Estudos dos aspectos clínico-patológicos e da imunoexpressão das proteínas APE1 e XRCC1 em uma série de leucoplasias orais

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL. CAIO CÉSAR DA SILVA BARROS. ESTUDO DOS ASPECTOS CLÍNICO-PATOLÓGICOS E DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS APE1 E XRCC1 EM UMA SÉRIE DE LEUCOPLASIAS ORAIS. Natal - RN 2018.

(2) CAIO CÉSAR DA SILVA BARROS. ESTUDO DOS ASPECTOS CLÍNICO-PATOLÓGICOS E DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS APE1 E XRCC1 EM UMA SÉRIE DE LEUCOPLASIAS ORAIS. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Patologia Oral. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Éricka Janine Dantas da Silveira. Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Márcia Cristina da Costa Miguel.. Natal - RN 2018.

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(5) Dedicatória.

(6) Aos meus pais, pela dedicação a mim e por sonharem junto comigo.. “Por isso não tema, pois estou com você; Não tenha medo, pois sou o seu Deus. Eu o fortalecerei e o ajudarei; eu o segurarei com a minha mão direita vitoriosa” Isaías 41:10.

(7) Agradecimentos.

(8) AGRADECIMENTOS. A Deus, que me protege, capacita, concede força, guia todos os meus caminhos e que me faz vencedor. Ao meu pai, Ronald (in memoriam), por ser meu maior exemplo de perseverança e honestidade nesse mundo. Eu não seria ninguém sem a sua dedicação e amor. À minha mãe e melhor amiga, Neide, por não se abalar diante das dificuldades e por sempre me resgatar nos momentos em que não sou capaz de me encontrar. Aos meus irmãos, João Paulo e Gustavo, por me apoiarem incondicionalmente, mesmo nos inúmeros momentos em que me faço ausente. Vocês são a melhor parte de mim. À Prof.ª Dr.ª Éricka Janine Dantas da Silveira pela confiança e orientação, os quais foram fundamentais para o meu aprendizado. Obrigado por não medir esforços para me ensinar e me mostrar qual caminho devo seguir. Cada vez mais a senhora tem se tornado um exemplo para mim. À Prof.ª Dr.ª Márcia Cristina da Costa Miguel, a responsável pelo amor que sinto pela patologia. Para mim, a senhora sempre será um grande exemplo do que é ser pesquisador e ético. Muito obrigado por todos os ensinamentos, por ser acessível e por ter me ajuda tanto nessa reta final. Agradeço aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN, os quais foram fundamentais na minha formação. Ao Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, por sua dedicação e gentileza. À Prof.ª Dr.ª Lélia Batista de Souza, pela dedicação, oportunidades e por ser exemplo de amor à patologia oral. À Prof.ª Dr.ª Roseana de Almeida Freitas, pela serenidade e simplicidade ao transmitir o seus conhecimentos, pensamentos e opiniões. À Prof.ª Dr.ª Patricia Teixeira de Oliveira, pelos ensinamentos na clínica de Estomatologia e por toda atenção, confiança e ajuda. À Prof.ª Dr.ª Ana Miryam Costa de Medeiros, por todos os ensinamentos e pela confiança. À Prof.ª Dr.ª Hébel Cavalcanti Galvão, pelo carinho, simpatia e compreensão nos momentos de dúvidas. Ao Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, pela gentileza e atenção. À Prof.ª Dr.ª Lélia Maria Guedes Queiroz, agradeço pelos conhecimentos transmitidos, obrigado pelas sugestões no exame de qualificação. Ao Prof. Dr. Pedro Paulo Andrade dos Santos, pela disponibilidade e confiança depositada em mim. O senhor é um grande exemplo de docente. Ao Prof. Dr. Kênio Costa Lima, pelos ensinamentos.

(9) na disciplina de bioestatística e ao Prof. Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel, pelos ensinamentos na disciplina de patologia periodontal e metodologia do ensino superior. Aos meus amigos de mestrado, que fizeram esses dois anos serem incríveis. Israel, o irmão que a patologia me deu. Muito obrigado pela sua generosidade e ajuda, pelas conversas e conselhos, e principalmente por aguentar todos os meus abusos. Você é uma das pessoas mais competentes e incríveis que já conheci, seu futuro será brilhante e tenha a certeza de que sempre estarei ao seu lado. Larissa, a irmã que eu nunca tive. Obrigado por lançar a doçura do seu mundo na amargura dos dias, como também pelas conversas durante as madrugadas, onde o sono não se fazia presente. Tenha a certeza de que você me fez ser uma pessoa melhor. E lembre-se, você é mais forte e capaz do que imagina, nunca pense ou deixe que digam o contrário. Deborah, admiro muito a profissional que você é. Obrigado pela amizade que vem desde a graduação, dentre todas as pessoas que já conheci, você certamente é a com o coração mais bondoso. Aguardo as nossas próximas jornadas. Juliana, obrigado pelas risadas e momentos de descontração e por compartilhar o mesmo gosto musical. A verdade é que a sua loucura parece um pouco com a minha. Cristianne, a mãe de toda a turma. Obrigado pela sua amizade e generosidade. Para mim você sempre será um exemplo de competência e dedicação. Obrigado Mariana, por me ensinar que as coisas podem e devem ser simplificadas. Agradeço também pelas risadas gratuitas e pelos jargões ensinados, tenho certeza de que você será uma docente inesquecível. Yailit, lhe agradeço por mostrar o significado de coragem. Sempre levarei comigo a sua gentileza, carinho e o ensinamento de que o abraço é algo transformador. Agradeço a Ondina, pelos momentos compartilhados, pela acolhida na família patológica e por me ensinar que devo ser exigente em tudo aquilo que eu fizer. Obrigado Dáurea, pelas risadas e por mostrar que a gente não deve se abalar com os percalços da vida. Você é uma pessoa muito forte, lhe admiro por isso. Glória, sou grato por você mostrar que é necessário ver o mundo de uma maneira diferente, que assim podemos ser pessoas melhores. Rômulo, obrigado por sempre estar a disposição e não medir esforços para ajudar. Everton, obrigado pelo companheirismo e momentos compartilhados. É como sempre comentamos, tudo foi no tempo certo e cada um da nossa turma foi escolhido a dedo por Deus. Aos colegas doutorandos, Mara, Maria Luiza, Leorik, Rodrigo, Amanda, Hugo, Patrícia, Luiz Arthur, Luciana, Marcelo, Tiago, Andreia, Rafaela e Salomão agradeço a receptividade e a boa vontade em ensinar nos momentos de dúvida. Agradeço, de forma especial, a Hellen e Hianne por mostrarem de forma simples que a amizade, gentileza e o bom.

(10) senso são necessários e que eles sempre devem prevalecer. Vocês são pessoas maravilhosas, tenho certeza de que o sucesso e a felicidade é algo certo na vida de vocês duas. Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, Gracinha, Sandrinha, Hevio, Ricardo, Betsaida, Francianne, Idelzuite e Lurdinha pela disponibilidade e por sempre ajudar. Agradeço aos amigos que a vida me trouxe, tanto nos tempos de escola quanto na graduação. Obrigado por torcerem por mim, pelas conversas sinceras, conselhos e por me ouvirem nos momentos em que eu só reclamava das atribulações e percalços da vida. Vocês sempre serão importantes para mim. Ao CNPq, pelo apoio financeiro desta pesquisa e durante o curso de mestrado.. “All these places had their moments With lovers and friends, I still can recall Some are dead, and some are living In my life, I've loved them all”. In my life - The Beatles.

(11) Resumo.

