UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
PRISCILA NUNES COSTA
ASSOCIAÇÃO ENTRE NUTRIENTES DA ALIMENTAÇÃO COMPLEMENTAR, FUNÇÃO DA BARREIRA INTESTINAL E ENTEROPATIA AMBIENTAL EM
CRIANÇAS DA COORTE BRASILEIRA DO ESTUDO MAL-ED
NATAL/RN 2019
PRISCILA NUNES COSTA
ASSOCIAÇÃO ENTRE NUTRIENTES DA ALIMENTAÇÃO COMPLEMENTAR, FUNÇÃO DA BARREIRA INTESTINAL E ENTEROPATIA AMBIENTAL EM
CRIANÇAS DA COORTE BRASILEIRA DO ESTUDO MAL-ED
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Orientadora: Prof.ª Drª Bruna Leal Lima Maciel
NATAL/RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Costa, Priscila Nunes.
Associação entre nutrientes da alimentação complementar, função da barreira intestinal e enteropatia ambiental em crianças da coorte brasileira do estudo MAL-ED / Priscila Nunes Costa. - 2019.
74f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Nutrição, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal, RN, 2019.
Orientadora: Prof.ª Drª Bruna Leal Lima Maciel.
1. Nutrição do lactente - Dissertação. 2. Consumo alimentar - Dissertação. 3. Nutrientes - Dissertação. 4. Mucosa intestinal - Dissertação. I. Maciel, Bruna Leal Lima. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 613.221
PRISCILA NUNES COSTA
ASSOCIAÇÃO ENTRE NUTRIENTES DA ALIMENTAÇÃO COMPLEMENTAR, FUNÇÃO DA BARREIRA INTESTINAL E ENTEROPATIA AMBIENTAL EM
CRIANÇAS DA COORTE BRASILEIRA DO ESTUDO MAL-ED
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Nutrição da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Aprovada em 29 de julho de 2019.
Prof.ª Drª Karine Cavalcanti Mauricio de Sena Evangelista Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Nutrição
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________ Profª Drª Bruna Leal Lima Maciel
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN Orientadora
_____________________________________________ Profª Drª Karine Cavalcanti Mauricio de Sena Evangelista
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Membro interno
_____________________________________________ Prof° Drº Armênio Aguiar dos Santos
Universidade Federal do Ceará – UFC Membro externo
A Deus, aos meus pais, ao meu esposo, aos meus familiares e amigos.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me proporcionado a realização deste sonho, por sua infinita bondade e misericórdia e por ter me dado forças para persistir nos momentos de dificuldades e cansaço.
À toda minha família – em especial aos meus pais, meus irmãos e meu esposo - que estiveram sempre ao meu lado.
À professora Bruna Leal Lima Maciel por todo o apoio e orientação no decorrer do estudo.
Aos professores e funcionários do PPGNUT pelos conhecimentos e momentos compartilhados.
Aos colegas de turma por dividir muito além de horas de aula. Com vocês os dias foram mais leves. Em especial, sou grata à Fernanda Lambert, que desde a Residência compartilhou comigo sua amizade, confidências, aflições e alegrias.
A todos que contribuíram para a realização do estudo MAL-ED no Brasil: aos bebês e cuidadores, a toda a equipe de pesquisadores envolvidos e ao apoio da Fundação Bill & Belinda Gates, da Foundation for the National Institutes for Health
(FNIH) e do Fogatory International Center (FIC) (número de concessão OPP47075).
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Agradeço.
RESUMO
A alimentação complementar fornece nutrientes e outras substâncias que influenciam a saúde intestinal. A enteropatia ambiental é uma disfunção intestinal crônica que ocorre no mesmo período que a alimentação complementar, em condições de baixo acesso à higiene e sanitização. Poucos estudos avaliaram se os nutrientes melhoram ou protegem contra a enteropatia embiental. O presente estudo teve como objetivo investigar a associação entre a ingestão habitual de nutrientes da alimentação complementar, função da barreira intestinal e enteropatia ambiental em crianças menores de dois anos. Realizou-se um estudo longitudinal prospectivo, em Fortaleza-CE, com 233 crianças dos 9 aos 15 meses de idade. A ingestão dietética habitual da alimentação complementar foi estimada com base em recordatórios de 24 horas (R24h), aplicados mensalmente dos 9 aos 15 meses de idade. A ingestão habitual dos nutrientes foi ajustada pela variância intrapessoal e pela energia. A adequação nutricional da ingestão de energia, fibra e macronutrientes da dieta foi avaliada pela razão entre o valor ingerido e o recomendado. Para medir a adequação nutricional global de micronutrientes, utilizou-se o índice de adequação média (MAR), construído a partir das razões de adequação de nutrientes (NAR) calculadas para vitaminas (vitamina A, tiamina e folato) e minerais (ferro, zinco e cálcio). A avaliação da função da barreira intestinal foi realizada por meio do teste urinário lactulose/manitol (L:M). A inflamação intestinal foi avaliada pela análise das concentrações fecais de mieloperoxidase (MPO), neopterina (NEO) e alfa-1-antitripsina (AAT). Como indicativo de enteropatia ambiental (EE), calculou-se o EE escore, baseando-se na categorização das distribuições das concentrações dos biomarcadores fecais (MPO, NEO, AAT). Para investigar a associação entre a adequação nutricional e a razão L:M e o EE escore foram usadas regressões lineares múltiplas. As adequações nutricionais se mostraram de acordo com os valores recomendados para todos os nutrientes avaliados, com exceção para a adequação de fibra. Todos os biomarcadores apresentaram valores elevados, indicando um comprometimento da função da barreira intestinal e presença de inflamação intestinal entre as crianças avaliadas. Houve correlação negativa entre a adequação energética e L:M (ρ = -0,19; p < 0,05) e entre a adequação de folato e as concentrações de NEO (ρ = -0,21; p < 0,01). Foi observada uma correlação positiva entre a adequação de tiamina e a concentração de MPO (ρ = 0,22; p < 0,01) e entre a adequação de cálcio
e a concentração de NEO (ρ = 0,23; p < 0,01). Os modelos de regressão demonstraram uma menor ingestão energética foi associada com uma maior razão L:M (β = -0.19, p = 0.02) e uma menor ingestão de fibra foi associada com maior inflamação intestinal (EE escore) (β = -0.20, p = 0.04). Em conclusão, as crianças avaliadas mostraram ingestão adequada para todos os nutrientes, exceto fibra, e apresentaram comprometimento na função da barreira e inflamação intestinais. A maior ingestão energética e de fibras da dieta esteve associada com uma melhor função da barreira intestinal e com menor inflamação intestinal, respectivamente.
Palavras-chave: nutrição do lactente, consumo alimentar, nutrientes, mucosa intestinal.
