que significa que pode ser uma doença hereditária, tanto como outras condições de saúde complexas. A procura de genes de risco específicos não tem sido satisfatória, dado que não foi identificado, até ao presente, nenhum evento genético relacionado. A vulnerabilidade à depressão possui também fatores não genéticos, como o stress e o trauma emocional, infeções víricas (ex. vírus Borna), ou mesmo processos aleatórios no desenvolvimento cerebral, alterações hormonais (híper- ou hipocortisolémia,

Introdução geral

híper- ou hipotiroidismo), doença de Parkinson, traumatismos crânio-encefálicos, alguns carcinomas, asma, diabetes e acidentes vasculares cerebrais[8]_.

1.2. Farmacodinâmica

Os primeiros antidepressivos eficazes, os inibidores da monoaminoxídase (MAO) e os tricíclicos, levavam ao aumento dos níveis de noradrenalina, de 5-hidroxitriptamina (5-HT) ou serotonina (e em menor escala, da dopamina) nas sinapses dos neurónios do SNC (Sistema Nervoso Central)[9]_{. Os antidepressivos estudados neste trabalho podem ser}

divididos em dois grupos:

-Inibidores da recaptação de neurotransmissores

-Outros antidepressivos: trazodona, mirtazapina e mianserina

1.2.1. Inibidores da recaptação de neurotransmissores

a) Antidepressivos tricíclicos

Os antidepressivos tricíclicos possuem esta nomenclatura devido à estrutura química dos seus principais representantes. Quando estavam disponíveis apenas alguns antidepressivos, os fármacos eram classificados como antidepressivos tricíclicos, ou inibidores da MAO, uma classificação que mistura um critério estrutural com um critério funcional. Atualmente, os antidepressivos são constituídos por uma vasta gama de estruturas químicas, mas existem apenas alguns mecanismos de ação conhecidos destes mesmos compostos. Assim, uma classificação baseada na funcionalidade é mais vantajosa que uma classificação estrutural[10]_{. Os antidepressivos tricíclicos são semelhantes}

estruturalmente, o que não surpreende que as suas ações farmacológicas e eficácia terapêutica também se sobreponham. Após a introdução da imipramina, muitos compostos

Introdução geral

Trimipramina Clomipramina Dosulepina

A maprotilina não é um composto tricíclico, contudo, do ponto de vista farmacodinâmico e aplicação terapêutica, apresenta bastante analogia com este grupo, sendo assim considerada em conjunto com os tricíclicos[11]_.

Maprotilina

A ação antidepressora deve-se ao aumento da serotonina e noradrenalina nas sinapses dos neurónios do SNC, por bloqueio da recaptação dos neurotransmissores. Para além deste resultado, observa-se ainda o bloqueio dos recetores muscarínicos H1 da

histamina e dos adrenoceptores α1, o que não produz efeito terapêutico, mas sim os efeitos

adversos destes medicamentos[11]_.

b) Inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS)

A procura de novos antidepressivos mais eficazes que os tricíclicos, melhor tolerados, com um início de ação mais rápido e mais eficazes nos casos resistentes à terapêutica antidepressora clássica, levou ao desenvolvimento de novos antidepressivos. Os antidepressivos tricíclicos, apesar de eficazes, apresentam um perfil de efeitos adversos que é desvantajoso. Assim, surgiram outros fármacos antidepressivos, mas com um mecanismo de ação diferente. A fluoxetina, a fluvoxamina, a paroxetina, o citalopram e a sertralina partilham o mesmo perfil farmacodinâmico, inibindo seletivamente a recaptação da serotonina na fenda sináptica. A eficácia clínica destes fármacos relaciona-se com a ocupação de 70 - 80% dos transportadores da serotonina[11]_.

Introdução geral

Citalopram Escitalopram Fluoxetina

Fluvoxamina Paroxetina Sertralina

c) Inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina e da serotonina

Estes antidepressivos distinguem-se dos tricíclicos por não provocarem reações parassimpaticolíticas, anti-histamínicas e adrenérgicas, sendo a venlafaxina a representante do grupo[11]_{. Um estudo sobre a interligação entre o sistema serotoninérgico}

e noradrenérgico comprovou que os inibidores da recaptação da serotonina e da noradrenalina apresentam uma maior eficácia que os ISRS e os ISRN isoladamente[9]_.

