Universidade de Aveiro Ano 2019
Departamento de Biologia
SÉRGIO GONÇALO
REIS MENDES
MICROBIOLOGIA E BIOLOGIA MOLECULAR EM
CONTEXTO HOSPITALAR
DECLARAÇÃO
Declaro que este relatório é integralmente da minha autoria, estando
devidamente referenciadas as fontes e obras consultadas, bem como
identificadas de modo claro as citações dessas obras. Não contém, por isso,
qualquer tipo de plágio quer de textos publicados, qualquer que seja o meio dessa
publicação, incluindo meios eletrónicos, quer de trabalhos académicos.
Universidade de Aveiro Ano 2019
Departamento de Biologia
SÉRGIO GONÇALO
REIS MENDES
MICROBIOLOGIA E BIOLOGIA MOLECULAR EM
CONTEXTO HOSPITALAR
Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Microbiologia, realizada sob a orientação científica do Doutor José Afonso Moreira, responsável pelo Setor de Biologia Molecular do Serviço de Medicina Laboratorial do Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E., e sob coorientação da Professora Doutora Adelaide Almeida, Professora Auxiliar com Agregação, do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro.
Dedico este trabalho aos meus pais e avós pelo enorme apoio e motivação e à minha namorada pelo seu grande carinho e toda a ajuda.
o júri
Presidente Prof.a Doutora Sónia Alexandra Leite Velho Mendo Barroso
Professora Auxiliar com Agregação, Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro
Arguente Prof.a Doutora Ana Cristina de Fraga Esteves
Professora Auxiliar da Faculdade de Medicina Dentária, Universidade Católica Portuguesa
Orientador Prof.a Doutora Maria Adelaide de Pinho Almeida
agradecimentos Quero agradecer à Doutora Paula Vasco, Diretora Clínica do Serviço de Medicina Laboratorial do Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E. pela oportunidade que me concedeu de poder realizar o meu estágio neste laboratório.
Ao Doutor José Afonso Moreira, meu orientador, um enorme agradecimento por toda a paciência, compreensão, como também todo o apoio, ajuda e ensinamentos que me transmitiu.
Um agradecimento a todos os elementos que constituem o Serviço de Medicina Laboratorial do Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E., que tão gentilmente me acolheram nesta instituição.
À professora Doutora Adelaide Almeida, minha coorientadora, que me apoiou bastante, agradeço todos os ensinamentos e apoio não só para este trabalho como também em todas as Unidades Curriculares lecionadas.
Um agradecimento muito especial aos meus pais, os quais se esforçam desde sempre para me proporcionarem as melhores condições possíveis para realizar o meu percurso académico da melhor forma possível.
Aos meus avós, um agradecimento muito especial por todo o apoio, ajuda, carinho e motivação que me transmitem.
À minha namorada, um especial agradecimento pela sua enorme paciência e benevolência, como também o seu esforço e grande apoio que me tem dado para superar os momentos mais difíceis da minha vida.
Um grande agradecimento à professora Maria Duarte, pelo enorme apoio, carinho, ensinamentos e ajuda que me transmite desde há muitos anos.
palavras-chave Microbiologia Clínica, microrganismos, cultura de microrganismos, análises microbiológicas, Biologia Molecular.
resumo O presente documento tem como objetivo apresentar e descrever as atividades realizadas no decorrer de um estágio efetuado nos Setores de Microbiologia e de Biologia Molecular do Serviço de Medicina Laboratorial do Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E. Neste documento serão também apresentadas as técnicas e metodologias relacionadas e aplicadas no decorrer da execução das respetivas atividades.
keywords Clinical Microbiology, microorganisms, culture of microorganisms, microbiological analyzes, Molecular Biology.
abstract The present document aims to present and describe the activities performed during an internship carried out in the Microbiology and Molecular Biology Sectors of the Laboratory Medicine Service of the Figueira da Foz District Hospital, E.P.E. In this document it will be also presented the techniques and methodologies related and applied during the execution of the respective activities.
Índice
Lista de Abreviaturas, Acrónimos e Siglas ... I Índice de Figuras ... III Índice de Tabelas ... VI
1. Introdução ... 1
2. Local do estágio curricular ... 2
3. Setor de Microbiologia ... 2
3.1 Gestão e tipos de produtos biológicos, classificação das análises efetuadas e validação de resultados.. ... 2
3.1.1 Receção, triagem e integração dos produtos biológicos ... 2
3.1.2 Tipos de produtos biológicos ... 3
3.1.3 Classificação das análises efetuadas aos diversos produtos biológicos ... 4
3.1.4 Validação de resultados ... 4
3.2 Observação, apreciação e análise visual dos meios de cultura semeados e incubados ... 5
3.3 Meios de cultura e principais equipamentos utilizados no Setor de Microbiologia ... 7
3.3.1 Meios de cultura ... 7
3.3.2 Equipamentos ... 10
3.4 Produtos biológicos e análises efetuadas no Setor de Microbiologia ... 16
3.4.1 Urina ... 16
3.4.2 Sangue ... 18
3.4.3 Líquido Cefalorraquidiano (LCR) ... 20
3.4.4 Expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares ... 21
3.4.5 Sémen ... 25
3.4.6 Exsudado purulento superficial ou profundo e ponta de cateter ... 26
3.4.7 Fezes ... 28
3.4.8 Exsudado vaginal e/ou anal ... 39
3.4.9 Fragmentos de unhas, fragmentos de pele e cabelos ... 41
3.5 Testes de avaliação presuntiva ... 43
3.5.1 Teste de suscetibilidade à bacitracina ... 43
3.5.3 Teste da catalase, coagulase e esculina-bílis ... 44
3.5.4 Teste da oxidase... 45
3.6 Controlos da Qualidade do Setor de Microbiologia ... 46
3.6.1 Controlo Interno da Qualidade ... 46
3.6.2 Controlo Externo da Qualidade ... 46
3.7 Dados relativos aos produtos biológicos processados no Setor de Microbiologia ... 47
4. Setor de Biologia Molecular ... 48
4.1 Extração ... 48
4.2 Amplificação ... 49
4.3 Deteção e genotipagem do Vírus do Papiloma Humano (VPH) ... 51
4.4 Deteção e quantificação da carga viral do Vírus da Hepatite B (VHB) e do Vírus da Hepatite C (VHC)… ... 52
4.5 Deteção de vírus respiratórios e microrganismos atípicos ... 53
4.6 Deteção e análise do Complexo M. tuberculosis e genes de resistência ... 54
4.7 Controlo Externo da Qualidade do Setor de Biologia Molecular... 56
5. Conclusões... 57
Lista de Abreviaturas, Acrónimos e Siglas
ATCC - American Type Culture Collection; BAAR - Bacilos Ácido-Álcool Resistentes; CAN2 - Meio de cultura CHROMID® Candida;
CARB/OXA - Meio de cultura CHROMID® CARBA SMART Agar;
CCDA - Meio de cultura para Campylobacter spp.;
CLED - Meio de cultura Cystine, Lactose, Electrolyte Deficient (Cistina, Lactose, Deficiente em Eletrólitos); CMI - Concentração Mínima Inibitória;
CMRRC - Centro de Medicina e Reabilitação da Região Centro-Rovisco Pais; CMTB - Complexo Mycobacterium tuberculosis;
COS - Meio de cultura Columbia agar com 5% de Sangue de Ovelha; DCO - Meio de cultura D-Coccosel agar;
EDTA - Ethylenediaminetetraacetic Acid (Ácido Etilenodiaminotetracético); EPC - Enterobactérias Produtoras de Carbapenemases;
GDH - Glutamato-Desidrogenase; GRAN - Meio de cultura Granada agar;
H.D.F.F., E.P.E. - Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E.; INSA - Instituo Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge;
KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (Produtora de Carbapenemases); LCR - Líquido Cefalorraquidiano;
LJ - Meio de cultura Löwenstein-Jensen; MCK - Meio de cultura MacConkey agar; MOC - Microscópio Ótico Composto;
PCR - Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase); PSO - Pesquisa de Sangue Oculto;
PVX - Meio de cultura chocolate agar PolyViteX;
qPCR - Real-Time Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da Polimerase em Tempo Real);
RT-qPCR - Reverse Transcription Real-Time Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real com Transcrição Reversa);
SALM - Meio de cultura CHROMID® Salmonella Elite;
SGA - Meio de cultura Sabouraud, Gentamicina e Actidiona; SGC - Meio de cultura Sabouraud, Gentamicina e Cloranfenicol; SGC2 - Meio de cultura Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2 agar; SML - Serviço de Medicina Laboratorial;
SNVS - Meio de cultura SNVS; SPZ - Espermatozoides;
SS - Meio de cultura para Salmonella spp. e Shigella spp.; TSA - Teste de Suscetibilidade a Antimicrobianos; UFC/mL - Unidades Formadoras de Colónias por mililitro;
UK NEQAS - United Kingdom National External Quality Assessment Service;
VCAT3 - Meio de cultura chocolate agar PolyViteX Vancomicina, Colistina, Anfotericina e Trimetoprim 3; VHB - Vírus da Hepatite B;
VHC - Vírus da Hepatite C; VPH - Vírus do Papiloma Humano; WT - Wild Type (Tipo Selvagem).