(12) RESUMO Introdução: A leucoplasia oral (LO) é a desordem potencialmente maligna mais frequente encontrada na prática odontológica. À análise histopatológica, a maioria das LO exibe mudanças histológicas que podem estar associadas ou não a uma displasia epitelial (DE), entretanto, não há um consenso se a presença de DE é indicativa de transformação maligna. O reparo do DNA é um importante mecanismo genético relacionado à carcinogênese. Nesse processo, genes e proteínas específicas atuam na detecção e remoção do dano com posterior reparo do DNA, destacando-se nesta pesquisa, a via de reparo por excisão de base (BER), na qual as proteínas APE1 e XRCC1 atuam. Assim, o objetivo desse estudo foi verificar se as proteínas APE1 e XRCC1 encontram-se associadas a parâmetros clínico-patológicos das LOs. Métodos: Foram selecionados 40 pacientes diagnosticados com LO, para cada caso, foi realizada a análise morfológica, onde nos casos em que houve DE, foi realizada a gradação histopatológica de DE de acordo com a Organização Mundial de Saúde (2017). A expressão imuno-histoquímica de APE1 e XRCC1 foi avaliada em 24 casos de LO e em seis casos de mucosa oral normal (MON). Foi realizada uma análise semiquantitativa, onde os casos foram classificados em imunoexpressão negativa (0-10% de células imunomarcadas), baixa (11-50% de células imunomarcadas) e alta imunoexpressão (>50% de células imunomarcadas). Para a análise estatística foram realizados os testes Qui-quadrado de Pearson e Exato de Fisher (significância de p≤0,05). Resultados: Dos 40 casos de LOs, 65% eram do gênero feminino, com idade média de 58 anos. Trinta pacientes possuíam histórico de tabagismo. A língua foi o sítio anatômico mais acometido (27.5%). Trinta e dois casos apresentaram lesões homogêneas, enquanto 60% e 41.2% dos casos exibiram lesões múltiplas e recidiva das lesões, respectivamente. Foi observada associação estatisticamente significativa nos casos gradados como DE moderada/severa com o aspecto clínico não-homogêneo da lesão (p=0.039). As proteínas APE1 e XRCC1 apresentaram alta expressão na MON e na LO independente da presença ou não de displasia epitelial. A APE1 demonstrou imunomarcação nuclear em 60% dos casos gradados como DE moderada ou severa (p=0.005). Conclusões: O aspecto clínico não-homogêneo das LOs foi um forte indicador da presença de DE moderada/severa. As proteínas APE1 e XRCC1 não parecem estar relacionadas aos processos moleculares envolvidos com desenvolvimento e com os aspectos clínico-patológicos das leucoplasias orais.. Palavras-chave: Leucoplasias orais. Displasia epitelial. Reparo do DNA..

(13) Abstract.

(14) ABSTRACT. Background: Oral leukoplakia (OL) is the most frequent oral potentially malignant disorder in dental practice. At histopathological examination, most of the OLs exhibit histological changes that may or may not be associated with epithelial dysplasia (ED), however, there is no consensus if the presence of ED is indicative of malignant transformation. DNA repair is an important genetic mechanism related to carcinogenesis. In this process, specific genes and proteins act in the detection and removal of the damage with subsequent DNA repair, highlighting in this research the base excision repair (BER) pathway which APE1 and XRCC1 proteins act. Thus, the aim of this study was to verify if the APE1 and XRCC1 proteins are associated with clinicopathological features. Methods: Forty patients diagnosed with OL were selected, clinical data were collected in the clinical records and during each patient’s follow-up. For each case, morphological analysis was performed, in case where there was ED the epithelial dysplasia grading. according. with. the. World. Health. Organization. was. performed.. The. immunohistochemical expression of APE1 and XRCC1 was evaluated in 24 cases of OL and in six cases of normal oral mucosa (NOM). A semiquantitative analysis was performed, where the cases were classified as negative immunoexpression (0-10% of positive cells), low (11-50% of positive cells) and high immunoexpression (> 50% of positive cells). Pearson’s chi-square and Fisher's exact tests were performed to determine the association between protein expression and clinicopathological features (significance of p≤0.05). Results: Of the 40 cases of OL 65% were female with a mean age of 58 years. Thirty patients had tobacco consumption habit. Tongue was the most affected location (27.5%). Thirty-two cases presented homogeneous lesions while 60% and 41.2% of the cases showed multiple lesions and lesions recurrence, respectively. A significant association was observed in the cases graded as moderate/severe ED with the non-homogeneous clinical aspect (p=0.039). APE1 and XRCC1 proteins showed high expression in NOM and OL independent of the presence or absence of epithelial dysplasia. APE1 demonstrated nuclear immunostaining in 60% of cases graded as moderate or severe epithelial dysplasia (p=0.005). Conclusions: The non-homogeneous clinical aspect of OL was a strong indicator of the presence of moderate/severe epithelial dysplasia. The APE1 and XRCC1 proteins do not appear to be related to molecular processes involved in the development and with the clinicopathological features of oral leukoplakias. Keywords: Oral leukoplakias. Epithelial dysplasia. DNA repair..

(15) Lista de Siglas e Abreviaturas.

(16) LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS. ▪ AP-1. Do inglês Activator protein 1, traduzido como Proteína ativadora 1. ▪ APE1. Do inglês apurinic/apyrimidinic AP endonuclease 1, traduzido como APendonuclease apurínica/apirimidínica 1. ▪ BER. Do inglês Base excision repair, traduzido como reparo por excisão de base. ▪ CCE. Carcinoma de células escamosas. ▪ CCEO. Carcinoma de células escamosas oral. ▪ CEP. Comitê de Érica em Pesquisa. ▪ CNS. Conselho Nacional de Saúde. ▪ CO. Câncer oral. ▪ DAB. Diaminobenzidina. ▪ DE. Displasia epitelial. ▪ DNA. Do. inglês. Deoxyribonucleic. acid,. traduzido. como. ácido. desoxirribonucléico ▪ DOD. Departamento de Odontologia. ▪ DPMs. Desordens potencialmente malignas. ▪ EGR-1. Do inglês Early growth response protein 1, traduzido como proteína 1 da resposta primária de crescimento. ▪ EROs. Espécies reativas de oxigênio. ▪ H2O2. Peróxido de Hidrogênio. ▪ HE. Hematoxilina/Eosina. ▪ HIF-1. Do inglês Hypoxia-inducible factor 1, traduzido como fator indutor de hipóxia 1. ▪ HIV. Do inglês Human immunodeficiency virus, traduzido como Vírus da imunodeficiência humana. ▪ HPV. Do inglês Human papiloma virus, traduzido como vírus do papiloma humano. ▪ INCA. Instituto Nacional do Câncer. ▪ KPNA2. Carioferina 2. ▪ LO. Leucoplasia oral. ▪ LVP. Leucoplasia verrucosa proliferativa.

(17) ▪ MMR. Do inglês Mismatch repair, traduzido como reparo de pareamentos errados. ▪ MON. Mucosa oral normal. ▪ MPG. Do inglês N-methylpurine DNA glycosylase. ▪ mtDNA. Do inglês Mitochondrial deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido desoxirribonucleico mitocondrial. ▪ NEIL2. Do inglês E.coli Fpg/Nei-like 2. ▪ NER. Do inglês Nucleotide excision repair, traduzido como reparo de excisão de nucleotídeo. ▪ NF-κB. Do inglês Nuclear factor kappa B, traduzido como Fator nuclear kappa B. ▪ NMPI. Neoplasia mucinosa papilar intraductal. ▪ NSL. Do inglês Nuclear localization signals, traduzido como sinais de localização nuclear. ▪ OGG1. Do inglês 8-Oxoguanine DNA N-glycosylase 1. ▪ OMS. Organização Mundial da Saúde. ▪ PCR. Do inglês Polymerase chain reaction, traduzido como Reação em cadeia da polimerase. ▪ pH. Potencial Hidrogeniônico. ▪ SPSS. Do inglês Statistical Packagefor the Social Sciences. ▪ TA. Temperatura ambiente. ▪ TCLE. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. ▪ TRIS. Tris-hidroximetil-aminometano. ▪ UFRN. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. ▪ XRCC1. Do inglês X-ray Repair Cross-complementing Group 1.

(18) Sumário.