Introdução geral

Trazodona

b) Mirtazapina

A mirtazapina é um antidepressivo cujos efeitos terapêuticos se devem diretamente ao bloqueio dos adrenorecetores α2 pré-sinápticos e de alguns recetores pós-sinápticos

(exemplo 5-HT2A). Para além destas ações, também bloqueia ligeiramente o transporte da

noradrenalina, serotonina e da dopamina[10]_.

Mirtazapina

c) Mianserina

A mianserina atua por antagonismo nos recetores H2, 5-HT e nos adrenorecetores α2

pré-sinápticos, aumentando desta forma a libertação de noradrenalina. Provavelmente, as ações sedativas surgem devido ao bloqueio dos recetores pós-sinápticos H1 e α1[13].

Mianserina

1.3. Farmacocinética

Conforme referido, os antidepressivos estudados neste trabalho podem ser divididos em dois grupos:

Introdução geral

1.3.1. Inibidores da recaptação de neurotransmissores

a) Antidepressivos tricíclicos

Geralmente, os antidepressivos tricíclicos são bem absorvidos no trato gastrointestinal e, devido à sua elevada solubilidade lipídica, estes fármacos encontram-se em concentrações muito mais baixas no sangue do que nos tecidos. O seu volume de distribuição é igualmente elevado, estando compreendido entre os 20 e os 40 L/kg. Após a administração oral dos antidepressivos tricíclicos, estes são extensamente metabolizados pelo fígado, sobretudo por N-desmetilação e N-hidroxilação, seguidas de conjugação por glucuronidação e excreção por via renal. O tempo de semivida médio destes fármacos situa-se entre 12 - 48 horas[14]_.

b) Inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS)

Apesar destes fármacos possuírem o mesmo mecanismo de ação, diferem bastante nalguns parâmetros de farmacocinética, diferenças que têm significado clínico, nomeadamente as relacionadas com a eliminação ou com as reações adversas. Os medicamentos deste grupo diferem quantitativa e qualitativamente na forma como são metabolizados pelas enzimas do citocromo P450 (CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2, CYP3A4) o que gera a possibilidade de ocorrerem interações medicamentosas. Os ISRS possuem uma toxicidade aguda inferior à dos antidepressivos tricíclicos e à dos inibidores da MAO, pelo que o risco associado à overdose é inferior em relação a estes[11]_.

c) Inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina e da serotonina

A venlafaxina é principalmente metabolizada no fígado, pelas isoenzimas 2D6 e 3A3/4. Devido a isto, este fármaco apresenta um potencial risco de originar interações

Introdução geral

1.3.2. Outros antidepressivos

a) Trazodona

Após administração oral, a trazodona é rapidamente absorvida, sendo extensamente metabolizada por hidroxilação e oxidação pela CYP3A4[16]_{. Cerca de 75% da dose}

administrada é excretada na urina sob a forma de metabolitos e 15% é eliminada nas fezes em 72h[17]_.

b) Mirtazapina

A mirtazapina é rapidamente e bem absorvida no trato gastrointestinal após administrações múltiplas, atingindo picos plasmáticos em 2 horas. A sua biodisponibilidade é de aproximadamente 50%, devido principalmente ao efeito de primeira passagem. A dose administrada por via oral é praticamente eliminada na urina e nas fezes em 4 dias. A sua metabolização é mediada pelas isoenzimas CYP2D6 e CYP3A4[18]_.

c) Mianserina

Assim como outros antidepressivos já aqui referidos, a mianserina também é absorvida rapidamente após administração oral. A sua biodisponibilidade é reduzida devido ao efeito de primeira passagem. Aproximadamente 30 - 40% da dose administrada é eliminada na urina em 24 horas, e destes, 5% sob a forma inalterada.

Introdução geral

2. ANTIPSICÓTICOS

2.1. Introdução

Os transtornos psiquiátricos, incluindo a esquizofrenia, estiveram presentes desde sempre e são reconhecidos ao longo da história como um problema grave de saúde pública. A esquizofrenia é geralmente descrita como uma síndrome que inclui a presença de múltiplos sintomas considerados como psicóticos, que ocorrem durante um período de tempo específico. As alterações mais recentes no diagnóstico desta doença estão presentes no DMS-5, onde a esquizofrenia e os seus transtornos associados são caracterizados ao longo de um espectro (Tabela 2)[19]_.