Índice de Figuras
Figura 1: Meios de cultura semeados e incubados, já organizados de forma decrescente relativamente ao seu
código numérico e prontos a serem observados. ... 6
Figura 2: Equipamento VITEK® 2 Compact. ... 10
Figura 3: Suporte de cartas do VITEK® 2 Compact, com várias cartas prontas a serem inseridas na câmara de enchimento por vácuo. Cada carta tem a si associado um tubo com uma suspensão microbiana com uma densidade ótica conhecida. ... 10
Figura 4: Equipamento DensiCHEKTM Plus utilizado para leitura da densidade ótica de uma suspensão microbiana na escala nefelométrica McFarland. ... 11
Figura 5: Equipamento BACT/ALERT® 3D. ... 13
Figura 6: Figura onde é possível observar a variação de cor do sensor permeável ao CO2 entre dois frascos. À direita é possível observar uma hemocultura positiva, enquanto que à esquerda é possível observar uma hemocultura negativa... 13
Figura 7: Microscópio ZEISS Axio Lab. A1 utilizado no Setor de Microbiologia. ... 15
Figura 8: Meio de cultura duplo Uriline. ... 16
Figura 9: Procedimento para análise bacteriológica de urina. Adaptado de Fonseca et al., 2004. ... 16
Figura 10: Staphylococcus saprophyticus isolado a partir de uma urocultura. ... 17
Figura 11: Proteus mirabilis isolado a partir de uma urocultura. ... 17
Figura 12: E. coli isolada a partir de uma urocultura. ... 17
Figura 13: Enterobacter cloacae isolado a partir de uma urocultura. ... 17
Figura 14: Procedimento para análise bacteriológica de hemoculturas positivas. Adaptado de Fonseca et al., 2004. ... 18
Figura 15: Streptococcus pyogenes isolado a partir de uma hemocultura positiva. Na Figura é possível observar um disco do teste de suscetibilidade à bacitracina. ... 19
Figura 16: Acinetobacter baumannii isolado a partir de uma hemocultura positiva. ... 19
Figura 17: S. agalactiae isolado a partir de uma hemocultura positiva. ... 19
Figura 18: Procedimento para análise bacteriológica e avaliação citológica de LCR. Adaptado de Fonseca et al., 2004 e Gilhus et al., 2011. ... 20
Figura 19: Observação de células mononucleares (A) e polimorfonucleares (B) durante uma avaliação citológica de LCR. Ampliação: 10x40=400X. ... 20
Figura 20: Procedimento para análise bacteriológica, micológica e recolha de amostra para análise micobacteriológica de expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares. Adaptado de Fonseca et al., 2004. ... 22
Figura 21: Colónias de S. aureus, isoladas a partir da análise bacteriológica de uma expetoração. ... 22
Figura 22: Colónias de H. influenzae, isoladas a partir da análise bacteriológica de uma expetoração. ... 22
Figura 23: Procedimento para análise micobacteriológica de expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares. Adaptado de Bula informativa dos frascos de cultura, Stinson et al., 2014 e Vega et al., 2005. ... 23
Figura 24: Observação microscópica de BAAR, após coloração através do método de Ziehl-Neelsen.
Ampliação: 10x100=1000X. ... 24
Figura 25: Observação microscópica a fresco de sémen (em lâmina normal), aquando de uma análise de sémen. Ampliação: 10x100=1000X. ... 25
Figura 26: Observação microscópica de sémen em câmara de Neubauer, para contagem de SPZ. ... 25
Figura 27: Procedimento para análise bacteriológica de exsudado purulento superficial ou profundo e ponta de cateter. Adaptado de Fonseca et al., 2004. ... 26
Figura 28: Staphylococcus epidermidis isolado a partir de um cateter com suspeita de contaminação. ... 27
Figura 29: Enterococcus faecalis isolado a partir de um exsudado purulento em zaragatoa. ... 27
Figura 30: Finegoldia magna isolada a partir de um exsudado purulento líquido. ... 27
Figura 31: Procedimento para análise bacteriológica de fezes. Adaptado de Fonseca et al., 2004. ... 29
Figura 32: S. enteritidis obtida a partir da análise bacteriológica de fezes. ... 29
Figura 33: Procedimento para análise parasitológica com exame microscópico em fezes. Adaptado de Bula informativa do Kit e Forbes et al., 2007. ... 30
Figura 34: Observação microscópica de um ovo de Enterobius vermicularis. Ampliação: 10x40=400X. .... 30
Figura 35: Figura onde é possível observar um cisto de Giardia lamblia. Ampliação: 10x40=400X. ... 30
Figura 36: Teste rápido imunocromatográfico One-step Diagnostic Test FOB, positivo e válido. ... 31
Figura 37: Teste rápido imunocromatográfico RIDA® QUICK Campylobacter, positivo e válido. ... 32
Figura 38: Figura onde é possível observar a presença de colónias com um aspeto metálico, sendo estas formadas por Campylobacter spp. ... 32
Figura 39: Teste rápido imunoenzimático TECHLAB® C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE®, com resultado negativo e válido. ... 33
Figura 40: Teste rápido imunoenzimático TECHLAB® C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE®, positivo e válido para GDH. ... 33
Figura 41: Teste rápido imunocromatográfico bioNexia® Rota-Adeno, positivo e válido para Rotavírus. .... 34
Figura 42: Teste rápido imunocromatográfico Pylori-strip H. pylori diagnostic, positivo e válido. ... 35
Figura 43: Teste rápido imunocromatográfico Crypto/Giardia Duo-Strip, negativo e válido. ... 36
Figura 44: Procedimento para análise bacteriológica de zaragatoas retais – fezes. Adaptado de Fonseca et al., 2004 e PPCIRA, 2017. ... 37
Figura 45: Colónias com suspeita de serem formadas por KPC (colónias à esquerda). ... 38
Figura 46: Repicagem de colónias com suspeita de serem formadas por KPC (Figura 45), para posterior identificação e TSA. ... 38
Figura 47: Procedimento para análise bacteriológica e micológica de zaragatoas vaginais e/ou anais. Adaptado de Fonseca et al., 2004. ... 39
Figura 48: Colónias de Candida glabrata obtidas a partir de uma zaragatoa vaginal, após análise micológica e repicagem para meio de cultura COS. ... 40
Figura 49: Colónias de S. agalactiae isoladas após análise bacteriológica de uma zaragatoa vaginal enviada para rastreio de S. agalactiae. ... 40
Figura 50: Procedimento para análise micológica de fragmentos de unhas, fragmentos de pele e cabelos.