ABSTRACT
Nutrition during the complementary feeding period provides nutrients and dietary compounds that influence intestinal health. This study aimed to investigate the association between nutrient intake of complementary food and intestinal barrier function in infants under two years of age. A prospective longitudinal study included 233 children aged 9 to 15 months from the Etiology, Risk Factors and Interactions of Enteric Infections and Malnutrition and the Consequences for Child Health and Development (MAL-ED) study, carried out in Fortaleza-CE. The dietary intake of complementary food was estimated based on 24-hour dietary recall (24HR), collected monthly from 9 to 15 months of age. The usual nutrient intake was adjusted by intrapersonal variance and energy. Nutritional adequacy of the energy, fiber, and macronutrients dietary intake was evaluated by the ratio between the value consumed and the recommended one. For the micronutrient adequacy of diet, the mean adequacy ratio (MAR) was constructed from the nutrient adequacy ratios (NAR) calculated for vitamins (vitamin A, thiamine and folate) and minerals (iron, zinc, and calcium). The evaluation of intestinal barrier function was determined by the lactulose/mannitol urinary ratio (L:M). Myeloperoxidase (MPO), neopterin (NEO) and alpha-1-antitrypsin (AAT) concentrations were measured in stool samples to indicate gut immunity and permeability. As an indicator of environmental enteropathy (EE), the EE score was calculated, based on the categorization of the three fecal biomarkers concentrations (MPO, NEO, AAT) distributions. To investigate the association between energy and nutrient intake and intestinal biomarkers multiple linear regressions were used. Nutritional adequacy was high for all evaluated nutrients, except for the fiber intake adequacy. All biomarkers exhibited high values, indicating a compromised intestinal barrier function and the presence of intestinal inflammation among the infants evaluated. There was a negative correlation between energy adequacy and L: M (ρ = -0.19, p <0.05) and between folate adequacy and NEO concentrations (ρ = -0.21, p <0.01). However, a positive correlation between thiamine adequacy and MPO concentration (ρ = 0.22, p <0.01) and between calcium adequacy and NEO concentration (ρ = 0.23; p < 0.01). The results from the regression models showed that higher energy intake was associated with a lower L: M ratio (β = -0.19, p = 0.02) and that higher fiber intake was associated with lower intestinal inflammation (β = -0.20, p = 0.04). In conclusion, the infants showed nutrient intakes higher than the recommended dietary allowance (on the exception of fiber), impaired intestinal barrier
function and intestinal inflammation. The higher energetic and fiber intakes were associated with a better intestinal barrier function and lower intestinal inflammation, respectively.
Key words: infant, complementary feeding, nutrients, intestinal mucosa Intestinal Diseases; Environmental Microbiology;
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Fluxograma de inclusões, perdas e coleta de dados da população estudada Figura 2 – Representação esquemática simplificada dos componentes da barreira intestinal
Figura 3 – A esquematização simplificada da localização das junções celulares em células epiteliais intestinais justapostas. B: esquematização da composição das proteínas das TJ
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Características gerais, função da barreira intestinal e biomarcadores de inflamação intestinal em crianças do estudo MAL-ED, Fortaleza-CE, Brasil
Tabela 2 – Ingestão e adequação nutricional da alimentação complementar, dos 9 aos 15 meses (n = 233) de crianças do estudo MAL-ED, Fortaleza-CE, Brasil
Tabela 3 – Correlação entre biomarcadores da função da barreira intestinal, biomarcadores de inflamação intestinal, EE escore e adequação nutricional da alimentação complementar
Tabela 4 – Modelos de regressão linear múltipla para a função da barreira intestinal e enteropatia ambiental, em crianças aos 15 meses de idade, de acordo com fatores determinantes
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGCC Ácidos Graxos de Cadeia Curta AGCR Ácidos Graxos de Cadeia Ramificada AMPs Antimicrobial Peptides
AR Ácido Retinóico
ATRA Ácido all-trans Retinóico Ca++ Cálcio iônico
DCs Dendritic Cells
EE Environmental Enteropathy
GALT Gut-Associated Lymphoid Tissue
IEDCs Intraepithelial Dendritic Cells
JAM Junctional Adhesion Molecule
L:M Lactulose:Manitol LPS Lipopolissacarídeos MPO Mieloperoxidase MS Ministério da Saúde NEO Neopterina NK Natural Killers
OMS Organização Mundial de Saúde
TJ Tight Junctions
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 15 2. OBJETIVOS ... 17 2.1. OBJETIVO GERAL ... 17 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 17 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 18 3.1. ALIMENTAÇÃO COMPLEMENTAR ... 18
3.2 BARREIRA E IMUNIDADE INTESTINAIS ... 20
3.3 NUTRIENTES, BARREIRA E IMUNIDADE INTESTINAIS ... 24
3.3.1 Energia e Macronutrientes ... 24
3.3.2 Micronutrientes ... 27
3.4 ENTEROPATIA AMBIENTAL (EE): CARACTERÍSTICAS, BIOMARCADORES E INTERFACE COM NUTRIENTES ... 30
4 METODOLOGIA ... 36
4.1 APROVAÇÃO ÉTICA ... 36
4.2 TIPO E PERÍODO DO ESTUDO ... 36
4.3 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ... 36
4.4 COLETA DE DADOS ... 37
4.5 ALEITAMENTO MATERNO E STATUS SOCIOECONÔMICO ... 38
4.6 AVALIAÇÃO DA INGESTÃO NUTRICIONAL ... 39
4.7 AVALIAÇÃO DA ADEQUAÇÃO NUTRICIONAL ... 40
4.8 AVALIAÇÃO DE FUNÇÃO DA BARREIRA E DE INFLAMAÇÃO INTESTINAIS ... 40 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 42 5 RESULTADOS ... 44 6 DISCUSSÃO ... 48 7 CONCLUSÃO ... 54 8 TRAJETÓRIA ACADÊMICA ... 55 9 REFERÊNCIAS ... 57
ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa ... 72
1. INTRODUÇÃO
Nos primeiros anos de vida, as práticas alimentares podem trazer consequências à saúde do indivíduo em curto, médio e longo prazo1. Recomenda-se o aleitamento materno exclusivo até os seis meses de idade e, a partir de seis meses, faz-se necessária a introdução de alimentos complementares, uma vez que antes desse período o leite materno é capaz de suprir todas as necessidades nutricionais do bebê2–4. A introdução da alimentação complementar nutricionalmente adequada é importante para evitar inadequações na ingestão de nutrientes, as quais comprometem o estado nutricional e podem levar carências ou excessos nutricionais5. A influência do aleitamento materno sobre o sistema imunológico, maturação da integridade e sistema imune intestinais e redução de infecções é um assunto bastante investigado6. Contudo, poucos estudos avaliaram o papel dos nutrientes provenientes daalimentação complementar nesse sentido. Tendo em vista, a importância da dieta na função intestinal, a alimentação complementar representa um período com potencial influência sobre proteção da barreira intestinal7–10.
Diversos componentes da dieta como macronutrientes, fibras, vitaminas e minerais têm sido associados à função da barreira intestinal. A glutamina, por exemplo, é responsável por manter a integridade intestinal, supressão da sinalização de via pró-inflamatórias e proteção contra apoptose e estresse celular9,11. Em crianças, a glutamina melhorou a função da barreira intestinal e o estado nutricional antropométrico11. As fibras são outro componente dietético que podem atuar na função da barreira e nas vias de inflamação intestinais8,10,12,13. A maior parte desses efeitos são atribuídos aos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), que são produzidos pela fermentação de fibras pela microbiota intestinal12,14. Os AGCC são essências para a proteção, reparo e possuem efeitos anti-inflamatórios sobre a função da barreira intestinal10,12,14.
Apesar de alguns micronutrientes mostrarem ter relação com a função da barreira intestinal, como vitamina A, zinco, ferro, a maioria dos achados é proveniente de estudos experimentais em modelos com animais ou células, em que os nutrientes foram avaliados isoladamente15–17.
Uma condição comum durante o período da alimentação complementar é o aumento da incidência de infecções entéricas e diarreia a partir do segundo semestre de vida, justamente quando a ingestão de alimentos complementares é iniciada18–20. Infecções entéricas de repetição ou subclínicas podem trazer danos à
barreira intestinal, produzindo uma condição denominada “enteropatia ambiental” (Environmental Enteropathy, EE)21. A EE é caracterizada por inflamação da mucosa intestinal, alteração na função da barreira intestinal e inflamação sistêmica crônica22. O déficit no crescimento infantil é o desfecho mais amplamente investigado da EE23,24. No entanto, a EE também está associada, em curto e médio prazo, ao
impacto negativo sobre as respostas às vacinas 25 e desenvolvimento cognitivo 26 e, em longo prazo, ao aumento no risco de obesidade, diabetes do tipo 2, síndrome metabólica e doenças cardiovasculares27,28.