(19) SUMÁRIO. 1. REFERENCIAL TEÓRICO........................................................................ 18. 1.1. LEUCOPLASIAS ORAIS............................................................................... 18. 1.2. MECANISMOS DE REPARO DO DNA........................................................ 22. 1.3. ASSOCIAÇÃO DAS. PROTEÍNAS. APE1. E XRCC1 COM O. DESENVOLVIMENTO DO CÂNCER.......................................................... 24. 2. OBJETIVOS.................................................................................................. 28. 2.1. OBJETIVOS GERAIS.................................................................................... 28. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................... 28. 3. ARTIGO......................................................................................................... 30. 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................ 52. REFERÊNCIAS............................................................................................ 54. APÊNDICES.................................................................................................. 58. ANEXOS........................................................................................................ 63.

(20) Referencial Teórico.

(21) 18. 1 REFERENCIAL TEÓRICO 1.1 LEUCOPLASIAS ORAIS O carcinoma de células escamosas (CCE) é o tipo mais frequente de neoplasia maligna da cabeça e pescoço, correspondendo a 90% das neoplasias malignas desta região. (NOGUTI et al., 2012; PEREIRA et al., 2014). O surgimento dessa neoplasia pode ser precedido pela presença das desordens potencialmente malignas (DPMs). A detecção e o tratamento das DPMs são de extrema importância, no intuito de impedir a sua progressão para o carcinoma de células escamosas oral (ABRAHAM et al., 2016). A Organização Mundial de Saúde (OMS), em 2017, definiu as DPMs como um tecido benigno morfologicamente alterado, que apresenta um risco maior de sofrer transformação maligna, listando as seguintes condições nesse grupo: leucoplasias oral (LO), eritroplasia oral, leucoplasia verrucosa proliferativa, fibrose submucosa oral, queilite actínica e líquen plano oral (EL-NAGGAR et al., 2017). Entre as DPMs, a LO é a mais comumente encontrada na prática clínica, sendo a sua prevalência global estimada em 2,60%, entretanto, a prevalência da LO é variável no mundo, de acordo com a exposição a fatores de risco (WARNAKULASURIYA; ARIYAWARDANA, 2016). Além disso, Yardimci et al. (2014) apontaram que a prevalência da LO, em diferentes países, pode variar de 1,1 a 11,7%. A LO é definida como uma “placa branca de risco questionável que não pode ser caracterizada clínica ou patologicamente como outra doença” (MASTHAN et al., 2015; VILLA; WOO, 2017). O seu diagnóstico é realizado pela exclusão de outras doenças ou distúrbios conhecidos que não possuem nenhum risco de desenvolver um câncer (BROUNS et al., 2013). A LO apresenta maior incidência em homens, na razão de 2:1, da raça branca e a partir da quinta década de vida, além disso, cerca de 90% dos casos de LOs são associados ao uso do tabaco (NAPIER; SPEIGHT, 2008), sendo relatado que essas lesões são seis vezes mais frequentes em fumantes do que em não fumantes (YARDIMCI et al., 2014). Clinicamente as LO podem se apresentar como lesões homogêneas: placas planas, onduladas ou enrugadas; e não-homogêneas: placas verrucosas, nodulares, com presença de áreas avermelhadas (eritroleucoplasia), podendo ainda estar ou não ulceradas. As lesões homogêneas são caracterizadas pela aparência uniforme, delgada e cor predominantemente branca, enquanto que as não-homogêneas podem exibir áreas vermelhas, aspecto verrucoso ou.

(22) 19. nodular e ainda associação desses aspectos (YARDIMCI et al., 2014; CARRARD, VAN DER WAAL, 2018). É importante ressaltar que a leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP) constitui um outro tipo de leucoplasia descrita como uma condição progressiva e de longa duração, que se desenvolve inicialmente como uma placa branca de crescimento lento e persistente, irreversível, resistente ao tratamento e com alto potencial de sofrer transformação maligna; não sendo incomum também encontrar ao longo do seu desenvolvimento lesões verrucosas e/ou eritematosas (GARCIA-CHIAS et al., 2014; EL-NAGGAR et al., 2017). Carrard e van der Waal (2018) descreveram alguns aspetos clínicos e demográficos importantes para o diagnóstico das LOs, citando que estas lesões raramente ocorrem até a segunda década de vida, que o gênero não é relevante para o diagnóstico e que a mesma é mais frequente em pacientes fumantes, apesar do hábito de fumar não ser um parâmetro clínico relevante para seu diagnóstico. A realização de biópsia nas suspeitas clínicas de leucoplasia é importante para descartar outras condições e para avaliar a presença de displasia epitelial (DE), a qual consiste em alterações citomorfológicas e estruturais que caracterizam a progressão de um tecido normal para um tecido morfologicamente alterado (WARNAKULASURIYA et al., 2008; CARRARD; VAN DER WAAL, 2018). A Organização Mundial da Saúde (OMS) sugere uma avaliação baseada em critérios para gradar as displasias. A DE leve demonstra a proliferação ou hiperplasia de células das camadas basal e parabasal e que não se estende para além do terço inferior do epitélio. As atipias citológicas consistem em pleomorfismo celular e nuclear leve, com rara presença de mitoses, que quando encontradas localizam-se na camada basal, além das alterações arquiteturais serem mínimas; a DE moderada exibe uma proliferação de células atípicas que vão até o terço médio do epitélio. As alterações citológicas são mais graves que na DE leve e o hipercromatismo e pleomorfismo nuclear são proeminentes, há presença de figuras de mitoses anormais, as mudanças arquiteturais podem ser vistas no terço inferior do epitélio e frequentemente a hiperceratose está associada; a DE severa mostra alterações celulares que se estendem da camada basal ao terço superior do epitélio, mitoses tripolares e bizarras, além de em alguns casos haver perda da estratificação e produção anormal de ceratina (EL-NAGGAR et al., 2017)..

(23) 20. Apesar destes critérios serem reconhecidos e bem aceitos, as análises histopatológicas das DEs continuam difíceis, pois ainda há grande variabilidade na interpretação da sua presença e grau de severidade. Vários estudos mostram grande variabilidade inter e intraexaminador, sendo a estratificação epitelial irregular, perda de polaridade das células basais, hipercromatismo e tamanho nuclear, os critérios que mais causam discordâncias (KUJAN et al., 2006; SPEIGHT, 2007; WARNAKULASURIYA et al., 2008). Diante desses aspectos, Kujan et al. (2006) elaboraram um novo sistema de classificação binária em DE orais, no intuito de complementar, de acordo com critérios celulares e arquiteturais, a classificação de 2005 da Organização Mundial de Saúde. Esse sistema, que busca gradar as DEs em alto e baixo risco de transformação maligna, mostra um maior consenso entre os profissionais e ajuda a tomar decisões mais precisas, principalmente nos casos de displasia epitelial moderada. Ainda que o risco de transformação maligna das LO seja difícil de avaliar, estudos mostram que as taxas de transformação maligna das LOs variam entre 0,13% e 34%, sendo a média de 14,9%. Quatro características são associadas a uma maior taxa de transformação: idade, local, tipo de LO e presença de displasia. A idade mais avançada, presença da lesão em sítio látero-ventral da língua, aparência clínica não-homogênea e alto grau de displasia epitelial possuem um risco mais elevado de transformação (LIU et al., 2012; WARNAKULASURIYA; ARIYAWARDANA, 2016). Warnakulasuriya, Johnson e Van Der Waal (2007) relataram que as taxas de transformação maligna das LOs variam significantemente entre os estudos, sendo estimado que anualmente menos de 2% dessas lesões sofram transformação maligna e que menos de 0,03% dos CCEOs sejam atribuídos a uma LO precursora. A LO tende a ter uma maior transformação maligna em mulheres mais velhas quando comparada a indivíduos jovens ou do sexo masculino. O sítio mais associado com a transformação das lesões é a língua, correspondendo a cerca de 24,22%, seguido pelo assoalho de boca. Uma característica importante é a aparência clínica da LO, pois embora, clinicamente, o tipo homogêneo seja o mais comum, a taxa de transformação maligna mais alta corresponde às. lesões. não-homogêneas,. com. cerca. de. 59%. de. transformação. dos. casos. (WARNAKULASURIYA; ARIYAWARDANA, 2016). Dentro deste grupo, é relatado que 23,4% dos casos de eritroleucoplasia se transformam em CCEO, principalmente quando estas lesões possuem tamanho superior a 200 mm2 (LIU et al., 2012; WARNAKULASURIYA; ARIYAWARDANA, 2016)..