Adaptado de Forbes et al., 2007 e Hainer, 2003. ... 41
Figura 51: Dermatófito M. canis isolado a partir de fragmentos de pele (frente). ... 42
Figura 52: Dermatófito M. canis isolado a partir de fragmentos de pele (verso). ... 42
Figura 53: Observação microscópica do dermatófito M. canis, sendo observado na Figura algumas estruturas (macroconídios) deste. Ampliação: 10x40=400X. ... 42
Figura 54: Teste de suscetibilidade à bacitracina positivo para S. pyogenes, sendo observado um halo de inibição em volta do disco de bacitracina. ... 43
Figura 55: Teste da coagulase positivo. Suspeita de S. aureus. ... 44
Figura 56: Colónias com suspeita de serem formadas por Enterococcus spp. O meio apresenta uma mudança de cor, ficando com uma tonalidade bastante escura. ... 45
Figura 57: Figura onde é possível observar a ordem de realização dos testes da catalase, da coagulase e da esculina-bílis no Setor de Microbiologia. ... 45
Figura 58: Equipamento de extração automática QIAGEN® EZ1® Advanced. ... 49
Figura 59: Termociclador Rotor-Gene 3000TM. ... 50
Figura 60: Equipamento TENDIGOTM. ... 54
Figura 61: Tira de hibridização positiva e válida para a presença de micobactérias pertencentes ao CMTB. É possível ainda visualizar algumas bandas dos seus genes de resistência WT, relativamente aos antibióticos isoniazida e rifampicina. ... 55
Índice de Tabelas
Tabela 1: Parâmetros qualitativos e quantitativos avaliados na realização de um espermograma. Adaptado de WHO, 2010. ... 25 Tabela 2: Tabela com os dados relativos ao número total de análises de alguns produtos biológicos processados no ano de 2018. ... 47
Todas as figuras e tabelas apresentadas neste documento são da autoria do responsável pela redação deste mesmo documento.
1.
Introdução
O presente documento foi elaborado com base no estágio curricular de seis meses efetuado nos Setores de Microbiologia e de Biologia Molecular do Serviço de Medicina Laboratorial (SML) do Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E. (H.D.F.F., E.P.E.). O estágio curricular e relatório associado foram realizados em conformidade com os requisitos de avaliação necessários à Unidade Curricular Dissertação/Projeto/Estágio do Mestrado em Microbiologia, lecionado no Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro.
Este estágio curricular teve como principais objetivos, a aplicação prática de conhecimentos teóricos adquiridos anteriormente, como também a aquisição de novas competências e experiências através da realização de várias atividades, nos Setores de Microbiologia e de Biologia Molecular, no SML do H.D.F.F., E.P.E. Deste modo, pude fazer parte integrante da equipa técnica, adaptando-me à rotina inerente a cada Setor e realizando várias tarefas que me foram atribuídas durante o período de estágio. Com o apoio e ajuda dos elementos de cada Setor, realizei em ambos os Setores a triagem e integração dos vários produtos biológicos, o seu processamento, envolvendo diversos métodos e equipamentos, a obtenção/gestão de resultados e a sua posterior análise e interpretação.
Por meio deste relatório, serão apresentadas de forma detalhada as tarefas e análises por mim realizadas no decorrer do meu estágio curricular, os objetivos de cada análise, alguns dos métodos, materiais e equipamentos utilizados no processamento dos vários produtos biológicos e ainda alguns resultados demonstrativos obtidos em ambos os Setores de Microbiologia e de Biologia Molecular.
2.
Local do estágio curricular
O estágio curricular em questão foi realizado num período de seis meses, sendo iniciado no dia 10 de setembro de 2018 e finalizado no dia 18 de março de 2019, nos Setores de Microbiologia e de Biologia Molecular do SML do H.D.F.F., E.P.E. Este Serviço encontra-se localizado na face norte do H.D.F.F., E.P.E. e engloba ainda outros Setores, tais como o Setor de Bioquímica, o Setor de Hematologia e o Setor de Imunohemoterapia. Atualmente, o SML do H.D.F.F., E.P.E. está sob a chefia da Diretora Clínica Doutora Paula Vasco.
3.
Setor de Microbiologia
No Setor de Microbiologia são desenvolvidas diversas atividades que envolvem por exemplo, a triagem e integração dos produtos biológicos, a execução de diversas análises através de várias técnicas microbiológicas clássicas e automatizadas, a interpretação dos resultados obtidos e a sua validação no sistema informático do SML. Todas estas atividades são realizadas com o objetivo de produzir um diagnóstico conciso e objetivo.
3.1 Gestão e tipos de produtos biológicos, classificação das análises efetuadas e
validação de resultados
3.1.1 Receção, triagem e integração dos produtos biológicos
A receção dos produtos biológicos para análise microbiológica é diária e várias vezes por dia. Os produtos biológicos podem ser provenientes dos vários Serviços do H.D.F.F., E.P.E. ou do Centro de Medicina e Reabilitação da Região Centro-Rovisco Pais (CMRRC, Tocha, Portugal), sendo estes entregues nas instalações do SML. Diversos produtos biológicos são ainda provenientes das colheitas realizadas no próprio SML.
Após a entrega dos produtos biológicos, estes são triados e integrados no sistema informático do SML, sendo este o Clinidata®XXI (Maxdata, Carregado, Portugal). Deste modo, a cada produto
biológico pertencente a um doente com um número de processo e/ou episódio específico, são verificadas as análises requisitadas e em simultâneo, é atribuído um código numérico único no sistema informático do SML.
Consoante o tipo de análise e o tipo de produto biológico, são impressas várias etiquetas. Estas por sua vez, apresentam várias informações úteis, sendo algumas delas, a data de colheita, o código numérico único do produto biológico no sistema informático do SML e o código de barras. Tudo isto, de forma a facilitar todo um processo complexo posterior.
3.1.2 Tipos de produtos biológicos
São vários os tipos de produtos biológicos que podem chegar ao Setor de Microbiologia para análise. Estes por sua vez, dependem essencialmente do tipo de doença envolvida. No decorrer do meu estágio curricular, pude efetuar o processamento de diversos produtos biológicos, tais como:
➢ Urina; ➢ Sangue;
➢ Líquido Cefalorraquidiano;
➢ Expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares;
➢ Sémen;
➢ Exsudado purulento superficial ou profundo e ponta de cateter; ➢ Fezes;
➢ Exsudado vaginal e/ou anal;
3.1.3 Classificação das análises efetuadas aos diversos produtos biológicos
A requisição enviada pelo clínico para as análises a serem efetuadas, define os procedimentos a serem realizados aos produtos biológicos. Os procedimentos das análises bacteriológicas e micológicas (para algumas leveduras), realizadas no Setor de Microbiologia do SML, baseiam-se nas recomendações publicadas pelo Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) (Fonseca
et al., 2004). A classificação das análises divide-se essencialmente em quatro categorias:
a) Análise bacteriológica
A análise bacteriológica tem como principal objetivo a deteção e estudo de bactérias responsáveis por infeção no seu hospedeiro. A análise bacteriológica engloba sempre um exame cultural. É também realizado um exame direto sempre que possível envolvendo este, um esfregaço em lâmina (Normax - Fábrica de Vidros Científicos, Lda., Marinha Grande, Portugal) para coloração pelo método de Gram e posterior observação microscópica. Por último, é realizado o estudo de identificação e Teste de Suscetibilidade a Antimicrobianos (TSA) às colónias relevantes obtidas após incubação e observação dos meios de cultura.
b) Análise micobacteriológica
A análise micobacteriológica tem como objetivo a deteção de micobactérias. A execução desta análise é solicitada com frequência em produtos biológicos do trato respiratório. Esta análise engloba uma descontaminação e homogeneização inicial, seguindo-se um exame cultural com sementeira em meio de cultura sólido e líquido. É ainda realizado um exame direto através de um esfregaço em lâmina para coloração por método de Ziehl-Neelsen e sua observação microscópica.
c) Análise micológica
A análise micológica tem como objetivo a deteção de fungos responsáveis por várias doenças. Esta análise envolve sempre um exame cultural, no entanto, em produtos biológicos específicos, pode ser ainda realizado um exame direto. Aquando da deteção e obtenção de fungos específicos como por exemplo leveduras, é realizado o seu estudo de identificação e TSA.
d) Análise parasitológica com exame microscópico
A análise parasitológica com exame microscópico tem como principal objetivo a deteção e identificação presuntiva de parasitas causadores de diversas doenças no hospedeiro. Esta análise é efetuada a fezes e envolve a observação microscópica dos próprios parasitas, alguns fragmentos e também algumas das suas estruturas numa preparação a fresco, após concentração e sedimentação.