Biomarcadores não invasivos vêm sendo estudados quanto ao seu potencial uso no diagnóstico e tratamento em diversas condições de alteração na integridade da barreira intestinal e/ou de inflamação intestinal crônica, como na
EE29,30. Dentre os biomarcadores não invasivos utilizados no estudo da EE estão: os
biomarcadores urinários indicativos de distúrbio na função da barreira intestinal (como o teste lactulose:manitol), os biomarcadores fecais para a avaliação da inflamação intestinal (como a neopterina e a mieloperoxidadase) e para investigar alteração na permeabilidade intestinal e perda proteica intestinal (alfa-1-antitripsina, por exemplo)31.
As concentrações fecais de mieloperoxidase, neopterina e alfa-1-antitripsina e o teste urinário lactulose:manitiol são influenciados pela carga de enteropatógenos, condições de saneamento e higiene e pelo status
socioeconômico20,32,33. Contudo, não está claro se e/ou até que ponto a ingestão de nutrientes da dieta poderia melhorar ou não a função da barreira e inflamação intestinais na EE.
Apesar do potencial efeito dos nutrientes sobre a função da barreira e inflamação intestinais, características da EE, poucos estudos avaliaram a associação entre a ingestão de nutrientese os biomarcadores de EE, no contexto da alimentação complementar. Diante disso, ressalta-se a importância da investigação das associações entre a ingestão de nutrientes da alimentação complementar, período de risco para o desenvolvimento de EE, e os biomarcadores de função da barreira e inflamação intestinais em crianças.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Investigar as associações entre a ingestão de nutrientes da alimentação complementar e a função da barreira intestinal e EE em crianças dos 9 aos 15 meses de idade da coorte brasileira do estudo MAL-ED.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estimar a ingestão habitual de energia, fibras, macronutrientes e micronutrientes na população estudada;
Analisar a adequação de energia, fibras, macronutrientes e micronutrientes provenientes da alimentação complementar nas crianças em estudo;
Avaliar a função de barreira intestinal e a presença de EE nas crianças estudadas;
Avaliar as associações da adequação energética, de fibras, macro e micronutrientes com a função de barreira intestinal e a presença de EE na população estudada.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. ALIMENTAÇÃO COMPLEMENTAR
A nutrição adequada durante os dois primeiros anos de vida é essencial para assegurar que o crescimento físico, a saúde e o desenvolvimento neurológico da criança possam atingir seu pleno potencial4,34. Uma alimentação adequada é também importante para evitar inadequações na ingestão de nutrientes, que levam a carências ou excessos nutricionais e comprometem o estado nutricional5.
O Ministério da Saúde do Brasil2, em conformidade com as orientações da Organização Mundial da Saúde3,4, recomenda a prática do aleitamento materno exclusivo desde o nascimento até os 6 meses de vida e, após esse período, uma alimentação complementar nutricionalmente adequada e segura associada à amamentação até os 2 anos ou mais.
Amamentação exclusiva significa que uma criança recebe apenas leite materno, direto da mama ou ordenhado, ou leite humano de outra fonte, sem outros líquidos ou sólidos (incluindo água), com exceção de gotas ou xaropes contendo vitaminas, suplementos minerais ou medicamentos3,34. A alimentação complementar é definida como o processo que começa quando o leite materno não é suficiente para atender às necessidades infantis e, por tanto, outros alimentos e líquidos são necessários, juntamente com o leite materno2,4,34. A faixa alvo da alimentação complementar é de 6 a 24 meses, embora a amamentação possa continuar além dos 2 anos2,4,34. Portanto, o período da alimentação complementar fornece uma janela de oportunidade para prevenir a desnutrição, incluindo a baixa estatuda e baixo peso, como também para a prevenção do excesso de peso, obesitade e co-morbidades relacionadas34,35.
Durante o período da alimentação complementar, a avaliação da adequação da ingestão de nutrientes em relação às recomendações preconizadas é importante, tendo em vista que a necessidade nutricional está aumentada devido a fatores fisiológicos, como o rápido crescimento e a capacidade gástrica limitada, mas também a fatores patológicos, como a exposição frequente a patógenos36,37. Essas cituações aumento o risco da ocorrência de inadequações na ingestão nutricional36,37. Em diferentes populações, tem-se observado inadequações na ingestão de alguns nutrientes provenientes da alimentação complementar, o que pode levar ao desenvolvimento de deficiências nutricionais37–41. Em estudo sobre as tendências
globais da qualidade da dieta entre 1961 e 2011, Beal et al41 observaram que, como um todo, a prevalência de ingestão inadequada de micronutrientes em todo mundo foi acentuadamente reduzida nos últimos 50 anos, apesar de ainda ser uma realidade em alguns países do sul da Ásia e na África subsaariana. Na América Latina, os micronutrientes com maior prevalência estimada de ingestão inadequada em 2011 foram cálcio, vitamina A, folata, ferro, e zinco41. Os autores ainda observaram que a fortificação com micronutrientes em alimentos na América Latina aumentou muito a ingestão de folato e ferro e aumentou moderadamente a ingestão de vitamina A, zinco e tiamina41.
Em relação ao cenário da ingestão nutricional no Brasil, em menores de 5 anos, Carvalho et al5 em revisão sistemática observaram que a maioria dos estudos apontaram para elevadas frequências na inadequação de micronutrientes, sobretudo ferro, folato e zinco. No entanto, quando se avalia atentamente a metodologia empregada nesses estudos, apenas cinco utilizaram em sua metodologia a ajuste da ingestão de nutrientes pela variabilidade intraindividual. Desses cinco, somente dois incluíram crianças no período da alimentação complementar (6 aos 24 meses)42,43. Ambos encontraram que a ingestão de energia e da maioria dos micronutrientes foi maior do que os valores recomendados. No entanto, um estudo encontrou inadequação na ingestão de zinco e ferro42 e no outro inadequação para vitamina E, ferro e folato43. Tais diferenças na ingestão podem ter sido atribuídas aos fatores característicos do consumo alimentar e por diferenças regionais entre as populações avaliadas.
O consumo alimentar de indivíduos e populaçãoes é marcado pela variabilidade da dieta e, consequentemente, de nutrientes44,45. Mesmo em uma dieta monótona, situações como o dia a dia, o dia da semana, a sazonalidade, tamanho das porções e tipo de alimentos contribuem para a variabilidade diária44,45. Essa variabilidade do dia a dia em relação à ingestão de nutrientes pode ser ajustada por métodos estatísticos, quando se tem informações da ingestão de nutrientes por pelo menos 2 dias45,46. Essencialmente, quanto maior a variabilidade intraindividual maior a necessidade de repetições requeridas para aumentar o nível de precisão da análise45. Assim, deve-se fazer o ajuste pela variabilidade intraindividual quando se quer avaliar a adequação de energia ou nutrientes em relação aos valores recomendados e para avaliar as associações entre a ingestão de nutrientes e o estado de saúde44,45.
As deficiências de micronutrientes têm sido associadas como fator de importante contribuição para a carga global de doenças infecciosas, especialmente em crianças 47,48. Ferro, vitamina A e zinco são os micronutrientes mais estudados, que têm se mostrado capazes de influenciar os mecanismos de resistência do hospedeiro, associando-se à morbidade e mortalidade relacionadas às infecções em crianças48. Dentre essas infecções, as infecções entéricas são importantes determinantes da saúde infantil, tendo em vista que as doenças diarreicas são a quarta principal causa de óbito em menores de cinco anos no mundo49.
Dada a importância do trato gastrointestinal para a defesa do hospedeiro50, esse processo é ainda mais crítico até o segundo ano de vida, uma vez que a barreira da mucosa e os componentes imunológicos intestinais estão em processo de desenvolvimento51.