Tabela 2 - Espectro da esquizofrenia e outros transtornos psicóticos do DSM-5[19]

Diagnóstico Características associadas

Transtorno delirante Delírio isolado na ausência de outros sintomas psicóticos

Transtorno psicótico breve Psicose transitória com regresso ao funcionamento pré-mórbido

Transtorno esquizofreniforme Esquizofrenia sub-sindrómica com sintomas psicóticos múltiplos de duração superior a 1 mês e inferior a 6 meses

Esquizofrenia Dois ou mais sintomas psicóticos no mínimo 6 meses

Transtorno esquizoafetivo Sintomas psicóticos durante 2 semanas na ausência de sintomas relativos ao humor, que atendam aos critérios para um episódio de humor, durante a maior parte da duração da doença

Transtorno psicótico induzido por uma substância/medicamento

Sintomas psicóticos que resultam diretamente da administração de uma substância/medicamento

Transtorno psicótico devido a outra condição médica Sintomas psicóticos que resultam diretamente de uma condição médica

Catatonia Utilizado para descrever transtornos psiquiátricos, mas pode existir catatonia devido a condições médicas, etc.

Outro espectro da esquizofrenia específico e outros transtornos psicóticos

Outros transtornos psicóticos que não satisfazem os critérios para outro transtorno.

Espectro da esquizofrenia não-específico e outros transtornos psicóticos

Transtorno psicótico devido a causas desconhecidas ou indeterminadas

Transtorno da personalidade esquizotípica Padrão generalizado de capacidade reduzida para

Introdução geral

2.2.1. Antipsicóticos tricíclicos

Este grupo de antipsicóticos subdivide-se em fenotiazinas e tioxantenos, classificação que se baseia no tipo de cadeia acoplada ao azoto ou carbono na posição 10 do núcleo central. Neste trabalho apenas irão ser abordadas algumas fenotiazinas.

As fenotiazinas podem ainda dividir-se em três grupos: aminoalquílicas, piperidínicas e piperazínicas, possuindo todas a estrutura comum –C–C–C–N–, necessária para a atividade neuroléptica[21]_.

Cloropromazina Levomepromazina

Ciamemazina

2.2.2. Antipsicóticos heterocíclicos

A definição de antipsicótico atípico (ou heterocíclico) refere-se a um fármaco que leva a um aumento do bloqueio do recetor da serotonina e efeitos adversos reduzidos, como os efeitos extrapiramidais, comparativamente aos agentes convencionais[22]_{. Os antipsicóticos}

heterocíclicos abrangem um grupo de compostos muito heterogéneo, que se agrupam em diferentes classes químicas, como é possível verificar na Tabela 3[20]_.

Tabela 3 - Antipsicóticos heterocíclicos (adaptado de[20]₎

Classe Fármaco

Butirofenona piperidínica Haloperidol, Melperona

Dibenzodiazepina Clozapina

Dibenzotiazepina Quetiapina

Tienobenzodiazepina Olanzapina

Benzisoxazole Risperidona

Introdução geral Butirofenona piperidínica Haloperidol Melperona Dibenzodiazepina Clozapina Dibenzotiazepina Tienobenzodiazepina Quetiapina Olanzapina Benzisoxazole Risperidona

Introdução geral

2.3. Farmacocinética

Os antipsicóticos são, no geral, bem absorvidos por via oral, apesar da sua biodisponibilidade ser afetada na ingestão simultânea com determinados alimentos. Possuem também uma elevada solubilidade e atravessam facilmente a barreira hemato-encefálica. Estes fármacos apresentam forte ligação com as proteínas plasmáticas (85 - 90%), o que aumenta o risco de interações medicamentosas. Os antipsicóticos clássicos são metabolizados no fígado por hidroxilação e desmetilação pelo citocromo P450. Alguns, como o haloperidol, sofrem ainda processos de glucuronidação, permanecendo ativos como antagonistas da dopamina. As isoenzimas mais envolvidas no metabolismo destes fármacos são 2D6 e a 3A4. A eliminação dos antipsicóticos ocorre principalmente via renal e fecal, variando o tempo de semivida, em média, entre 18h e 40 horas[23]_.

Introdução geral

3. TÉCNICAS E MÉTODOS ANALÍTICOS

3.1. Metodologias analíticas de análise de antidepressivos e antipsicóticos

Através de pesquisa na literatura dos últimos anos, foram elaboradas as seguintes tabelas (Tabelas 4 a 9), que descrevem para cada um dos analitos em estudo na parte experimental, antidepressivos e antipsicóticos por classe terapêutica, os métodos de preparação de amostra e técnicas instrumentais mais utilizadas, bem como alguns parâmetros de validação associados a cada método.