3.1.4 Validação de resultados
A validação de resultados é realizada pelos responsáveis do Setor. Esta tarefa envolve a avaliação e inserção dos resultados obtidos, no sistema informático do SML do H.D.F.F., E.P.E.
3.2 Observação, apreciação e análise visual dos meios de cultura semeados e
incubados
No Setor de Microbiologia, podem ser observados dois tipos de culturas, as culturas primárias e as repicagens. Estas consistem na realização de sementeiras em meios de cultura a partir de uma amostra do produto biológico chegado ao Setor e a partir de colónias já presentes em meio de cultura (cultura primária) para isolamento de um microrganismo de interesse, respetivamente. Consoante os meios de cultura e as necessidades dos microrganismos que se suspeitem que estejam presentes, os meios de cultura podem ficar em incubação em aerobiose, anaerobiose, atmosfera rica em dióxido de carbono (CO2) ou microaerofilia.
A observação e apreciação visual de todos os meios de cultura é uma tarefa realizada diariamente, sempre ao início do dia. Todos os dias de manhã são observados os meios de cultura semeados nos dias anteriores ou durante a noite do próprio dia (Figura 1). Durante a análise e observação dos meios de cultura, são avaliados diversos fatores (Fonseca et al., 2004), sendo estes:
• Cor das colónias em crescimento;
• Presença ou ausência de vários tipos de colónias (colónias com vários formatos e cores no mesmo meio de cultura);
• Odor;
• Formato das colónias;
• Presença ou ausência de hemólise e o tipo de hemólise (colónias α-hemolíticas, β-hemolíticas ou ϒ-β-hemolíticas);
• Textura;
• Alteração da cor do meio de cultura na presença de colónias microbianas específicas; • Observação da presença ou ausência de halos de inibição (ex: na adição de um disco de
bacitracina ou optoquina nos testes de avaliação presuntiva).
Aquando da observação e análise dos meios de cultura semeados e incubados, podem ser obtidos quatro tipos de resultados tendo em consideração o crescimento microbiano, sendo estes:
• Cultura sem crescimento de microrganismos;
• Cultura sem crescimento de microrganismos relevantes ou predominantes; • Cultura com crescimento de microrganismos relevantes ou predominantes; • Cultura polimicrobiana (três ou mais isolados de microrganismos).
Excecionalmente, culturas polimicrobianas obtidas a partir de análises realizadas a urinas, são descartadas, uma vez que tanto impossibilita a realização de repicagens, como pode levar à invalidação do diagnóstico devido à possibilidade de contaminações.
Os resultados obtidos após observação e análise dos meios de cultura são posteriormente inseridos e validados no sistema informático do SML.
Para posteriores testes de identificação e TSA, são realizadas anotações para esse efeito. Adicionalmente, podem ser registadas anotações para a realização de esfregaços para coloração pelo método de Gram ou pelo método de Ziehl-Neelsen, mas também para a execução de testes de avaliação presuntiva.
Figura 1: Meios de cultura semeados e incubados, já organizados de forma decrescente relativamente ao seu código numérico e prontos a serem observados.
3.3 Meios de cultura e principais equipamentos utilizados no Setor de Microbiologia
3.3.1 Meios de cultura
a) Meio de cultura Columbia agar com 5% de Sangue de Ovelha (COS) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura destinado ao crescimento e isolamento da grande maioria dos microrganismos com importância na Microbiologia Clínica, incluindo os fastidiosos. Este meio de cultura não seletivo e não diferencial é nutritivo e contém 5% de sangue de ovelha. A presença de sangue neste meio, possibilita a deteção de microrganismos capazes de gerar hemólise (bioMérieux, 2019g; Murray et al., 2007). Este meio de cultura é utilizado em quase todas as análises efetuadas, essencialmente na realização de culturas primárias.
b) Meio de cultura Cystine Lactose Electrolyte Deficient agar (CLED) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura diferencial e não seletivo, recomendado para a deteção e isolamento de microrganismos infeciosos do trato urinário. A presença de cistina permite o desenvolvimento de microrganismos que são dependentes deste reagente, enquanto que a lactose e o indicador de pH azul de bromotimol possibilitam a diferenciação entre microrganismos fermentadores e não fermentadores da lactose. Os microrganismos fermentadores da lactose formam colónias amarelas, enquanto que os microrganismos não fermentadores formam colónias verdes, azuis ou incolores. Por fim, a sua deficiência em eletrólitos evita a formação de “swarming” por parte de espécies de Proteus spp. (Benito et al., 1990; bioMérieux, 2019f; Fonseca et al., 2004).
c) Meio de cultura cromogénico CHROMID® CARBA SMART Agar (CARB/OXA)
(bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura cromogénico seletivo duplo com um antibiótico em cada lateral, utilizado para a deteção de Enterobactérias Produtoras de Carbapenemases (EPC), como por exemplo
Klebsiella pneumoniae Produtora de Carbapenemases (KPC) (bioMérieux, 2019d).
d) Meio de cultura MacConkey agar (MCK) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo e diferencial aplicado para o isolamento seletivo de microrganismos de Gram-negativo como por exemplo, enterobactérias. Os sais biliares e violeta de cristal presentes na sua composição inibem o crescimento de bactérias de Gram-positivo. A lactose e vermelho neutro presentes na sua composição permitem a diferenciação entre microrganismos fermentadores da lactose e não fermentadores. Microrganismos fermentadores da lactose geram colónias de cor rosa ou vermelha (bioMérieux, 2019j; Fonseca et al., 2004; Murray et al., 2007).
e) Meio de cultura cromogénico CHROMID® Salmonella ELITE (SALM) (bioMérieux S.A.,
Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo e cromogénico aplicado para o isolamento seletivo e identificação de Salmonella spp. (bioMérieux, 2019e).
f) Meio de enriquecimento Selenite F BD-BBL (Becton, Dickinson and Company, Nova Jersey, Estados Unidos da América)
Meio de enriquecimento líquido e nutritivo, destinado ao isolamento de Salmonella spp. e
Shigella spp. a partir de amostras de fezes. A presença de selenito inibe o desenvolvimento de outros
microrganismos como por exemplo, coliformes (Fonseca et al., 2004; Murray et al., 2007).
g) Meio de cultura Salmonella Shigella agar (SS) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo e diferencial utilizado para o isolamento seletivo de Salmonella spp. e Shigella spp. Os sais biliares, citratos e verde brilhante da sua composição inibem o crescimento de microrganismos de Gram-positivo. A presença de lactose e o indicador de pH vermelho neutro na sua composição, permitem a diferenciação entre microrganismos fermentadores da lactose que geram colónias vermelhas e microrganismos não fermentadores que geram colónias incolores. Sendo a
Salmonella spp. e a Shigella spp. não fermentadoras, estas geram colónias incolores. Este meio
permite ainda diferenciar microrganismos produtores de sulfeto de hidrogénio, os quais geram colónias com um centro negro (ex: Salmonella spp.) (bioMérieux, 2019l; Murray et al., 2007).