3.2 BARREIRA E IMUNIDADE INTESTINAIS
O trato gastrointestinal compreende a maior interface entre o ambiente interno humano e o ambiente externo52. O sistema imunológico intestinal evoluiu para distinguir as diferenças moleculares existentes entre microrganismos patogênicos e não-patogênicos, além de manter a tolerância a antígenos alimentares50. Portanto, no trato gastrointestinal, o sistema imunológico contribui para a prevenção de alergias alimentares e para a manutenção do delicado equilíbrio existente entre bactérias, fungos, bacteriófagos e o epitélio intestinal para garantir a homeostase e saúde ótima do organismo50.
Histologicamente, o trato gastrointestinal em toda sua extensão é constituído por quatro camadas principais (a partir do lúmen): mucosa (epitélio, tecido conectivo e músculo liso), submucosa (tecido conectivo), muscular (músculo liso) e adventícia ou serosa (tecido conectivo)50. Enquanto que a camada da mucosa do intestino delgado é caracterizada pela presença de vilos (longas projeções digiformes do epitélio intestinal para o lúmen) e criptas de Lieberkühn (invaginações do epitélio intestinal entre os vilos), na mucosa do intestino grosso, os vilos estão ausentes50.
A barreira intestinal representa uma estrutura heterogênea complexa, possuindo componentes celulares e extracelulares (Figura 1). A parte celular é definida pelo epitélio intestinal e a lâmina própria, que é a parte de tecido conectivo adjacente ao epitélio e contém a maior parte das células imunológicas50,53. O epitélio
intestinal consiste em uma camada única contínua de células epiteliais justapostas especializadas que compõem uma barreia seletivamente permeável incluindo enterócitos, células enteroendócrinas, células de Globet, células M (microfold cells), células de Tuft, células de Paneth e células-tronco intestinais adultas (Lgr5+)50,54. A parte extracelular é constituída por uma camada de muco produzido pelas células de Globet, pelos peptídeos antimicrobianos (AMPs, antimicrobial peptides) secretados pelas células de Paneth e pelos dímeros IgA liberados por células B. As células imunes do intestino estão localizadas dentro do tecido linfoide ligado à mucosa (GALT,
gut-associated lymphoid tissue), dentro da lâmina própria e submucosa intestinais ou
estão distribuídos de maneira difusa pelo epitélio e lâmina própria. Dentre as células imunológicas intestinais, estão células linfoides inatas, macrófagos, células dendríticas (DCs, dendritic cells), DC intraepiteliais (IEDCs, intraepithelial DCs), linfócitos intraepiteliais, células B, células T, células Natural killers (NK), neutrófilos, eosinófilos e mastócitos50,54.
Figura 1. Representação esquemática simplificada dos componentes da barreira intestinal. Fonte: Mowat; Agace55.
Uma característica importante da barreira intestinal é a sua capacidade de permeabilidade seletiva, que permite absorção eficiente de nutrientes e água dos alimentos, ao mesmo tempo que evita a entrada de microrganismos invasores, toxinas e antígenos dietéticos53,56. A permeabilidade intestinal é definida como uma
característica funcional da barreira intestinal, se refere à via para celular (difusão passiva), que é regulada principalmente pelas tight junctions (TJ) e permite a passagem de moléculas menores que 600 daltons53. As substâncias podem atravessar o epitélio intestinal por duas vias: a via transcelular – na qual uma substância passa por dentro do enterócito – e a via paracelular – em que a substância passa entre as junções celulares entre células vizinhas53,57. As junções celulares incluem as TJ, as junções aderentes, os desmossomos e as gap jucntions (Figura 2)57. As TJ controlam a permeabilidade paracelular do epitélio intestinal, se localizam perto da superfície apical e interconectam células epiteliais adjacentes (Figura 2). As TJ permitem a difusão seletiva de fluidos, eletrólitos e pequenas moléculas através do espaço paracelular, ao mesmo tempo em que fornecem uma barreira altamente seletiva para moléculas maiores, regulando assim a permeação paracelular de íons e outras moléculas53,57. As junções aderentes estão envolvidas na adesão célula-célula e na sinalização intracelular. Outras junções epiteliais basolaterais incluem os desmossomos e as junções comunicantes, que estão envolvidas na adesão célula-célula e na comunicação intracelular, respectivamente57.
As TJ são constituídas por proteínas transmembrana como as ocludinas, caludinas, proteínas junctional adhesion molecule (JAM), as tricelluin e as proteínas de estrutura celular - como as zonula ocludens (ZO), ZO-1, -2 e -3 – as quais interagem com outras proteínas, incluindo actina e citoesqueleto (Figura 3)57.
Figura 2. A: esquematização simplificada da localização das junções celulares em células epiteliais intestinais justapostas. B: esquematização da composição das proteínas das TJ. TJ=Tight Junctions. ZO=zonula occludens. Fonte: Wells et al57.
A permeabilidade intestinal pode ser mensurada pela análise de taxas de fluxo através da parede intestinal como um todo ou pela análise de moléculas específicas53. A avaliação pode ser feita in vivo pelo fluxo de isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano, peso molecular) através do epitélio intestinal e recuperação no sangue53. No entanto, esse método não pode ser aplicado a seres humanos defido aos potenciais efeitos adversos graves do dextrano53. Em humanos, a permeabilidade intestinal é classicamente expressa pela razão entre a fração de excreção urinária de um açúcar grande como a lactulose para um açúcar de tamanho pequeno, como manitol ou raminose53,58. Quanto maior essa proporção, razão lactulose/manitol (L:M), maior a permeabilidade intestinal53,58.
Muitos fatores podem alterar a permeabilidade intestinal, como modificações na microbiota intestinal, alterações na camada de muco, danos epiteliais e infecções intestinais por patógenos, resultando na translocação do conteúdo luminal para as camadas internadas da parede intestinal53,54. Além disso, o estilo de vida e os fatores dietéticos, como uso de álcool e o consumo de alimentos com alta densidade energética da dieta do tipo ocidental, podem aumentar a permeabilidade intestinal 54. Uma disfunção na barreira intestinal está associada ao aumento nas vias de sinalização inflamatória e aumento da permeabilidade intestinal, que por sua vez facilita a translocação antígenos alimentares e bacterianos (como lipopolissacarídeos, LPS) através da mucosa intestinal, resultando em uma perturbação nas respostas imunes da mucosa e indução de inflamação local e sistêmica54,59. Por sua vez, as citocinas pró-inflamatórias são capazes de induzir uma desregulação das TJ, levando a um clico vicioso de inflamação54,59. Essa condição de disfunção e inflamação intestinais vem sendo associada a várias doenças e distúrbios locais e sistêmicos54,59. Dentre as condições patológicas que têm como fator comum uma barreira intestinal disfuncional, pode-se citar as infecções por patógenos intestinais, obesidade, doença celíaca, alergias alimentares, doenças autoimunes e inflamatórias crônicas, incluindo doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, diabetes tipo 1, artrite reumatoide e esclerose múltipla54,59–61.
3.3 NUTRIENTES, BARREIRA E IMUNIDADE INTESTINAIS 3.3.1 Energia e Macronutrientes
Os nutrientes são capazes de atuar diretamente sobre várias funções intestinais, incluindo absorção de outros nutrientes, transporte de íons, imunomodulação, crescimento e diferenciação celular62–64. A atuação também pode ocorrer de forma indireta por meio dos compostos produzidos a partir da fermentação de carboidratos, proteínas e lipídeos pela microbiota intestinal, compostos esses que afetam a saúde do hospedeiro65–70.