Tabela 4 - Métodos analíticos para a determinação de antidepressivos tricíclicos

Analito Matriz (volume) Prep. da amostra Cromatografia e deteção LD/LQ (ng/mL) Recuperação % PI Ref. Antidepressivos tricíclicos Amitriptilina Plasma (1mL) SPE HPLC-MS 60/100 80,5 Diazepam [24] Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,03/0,10 81,2 -118 - [25] Humor Vítreo (500µL) LPME GC-MS 1/5 73 – 98 Amitriptilina-d3 [26] Sangue total (1 mL) SPE GC-MS/MS 4,0/12,1 96 Trimipramina-d3 [27] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 0,53/5,00 79 – 93 Diazepam-d5 [28] Soro

(1mL) MAE HPLC-DAD 30/110 98,5 Clomipramina

[29] Saliva (1mL) SPE HPLC-MS/MS - /5 74,0 Nortriptilina-d3 [30] Sangue

Introdução geral Saliva (1mL) SPE HPLC-MS/MS - /5 63,2 Fluoxetina-d6 [30] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 5/50 91 – 95 - [31] Dosulepina Plasma (1 mL) SPE HPLC-MS 80/100 77,4 Diazepam [24] Sangue total (1 mL) SPE GC-MS/MS 5,2/15,9 93 Trimipramina-d3 [27] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 1,18/5,00 87 – 95 Diazepam-d5 [28] Saliva (1mL) SPE HPLC-MS/MS - /5 80,3 Nortriptilina-d3 [30] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 5/50 90 – 97 - [31] Imipramina Plasma (1 mL) SPE HPLC-MS 50/100 83,2 Diazepam [24] Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,02/0,07 81,2 – 118 - [25] Sangue total (1 mL) SPE GC-MS/MS 3,3/9,9 87 Trimipramina-d3 [27] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 0,66/5,00 85 – 93 Diazepam-d5 [28] Soro

(1mL) MAE HPLC-DAD 20/60 94,4 Clomipramina

[29] Saliva (1mL) SPE HPLC-MS/MS - /5 87,4 Nortriptilina-d3 [30] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 5/50 93 – 95 - [31] Maprotilina Plasma (1 mL) SPE HPLC-MS 150/200 89,2 Diazepam [24] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 0,52/5,00 61 - 82 Diazepam-d5 [28] Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS - /6,7 95 Metabenztiaz urona [33] Sangue

total SPE GC/MS 0,3/1 88 – 94 Protriptilina

[34] Nortriptilina Plasma (1 mL) SPE HPLC-MS 80/150 69,4 Diazepam [24] Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,03/0,10 81,2 – 118 - [25] Humor Vítreo (500µL) LPME GC-MS 1/5 60 – 85 Nortriptilina-d3 [26] Sangue total (1 mL) SPE GC-MS/MS 5,2/15,6 42 Clomipramina -d3 [27] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 0,34/5,00 62 – 83 Diazepam-d5 [28] Soro

(1mL) MAE HPLC-DAD 10/50 95,4 Clomipramina

[29]

Nortriptilina-Introdução geral Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 10/50 86 – 97 - [31] Trimipramina Plasma (1 mL) SPE HPLC-MS 50/100 70,4 Diazepam [24] Sangue total (1 mL) SPE GC-MS/MS 3,1/9,4 81 Trimipramina-d3 [27] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 0,95/5,00 89 - 97 Diazepam-d5 [28] Saliva (1mL) SPE HPLC-MS/MS -/5 81,6 Nortriptilina-d3 [30] Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS -/3,3 99 Metabenztiaz urona [33] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 5/50 91 – 99 - [31]

Tabela 5 - Métodos analíticos para a determinação de inibidores seletivos da recaptação da serotonina

Analito Matriz (volume) Prep. da amostra Cromatografia e deteção LD/LQ (ng/mL) Recuperação % PI Ref.

Inibidores seletivos da recaptação da serotonina

Citalopram Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,04/0,11 81,2 – 118 - [25] Soro SPE GC-MS 4,7/15,6 65 – 85 - [32] Plasma SPE GC-MS 4,7/15,6 50 – 83 - [32] Sangue total SPE GC-MS 4,7/15,6 58,7 – 90 - [32] Sangue total (1 mL) SPE GC-MS/MS 5,0/15,2 88 Clomipramina -d3 [27] Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS - /1,00 98 Metabenztiaz urona [33] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 5/50 92 – 99 - [31] Águas SPE UHPLC- 0,12/0,50 81,2 – 118 - [25]