h) Meio de cultura duplo Uriline (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura duplo de transporte, sendo uma das faces constituída por meio de cultura MacConkey agar (MCK) e a outra face constituída por meio de cultura CLED. Este meio de cultura duplo é aplicado para a sementeira de urinas (Bula informativa).
i) Meio de cultura duplo Mycoline (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura duplo de transporte, constituído por meio de cultura Sabouraud, Gentamicina e Cloranfenicol (SGC) e a outra face constituída por meio de cultura Sabouraud, Gentamicina e Actidiona (SGA). Este meio de cultura duplo é aplicado na deteção de fungos (Bula informativa).
j) Meio de cultura Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2 agar (SGC2) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo aplicado para a deteção e isolamento seletivo de fungos filamentosos ou leveduriformes de importância microbiológica clínica. Este meio de cultura é rico em glucose e peptonas, o que favorece o crescimento de fungos. Contém gentamicina para inibição da grande maioria de bactérias de Gram-positivo e de Gram-negativo. O cloranfenicol é adicionado para a inibição do crescimento de bactérias que possam apresentar resistência à gentamicina (Benito et al., 1990; bioMérieux, 2019k; Murray et al., 2007).
k) Meio de cultura CHROMID® Candida (CAN2) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França) Meio de cultura seletivo e cromogénico utilizado para a deteção e isolamento seletivo de leveduras causadoras de infeções como por exemplo, Candida spp. (bioMérieux, 2019c).
l) Meio de cultura Granada agar (GRAN) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo aplicado para a pesquisa e identificação de Streptococcus do grupo B de Lancefield como Streptococcus agalactiae (bioMérieux, 2019i).
m) Meio de cultura Chocolate agar PolyViteX (PVX) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura não seletivo o qual contém componentes específicos como fator X (hemina) e fator V (NAD) fornecidos pela hemoglobina e pelo PolyViteX, respetivamente. Este meio de cultura é aplicado para o isolamento de estirpes fastidiosas, tais como Neisseria spp. ou Haemophilus spp. (bioMérieux, 2019a; Fonseca et al., 2004; Murray et al., 2007).
n) Meio de cultura Chocolate agar PolyViteX Vancomicina, Colistina, Anfotericina e Trimetoprim 3 (VCAT3) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo utilizado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae ou
Neisseria meningitidis (bioMérieux, 2019b; Fonseca et al., 2004).
o) Meio de cultura SNVS (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo empregue no isolamento seletivo de microrganismos anaeróbios. A sua composição inclui por exemplo, peptonas e sangue de ovelha (Murray et al., 2007).
p) Meio de cultura D-Coccosel agar (DCO) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo e diferencial utilizado para o isolamento seletivo e diferenciação de
Streptococcus do Grupo D de Lancefield e Enterococcus spp. de outros microrganismos. Na presença
destes microrganismos, a esculina é hidrolisada e o meio adquire uma tonalidade escura devido à precipitação de sais de ferro. O carácter seletivo deste meio de cultura é proporcionado pela bílis (bioMérieux, 2019h; Murray et al., 2007).
q) Meio de Cultura Löwenstein-Jensen (LJ) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura não seletivo aplicado para o isolamento de Mycobacterium spp. Os compostos específicos incluem por exemplo, glicerol, amido de batata, ovos e verde de malaquita. Este último, inibe o crescimento de outros microrganismos (Murray et al., 2007).
r) Meio de cultura CCDA (Biogerm S.A., Maia, Portugal)
Meio de cultura seletivo o qual contém por exemplo carvão e cefoperazona. Este meio de cultura é aplicado no isolamento seletivo de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli, a partir de amostras de fezes (Murray et al., 2007).
3.3.2 Equipamentos
a) VITEK® 2 Compact (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
O Setor de Microbiologia está atualmente equipado com um sistema automático para o estudo de identificação e TSA, sendo este o VITEK® 2 Compact (Figura 2).
Figura 2: Equipamento VITEK® 2 Compact.
O VITEK® 2 Compact compreende várias secções, como por exemplo a câmara de
enchimento de cartas por vácuo, a câmara de selagem de cartas e recolha das mesmas, a câmara de incubação e a zona de leitura de cartas. Após o enchimento e selagem, este equipamento realiza a incubação e a leitura periódica e automática de reações/alterações que ocorrem dentro de poços de cartas VITEK® 2 (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França) específicas, estando algumas
apresentadas abaixo na Figura 3. Estas cartas podem ser aplicadas para identificação microbiana ou TSA, sendo estas por sua vez, utilizadas após a realização de uma suspensão microbiana com uma densidade ótica específica medida e obtida na escala McFarland, através do equipamento DensiCHEKTM Plus (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França) (Figura 4). As cartas de identificação
microbiana contêm poços com compostos específicos como por exemplo substratos que permitem que o crescimento microbiano e metabolização associados se traduzam em alterações de turvação e/ou cor. Estas alterações são então lidas por turbidimetria e colorimetria pelo leitor do equipamento. Os dados obtidos são posteriormente transmitidos para um computador com um software específico para análise da informação (bioMérieux, 2018b; Michalik and bioMérieux, 2017; Pincus, 2006).
Figura 3: Suporte de cartas do VITEK® 2 Compact, com várias cartas prontas a serem inseridas na câmara
de enchimento por vácuo. Cada carta tem a si associado um tubo com uma suspensão microbiana com uma densidade ótica conhecida.
Relativamente às cartas para TSA, estas contêm no seu interior poços de controlo e poços de teste. Os poços de teste contêm no seu interior antimicrobianos conhecidos, cujas concentrações vão sendo crescentes de poço para poço. O equipamento realiza a leitura periódica do crescimento microbiano em cada poço através de turbidimetria, sendo os dados obtidos transmitidos para um computador com um software específico para análise da informação. A suscetibilidade a cada antimicrobiano é então fornecida em valores internacionais de Concentração Mínima Inibitória (CMI). Após a finalização de cada teste, as cartas são então descartadas automaticamente pelo equipamento (bioMérieux, 2018b; Michalik and bioMérieux, 2017).
Figura 4: Equipamento DensiCHEKTM Plus utilizado para leitura da densidade ótica de uma suspensão
Cartas VITEK® 2 utilizadas no estudo de identificação e TSA: ➢ Identificação
• Cartas para identificação de microrganismos anaeróbios microaerófilos; • Cartas para identificação de microrganismos de Gram-negativo;
• Cartas para identificação de microrganismos de Gram-positivo; • Cartas para identificação de leveduras de maior importância clínica. ➢ TSA
Leveduras
• Cartas para leveduras de maior importância clínica.
Microrganismos de Gram-negativo
• Cartas para microrganismos de Gram-negativo fermentadores como por exemplo
Escherichia coli;
• Cartas para microrganismos de Gram-negativo não fermentadores como por exemplo
Pseudomonas aeruginosa;
• Cartas para microrganismos de Gram-negativo fastidiosos/crescimento lento como por exemplo N. gonorrhoeae;
• Cartas para microrganismos multirresistentes como por exemplo KPC.
Microrganismos de Gram-positivo
• Cartas para microrganismos de Gram-positivo como por exemplo Staphylococcus aureus; • Cartas para microrganismos de Gram-positivo como por exemplo Streptococcus
pneumoniae ou Streptococcus viridans;
• Cartas para microrganismos de Gram-positivo, em particular para Enterococcus spp. e S.
agalactiae.
TSA manual para Haemophilus spp. e Moraxella Catarrhalis
• A execução de TSA para Haemophilus spp. e M. Catarrhalis envolve as galerias ATBTM
HAEMO EU (08) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França), sendo esta análise realizada manualmente.
b) BACT/ALERT® 3D (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
O Setor de Microbiologia está equipado com um equipamento para a incubação e deteção de microrganismos em frascos de hemocultura BACT/ALERT® FN Plus, BACT/ALERT® FA Plus e
BACT/ALERT® PF Plus (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França) e frascos de cultura
BACT/ALERT® MP (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França) para deteção de micobactérias sendo
este, o BACT/ALERT® 3D (Figura 5).