(24) 21. Dost et al. (2013) realizaram um estudo clínico e histopatológico em 124 pacientes portadores de DE. Destes, 27 pacientes sofreram transformação maligna. Os autores encontraram que o aspecto clínico não-homogêneo das LOs foi fortemente associado com a presença de algum grau de DE. Além disso, o grau de DE foi associado com a localização da lesão e histórico de tabagismo, sugerindo que o aspecto clínico não-homogêneo é um fator independente e que influencia no grau da displasia epitelial. Como anteriormente referido, nem sempre o grau de DE é indicativo da maior ou menor probabilidade da LO sofrer transformação maligna. No estudo realizado por Silverman, Gorsky e Lozada. (1984) nos Estados Unidos, 15.7% dos pacientes com diagnóstico de hiperceratose desenvolveram CCEO. No estudo realizado por Schepman et al. (1998), foi verificado que 30% dos pacientes com diagnóstico histopatológico de hiperceratose exibiram CCEO durante o acompanhamento clínico. Quando há presença de carcinoma in situ e DE, a taxa de transformação maligna varia de 5 a 36% a depender da exposição a hábitos como o uso de betel e fumo mascado (VILLA; WOO, 2017). Narayan e Shilpashree (2016), verificaram em sua metanálise sobre riscos clínicopatológicos associados a transformação maligna das LOs, que existem casos de LO sem displasia que sofreram transformação maligna, fato que os conduziram a sugerir que a ausência de DE não exclui a possibilidade de transformação maligna. Villa e Woo (2017) relataram que a transformação maligna das LOs é conduzida por múltiplas alterações genéticas e epigenéticas e que as LOs podem exibir algumas das mesmas mutações observadas no câncer. Conforme Dost et al. (2013), o aspecto clínico frequentemente direciona a decisão da intervenção cirúrgica e a forma de acompanhamento, muito embora outros fatores como o tamanho da lesão, idade, gênero, histórico de exposição ao fumo sejam importantes para a conduta clínica. Conforme relataram Holmstrup e Dabelsteen (2016), o fato da LO poder ser derivada de um ou vários clones de células dentro de uma grande área da mucosa oral, os quais são invisíveis ao exame clínico, pode explicar em parte os erros que ocorrem em alguns procedimentos de remoção cirúrgica, o que torna o manejo dessas lesões complicado. Assim, os autores sugeriram que a remoção dessas lesões deve envolver tecido sadio adjacente e os pacientes devem ser acompanhados em curtos intervalos de tempo..

(25) 22. Conforme mencionado anteriormente, as displasias são caracterizadas pela presença de alteração na estrutura celular, como também pela mudança da arquitetura normal do tecido. Essas alterações celulares ocorrem devido a modificações genéticas e epigenéticas, geralmente danos às bases do DNA. Entretanto, a maioria desses danos ao DNA são temporários, visto que são corrigidos por processos que compõem o reparo do DNA. Caso não sejam corrigidas, essas alterações levam à propagação de mutações para as gerações celulares subsequentes (SCULLY; FIELD; TANZAWA, 2000; IYAMA; WILSO, 2013; HINZ; CZAJA, 2015). 1.2 MECANISMOS DE REPARO DE DNA. O DNA pode ser danificado por diversos eventos mutagênicos decorrentes da exposição a agentes químicos (carcinógenos, como o tabaco), físicos (ex.: radiação ionizante) ou biológicos (ex.: microrganismos, como o vírus HPV); entretanto, acredita-se que alguns danos surjam de forma espontânea. Assim, os sistemas de reparo do DNA mantêm a integridade do genoma e previne a carcinogênese (SCULLY; FIELD; TANZAWA, 2000; IYAMA; WILSO, 2013; HINZ; CZAJA, 2015) Alguns estudos mostram que algumas proteínas associadas ao reparo de DNA se encontram desreguladas em carcinomas de pulmão, ovário, mama, bexiga, estômago e de cabeça e pescoço. Além disso, a expressão desregulada destas proteínas está associada a um maior grau de malignidade, presença de metástases e menor sobrevida no CCE de cabeça e pescoço (UPAL, 2014; MAHJABEEN et al., 2014). Os mecanismos de reparo do DNA são variados, complexos e envolvem aproximadamente 150 genes. Esses mecanismos são subdivididos em cinco grupos principais: reparo de excisão de base (BER, do inglês base excision repair), reparo de excisão de nucleotídeo (NER, nucleotide excision repair), reparo de pareamentos errados (MMR, mismatch repair), reparo de quebra de dupla fita (recombinação homóloga e junção terminal não homóloga) e reparo direto (exclusivo de organismos procariotos e eucariotos não placentários) (SCULLY; FIELD; TANZAWA, 2000; IYAMA; WILSO, 2013; HINZ; CZAJA, 2015) A via BER é uma das principais vias envolvidas na resposta a danos provocados por estresse oxidativo, desaminação e alquilação. Tal via atua por meio de mecanismos de.

(26) 23. eliminação de bases nitrogenadas danificadas (oxidadas ou alquiladas) ou até mesmo erroneamente utilizadas. Ela também é responsável por reparar quebras de DNA de fita simples provocadas por espécies reativas de oxigênio (EROs) (SCULLY; FIELD; TANZAWA, 2000; IYAMA; WILSO, 2013; HINZ; CZAJA, 2015). Dentre as proteínas envolvidas no reparo do DNA pela via BER, A APE1 (APendonuclease apurínica/apurimidínica) é uma proteína multifuncional que processa o reparo do DNA e atividades regulatórias transcricionais, exercendo um papel pleiotrópico no controle da resposta celular ao estresse oxidativo. Essa é a principal endonuclease apurínica/apurimidínica em células eucarióticas, que desenvolve uma função central na via BER, quando ocorrem lesões no DNA, causadas por alquilações, oxidações, sítios abásicos e quebras de fitas simples de DNA (TELL et al., 2009). Adicionalmente, Hsia et al. (2016) relataram que a APE1 exerce importante papel na regulação redox de fatores de transcrição, tais como fator nuclear kappaB (NF-κB), p53, AP-1 e fator indutor de hipóxia 1 (HIF-1). Tell et al. (2005) relataram que a APE1 é importante para a sobrevivência celular e sua frequente superexpressão em células tumorais sugere um papel fundamental dessa proteína na prevenção de morte celular e no controle da proliferação celular. Estudos também demonstram que a heterogeneidade no padrão de expressão da APE1 está relacionada a diferentes condições patológicas que variam de desordens metabólicas ao câncer, como também doenças neurodegenerativas; e que diferentes tipos de tumores humanos foram caracterizados por alterações na expressão celular de APE1 em relação ao tecido não tumoral (TELL et al., 2009; HSIA et al., 2016). A XRCC1 (X-ray Repair Cross-complementing Group 1), inicialmente clonada em 1990, pertence ao grupo das proteínas scaffold que são reguladoras cruciais em diversas vias de sinalização. Tais proteínas não tem suas funções totalmente definidas, entretanto, sabe-se que regulam a transdução de sinal e ajudam a direcionar componentes da via de sinalização, organizando-os em complexos. Aparentemente, XRCC1 não possui ação enzimática, entretanto, atua no suporte a outros fatores de reparo, coordenando principalmente a função de enzimas que dão início ao processo de reparo, como a MPG (N-methylpurine DNA glycosylase), OGG1 (Oxoguanine-DNA N-glycosylase homolog) e NEIL2 (E.coli Fpg/Nei-like 2) (ALMEIDA; SOBOL, 2007, SANTANA et al., 2017)..