Introdução geral Plasma (500µL) UA-DLLME UPLC-PDA 5/17 96 - [35] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 1,46/5,00 82 – 91 Diazepam-d5 [28] Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS - /1,17 100 Metabenztiaz urona [33] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 50/400 85 – 98 - [31] Paroxetina Plasma (1 mL) SPE HPLC-MS 50/100 87,6 Diazepam [24] Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,05/0,16 81,2 – 118 - [25] Sangue total (1 mL) SPE GC-MS/MS 9,3/28,2 53 Clomipramina -d3 [27] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 1,22/5,00 63 – 80 Diazepam-d5 [28] Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS -/1,07 104 Metabenztiaz urona [33] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 50/100 91 – 99 - [31] Sertralina Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,02/0,06 81,2 – 118 - [25] Plasma (500µL) UA-DLLME UPLC-PDA 4/13 94 – 103 - [35] Soro SPE GC-MS 7,5/25,0 10,9 – 30,4 - [32] Plasma SPE GC-MS 7,5/25,0 9,3 – 27,3 - [32] Sangue total SPE GC-MS 7,5/25,0 10,9 – 29,1 - [32] Sangue total (1 mL) SPE GC-MS/MS 9,7/29,3 49 Clomipramina -d3 [27] Saliva (1mL) SPE HPLC-MS/MS -/5 51,4 Fluoxetina-d6 [30] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 10/50 86 - 93 - [31]

Tabela 6 - Métodos analíticos para a determinação de inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina e da serotonina Analito Matriz (volume) Prep. da amostra Cromatografia e deteção LD/LQ (ng/mL) Recuperação % PI Ref.

Inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina e da serotonina

Venlafaxina Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,03/0,09 81,2 – 118 - [25] Plasma (500µL) UA-DLLME UPLC-PDA 4/13 97 – 106 - [35] Plasma (500µL) SPE HPLC-MS -/2 106 Remoxipride [36] Sangue SPE GC-MS/MS 9,3/28,3 98 Trimipramina- [27]

Introdução geral (1 mL) Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS -/12,7 98 Metabenztiaz urona [33] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 5/50 94 – 99 - [31]

Tabela 7 - Métodos analíticos para a determinação de outros antidepressivos

Analito Matriz (volume) Prep. da amostra Cromatografia e deteção LD/LQ (ng/mL) Recuperação % PI Ref. Outros antidepressivos Mianserina Plasma (1 mL) SPE HPLC-MS 50/100 102,4 Diazepam [24] Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,04/0,14 81,2 – 118 - [25] Sangue total (1 mL) SPE GC-MS/MS 3,9/11,7 82 Trimipramina-d3 [27] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 0,51/5,00 90 – 97 Diazepam-d5 [28] Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS - /2,20 98 Metabenztiaz urona [33] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 50/50 88 – 96 - [31] Mirtazapina Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,02/0,06 81,2 – 118 - [25] Plasma (500µL) UA-DLLME UPLC-PDA 4/12 102 – 110 - [35] Soro SPE GC-MS 2,5/8,3 79 – 91 - [32] Plasma SPE GC-MS 2,5/8,3 74,4 – 97,8 - [32] Sangue total SPE GC-MS 2,5/8,3 80 – 89,6 - [32] Sangue total (1 mL) SPE GC-MS/MS 3,3/10,0 84 Clomipramina -d3 [27] Sangue

Introdução geral

Tabela 8 - Métodos analíticos para a determinação de antipsicóticos tricíclicos ou clássicos

Analito Matriz (volume) Prep. da amostra Cromatografia e deteção LD/LQ (ng/mL) Recuperação % PI Ref.

Antipsicóticos tricíclicos ou clássicos

Ciamemazina Plasma (250µL) MEPS GC-MS/MS 1/4 73 – 88 Cloropromazi na-d3 [38] Sangue total (200µL) SPE GC-MS/MS - /12,5 44 – 45 Ciamemazina -d6 [39] Cloropromazin a Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,01/0,03 81,2 – 118 - [25] Sangue total (100 µL) LLE HPLC-MS/MS - /10 86 – 91 Haloperidol-d4 [40] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 0,39/5,00 68 – 75 Diazepam-d5 [28] Plasma (500µL) LLE UHPLC-MS/MS 11,3/15,0 - Trimipramina-d3 [41] Saliva (1mL) SPE HPLC-MS/MS - /5 59,4 Fluoxetina-d6 [30] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 50/100 92 - 111 - [31] Levomepromaz ina Plasma (250 µL) PP UHPLC-MS/MS - / 1 75 – 78 Levomeprom azina-d6 [42] Sangue total (100 µL) LLE HPLC-MS/MS - /1 85 – 91 Haloperidol-d4 [40] Plasma (500µL) LLE UHPLC-MS/MS 7,5/7,5 - Trimipramina-d3 [41] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 0,74/5,00 78 – 80 Diazepam-d5 [28] Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS - /0,47 100 Metabenztiaz urona [33]

Tabela 9 - Métodos analíticos para a determinação de antipsicóticos heterocíclicos ou atípicos

Analito Matriz (volume) Prep. da amostra Cromatografia e deteção LD/LQ (ng/mL) Recuperação % PI Ref.