Em relação ao papel do aporte energético sobre a barreira e imunidade intestinais, a maior parte do conhecimento acumulado vem de modelos em animais, utilizando dietas com restrição calórico-proteicas71–74. Os achados mostram que essas dietas de restrição afetam a estrutura e função do epitélio intestinal, o GALT, a microbiota intestinal e o sistema nervoso entérico. As alterações estruturais da mucosa intestinal incluem diminuição em número, volume e altura dos vilos72 e diminuição da profundidade das criptas intestinais, redução da proliferação de células epiteliais intestinais71, alteração nas proteínas TJ e aumento na permeabilidade intestinal74, prejuízos na digestão e absorção de nutrientes e estímulo de respostas imune intestinais e sistêmicas72,73. Os estudos em animais sugerem que a restrição calórica ou proteica estaria associada à inflamação – com aumento de TNF-α e outras citocinas pró-inflamatórias, diminuição de IgA secretora, da atividade dos macrófagos, da proliferação de células T e atividade das células NK – influenciando a imunidade humoral e celular e estimulando respostas imunes intestinais e sistêmicas73,74.
Os estudos em humanos se concentram no impacto do status nutricional (que reflete a restrição calórico-proteica) sobre a função da barreira intestinal73. Welsh et al75 relataram um aumento significativo na permeabilidade intestinal em pacientes desnutridos, em associação com a ativação de células mononucleares da lâmina própria e enterócitos, levando os autores a concluir que a função da barreira intestinal estava significativamente comprometida nos pacientes desnutridos. Além disso, o déficit no crescimento, uma característica da restrição calórico-proteica em crianças, tem sido associado ao aumento da permeabilidade intestinal avaliada pela razão L:M em crianças com EE em Bangladesh76, Malawi77, Índia78 e em crianças Brasileiras30,79. As fibras alimentares são o tipo de carboidrato mais estudado com relação a capacidade de influenciar a função da barreira intestinal10. Essa atuação pode ocorrer via produção de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), a partir da
fermentação de carboidratos não-digeríveis pela microbiota intestinal10,14. Acetato, proprionato e butirato são os AGCC predominantemente produzidos durante essa fermentação14. Eles servem, especialmente o butirato, como principal fonte energética para as células epiteliais colônicas e influenciam diferentes processos celulares e funções do cólon, como diferenciação celular, apoptose, motilidade colônica e absorção de eletrólitos14,66. Os ACGG são importantes para proteção e reparo da barreira epitelial intestinal12 e possuem ação anti-inflamatória, regulando a inflamação intestinal80. Algumas fibras (como pectina, amido resistente e galacto-oligossacarideos, GOS) podem interagir diretamente com células imunes, atenuando a produção de citocinas pró-inflamatórias em células dendríticas, por exemplo13,81,82. As proteínas influenciam a função da barreira e a inflamação intestinais de diversas formas. Além de servir como substrato para a biossíntese de proteínas, os aminoácidos como triptofano, arginina, glutamina e cisteína são importantes na manutenção do crescimento, estrutura, homeostase e funções das células epiteliais intestinais, como também na regulação das funções da imunidade intestinal7,83. Achados recentes mostram que a privação de glutamina levou a um comprometimento da função de barreira, como evidenciado pelo aumento da permeabilidade intestinal, diminuição da resistência transepitelial e diminuição da expressão das proteínas de junção apertada claudina-1 e ZO-163.
Outra forma de influência das proteínas sobre o intestino seria por meio dos diversos metabólitos produzidos a partir da fermentação de aminoácidos pela microbiota intestinal84. Embora a digestão de proteínas dietéticas e endógenas seja um processo eficiente, proteínas e peptídeos residuais não digeridos que chegam ao intestino grosso podem ser degradados em aminoácidos pela microbiota, sendo convertidos ou fermentados para produzir uma variedade de metabólitos84. Dentre esses metabólitos produzidos estão AGCC, ácidos graxos de cadeia ramificada (AGCR), amônia, sulfeto de hidrogênio, óxido nítrico, poliaminas, compostos fenólicos e indólicos85.
Entre a diversidade dos metabólitos bacterianos produzidos a partir da degradação aumentada de aminoácidos, alguns deles, quando presentes em excesso, parecem ser benéficos (butirato, indol) ou prejudiciais (amônia, sulfeto de hidrogênio, p-cresol) para a mucosa cólica, notadamente em termos de renovação de células epiteliais intestinais, características da membrana de colonócitos e função da barreira intestinal84,86.
Alguns dos benefícios para a saúde da fermentação proteica reduzida estão relacionados à redução de amônia e outros compostos nitrogenados no trato gastrointestinal86. Por outros lado, alguns estudos sugerem que o aumento da fermentação proteica pode ser considerado prejudicial à saúde do trato gastrointestinal, havendo associação com câncer de colorretal, colite ulcerativa e outros distúrbios intestinais graves84–86. No entanto, na presença de carboidratos fermentáveis e bactérias sacarolíticas suficientes, os efeitos prejudiciais desses metabólitos podem ser significativamente reduzidos84.
Com relação aos mecanismos do papel dos lipídeos na função e sistema imune intestinais, uma boa parte dos achados na literatura são provenientes de modelos animais alimentados com dieta hiperlipídica na obesidade e doença inflamatória intestinal62,87.
A dieta hiperlipídica induz disbiose intestinal - englobando mudanças no equilíbrio da composição e redistribuição maciça com bactérias ocupando espaços interespaciais e criptas - associadas a alterações fisiopatológicas precoces, predominantemente no íleo, como inflamação de baixo grau, diminuição da expressão de peptídeos antimicrobianos, produção de muco prejudicada, secreção e espessura da camada e expressão diminuída de TJ88.
Com o tempo, a dieta hiperlipídica induz disbiose intestinal pelo aumento dos níveis lumiais de LPS bacterianos, que após a ativação do receptor TLR-4, desencadeiam a sinalização inflamatória e a secreção de citocinas pró-inflamatórias no intestino delgado89. Este estado inflamatório pode, subsequentemente, exacerbar o rompimento da barreira da camada mucosa e aumentar a permeabilidade epitelial do intestino delgado, criando um ambiente que facilita a passagem de componentes bacterianos (por exemplo, LPS e flagelina) e metabólitos do lúmen intestinal (por exemplo, ácidos biliares secundários) para a circulação e tecidos periféricos87,88. Tais eventos têm sido associados ao posterior desenvolvimento de inflamação sistêmica, obesidade, adiposidade, resistência à insulina e intolerância à glicose, precedendo a hiperglicemia88.
3.3.2 Micronutrientes
Os micronutrientes – especialmente vitamina A, zinco e ferro – presentes na dieta são fatores indispensáveis para manter a integridade do epitélio e promover respostas imunes essenciais para a saúde intestinal7,15. Portanto, supõe-se que a baixa ingestão desses e outros micronutrientes poderia exacerbar a permeabilidade e inflamação intestinais90.
A importância da vitamina A, especialmente seus metabólitos ácido retinóico (AR) e ácido all-trans retinóico (ATRA), na regulação da imunidade intestinal está relacionada a uma gama de eventos imunológicos, incluindo tráfego e diferenciação celular, produção de citocinas e organogênese linfoide15. O AR regula o tráfego celular por meio da indução da expressão de integrina alfa-4-beta-7 (α4β7) e receptor para quimiocina CC tipo 9 (CCR9) em linfócitos, levando ao tropismo intestinal dessas células91. As células epiteliais e as células dendríticas especializadas CD103+ são capazes de sintetizar o AR, estando, assim, relacionadas a esse tropismo celular92. Além do tropismo intestinal dos linfócitos ativados, o AR também está relacionado à diferenciação celular promovendo, por exemplo, em ação conjunta com o fator de transformação do crescimento beta (TGF-β), a diferenciação de células B IgM+ em células que expressão IgA93,94. A diferenciação das células T é influenciada pelo AR, havendo uma diferenciação dessas em células T regulatórias (Tregs), mediada pelas células dendríticas CD103+95. Além disso, também foi demonstrado que o AR melhora a produção de IL-22 por células T γδ e células linfoides inatas, que estão envolvidas na atenuação da inflamação intestinal96.