(27) 24. Estudos in vitro e in vivo demonstraram que XRCC1 participa no reparo do DNA por meio da via BER. A perda de XRCC1 resulta na diminuição da estabilidade genômica, no aumento da frequência de translocações e deleções cromossômicas espontâneas ou induzidas, sendo essa instabilidade genética propícia para carcinogênese (DUTTA et al., 2017).. 1.3 ASSOCIAÇÃO DAS PROTEÍNAS APE1 E XRCC1 COM O DESENVOLVIMENTO DO CÂNCER. Tem sido relatado que mutações nos genes de reparo encontram-se associadas ao desenvolvimento de diversas neoplasias, assim como a resistência de células malignas ao tratamento quimioterápico (ROBERTSON; EVANS; ABRAHAMSE, 2009). A via BER é considerada uma das principais no reparo ao dano oxidativo do DNA (IYAMA; WILSO, 2013; HINZ; CZAJA, 2015; SANTANA et al., 2017). Dessa forma, nos últimos anos, estudos moleculares têm investigado possíveis associações entre alterações nos genes das proteínas APE1 e XRCC1 com o risco para o desenvolvimento de câncer, entretanto esta informação ainda é controversa na literatura. A expressão da XRCC1 através de PCR foi avaliada em 172 casos de CCE esofágico e os autores observaram que uma alta expressão desta proteína foi correlacionada a uma maior média de sobrevida global em todos os pacientes (WEI et al., 2015). Por outro lado, outro estudo com 137 casos de CCE de cabeça e pescoço, demonstrou alta expressão da XRCC1 em 77 casos, a qual esteve associada a pior sobrevida global e pior sobrevida livre de doença, especialmente em pacientes em tratamento com radio e quimioterapia (ANG et al., 2011). Em estudo realizado com pacientes com CCE de cabeça e pescoço observou-se, através de técnica imuno-histoquímica, uma subregulação da XRCC1 em tecido tumoral. Essa subregulação foi maior em tumores pobremente diferenciados, com resultados semelhantes aos observados para carcinomas de pulmão e de estômago; como também observaram correlação inversa entre a imunoexpressão da XRCC1 e APE1, sugerindo que essas proteínas podem ser biomarcadores úteis na classificação molecular e para determinar o prognóstico dos CCE de cabeça e pescoço (MAHJABEEN et al., 2014). Adicionalmente, expressão elevada ou distribuição intracelular alterada da proteína APE1 tem sido observada em diversas neoplasias, incluindo as de colo do útero, ovário, próstata, trato gastro-esofágico, pâncreas, cabeça e pescoço e pulmão. Existe crescente.

(28) 25. evidência de que a APE1 possui valor prognóstico e está relacionada à agressividade em diversos tumores. Pesquisadores acreditam que células neoplásicas que expressam altas quantidades de APE1 possam conferir resistência terapêutica e influenciar negativamente o prognóstico dos pacientes e na resistência ao tratamento radio e quimioterápico (MAHJABEEN et al., 2014; HSIA et al., 2016). Woo et al. (2014), relataram elevada imunoexpressão nuclear da APE1 em um estudo com 239 casos de câncer de mama. Foram observados 177 casos com elevada expressão da APE1 e apenas 62 casos com baixa expressão. Apesar da elevada imunoexpressão mostrar uma tendência à associação com pior prognóstico, em relação à sobrevida livre de doença, não houve diferença significante na sobrevida global entre os casos com alta ou baixa expressão dessa proteína, assim, os autores sugeriram que essa proteína pode exercer um papel significativo no câncer de mama (WOO et al., 2014). Para casos de câncer do trato gastrointestinal também foi relatada elevada expressão da APE1. Neste estudo, observou-se que 86,9% de 107 casos de carcinomas gástricos apresentaram imunoexpressão nuclear e citoplasmática positiva e que esta expressão esteve significativamente associada com profundidade de invasão, metástase linfonodal, subtipo histopatológico, sobrevida global e tamanho do tumor. Sendo assim, os autores concluíram que a imunoexpressão da APE1 é um fator de risco e biomarcador prognóstico para câncer do trato gastrointestinal (QING et al., 2015). Mahjabeen et al. (2014) também encontraram elevada imunoexpressão de APE1 em 50 casos de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço. A intensa expressão da proteína APE1 foi significativamente associada a um pior grau histopatológico de malignidade. Assim, os autores sugeriram que as proteínas da via BER podem ser biomarcadores úteis para o prognóstico dos CCE de cabeça e pescoço. Em estudo com 146 casos de CCEO, Hsia et al. (2016) detectaram elevada imunoexpressão nuclear (com fraca expressão citoplasmática) da APE1 em 52,73% dos casos, o que foi correlacionado com a presença de metástase linfonodal e o tamanho do tumor. Deste modo, os autores sugerem que a APE1 pode estar envolvida na progressão do CCEO e pode servir como um marcador prognóstico nessas neoplasias. Santana et al. (2017) analisaram a expressão imuno-histoquímica de APE1 e XRCC1 em 82 casos de CCEO de língua e verificaram que a APE1 foi altamente expressa no núcleo e citoplasma em 64,4% dos casos e que XRCC1 mostrou superexpressão somente no núcleo em 61% dos casos. A elevada expressão de XRCC1 foi significativamente associada com tumores.

(29) 26. em estágios iniciais e com ausência de metástases em linfonodos cervicais. Adicionalmente, os autores acreditam que as proteínas do sistema de reparo BER estão envolvidas na iniciação e progressão do câncer..

(30) 27. Objetivos.

(31) 28. 2 OBJETIVOS. 2.1 OBJETIVOS GERAIS. Avaliar a expressão imuno-histoquímica das proteínas APE1 e XRCC1 e a sua associação com aspectos clínico-patológicos em uma série de casos de LOs, visando contribuir para o entendimento do papel destas proteínas na patogênese das leucoplasias orais.. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS •. Analisar se a localização, aspectos clínicos (lesão homogênea/não-homogênea), presença de lesões múltiplas e recidiva estão associados com os graus de DE oral;. •. Verificar se os aspectos clínicos (lesão homogênea/não-homogênea e localização intraoral) e a presença de recidiva e lesões múltiplas encontram-se associados ao tabagismo e etilismo;. •. Verificar se os hábitos de fumar e beber estão associados aos graus de DE oral;. •. Analisar o perfil da expressão imuno-histoquímica das proteínas APE1 e XRCC1 em amostras de pacientes portadores de leucoplasia oral;. •. Analisar se a expressão imuno-histoquímica das proteínas APE1 e XRCC1 está associada com os aspectos clínicos (lesão homogênea/não-homogênea e localização) e a presença de recidiva e lesões múltiplas;. •. Associar a expressão imuno-histoquímica das proteínas APE1 e XRCC1 com os graus de DE oral..

(32) 29. Artigo.

(33) 30. 3 ARTIGO. ASPECTOS CLÍNICO-PATOLÓGICOS E IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS APE1 E XRCC1 EM UMA SÉRIE DE LEUCOPLASIAS ORAIS *. CLINICALPATHOLOGICAL FEATURES AND IMMUNOEXPRESSION OF APE1 E XRCC1 PROTEINS IN A SERIES OF ORAL LEUKOPLAKIAS. Caio César da Silva Barrosa, Maria Luiza Diniz de Sousa Lopesa, Márcia Cristina da Costa Miguelb, Roseana de Almeida Freitasb, Éricka Janine Dantas da Silveirab.. a. Aluno do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral pela Universidade Federal do Rio. Grande do Norte, Rio Grande do Norte, Brasil. b. Professora do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral pela Universidade Federal do. Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte, Brasil.. Caio César da Silva Barros Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte Av. Senador Salgado Filho, 1787, Lagoa Nova CEP: 59056-000, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil Telefone/Fax: +55 84 32154138 Email: caioc.barros@outlook.com. *Artigo nas normas da revista Clinical Oral Investigations (Qualis A1 – Fator de impacto: 2.308).