Antipsicóticos heterocíclicos ou atípicos

Amissulprida Soro (200µL) LLE UHPLC-MS/MS 0,3/ - 86,8 Amissulprida-d5 [43] Sangue total (100 µL) LLE HPLC-MS/MS - /10 68 – 72 Haloperidol-d4 [40] Plasma (500µL) LLE UHPLC-MS/MS 37,5/50,0 - Norclozapina-d8 [41] Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS - /28,3 106 Clonidina [33] Sangue

total SALLE

UPLC-QTOF-MS 1/50 97 – 99 -

Introdução geral Clozapina Soro (200µL) LLE UHPLC-MS/MS 0,5/ - 86,8 Clozapina-d8 [43] Águas residuais SPE UHPLC-MS/MS 0,01/0,04 81,2 – 118 - [25] Soro SPE GC-MS 7,5/25 46,2 – 60,0 - [32] Plasma SPE GC-MS 7,5/25 41,1 – 47,4 - [32] Sangue total SPE GC-MS 7,5/25 40,7 – 50,4 - [32] Plasma (500µL) SPE HPLC-MS - /2 102 Remoxipride [36] Sangue total (100 µL) LLE HPLC-MS/MS - /10 98 – 108 Haloperidol-d4 [40] Plasma (500µL) LLE UHPLC-MS/MS 112,5/150 - Trimipramina-d3 [41] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 5/50 98 – 118 - [31] Haloperidol Plasma (250 µL) PP UHPLC-MS/MS - / 0,2 85 – 91 Haloperidol-d4 [42] Soro (200µL) LLE UHPLC-MS/MS 0,1/ - 86,8 Haloperidol-d4 [43] Sangue total (100 µL) LLE HPLC-MS/MS - /1 99 – 110 Haloperidol-d4 [40] Plasma (500µL) LLE UHPLC-MS/MS 3,8/5,0 - Trimipramina-d3 [41] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 0,75/5,00 91 – 101 Diazepam-d5 [28] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 5/50 88 – 95 - [31] Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS - /0,47 100 Metabenztiaz urona [33] Melperona Sangue total (100 µL) LLE HPLC-MS/MS - /10 90 - 104 Haloperidol-d4 [40] Soro (100 µL) PP HPLC-MS/MS - /6,7 100 Metabenztiaz urona [33] Plasma (500µL) LLE UHPLC-MS/MS 18,8/25,0 - Zolpidem-d6 [41] Soro

Introdução geral Sangue total (100 µL) LLE HPLC-MS/MS -/10 102 – 107 Haloperidol-d4 [40] Plasma (500µL) LLE UHPLC-MS/MS 26,3/35,0 - Trimipramina-d3 [41] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 0,59/5,00 97 – 98 Diazepam-d5 [28] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 1/50 89 – 99 - [31] Risperidona Soro (200µL) LLE UHPLC-MS/MS 0,1/ - 86,8 Risperidona-d4 [43] Sangue total (1g) LLE LC-MS/MS - 86 Haloperidol-d4 [7] Sangue total (100 µL) LLE HPLC-MS/MS -/1 103 – 108 Haloperidol-d4 [40] Plasma (500µL) LLE UHPLC-MS/MS 1,9/2,5 - Citalopram-d6 [41] Sangue total (500 µL) QuEChE RS LC-MS/MS 1,19/5,00 95 – 99 Diazepam-d5 [28] Sangue total (100 µL) SALLE UPLC-QTOF-MS 1/50 90 – 98 - [31] Tiaprida Plasma (1 mL) SPE HPLC-PDA-FL -/8.24pmol ml-1 89 – 94 Sulpiride [45] Tecido cerebral (100 mg) SPE-PP-hibrido HPLC-MS/MS - / 2ng g -1 _- Haloperidol-d4 [46] Plasma (1000 µL) LLE HILIC-MS/MS - /1 96 – 97 Metoclopera mida [47]