Figura 5: Equipamento BACT/ALERT® 3D.
Este equipamento realiza a incubação e a monitorização periódica dos frascos. Cada frasco contém no fundo um sensor de emulsão líquida. Este sensor é permeável ao CO2 libertado pelos
microrganismos aquando do seu crescimento e metabolização dos substratos presentes no meio de cultura. Na presença de uma quantidade significativa de CO2, o pH diminui e o sensor sofre uma
variação de cor (Figura 6), detetada pelo equipamento por colorimetria. O frasco em causa é então assinalado como positivo para o crescimento microbiano (bioMérieux, 2018a; Bulas informativas dos frascos de hemocultura e cultura).
Figura 6: Figura onde é possível observar a variação de cor do sensor permeável ao CO2 entre dois frascos.
À direita é possível observar uma hemocultura positiva, enquanto que à esquerda é possível observar uma hemocultura negativa.
No Setor de Microbiologia existem frascos de hemocultura para colheitas em adultos e para colheitas pediátricas. A principal diferença entre estes dois tipos de frascos de hemocultura reside no volume de sangue que é colhido para cada tipo de frasco. Relativamente aos frascos de hemocultura para adultos, é colhido um volume de sangue maior comparativamente ao volume de sangue colhido para frascos de hemocultura para colheitas pediátricas. Em relação aos fracos de hemocultura para colheitas em adultos, estes subdividem-se em frascos de hemocultura para deteção de microrganismos anaeróbios e facultativos (BACT/ALERT® FN Plus) e frascos de hemocultura para
deteção de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos (BACT/ALERT® FA Plus).
Relativamente aos frascos de hemocultura BACT/ALERT® PF Plus, estes são utilizados para deteção
de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos em colheitas pediátricas. Após sementeira, os fracos de hemocultura ficam em incubação à temperatura constante e controlada de 37 ºC no equipamento até 5 dias. Caso haja desenvolvimento e multiplicação microbiana durante este período de tempo, o equipamento assinala a positividade no monitor (Bulas informativas dos frascos de hemocultura).
Por fim, existem ainda os frascos de cultura para crescimento e deteção de micobactérias (BACT/ALERT® MP). Após sementeira, estes frascos são mantidos em incubação a 37 ºC até 42
dias. Caso exista desenvolvimento e multiplicação durante esse período de tempo, o equipamento assinala a positividade no monitor (Bula informativa dos frascos de cultura).
c) Estufas de incubação
Existem duas estufas de incubação no Setor de Microbiologia, ambas à temperatura regulada de 37 ºC. Uma é utilizada para incubação de todos os meios de cultura e enriquecimento de microrganismos que não sejam micobactérias. A segunda estufa é utilizada para incubação de meios de cultura semeados para deteção e isolamento de micobactérias.
d) Câmara de fluxo laminar
No Setor de Microbiologia, é utilizada a câmara de fluxo laminar Labconco Logic+, classe II (Labconco Corporation, Kansas, Estados Unidos da América).
e) Frigoríficos
No Setor de Microbiologia, existem duas arcas de refrigeração. Nestas, estão colocados vários materiais, incluindo os meios de cultura e enriquecimento, cartas de identificação e TSA para o VITEK® 2 Compact e testes rápidos imunocromatográficos e imunoenzimáticos.
f) Microscópio Ótico Composto
O Setor de Microbiologia está equipado com um Microscópio Ótico Composto (MOC) ZEISS Axio Lab. A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha) apresentado abaixo na Figura 7. Este equipamento é utilizado para a realização de observações microscópicas de preparações a fresco e observação microscópica de esfregaços após coloração.
3.4 Produtos biológicos e análises efetuadas no Setor de Microbiologia
3.4.1 Urina
As infeções urinárias podem ser divididas em duas categorias, a infeção urinária superior e inferior, que podem envolver por exemplo, os rins e a uretra, respetivamente (Koneman et al., 1997). As infeções deste trato são frequentes em humanos e um dos tipos mais frequentes de infeção nosocomial (Elliott and Justiz-vaillant, 2018: Fonseca et al., 2004: Murray et al., 2007). As infeções urinárias agudas são normalmente provocadas por microrganismos da microbiota natural do ser humano (Fonseca et al., 2004).
Para análise de urina, a colheita pode ser efetuada através de vários métodos como por exemplo, a partir do jato médio da manhã por micção, por punção supra-púbica ou punção de cateter urinário (Fonseca et al., 2004). As urinas podem chegar ao Setor de Microbiologia em frascos estéreis de colheita de fluidos e líquidos biológicos ou já semeadas. Tendo como objetivo a deteção e estudo do agente infecioso, a análise de urina é maioritariamente bacteriológica (urocultura). Esta perfaz neste Setor, a grande maioria das análises efetuadas (Tabela 2), estando o seu procedimento descrito abaixo na Figura 9. As urinas são ainda analisadas no equipamento ROCHE cobas® u601 e ROCHE
cobas® u701 (F. Hoffmann-La Roche AG Ltd., Basileia, Suíça) localizado no Setor de Bioquímica.
No caso de urinas cujos resultados sejam urgentes (pediatria), estas chegam já semeadas em meios de cultura duplos Uriline (Figura 8), os quais possuem a vantagem de conter em simultâneo num só suporte os meios de cultura CLED e MCK.
Figura 8: Meio de cultura duplo Uriline.
Figura 9: Procedimento para análise bacteriológica de urina. Adaptado de Fonseca et al., 2004.
Urina Exame cultural
Sementeira em meio de cultura COS Sementeira em meio de cultura CLED Incubação em aerobiose, a 37 ºC entre 18 a 24 horas
Observação dos meios de cultura Identificação e TSA
Resultados
Durante a observação dos meios de cultura, além dos parâmetros e fatores gerais que são avaliados, são ainda retiradas conclusões relativamente à concentração em Unidades Formadoras de Colónias por mililitro (UFC/mL). A contagem de UFC/mL é feita de um modo presuntivo, avaliando visualmente o meio de cultura. Os resultados de UFC/mL podem variar entre 103 UFC/mL e igual ou
superior a 105 UFC/mL, tendo em consideração o número de colónias presentes no meio de cultura
observado. Nesta contagem são valorizados essencialmente os resultados iguais ou superiores a 105
UFC/mL (Fonseca et al., 2004). Durante o período de estágio, o agente etiológico mais vezes detetado e identificado na análise bacteriológica de urinas foi E. coli (Figura 12).
Os resultados obtidos no Setor de Microbiologia são inseridos e validados no sistema informático do SML, sendo estes associados aos resultados obtidos nos equipamentos de avaliação dos restantes parâmetros (Setor de Bioquímica). Nas Figuras 10, 11, 12 e 13 apresentadas abaixo, é possível observar alguns resultados obtidos a partir de uroculturas.
Figura 10: Staphylococcus saprophyticus isolado a partir de uma urocultura.
Figura 11: Proteus mirabilis isolado a partir de uma urocultura.
Figura 12: E. coli isolada a partir de uma urocultura.
Figura 13: Enterobacter cloacae isolado a partir de uma urocultura.
3.4.2 Sangue
Sendo o sangue um líquido estéril, a presença e deteção de qualquer microrganismo representa uma elevada importância clínica para a suspeita e identificação da origem de uma possível infeção (Benito et al., 1990). A presença de microrganismos na corrente sanguínea tais como bactérias (bacteriémia) é detetada através da realização de hemoculturas. O sangue é colhido diretamente do utente por punção venosa periférica para os respetivos frascos de hemocultura. As colheitas devem ser realizadas em localizações anatómicas diferentes (Fonseca et al., 2004).