(34) 31. RESUMO A leucoplasia oral (LO) é a desordem potencialmente maligna mais frequente encontrada na prática odontológica. Na análise histopatológica, a maioria das LO exibe mudanças histológicas que podem estar associadas ou não a uma displasia epitelial (DE). O reparo do DNA é um importante mecanismo genético relacionado à carcinogênese, no qual as proteínas APE1 e XRCC1 atuam. O objetivo desse estudo foi verificar se as proteínas de reparo do DNA APE1 e XRCC1 encontram-se associadas a parâmetros clínico-patológicos das leucoplasias orais. Os dados clínicos foram coletados nos prontuários clínicos de 40 pacientes com LO e nas consultas de acompanhamento e para cada caso, foi realizada a análise morfológica e a gradação histopatológica de DE quando esta se encontrava presente. A expressão imuno-histoquímica de APE1 e XRCC1 foi avaliada em 24 casos de LO e seis casos de mucosa oral normal (MON). Foi realizada uma análise semiquantitativa, onde os casos foram classificados em imunoexpressão negativa (0-10% de células imunomarcadas), baixa (11-50% de células imunomarcadas) e alta imunoexpressão (>50% de células imunomarcadas). Os testes Quiquadrado de Pearson e Exato de Fisher foram realizados para determinar a associação entre as expressões das proteínas e as características clínico-patológicas; adotou-se um valor de significância de p≤0,05. Dos 40 casos de LOs, 65% eram do gênero feminino com idade média de 58 anos. Trinta pacientes possuíam histórico de tabagismo. A língua foi o sítio anatômico mais acometido (27.5%). Trinta e dois casos apresentaram lesões homogêneas, enquanto 60% e 17.5% dos casos exibiram lesões múltiplas e recidivas respectivamente. Ao exame histopatológico, observou-se presença de DE em vinte e quatro casos. Foi observada associação significativa nos casos gradados como DE moderada/severa com o aspecto clínico nãohomogêneo da lesão (p=0.039). As proteínas APE1 e XRCC1 exibiram alta expressão na MON e nas LOs independente da presença ou não de displasia epitelial. A APE1 demonstrou imunomarcação nuclear em 60% dos casos gradados como DE moderada ou severa (p=0.005). O aspecto clínico não-homogêneo das LOs foi um forte indicador da presença de DE moderada/severa. As proteínas APE1 e XRCC1 não parecem estar relacionadas aos processos moleculares envolvidos com desenvolvimento e com os aspectos clínico-patológicos das leucoplasias orais.. Palavras-chave: Leucoplasias orais; Displasia epitelial; Reparo do DNA; Imuno-histoquímica..

(35) 32. ABSTRACT. Oral leukoplakia (OL) is the most frequent oral potentially malignant disorder in dental practice. At histopathological examination, most of the OLs exhibit histological changes that may or may not be associated with epithelial dysplasia (ED). DNA repair is an important genetic mechanism related to carcinogenesis which APE1 and XRCC1 proteins act. This study aimed to verify if DNA repair proteins APE1 and XRCC1 are associated with clinicalpathological features of oral leukoplakia. The clinical data were collected in the clinical records and in the follow-up visit of 40 patients diagnosed with OL. For each case, the morphological analysis and the histopathological grading of ED were performed when it was present. The immunohistochemical expression of APE1 and XRCC1 was evaluated in 24 cases of OL and six cases of normal oral mucosa (NOM). A semiquantitative analysis was performed, where the cases were classified as negative immunoexpression (0-10% of positive cells), low (11-50% of positive cells) and high immunoexpression (> 50% of positive cells). Pearson’s chi-square and Fisher's exact tests were performed to determine the association between protein expression and clinicopathological features. Statistical significance was set at p≤0.05. Of the 40 cases of OL 65% were female with a mean age of 58 years. Thirty patients had tobacco consumption habit. Tongue was the most affected location (27.5%). Thirty-two cases presented homogeneous lesions, while 60% and 17.5% of the cases showed multiple lesions and lesions recurrence, respectively. A significant association was observed in the cases graded as moderate/severe ED with the non-homogeneous clinical aspect (p=0.039). The APE1 and XRCC1 proteins showed high expression in NOM and OL independent of the presence or absence of epithelial dysplasia. APE1 demonstrated nuclear immunostaining in 60% of cases graded as moderate or severe epithelial dysplasia, this association was significant (p=0.005). The non-homogeneous clinical aspect of OL was a strong indicator of the presence of moderate/severe epithelial dysplasia. APE1 and XRCC1 proteins do not appear to be related to the molecular processes involved in the development and with clinicalpathological features of oral leukoplakias.. Keywords: Oral leukoplakias; Epithelial dysplasia; DNA repair; Immunohistochemistry..

(36) 33. INTRODUÇÃO. As desordens potencialmente malignas (DPMs) compreendem lesões que exibem uma ampla variação clínica, como também, apresentam um tecido que pode mostrar-se morfologicamente alterado, tornando-o mais susceptível a transformação maligna (1). As DPMs podem preceder o surgimento do carcinoma de células escamosas oral (CCEO), que representa um total de quase 94% das neoplasias malignas que acometem a cavidade oral (2,3). As leucoplasias orais (LOs) constituem as DPMs mais comuns da cavidade oral, com incidência global estimada em 2.60% (3). Elas são conceituadas como lesões brancas não removíveis a raspagem, que clinicamente devem ser distinguidas de outras lesões brancas sem potencial de malignização (4-6). A maioria das LOs exibe mudanças histológicas que são diagnosticadas como hiperceratose ou uma displasia epitelial (DE) (7). A displasia epitelial é uma importante alteração reconhecível microscopicamente, que auxilia no direcionamento da conduta clínica, visto que alguns autores apontam que a sua severidade está associada ao potencial de malignização das DPMs, se tornando assim, um indicador importante da progressão de um epitélio normal para uma DPM, e consequentemente, para um CCEO (8,9). Embora alguns estudos mostrem que o risco de desenvolver uma malignidade pode ser maior de acordo com o grau da DE, quando comparada as pessoas que não possuem (10), alguns aspectos associados à sua transformação maligna ainda não estão completamente esclarecidos. A realização de biópsia ainda tem sido considerada um importante parâmetro para determinar a presença ou não de displasia epitelial nas leucoplasias orais (3). É relatado na literatura que um importante mecanismo genético, o reparo do DNA, está relacionado à carcinogênese. Este mecanismo evita que células que sofreram mutação entrem no ciclo celular e continuem a se reproduzir, desempenhando assim um papel importante na manutenção da integridade do genoma humano, contra danos causados por agentes carcinogênicos (11). Deste modo, existem mecanismos celulares envolvidos no reparo do DNA, nos quais existe a participação de genes e proteínas específicas para detecção e remoção do dano com posterior reconstrução da estrutura do DNA; dentre elas, a via de reparo por excisão de base (BER – “base excision repair”), na qual as proteínas APE1 (AP-endonuclease apurínica/apurimidínica 1) e XRCC1 (X-ray Repair Cross-complementing Group 1) atuam (12)..

(37) 34. Estudos recentes demonstraram que a expressão das proteínas APE1 e XRCC1 se encontram desreguladas em diversos tipos de cânceres, incluindo o carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (13,14) e que a desregulação da sua expressão pode estar relacionada a um pior prognóstico (15). Assim, o objetivo desta pesquisa foi verificar se a expressão das proteínas APE1 e XRCC1 se encontra associada com parâmetros clínicopatológicos em uma série de casos de LO, visando esclarecer se estas proteínas influenciam a patogênese das LOs.. MATERIAIS E MÉTODOS. Caracterização do estudo. Este estudo foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, conforme parecer nº 2.052.349. Foi realizada uma pesquisa descritiva e longitudinal. Participaram da pesquisa pacientes diagnosticados com leucoplasias em mucosa oral entre janeiro de 2007 e junho de 2017 no Serviço de Estomatologia da UFRN, Natal-RN, Brasil. Apenas os casos diagnosticados histopatologicamente como hiperceratose e displasias epiteliais de variados graus e que compareceram para acompanhamento clínico foram incluídos na pesquisa, sendo excluídos os pacientes com acompanhamento inferior a 6 meses e casos suspeitos de lesão liquenóide. A partir dos prontuários, foram coletados dados clínicos e demográficos referentes a idade, gênero, raça, hábitos de tabagismo e etilismo, localização e aspecto clínico da lesão, assim como a presença de lesões múltiplas e recidiva, durante as sessões clínicas de acompanhamento. Os critérios clínicos de diagnóstico utilizados foram recomendados por Villa e Woo (16), os quais sugeriram que o diagnóstico das LOs verdadeiras deve ser realizado com base na história do paciente, aspectos clínicos, histopatológicos e exclusão de diagnóstico de outras lesões brancas que podem acometer a mucosa oral. Após a obtenção do diagnóstico histopatológico, com base nos aspectos clínicos da lesão e hábitos, alguns pacientes foram submetidos a tratamento cirúrgico para a remoção completa da lesão, enquanto outros permaneceram apenas em acompanhamento clínico..