3.2. Métodos de preparação de amostras biológicas

Uma vez que as amostras biológicas são muitas vezes difíceis de analisar devido à complexidade da matriz, a preparação da amostra é uma parte essencial do procedimento analítico. O isolamento e/ou pré-concentração de analitos com elevada recuperação produz, numa situação ideal, amostras limpas com reduzidos níveis de interferentes. A escolha do método aplicado à análise quantitativa de psicofármacos e metabolitos em matrizes biológicas (por exemplo, sangue, urina, tecidos, etc.) é influenciada por muitas variáveis, incluindo a estabilidade das amostras, a pureza da amostra a ser injetada, o número necessário de analitos a determinar, o limite inferior de quantificação, a resolução cromatográfica, entre outras[48]_.

Um dos problemas associados a amostras biológicas é a instabilidade dos fármacos, metabolitos e pro-fármacos, sendo por isso imperativa a conservação da amostra. A

Introdução geral

estabilidade pode ser condicionada pela temperatura de armazenamento, enzimas, pH, anticoagulante e ciclos de congelação. Fármacos e metabolitos muito instáveis podem ser estabilizados por agentes como ácido cítrico em amostras de sangue total, ou tampão fosfato ou citrato em amostras de plasma[49]_.

Previamente à análise das substâncias e dos seus metabolitos é necessário proceder à sua extração das matrizes biológicas, sendo o pré-tratamento da amostra um passo crítico para o sucesso da análise[50]_{. De todos os procedimentos descritos nas tabelas 4 a}

9, como a LPME, MAE, MEPS, PP, QuEChERS, SALLE, SPE e UA-DLLME, a extração que irá posteriormente ser utilizada na parte experimental será a SPE, sendo por isso abordada em maior profundidade.

3.2.1. Extração em fase sólida

A extração em fase sólida (SPE) é uma técnica de extração onde o analito pretendido é retido na fase estacionária, que está inserida num tubo de plástico ou vidro, entre dois filtros, comummente chamada cartucho, enquanto outras entidades químicas não desejáveis, presentes na amostra, atravessam a mesma, ou então, permanecem ligadas irreversivelmente à fase estacionária. O analito é posteriormente eluído, evaporado até à secura e reconstituído na fase móvel[49]_{. Os cartuchos comerciais possuem capacidade de}

1 - 10 mL e são descartados após a utilização[51]_{. Os cartuchos SPE são essencialmente}

de reduzida dimensão e podem conter diferentes tipos de enchimento como C18, C8, C2,

fenil, amino, HLB, polímero, WAX, SAX, WCX e SCX[50]_.

Esta técnica é geralmente utilizada usada para limpar ou purificar uma amostra, removendo interferentes de uma matriz complexa, antes desta ser submetida à análise cromatográfica para quantificação do analito. O protocolo geral, de uma forma simplificada, consiste na aplicação da amostra no enchimento, lavagem de componentes não

Introdução geral

Apesar das desvantagens supracitadas, a SPE é a técnica de preparação de amostra mais utilizada em laboratórios bio-analíticos[49]_{. A SPE apresenta diversas vantagens face}

à tradicional LLE, incluindo uma maior especificidade, a capacidade de obter extratos mais limpos, boa reprodutibilidade, ausência de formação de emulsões e uma redução substancial de volume de solvente utilizado[50]_.

Figura 3 - Passos da Extração em Fase Sólida[51]

3.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A cromatografia líquida, assim como a cromatografia gasosa, estão entre os tipos de separação mais utilizados, contudo, esta é limitada a amostras com compostos não termolábeis e facilmente volatilizados[53]_{. Um sistema de cromatografia líquida de elevada}

performance (HPLC) típico consiste num reservatório de fase móvel, bombas de elevada pressão, um controlador de fluxo, um sistema de injeção da amostra, uma pré-coluna, uma coluna analítica contendo a fase estacionária, um detetor e um sistema de aquisição de dados (Figura 4)[54]_.

Introdução geral

Figura 4 - Esquema de um Cromatógrafo Liquido de Alta Eficiência[54]

Em HPLC, uma amostra líquida é transportada para a coluna cromatográfica por uma fase móvel líquida. A separação é determinada pelas interações analito - fase estacionária, onde se incluem a adsorção líquido-líquido, a troca iónica, a partição líquido-líquido e a exclusão molecular[53]_.