Outro importante nutriente para a função da barreira intestinal é o zinco, que possui propriedades anti-inflamatória e antioxidante, estando sua deficiência associada ao desenvolvimento de um estado pró-inflamatório no trato gastrointestinal e na circulação sistêmica97.
O zinco é essencial para a manutenção da integridade da barreira intestinal e para o controle da infiltração celular inflamatória no intestino16,98. A depleção de zinco aumenta a permeabilidade intestinal, observada pela redução da resistência elétrica transepitelial (TER) e pela alteração de proteínas TJ e junção aderente, incluindo ZO-1, ocludina, β-catenina e E-caderina – em um modelo de cultura de células humanas do epitélio do intestino delgado, denominado células Caco-216. A suplementação com zinco melhora a integridade da barreira, tendo efeitos sobre os complexos TJ, tanto em modelo Caco-2 quanto em modelo animal98,99. A
suplementação com zinco também é reconhecida por ter efeitos benéficos na doença diarreica – uma das principais causas de morbidade e mortalidade em crianças de países em desenvolvimento – estando associada a redução da gravidade e da duração dos sintomas100,101.
O ferro, por sua vez, também é essencial para a imunidade inata e adaptativa, estando sua deficiência associada ao aumento no risco de infecções, como demonstrado em estudos realizados com animais e em humanos102. Apenas alguns estudos investigaram a influência do ferro sobre a permeabilidade e função da barreira intestinal em humanos. Berant et al 103, observaram que crianças com status deficiente de ferro exibiam aumento da permeabilidade intestinal global, utilizando a razão da excreção urinária de açúcares não absorvíveis como indicador. Dados de um estudo recente sugerem que, em crianças com idade entre 6 e 24 meses, reservas adequadas de ferro poderiam auxiliar na manutenção de uma mucosa intestinal normal17. Nesse estudo, a permeabilidade intestinal foi avaliada pelo teste L:M e foi demonstrada uma associação inversa significativa entre a razão L:M e o status de ferro, indicando que o baixo status de ferro estaria associado a um comprometimento nas TJ do epitélio intestinal, como refletido pela maior absorção paracelular e maior recuperação urinária de lactulose17. Por outro lado, algumas evidências indicam que o excesso de ferro pode ser prejudicial para a saúde gastrointestinal e defesa do hospedeiro, por mecanismos ainda não muito claros104.
Embora sejam menos estudados em comparação à vitamina A, zinco e ferro, as vitaminas do complexo B (como a vitamina B1 e a B9) e o cálcio são outros nutrientes importantes para a função da barreira intestinal e para as respostas imunológicas.
O papel da vitamina B1 (tiamina) na imunidade vem sendo relacionado a sua participação como co-fator enzimático no metabolismo energético das células imunes105,106. Estudos sugerem que o metabolismo energético – particularmente o equilíbrio entre a glicólise e o ciclo de Krebs – está associado ao controle funcional das células imunes, no que agora é referido como imunometabolismo107. No intestino, as células B naïve (IgM+) diferenciam-se em células B IgA+ nas placas de Peyer, por mudança de classe e depois as células B IgA+ se diferenciam em células plasmáticas produtoras de IgA na lâmina própria intestinal108. As células B naïve nas placas de Peyer preferencialmente usam o ciclo de Krebs dependente de vitamina B1 para a geração de ATP. No entanto, uma vez que as células B se diferenciam em células
plasmáticas produtoras de IgA, elas mudam o uso via da glicólise para a geração de ATP para a via catabólica para a produção de anticorpos IgA107. Consistente com a importância da vitamina B1 na manutenção do ciclo de Krebs, camundongos alimentados com uma dieta deficiente em vitamina B1 apresentam manutenção deficiente de células B naïve nas placas de Peyer, com pouco efeito sobre as células plasmáticas produtoras de IgA106. Como as placas de Peyer são os locais primários de indução de respostas IgA antígeno-específicas, a regressão das placas de Peyer induzida pela deficiência de vitamina B1 leva à diminuição das respostas de anticorpos IgA às vacinas orais106.
A vitamina B9 (folato), em sua forma ativa com tetrahidrofolato, é cofator de várias reações metabólicas, tendo um papel crucial na síntese de ácidos nucleicos e proteínas e, portanto, uma ingestão inadequada de folato altera significativamente a resposta imune109. A deficiência de folato altera a competência imunológica e a resistência a infecções e afeta a imunidade mediada por células, reduzindo a proporção de linfócitos circulantes e sua proliferação em resposta à ativação mitogênica. Tal fato, por sua vez, diminui à resistência a infecções109. Estudos recentes com modelos in vitro e in vivo demonstraram que o folato dietético é um fator de sobrevivência para células Treg, sendo observada redução da população das células Treg no intestino delgado em camundongos alimentados com dieta deficiente em vitamina B9110,111. Uma vez que as células Treg desempenham um papel importante na prevenção de respostas imunes excessivas, uma dieta deficiente em vitamina B9 confere maior suscetibilidade à inflamação intestinal110,111. Adicionalmente, Wu et al112 demonstraram que a deficiência de folato prejudicou as funções das células dendríticas, inibindo a diferenciação de células T CD4 + de CD4 + naïve para fenótipos efetores/memória e Foxp3 + regulatórios, especialmente as populações Th1 e Treg.
As concentrações extra e intracelulares de cálcio iônico (Ca++) influenciam a função da barreira e a imunidade intestinais. O cálcio extracelular é crucial para a manutenção da função da barreira do epitélio intestinal, por meio da atuação nas proteínas TJ. Em um modelo de cultura celular, Ma et al113 demonstraram que a incubação de células epiteliais intestinais Caco-2 com uma solução isenta de Ca++ levou ao aumento da permeabilidade intestinal, com alteração estrutural do citoesqueleto das TJ. A sinalização intracelular de Ca++ desempenha um papel fundamental na vida das células dendríticas, atuando como reguladores chave na
resposta imune das células dendríticas, incluindo a ativação, maturação, migração e formação de sinapses imunológicas com células T114. Além disso, a imunossupressão ou desativação da atividade das células dendríticas são transduzidas pela modificação na concentração de Ca++ livre citosólico114.
Vários estudos avaliaram os micronutrientes em situação de suplementação, poucos avaliaram os micronutrientes sob a perspectiva da ingestão a partir de fontes alimentares. Apesar das potenciais associações descritas acima entre os micronutrientes com a função da barreira e imunidade intestinais, são escassos estudos que tenham avaliado longitudinalmente a relação entre a ingestão de micronutrientes com os marcadores de função da barreira e inflamação intestinal, no contexto dos alimentos provenientes da alimentação complementar.
3.4 ENTEROPATIA AMBIENTAL (EE): CARACTERÍSTICAS, BIOMARCADORES E INTERFACE COM NUTRIENTES
As infecções por patógenos intestinais causam impacto na saúde especialmente nos primeiros anos de vida, tendo em vista que as doenças diarreicas são a quarta principal causa de óbito em menores de cinco anos no mundo49. Particularmente entre crianças de países pobres e em desenvolvimento, observa-se um aumento das infecções entéricas a partir do período da introdução dos alimentos da AC18–20.
A ocorrência de infecções entéricas de repetição, com ou sem (subclínicas) a presença de diarreia, leva a danos na barreira intestinal, produzindo uma condição denominada disfunção entérica ambiental ou enteropatia ambiental (Environmental
Enteric Dysfunction, EED, ou Environmental Enteropathy, EE)21, que tem como principal desfecho o déficit no crescimento linear infantil, contudo pode ter outros desfechos em médio e longo prazo22.
A EE caracteriza-se por ser um estado de ativação imune persistente e permeabilidade intestinal alterada decorrente de infecções entéricas frequentes e numerosas, com ou sem a presença de diarreia 21. Entre os desfechos associados à EE em curto e médio prazo estão: impactos negativos sobre respostas a vacinas 25, diminuição do crescimento linear 24,30,31 e desenvolvimento cognitivo 26. Em longo prazo, associam-se à EE o aumento no risco de obesidade, diabetes do tipo 2, síndrome metabólica e doenças cardiovasculares 27.