No H.D.F.F., E.P.E., em condições normais, para hemoculturas de adultos, são realizadas três colheitas para deteção de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos e três colheitas para deteção de microrganismos anaeróbios e facultativos. Em hemoculturas pediátricas, é realizada uma colheita por cada utente para deteção de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos. Após incubação dos frascos de hemocultura, são realizadas análises microbiológicas para avaliação e estudo do agente infecioso, em hemoculturas positivas. Na Figura 14 abaixo situada, é apresentado o procedimento para análise bacteriológica de hemoculturas positivas.
Figura 14: Procedimento para análise bacteriológica de hemoculturas positivas. Adaptado de Fonseca et al., 2004.
Hemocultura positiva
Exame cultural Exame direto
Frasco de hemocultura para deteção de microrganismos aeróbios e
anaeróbios facultativos
Frasco de hemocultura para deteção de microrganismos anaeróbios e
facultativos
Esfregaço para coloração Gram Sementeira em meio de cultura COS Sementeira em meio de cultura COS
Incubação em aerobiose, a 37 ºC durante 24 horas
Incubação em anaerobiose, a 37 ºC durante 24 horas
Observação dos meios de cultura
Resultados
Nas Figuras 15, 16 e 17 apresentadas abaixo, é possível observar alguns resultados de hemoculturas positivas obtidas durante o período de estágio.
Figura 15: Streptococcus pyogenes isolado a partir de uma hemocultura positiva. Na Figura é possível observar um disco do teste de suscetibilidade à bacitracina.
Figura 16: Acinetobacter baumannii isolado a partir de uma hemocultura positiva.
Figura 17: S. agalactiae isolado a partir de uma hemocultura positiva.
3.4.3 Líquido Cefalorraquidiano (LCR)
No caso de um doente com uma suspeita de infeção das meninges, é realizada uma punção lombar para o estudo microbiológico dessa infeção. Aquando da colheita, a amostra a ser retirada para análise microbiológica é preferencialmente a terceira por se entender que as probabilidades de contaminação sejam menores (Fonseca et al., 2004). O LCR é entregue no Setor de Microbiologia em pequenos frascos de colheita de vidro apropriados.
A análise efetuada ao LCR é maioritariamente bacteriológica, no entanto, pode ainda ser requisitada uma avaliação citológica do mesmo em câmara de Fuchs-Rosenthal (Marienfeld Superior GmbH & Co., Lauda-Königshofen, Alemanha), estando o procedimento para o processamento de LCR apresentado abaixo na Figura 18.
Figura 18: Procedimento para análise bacteriológica e avaliação citológica de LCR. Adaptado de Fonseca et al., 2004 e Gilhus et al., 2011.
Resultados
Na Figura 19 apresentada abaixo é possível observar algumas células do sistema imunitário detetadas em LCR.
Figura 19: Observação de células mononucleares (A) e polimorfonucleares (B) durante uma avaliação citológica de LCR. Ampliação: 10x40=400X.
LCR
Exame cultural Exame direto Exame citológico
Sementeira em meio de cultura COS Sementeira em meio de cultura PVX Sementeira em meio de cultura VCAT3 (na suspeita de infeção
por Neisseria spp.) Esfregaço para coloração Gram Observação microscópica do LCR em câmara de Fuchs-Rosenthal Incubação em aerobiose, a 37 ºC durante 5 dias
Incubação em atmosfera rica em CO2,
a 37 ºC durante 5 dias
Observação dos meios de cultura
Identificação e TSA Observação ao MOC
A
3.4.4 Expetorações,
secreções
brônquicas,
lavados
brônquicos,
lavados
broncoalveolares e aspirados pulmonares
A análise microbiológica dos produtos biológicos obtidos aquando do processo infecioso do trato respiratório inferior é importante, pois permite averiguar as causas microbiológicas da infeção em questão (Fonseca et al., 2004).
A estes produtos biológicos podem ser realizadas várias análises, tais como análises bacteriológicas, micológicas e micobacteriológicas. Estes produtos biológicos são enviados essencialmente pela área hospitalar de internamento, em recipientes próprios, sendo as expetorações, os produtos biológicos mais frequentemente analisados no Setor de Microbiologia em relação aos produtos biológicos do trato respiratório (Tabela 2).
a) Análise bacteriológica, micológica e recolha de amostra para análise micobacteriológica
Durante a realização da análise bacteriológica, é efetuado um exame direto envolvendo este, um esfregaço para coloração pelo método de Gram e a sua posterior observação microscópica. Relativamente às expetorações e secreções brônquicas, este exame direto permite a avaliação da qualidade do produto biológico para análise. Deste modo, durante a realização da observação microscópica, são avaliadas a quantidade de células epiteliais e também a quantidade de leucócitos presentes (Fonseca et al., 2004).
Na Figura 20 abaixo situada, é apresentado o procedimento para análise bacteriológica, micológica e recolha de amostra para análise micobacteriológica de expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares.
Figura 20: Procedimento para análise bacteriológica, micológica e recolha de amostra para análise micobacteriológica de expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e
aspirados pulmonares. Adaptado de Fonseca et al., 2004.
Resultados
Nas Figuras 21 e 22 apresentadas abaixo, é possível observar alguns resultados obtidos na análise bacteriológica de expetorações.
Figura 21: Colónias de S. aureus, isoladas a partir da análise bacteriológica de uma expetoração.
Figura 22: Colónias de H. influenzae, isoladas a partir da análise bacteriológica de uma expetoração. Expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares
e aspirados pulmonares
Exame cultural Exame direto Análise micobacteriológica
Sementeira em meio de cultura COS Sementeira em meio de cultura CAN2 Esfregaço para coloração Gram Recolha de amostra do produto biológico para um tubo cônico e execução do procedimento descrito na página 23 posteriormente Incubação em aerobiose, a 37 ºC
durante 24 horas Observação dos meios de cultura Repicagem das colónias
do meio de cultura COS para meio de cultura PVX
na suspeita de Haemophilus influenzae Incubação em aerobiose, a 37 ºC durante 24 horas Observação do meio de cultura
Identificação e TSA Observação ao MOC
b) Análise micobacteriológica
As micobactérias são bactérias pertencentes ao género Mycobacterium spp. Estes microrganismos são imóveis, aeróbios obrigatórios e sem flagelo (Vega et al., 2005). O
Mycobacterium tuberculosis é das micobactérias que mais preocupação gera, uma vez que é
responsável pela doença crónica tuberculose, uma das doenças infeciosas mais letais a nível mundial, transmitida por via aérea/inalatória (ex: tosse) (WHO, 2018a, 2018b).
Na Figura 23 abaixo situada, é apresentado o procedimento para a análise micobacteriológica de expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares.
Figura 23: Procedimento para análise micobacteriológica de expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares. Adaptado de Bula informativa dos frascos de
cultura, Stinson et al., 2014 e Vega et al., 2005.
Expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares
Descontaminação com NaOH e homogeneização dos produtos biológicos (eliminação de microrganismos contaminantes)
Exame cultural Exame direto
Sementeira em meio de cultura LJ Sementeira em frasco de cultura BACT/ALERT® MP Esfregaço para coloração Ziehl-Neelsen Incubação em aerobiose, a 37 ºC até 60 dias Incubação no equipamento BACT/ALERT® 3D até 42 dias
Observação do meio de cultura Frasco BACT/ALERT® MP positivo
Esfregaço a partir das colónias observadas, para coloração Ziehl-Neelsen e observação ao MOC
Esfregaço para coloração Ziehl-Neelsen com posterior observação ao MOC e
sementeira em meio de cultura COS
Deteção e confirmação no Setor de Biologia Molecular
(Página 54)
Incubação do meio de cultura COS em aerobiose, a 37 ºC durante 18 a 24 horas
Observação do meio de cultura Caso não haja desenvolvimento de colónias no meio de cultura COS, é realizada a deteção e confirmação no Setor de Biologia Molecular (Página 54)
Observação ao MOC
Resultados
O exame direto é realizado através da execução de um esfregaço, com posterior coloração pelo método de Ziehl-Neelsen e respetiva observação microscópica. Este exame tem como objetivo a deteção de Bacilos Ácido-Álcool Resistentes (BAAR), em especial as micobactérias, sendo estas resistentes à descoloração. Esta resistência encontra-se associada a uma elevada concentração de ácidos micólicos na sua parede celular. Uma vez realizada a coloração com fucsina, estas estruturas impedem a descoloração com misturas de ácido-álcool. Os BAAR quando observadas ao MOC em preparações/esfregaços corados pelo método de Ziehl-Neelsen, apresentam-se de cor vermelha, finos, compridos e por vezes curvados (Vega et al., 2005; Stinson et al., 2014).