A fase estacionária consiste numa película de líquido que reveste uma camada de partículas de sílica porosa de 3 - 10 µm. Se a fase estacionária for polar, a fase móvel terá que ser um solvente não-polar ou moderadamente polar, e neste caso, estamos na presença de uma cromatografia em fase normal. Na cromatografia de fase reversa, a forma mais comum de HPLC, a fase estacionária é não-polar[53]_.

Quando a separação usa apenas uma fase móvel de composição fixa é chamada de eluição isocrática. Contudo, é difícil encontrar uma fase móvel a uma composição fixa que seja adequada para todos os analitos em análise. Uma fase móvel conveniente para analitos que eluem primeiro, pode levar a longos tempos de retenção para analitos que saem tardiamente. A mudança de composição da fase móvel ao longo do tempo resolve

Introdução geral

ultrarrápido (UFLC). As vantagens da tecnologia UHPLC consistem na capacidade de separar e identificar fármacos e metabolitos com incremento significativo na seletividade e sensibilidade e uma redução significativa no tempo de análise, comparativamente ao HPLC. A técnica de UHPLC tornou-se amplamente utilizada em laboratórios de análise de todas as áreas, desde a alimentar, à da saúde. É uma ferramenta de separação rápida adequada a misturas complexas, que utiliza partículas de dimensão inferior a 2 µm e instrumentação otimizada[55]_.

A cromatografia é uma técnica de purificação que é considerada uma técnica de identificação não-específica, isto é, não fornece a identificação definitiva e objetiva de uma substância. Apesar de os tempos de retenção serem característicos de uma substância em particular, sob um conjunto de condições específicas, é necessário ter uma referência para comparação e identificação. A área correspondente a cada pico pode ser utilizada para a abundância relativa de cada componente. A massa molecular do analito, juntamente com informação estrutural, permite assim uma identificação inequívoca do analito. Desta forma, a espetrometria de massa, que irá ser abordada a seguir, permite a identificação mais definitiva de todos os detetores de HPLC[56]_.

3.3.1. Deteção por espetrometria de massa

A espetrometria de massa consegue dar mais informação que as outras técnicas acerca de um analito, utilizando um menor volume de amostra. A desvantagem da espetrometria de massa (MS) consiste no facto de ser necessário investir mais no equipamento e na formação dos operadores, em comparação com outras técnicas[57]_{. Os}

três componentes básicos de um espectrómetro de massa são uma fonte de ionização, um sistema de análise de iões (analisador) e um detetor. Existem vários tipos de analisadores de massa e fontes de ionização[57]_.

O quadrupolo, como o nome sugere, é um analisador de massa que consiste em quatro barras paralelas cuja potência de corrente contínua é fixa, mas frequência de rádio alternada. Os iões são reunidos e a sua trajetória passa no espaço entre as quatro barras, ao longo destas. O seu movimento depende do campo elétrico aplicado, de modo que, apenas iões com uma m/z definida se vão encontrar em ressonância e assim alcançar o detetor. Todos os outros valores de m/z serão considerados não-ressonantes e vão atingir as barras, logo, não serão detetados. A radiofrequência aplicada pode ser utilizada para selecionar iões com uma m/z específica. Este processo, chamado de SIM, permite passar mais tempo a monitorizar um ião em particular, resultando numa sensibilidade aumentada

Introdução geral

muito reduzida, uma vez que outros iões não são detetados, o que torna o SIM um método frequentemente utilizado para análise quantitativa de elevada sensibilidade[57]_.

O poder da MS pode ser amplificado, colocando analisadores de massa em série. No triplo quadrupolo, utilizado na parte experimental deste trabalho, são utilizados três analisadores. O primeiro quadrupolo é configurado para acelerar iões, de uma m/z definida, para o segundo quadrupolo, onde são fragmentados por impacto com um gás de colisão. O ião selecionado que passa pelo primeiro quadrupolo denomina-se de ião percursor. Os iões provenientes da fragmentação do ião percursor denominam-se iões filho. Nestes casos, a fragmentação produzida é bastante reprodutível. O terceiro quadrupolo é utilizado para monitorizar os iões produzidos e levar os iões até ao detetor (Figura 5). A fragmentação pode ser modificada pela alteração do gás de colisão (árgon, hélio, azoto ou xénon), pela energia dos iões emitidos pelo primeiro quadrupolo, pela temperatura e pela pressão. A MS-MS é uma ferramenta muito eficaz. Se o primeiro ião isolado é o ião molecular, a probabilidade de interferência de outros compostos é muito reduzida, aumentado a certeza da identificação do analito[57]_.

Introdução geral

Parte II