A EE afeta principalmente crianças que vivem em países pobres e em desenvolvimento, com acesso limitado a alimentos, água de qualidade e saneamento básico 21,115. Estando o Brasil incluído como área de risco, dados recentes apontam para a ocorrência de uma carga substancial de patógenos entéricos presentes nas fezes de crianças do Nordeste Brasileiro79. Nesse mesmo estudo, as infecções subclínicas por enteropatógenos mostraram ser condições comuns nas crianças (tanto nas desnutridas ou não) além de altas concentrações de biomarcadores de inflamação intestinal e sistêmica, sugerindo uma crônica e endêmica EE 79. Resultados de um estudo de coorte multicêntrico, com crianças da América Latina (incluindo o Brasil), África e Ásia, mostraram que a infecção por enteropatógenos foi comumente presente tanto nas amostras de fezes diarreicas quanto nas não-diarreicas das crianças em todos os países analisados 116. E a carga assintomática de enteropatógenos teve importante contribuição no déficit de crescimento infantil 24, situações características da EE21.
As características histológicas típicas da EE incluem infiltração da lâmina própria por linfócitos e plasmócitos, aumento dos linfócitos intraepiteliais (LIE), embotamento das vilosidades e hiperplasia das criptas 21,22,117. Essas alterações histológicas resultam em diminuição da área superficial absortiva das células epiteliais intestinais, perda das enzimas da borda em escova, levando à má absorção de macro e micronutrientes e aumento na permeabilidade a pequenas moléculas22,23,30. Em adição aos achados histológicos e da má absorção, outros componentes da EE são o aumento da permeabilidade intestinal (função de barreira prejudicada), inflamação da mucosa intestinal, translocação microbiana e inflamação sistêmica 22,23,115,118.
Quanto aos biomarcadores de disfunção da barreira e de inflamação intestinais, muitos estudos têm sido realizados com o objetivo de identificar os potenciais indicadores de EE. Idealmente, esses biomarcadores devem poder ser mensurados em fezes, urina ou sangue com significância clínica suficiente para ter o déficit de crescimento como desfecho, ou seja, que possam ser bons preditores do retardo no crescimento consequente à EE 31,118–120. A avaliação de biomarcadores em fezes e urina é particularmente importante e vantajosa para a investigação da saúde intestinal em crianças, por serem testes não invasivos, rápidos, simples e relativamente baratos 29,121.
O biomarcador mais amplamente utilizado para avaliar a função da barreira intestinal na EE é o teste urinário da razão L:M21,58. O teste envolve a ingestão de dois
açucares, a lactulose (peso molecular 342 daltons) e o manitol (peso molecular 182 daltons), sob condições controladas e quantificadas na urina58. Ambos os açúcares não são degradados no trato gastrointestinal superior nem metabolizados após sua absorção, sendo assim, excretados na urina 58. A lactulose é um dissacarídeo que só pode ser absorvido cruzando passivamente entre junções celulares rompidas, por isso a quantidade desse açúcar na urina reflete a permeabilidade intestinal alterada58,122. O manitol é um monossacarídeo que é absorvido através das membranas celulares e entre as junções celulares21. Acredita-se que a inflamação intestinal crie pequenos poros entre as células epiteliais, permitindo a permeação paracelular da lactulose, enquanto a atrofia vilosa reduz a área de superfície epitelial e a absorção de manitol, resultando em um aumento na razão L:M58. Uma maior razão L:M tem sido usada como uma indicação de EE, embora a recuperação dos dois açúcares seja algumas vezes relatada separadamente para desagregar a permeabilidade e a absorção 58,123. A mieloperoxidase (MPO) é um biomarcador de atividade neutrofílica na mucosa intestinal 124. Essa enzima é um dos principais constituintes proteicos dos grânulos primários (azurófilos), especialmente de neutrófilos jovens, que catalisa a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), por isso tem importante papel na fase efetora da resposta imune inata 125. Os produtos da atividade da MPO também podem contribuir para o desenvolvimento de doenças autoimunes e regular positiva ou negativamente a geração de respostas imunes adaptativas 125,126. Sendo assim, concentrações fecais de MPO têm sido avaliadas em condições de inflamação intestinal, como nas doenças inflamatórias intestinais, doença de Crohn e colite ulcerativa127,128 e na EE31,129. Uma das vantagens da análise da MPO fecal na população infantil é que seus níveis não se encontram elevados no leite materno ou nas fezes de crianças amamentadas, assim como a lactoferrina e calprotectina, as quais também são indicativos atividade neutrofílica comumente avaliados 130.
A neopterina (NEO), produzida a partir da guanosina trifosfato na via de síntese da biopterina, é sintetizada e liberada por células fagocitárias ativadas – principalmente macrófagos e células dendríticas – após estimulação com interferon-gamma (IFN-γ) produzido por linfócitos T ativados131. Embora o IFN-γ represente o principal indutor da liberação de NEO, outros mediadores pró-inflamatórios solúveis, incluindo o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-
α
) e componentes bacterianos como lipopolissacarídeos (LPS), também podem atuar como cofatores que promovem sualiberação132. A NEO é um composto notavelmente estável, biologicamente inerte e altamente resistente à proteólise e, portanto, apropriado para testes em fezes132. Por ser um marcador de ativação imune de células T auxiliares 1 (TH1), o potencial uso da NEO na doença inflamatória intestinal133 e na EE 31,129,134 tem sido estudado.
A alfa-1-antitripsina (AAT) é um inibidor sérico de protease, que é liberada durante a inflamação para proteger as células contra as enzimas proteolíticas liberadas pelos neutrófilos durante a infecção 135. Diferentemente de outras proteínas séricas, a AAT é altamente resistente à proteólise intestinal e pode ser excretada intacta nas fezes 136. Na inflamação intestinal, a AAT pode extravasar do soro para o intestino, devido ao aumento da permeabilidade intestinal e, finalmente, ser detectada nas fezes135. Assim, a AAT fecal é utilizada como biomarcador de alteração na permeabilidade intestinal e de enteropatia perdedora da proteínas 137. Várias pesquisas têm avaliado desse biomarcador especialmente em crianças com desordens intestinais, investigando disfunção na permeabilidade intestinal e perda entérica de proteínas plasmáticas 31,79,138–140.
Recentemente, tem-se levantado a hipótese de que a combinação de biomarcadores poderia explicar melhor os déficits de crescimento linear em comparação com um biomarcador único31. O estudo da Etiologia, Fatores de Risco e Interações de Infecções Entéricas e de Desnutrição e suas Consequências para a Saúde e Desenvolvimento infantil (The Etiology, Risk Factors and Interactions of
Enteric Infections and Malnutrition and the Consequences for Child Health and Development, MAL-ED), permitiu a proposição de um “escore composto de EE” (o EE score), que é calculado utilizando os biomarcadores fecais AAT, MPO e NEO31. Dados já publicados mostraram o uso do EE escore como marcador de atividade da doença em crianças com EE em Bangladesh141,142.
Levando em consideração o papel dos nutrientes sobre a função da barreira e imunidade intestinais, estudos foram realizados avaliando as associações entre os biomarcadores de EE e os nutrientes. De modo geral, os estudos foram realizados em crianças com infecções entéricas diarreicas, avaliando os biomarcadores de EE em relação ao status de determinados micronutrientes como também após a suplementação com micronutrientes.