(38) 35. Análise morfológica. Do material incluído em parafina, foram obtidos cortes histológicos de 5 µm de espessura, dispostos em lâminas de vidro e corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina (HE). Posteriormente, esses cortes foram examinados à microscopia de luz (Olympus CH30, Olympus Japan Co., Tokyo, Japão) por dois patologistas orais para análise do grau de DE, conforme os critérios morfológicos estabelecidos pela OMS em 2017 (17). Em seguida, a partir destes critérios, foi realizada a classificação dos casos em sem displasia, DE leve, moderada e severa conforme proposto por Warnakulasuriya et al. (18).. Método imuno-histoquímico. O material parafinado selecionado para esse estudo, foi submetido a cortes histológicos de 3m de espessura, os quais foram estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas, preparadas com adesivo à base de 3-aminopropyltrietoxy-silano (Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA).Posteriormente, o material foi submetido à técnica da imunoperoxidase, utilizando os anticorpos primários anti-APE1(clone Ab3722, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) e anti-XRCC1 (clone 33-2-5; Lab Vision Corporation, Freemont, CA, USA). Para as etapas de desparafinização, re-hidratação e recuperação antigênica, os cortes foram submetidos ao Trilogy (Cell Marque, CA, USA), em uma concentração de 1:100 em água destilada em panela Pascal por 10 minutos. Posteriormente, as amostras sofreram o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 10 volumes, por 15 minutos, em temperatura ambiente (TA). Em seguida, as amostras foram submetidas à lavagem em água corrente e incubadas em proteína block (Thermo Scientific, Runcorn, UK) por 5 minutos (TA), para bloqueio das ligações inespecíficas. Posteriormente, foram realizadas duas lavagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl (tris-hidroximetil-aminometano, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), pH 7,4 com duas trocas de 5 minutos, para então haver a incubação do anticorpo primário antianti-APE1 (1:500, overnight) e XRCC1 (1:2000, overnight). Após a incubação do anticorpo primário, as amostras foram incubadas no sistema de visualização ADVANCETM (Dako North America Inc., Capinteria, CA, USA), sendo o primeiro reagente o HRP Link e o segundo, o HRP Enzyme, ambos por 30 minutos (TA), intercalados.

(39) 36. por lavagens em TRIS. Em seguida, foi realizada a revelação com 3,3-diaminobenzidina (Liquid DAB + Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) em câmara escura por 5 minutos (TA), passando por água destilada, contra coloração com hematoxilina de Harris (5 minutos), lavagem em água corrente (5 minutos) e água destilada com duas trocas (5 minutos). Finalizando o processo com desidratação, diafanização e montagem da lâmina. Como controle negativo, o anticorpo foi substituído por albumina de soro bovino a 1% (BSA – bovine serum albumin), em solução tampão. Casos de carcinoma ductal de mama foram utilizados como controle positivo para a imunomarcação da APE1 e XRCC1.. Análise imuno-histoquímica. A análise da expressão das proteínas APE1 e XRCC1 foi realizada de forma semiquantitativa, entretanto, só foi possível realizá-la em 24 casos de LO, assim como nas bordas do epitélio de seis casos de mucosa oral normal (MON) diagnosticados como fenômeno de extravasamento de muco, os quais foram utilizados à nível de comparação. Toda a área de revestimento epitelial do espécime foi verificada através de microscópio óptico (Olympus CH30, Olympus Japan Co., Tokyo, Japão) sob o aumento de 400x. As células epiteliais que exibiram coloração acastanhada e granular no núcleo e/ou citoplasma, independente da intensidade de marcação, foram consideradas positivas. Foi realizada uma análise semiquantitativa semelhante à utilizada no estudo de Hsia et al. (15), no qual os casos foram classificados pelo avaliador em imunoexpressão negativa (0-10% de células imunomarcadas), baixa (11-50% de células imunomarcadas) e alta expressão (>50% de células imunomarcadas).. Análise estatística. Uma vez realizadas as análises clínicas, morfológicas e imuno-histoquímicas, os dados obtidos na análise foram analisados no software SPSS for Windows (Statistical Package for Social Sciences; IBM, USA), versão 22.0. Os resultados obtidos foram submetidos inicialmente a uma análise descritiva. Na análise da associação das variáveis clínicas qualitativas nominais (sexo, faixa etária, raça, tabagismo, etilismo, localização da lesão, aspecto clínico, presença/ausência de lesões múltiplas e recidiva) com a gradação histológica das LOs, utilizou-.

(40) 37. se o teste Qui-quadrado de Pearson e quando não foi possível utilizá-lo, lançou-se mão do teste exato de Fisher. Para os testes realizados, foi adotado um nível de significância de 5% (α=0,05).. RESULTADOS. A Tabela 1 descreve o perfil clinicopatológico da amostra. O tempo médio de acompanhamento dos casos foi de 13.5+18.9 meses, com mínimo de 6 e máximo de 109 meses. Vinte e seis casos (65%) das 40 LOs estudadas foram diagnosticados em mulheres. A idade média dos pacientes foi de 58+13 anos, variando de 29 a 85 anos, sendo a maioria (52.5%) com idade menor ou igual a 58 anos de idade. A maioria das LOs ocorreu em feodermas (42.5%) e indivíduos que relataram ser ex-fumantes ou fumantes (75%). Apenas 12.5% dos pacientes relatou histórico de consumir bebidas alcoólicas. A língua foi a localização anatômica mais afetada pelas LOs (27.5%) e 80% dos casos manifestaram-se clinicamente como LOs homogêneas. Lesões múltiplas foram frequentes, sendo encontradas em 60% dos indivíduos, enquanto recidivas das lesões foram observadas em 41.2% dos 17 casos tratados por meio de remoção cirúrgica total da lesão. A maioria das LOs exibiu ausência de displasia epitelial (40%), enquanto 30% foram classificadas como displasia epitelial leve, 22.5% como displasia epitelial moderada e 7.5% como severa. Os testes de associação dos parâmetros clínicos com a gradação histológica das LOs revelaram que a maioria dos casos de aspecto clínico não-homogêneo foi significativamente associada com a presença de displasia epitelial moderada/severa (p = 0.039; Tabela 2). As demais associações não foram estatisticamente significativas. Vinte e quatro casos de LO e seis de MON foram submetidos à marcação imunohistoquímica com anti-XRCC1 e anti-APE1. A análise da expressão de APE1 evidenciou alta imunoexpressão dessa proteína em todas as camadas epiteliais das LO e da mucosa oral normal (Figura 1 A, C e E). Adicionalmente, observou-se que 100% (n=19) das LOs gradadas como sem displasia/displasia leve exibiram marcação nuclear e citoplasmática para APE1, enquanto a maioria dos casos gradados como displasia epitelial moderada/severa (n=3; 60%) demonstrou marcação desta proteína restrita ao núcleo, sendo esta associação significativa (p = 0.005). Para a proteína XRCC1, foi observada uma alta expressão imuno-histoquímica em todos os casos de LO e mucosa oral normal (Figura 1 B, D e F). Além disso, houve uma predominante.