Durante o estágio, foi possível observar algumas lâminas com evidências da presença de BAAR, como se pode observar abaixo na Figura 24.
Figura 24: Observação microscópica de BAAR, após coloração através do método de Ziehl-Neelsen. Ampliação: 10x100=1000X.
3.4.5 Sémen
No Setor de Microbiologia, são realizadas análises ao sémen, de modo a avaliar a qualidade e quantidade do mesmo. Esta análise é requisitada maioritariamente no seguimento da consulta de fertilidade realizada no H.D.F.F., E.P.E.
Nesta análise são avaliados vários parâmetros qualitativos e quantitativos (Tabela 1), incluindo uma contagem de espermatozoides (SPZ) em câmara de Neubauer (Marienfeld Superior GmbH & Co., Lauda-Königshofen, Alemanha) (WHO, 2010).
Tabela 1: Parâmetros qualitativos e quantitativos avaliados na realização de um espermograma. Adaptado de WHO, 2010.
Sémen Parâmetros avaliados
à vista desarmada
Parâmetros avaliados por observação microscópica
Observação microscópica em câmara de Neubauer Cor Avaliação presuntiva do
número de SPZ por campo
Contagem de SPZ Volume total Vitalidade
Viscosidade
Mobilidade Opacidade
pH Morfologia
Resultados
Após a preparação, são realizadas observações ao MOC em lâmina normal (Figura 25) e em câmara de Neubauer (Figura 26), sendo avaliados os vários parâmetros por observação microscópica.
Figura 25: Observação microscópica a fresco de sémen (em lâmina normal), aquando de uma análise
de sémen. Ampliação: 10x100=1000X.
Figura 26: Observação microscópica de sémen em câmara de Neubauer, para contagem de SPZ.
3.4.6 Exsudado purulento superficial ou profundo e ponta de cateter
Um exsudado purulento pode ser superficial ou profundo e envolve uma colheita de pus de uma ferida. Relativamente às feridas, estas podem ser fechadas ou abertas (Fonseca et al., 2004).
Estes produtos biológicos podem chegar ao Setor de Microbiologia em zaragatoas (no caso de exsudados purulentos) ou em frascos de colheita de líquidos e fluidos biológicos (para os exsudados purulentos ou pontas de cateter). Tendo em conta o tipo e a proveniência do produto biológico, podem ser requisitadas análises para deteção e estudo de microrganismos aeróbios ou anaeróbios que poderão estar na origem da infeção. A análise destes produtos é essencialmente bacteriológica, estando o seu procedimento apresentado abaixo na Figura 27.
Figura 27: Procedimento para análise bacteriológica de exsudado purulento superficial ou profundo e ponta de cateter. Adaptado de Fonseca et al., 2004.
Exsudado purulento superficial ou profundo e ponta de cateter
Exame cultural Exame direto
Sementeira em meio de cultura COS Sementeira em meio de cultura COS Sementeira em meio de cultura SNVS Esfregaço para coloração Gram Incubação em aerobiose, a 37 ºC durante 18 a 24 horas Incubação em anaerobiose, a 37 ºC durante 18 a 24 horas Observação dos meios de cultura
Resultados
No processamento destes produtos biológicos, foram observados alguns casos positivos com relevância, apresentados abaixo nas Figuras 28, 29 e 30.
Figura 28: Staphylococcus epidermidis isolado a partir de um cateter com suspeita de contaminação.
Figura 29: Enterococcus faecalis isolado a partir de um exsudado purulento em zaragatoa.
Figura 30: Finegoldia magna isolada a partir de um exsudado purulento líquido.
3.4.7 Fezes
Os exames e as análises efetuadas às fezes no Setor de Microbiologia são orientados para a deteção e estudo de agentes etiológicos específicos causadores de doenças no trato gastrointestinal. As fezes são entregues em frascos de colheita estéreis, sendo sugerido aos utentes colheitas de três amostras em dias diferentes. Estes exames e análises podem envolver um exame macroscópico, um exame microscópico direto, uma análise bacteriológica e uma análise parasitológica com exame microscópico. Adicionalmente aos exames e análises referidas anteriormente, quando requisitado podem ainda ser efetuadas pesquisas/testes rápidos imunocromatográficos e/ou imunoenzimáticos (Fonseca et al., 2004). Estes últimos, são aplicados para rastreios e/ou deteção de agentes etiológicos específicos:
• Pesquisa de Sangue Oculto (PSO); • Pesquisa de Campylobacter spp.; • Pesquisa de Clostridium difficile; • Pesquisa de Rotavírus e Adenovírus; • Pesquisa de Helicobacter pylori;
• Pesquisa de Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia.
Os testes rápidos imunocromatográficos e imunoenzimáticos utilizados baseiam-se na deteção de antigénios específicos nas amostras de fezes. Os resultados obtidos nestes testes são lidos e interpretados tendo em consideração a presença ou ausência de determinadas bandas de cor nas linhas de teste (Bulas informativas dos Kits). Os resultados obtidos nestes testes podem ser posteriormente comparados com os resultados obtidos nas restantes análises, caso estas tenham sido efetuadas, conferindo um diagnóstico mais exato.
a) Exame macroscópico das fezes
Neste exame é tido em conta o aspeto macroscópico das fezes. É realizada a observação da presença de parasitas, presença de sangue, avaliação da sua cor e determinação do aspeto diarreico/líquido ou sólido das mesmas.
b) Exame microscópico direto das fezes
Com o objetivo de pesquisar e detetar leucócitos em fezes, pode ser efetuada quando requisitada, uma preparação a fresco para exame microscópico direto de amostras de fezes.
c) Fezes - coprocultura
A análise bacteriológica de fezes no Setor de Microbiologia é orientada para a deteção e estudo de microrganismos que infetam o trato gastrointestinal, tais como Salmonella spp. (Figura 32), Shigella spp., Yersinia enterocolitica, e Campylobacter spp. Alguns dos sintomas mais comuns em caso de infeção (sintomática) provocada por estes agentes etiológicos são diarreia, dores abdominais e febre (Fonseca et al., 2004; Murray et al., 2007). Esta análise envolve uma sementeira em vários meios de cultura diferentes e um meio de enriquecimento. Abaixo na Figura 31, é apresentado o procedimento para análise bacteriológica de fezes.
Figura 31: Procedimento para análise bacteriológica de fezes. Adaptado de Fonseca et al., 2004.
Resultados
Durante o período de estágio foi possível observar um isolamento de Salmonella enteritidis a partir de uma amostra de fezes, tal como se pode observar abaixo na Figura 32.
Figura 32: S. enteritidis obtida a partir da análise bacteriológica de fezes. Fezes
Exame cultural (para cada frasco) Sementeira em meio de cultura SS Sementeira em meio de cultura SALM Sementeira em meio de cultura MCK Sementeira em meio de enriquecimento Selenite F
Incubação em aerobiose, a 37 ºC durante 12 a 24 horas
Repicagem do meio Selenite F para um meio de cultura SS, um meio de
cultura SALM e um meio de cultura MCK Incubação em aerobiose, a
37 ºC durante 12 a 24 horas Observação dos meios de cultura
Identificação e TSA caso sejam observadas colónias suspeitas
Testes serológicos de aglutinação somáticos e flagelares na presença de colónias de Salmonella spp. ou Shigella spp.