A suplementação com vitamina A tem sido associada à redução da permeabilidade intestinal143–145. Em estudo prospectivo, randomizado, duplo-cego, controlado por placebo, Lima et al143 observaram que a prevalência de infecções
parasitárias, especialmente por Giardia spp., foi significativamente menor no grupo de crianças suplementadas com vitamina A, quando comparado ao grupo placebo, sugerindo que esse nutriente estaria associado a melhora da defesa do hospedeiro contra infecções intestinais. Nesse mesmo estudo, no entanto, a razão L:M não diferiu entre as crianças suplementadas com vitamina A daquelas do grupo placebo143. Estudos prévios realizados com crianças na Índia e em Gambia mostraram que a suplementação com vitamina A foi capaz de reduzir a permeabilidade intestinal, com menor razão de L:M144,145. De fato, a deficiência de vitamina A leva ao aumento da susceptibilidade a vários tipos de agentes patógenos, enquanto que a sua suplementação reduz a morbidade e mortalidade por doenças infecciosas, como a diarreia146,147.
A suplementação com zinco diminui o risco e a duração de diarreia por infecções entéricas em crinaças148. O uso de suplementação com zinco se mostrou capaz de reduzir a permeabilidade intestinal (avaliada pela razão L:M) em alguns estudos149, mas não em outros150. Em estudo realizado com crianças brasileiras, a suplementação com zinco e vitamina A levou a uma significativa redução da razão L:M, indicativo de melhora na função da barreira intestinal, além de influenciar positivamente no crescimento linear151. No entanto, essa melhoria na razão L:M não foi observada entre crianças da Gâmbia com infecção entérica após a suplementação com zinco150.
Em relação ao papel do ferro, uma maior ingestão desse micronutriente (suplementação ou fortificação) pode aumentar o risco de diarreia e de infecções por enteropatógenos, devido ao aumento da permeabilidade intestinal, formação de radicais livres e de estresse oxidativo, impacto negativo sobre a microbiota intestinal e aumento da inflamação intestinal104,152.
Resultados do estudo MAL-ED indicaram que em crianças com EE, acompanhadas desde o nascimento até 24 meses de idade, a baixa ingestão de vitamina B9 da alimentação complementar se mostrou associada a uma maior carga de enteropatógenos153. Adicionalmente, a presença de enteropatógenos demonstrou aumentar as concentrações dos biomarcadores de inflamação intestinal (MPO, NEO e AAT)33, nessa mesma população de crianças.
Somente um estudo foi encontrado investigando a associação entre a ingestão de micronutrientes da alimentação complementar com os biomarcadores de EE (L:M, MPO, NEO e AAT)154. Nesse estudo, onde foram avaliadas crianças de
Bhaktapur (Nepal), os pesquisadores encontraram associação significativa entre a ingestão de potássio, magnésio, fósforo, folato e vitamina C e o marcador de inflamação intestinal MPO154. Deve-se notar que os nutrientes que mostraram associação significativa com o biomarcador intestinal não foram os usualmente relacionados e pesquisados em relação à saúde intestinal154.
O estudo MAL-ED, do qual a presente pesquisa faz parte, trata-se de uma investigação longitudinal da inter-relação entre morbidade por doenças entéricas infecciosas e o consumo alimentar e ingestão nutricional, uma vez que afetam o crescimento infantil, o desenvolvimento cognitivo e a eficácia de vacinas. Esse estudo teve como hipótese que a função comprometida da barreira intestinal seria o mediador biológico chave dessas interações122,155,156. Para tanto, como biomarcadores fecais de inflamação intestinal, foram avaliadas MPO (para indicar atividade neutrofílica na mucosa intestinal) e NEO (indicando atividade das células TH1) e, para avaliar permeabilidade e absorção intestinais, a AAT fecal e o teste urinário da razão L:M122.
Dados recentes do estudo MAL-ED indicam que as concentrações fecais desses biomarcadores e a razão L:M urinária são influenciadas pela carga de enteropatógenos, condições de saneamento e higiene e pelo status
socioeconômico20,32,33. Contudo, não está claro se e/ou até que ponto esses biomarcadores são adicionalmente influenciados por fatores além dos enteropatógenos, como a ingestão de nutrientes da dieta.
4 METODOLOGIA 4.1 APROVAÇÃO ÉTICA
O presente estudo faz parte de um projeto maior multicêntrico, uma coorte que acompanhou crianças durante os seus primeiros 5 anos de vida, denominada “Estudo da Etiologia, Fatores de Risco e Interações de Infecções Entéricas e de Desnutrição e suas Consequências para a Saúde e Desenvolvimento Infantil” (The
Etiology, Risk Factors and Interactions of Enteric Infections and Malnutrition and the Consequences for Child Health and Development, MAL-ED). Esse projeto foi realizado
em cidades de 8 países, incluindo: Dhaka, Bangladesh; Fortaleza, Brasil; Vellore, Índia; Bhaktapur, Nepal; Naushahro Feroze, Paquistão; Loreto, Peru; Venda, África do Sul e Haydom, Tanzânia. O estudo MAL-ED foi um projeto colaborativo apoiado pela Fundação Bill & Belinda Gates, pela Foundation for the National Institutes for
Health (FNIH) e pelo Fogatory International Center (FIC) (número de concessão
OPP47075)156.
Os protocolos do estudo foram aprovados pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa – CONEP, com parecer nº029/10, registro nº157001 e processo nº25000.9836/2009-76 (ANEXO A). Também houve aprovação junto ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará – COMEPE, em carta de aprovação, com protocolo nº246/09 (ANEXO B). Os participantes da pesquisa foram incluídos no estudo após autorização pelo consentimento livre e esclarecido das mães ou responsáveis156.
4.2 TIPO E PERÍODO DO ESTUDO
Foi realizado um estudo do tipo longitudinal prospectivo entre novembro de 2010 a fevereiro de 2017.
4.3 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO
A pesquisa foi realizada com crianças, que participaram do estudo MAL-ED conduzido no Brasil, na comunidade do Parque Universitário, localizada em Fortaleza, capital do estado do Ceará, nordeste do Brasil, que tem aproximadamente 33 mil habitantes de famílias em sua maioria de baixa renda157.
De um total de 244 recém-nascidos incluídos, onze abandonaram o estudo por mudança de endereço, abandono do estudo ou por outros motivos, totalizando
233 crianças estudadas (Figura 1). Foram utilizados os seguintes critérios de inclusão: recém-nascidos saudáveis com até 17 dias de vida; responsável/cuidador pela criança que não tivesse planos para sair da área de captação por pelo menos 6 meses, a partir da inscrição no estudo; disposição do responsável/cuidador da criança em ser visitado em sua casa duas vezes por semana. Os critérios de exclusão foram: a família ter planos de mudar da área de captação em um período maior do que 30 dias consecutivos, durante os primeiros 6 meses de acompanhamento; idade materna inferior a 16 anos; mãe com outro filho inscrito no estudo; gestação gemelar; criança com doenças congênitas, doenças graves que necessitaram hospitalização ou qualquer outra condição grave ou crônica, como vírus da imunodeficiência humana (HIV), tuberculose, doença renal, insuficiência cardíaca crônica ou doença hepática grave; peso ao nascer inferior a 1500g156.
Figura 3. Fluxograma de inclusões, perdas e coleta de dados da população estudada.
4.4 COLETA DE DADOS
A coleta de dados da presente pesquisa foi realizada entre novembro de 2010 a fevereiro de 2017, sendo utilizados nesse trabalho os dados de tempo aleitamento materno exclusivo do nascimento aos 6 meses, dados socioeconômicos
Recém-nascidos elegíveis (n=244) Recém-nascidos incluídos (n=233) Mudou de endereço ou abandonou a pesquisa (n=11)
Práticas de aleitamento materno (de 0-15 meses)
Status socioeconômico (aos 9 meses)
Recordatório 24H (mensalmente, dos 9-15 meses)
Biomarcadores: teste urinário de lactulose:manitol (aos 15 meses) e proteínas fecais (mieloperoxidase, neotripsina e alfa-1-antitripsina) (aos 15 meses)