(41) 38. imunorreatividade nuclear até a camada superficial do epitélio em 95.8% dos casos (n=23), enquanto que em apenas um caso (4.2%) a imunorreatividade ocorreu até a camada média.. DISCUSSÃO. A LO é a DPM mais frequente da mucosa oral (1,19,20,21) cujo diagnóstico é realizado pela exclusão de outras entidades que surgem como placas brancas (9,10,16,20). Além disso, esta lesão apresenta comportamento clínico variável e é relatado que a sua taxa de transformação maligna varie entre 3.6 a 12.9% (22,23). Dionne et al. (24) sugerem que o correto diagnóstico e tratamento dessas lesões contribui na prevenção da transformação maligna e dessa forma, modifica o prognóstico do paciente. Entretanto, ainda há dificuldade em predizer quais casos sofrerão malignização, já que nem sempre o grau de displasia epitelial encontra-se associado a uma maior probabilidade de transformação maligna (3,10). A ocorrência da LO por sexo e idade é variada (16). Na presente pesquisa, dos 40 pacientes portadores de LOs, vinte e seis (65%) eram do gênero feminino, em uma relação F:M de 1.8:1, enquanto que a média de idade foi de 58 anos e variou de 29 a 85 anos, dados esses semelhantes aos encontrados na literatura (1,9,10,25). Enquanto isso, Liu et al. (19) observaram que de 218 pacientes, 110 casos eram do gênero masculino (50.5%) e 108 do feminino (49,5%), mostrando assim, que ambos sexos foram acometidos de forma igual. Entretanto, Amagasa et al. (1) afirmam que a literatura ainda é controversa em relação a predileção do gênero mais acometido pela leucoplasia oral. O hábito de fumar é um fator fortemente associado ao surgimento das LOs, há relatos de que a prevalência de LOs é relativamente mais alta em tabagista em relação aos que não possuem esse hábito (1,16,26), além disso, observou-se que o consumo de álcool pode aumentar em 1.5 vezes o risco de surgimento dessas lesões (27). Em nossa pesquisa, 75% e 12.5% dos pacientes apresentaram histórico de consumo de tabaco e álcool, respectivamente. A LO pode afetar qualquer parte da cavidade oral, a localização anatômica acometida depende da localização geográfica e dos hábitos da população estudada (1). Nos 40 casos diagnosticados com LO na presente pesquisa, a região mais acometida foi a língua (27.5%), seguida da mucosa jugal e do rebordo alveolar (22.5%). Estes achados são semelhantes aos encontrados por Kuribayashi et al. (28), no qual a língua foi o sítio anatômico mais frequente, e por Liu et al. (19), onde houve maior incidência de LOs na língua, seguida pela mucosa jugal..

(42) 39. Clinicamente, as LOs podem exibir aspectos homogêneo ou não-homogêneo. Em geral, lesões homogêneas possuem um baixo risco de transformação maligna, enquanto que lesões não-homogêneas, um risco intermediário (3,16,27). Nós observamos que, na nossa amostra, houve predominância de leucoplasias homogêneas (80%), dado que corrobora com os achados da literatura (3,9,10,28,29). Entretanto, é importante ressaltar que essas características macroscópicas auxiliam no estabelecimento de uma conduta clínica, porém elas não predizem com exatidão qual o grau de DE da lesão, deste modo, a análise histológica é indispensável para estabelecer o correto diagnóstico e conduta de tratamento e acompanhamento (26). A gradação histológica apresentou associação estatisticamente significante com o aspecto clínico das lesões, onde as lesões homogêneas exibiram em maioria DE leve ou não apresentavam DE, enquanto que as não-homogêneas foram em sua maioria DE moderadas ou severas. Villa e Woo (16), mencionam que o risco de transformação maligna das LO homogêneas é menor, em torno de 0.6 a 5%, enquanto que o das LO não-homogêneas é de 20 a 25%. Circunstância essa que pode estar relacionada ao fato de que leucoplasias nãohomogêneas podem ser, às vezes, classificadas como eritroleucoplasias, lesões essas que em cerca de 40% dos casos se apresentam como carcinoma in situ ou carcinoma de células escamosas no momento do diagnóstico histopatológico (30). Adicionalmente, nossos resultados não evidenciaram associação estatisticamente significante ao relacionar a presença ou ausência de DE com outras variáveis como gênero, idade, tabagismo e localização da lesão, fato que pode estar relacionado à pequena amostra. Todavia, ressaltamos que estas outras variáveis são consideradas, por outros autores, fatores importantes na transformação maligna das leucoplasias orais (3,10). Alguns autores relatam que presença de displasia epitelial, é um importante indicador para uma possível transformação maligna da leucoplasias oral (1,3), contudo, a literatura mostra que nem sempre esse aspecto é verdadeiro, visto que há relatos de casos, com diagnóstico histopatológico de hiperceratose, onde houve transformação maligna e casos que exibiam DE severa que não sofreram transformação maligna (1,25). Na presente pesquisa, segundo a gradação histológica proposta pela OMS (17), houve predominância das LOs que não exibiam DE (40%) seguido pelos casos com DE leve (30%). A avaliação histopatológica das DE nas LOs continua a ser um desafio para os patologistas, principalmente devido a sua subjetividade e fraca reprodutividade inter e intra examinador (18). Durante o acompanhamento dos pacientes do presente estudo, não houve transformação maligna em nenhum dos casos..

(43) 40. Diante das controvérsias observadas na literatura e na dificuldade em estabelecer com precisão quais LOs sofrerão transformação maligna, tem se investigado potenciais marcadores biológicos que sejam capazes de predizer tal risco de transformação. Dentre os potenciais marcadores biológicos, destacam-se os genes de reparo do DNA e suas proteínas correspondentes, os quais estão relacionados aos danos causados por agentes carcinogênicos, como o álcool e o tabaco. Dessa forma, o presente estudo também investigou a imunoexpressão das proteínas APE1 e XRCC1, as quais são associadas ao reparo do DNA por excisão de bases, em alguns casos de leucoplasias orais. A APE1 participa do controle de diferentes processos celulares como a apoptose, proliferação e diferenciação celular (15,31,32). Evidências sugerem que um elevado nível de APE1 tem valor prognóstico e correlação com a agressividade, invasão, metástase e a resistência a quimio e radioterapia em diversas neoplasias, incluindo o câncer de mama, colo retal, do trato gastro-esofágico, assim como no carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (11,14,15,32-34). Na presente pesquisa, todos os casos de LO e MON mostraram marcação do APE1 até a camada superficial do epitélio, exceto na camada de ceratina. Além disso, observou-se alta imunoexpressão para esta proteína tanto nos 24 casos de LO quanto nos casos de mucosa oral normal analisados. Adicionalmente, quando comparada a expressão da proteína APE1 nos diferentes graus de DE, evidenciou-se que as LOs gradadas como sem DE ou DE leve, assim como os casos de MON, apresentaram predominantemente um padrão de marcação nuclear e citoplasmática, enquanto que 60% dos casos de DE moderada/severa exibiram marcação apenas nuclear. Alguns autores relatam que a expressão da APE1 pode diferir nos diferentes tipos celulares mediante a estímulos, assim, a resposta a esses estímulos pode promover o movimento intracelular da proteína do núcleo para o citoplasma (15,35). Além disso, Jackson et al. (36) e Mitra et al. (37) relatam que o transporte da APE1 do citoplasma para o núcleo é mediado através da ligação entre a importina carioferina α2 (KPNA2) e a região de sinais de localização nuclear (NSL) presentes na porção N-terminal da proteína APE1. A KPNA2 é uma proteína transportadora que se expressa em diversos tecidos, dentre eles o tecido epitelial, hepático e neural (38), Sakai et al. (39) e Ma e Zhao (40) também relatam que esta proteína apresenta imunomarcação nuclear em tecido epitelial esofágico normal, assim como no carcinoma de células escamosas esofágico. Em relação a isto, Kubo et al. (41) investigaram a expressão.