Proteínas plasmáticas - Introdução

Proteínas plasmáticas

- Introdução

As proteínas estão presentes em todos os fluídos do nosso corpo. Analisa-se as proteínas plasmáticas com a finalidade de serem utilizadas como auxiliares de diagnóstico.

Mais de 100 proteínas têm função fisiológica no plasma.

Funções das proteínas plasmáticas

Funções das proteínas plasmáticas

FUNÇÃO EXEMPLO

Transporte

„globulina de ligação à tiroxina (hormonas da tiróide) „apolipoproteínas (colesterol, triglicerídeos) „transferrina (ferro)

Imunidade humoral „imunoglobulinas

Manutenção da Manutenção da

pressão osmótica „todas as proteínas, particularmente a albumina

Enzimas „renina

„factores de coagulação

Inibidores da

protease „α1-antitripsina (actua nas proteases)

Tampão „todas as proteínas

Proteínas plasmáticas

- Introdução

Quantitativamente a proteína mais importante é a albumina. As outras proteínas designam-se colectivamente por globulinas.

Alterações na concentração das diferentes proteínas podem fornecer informações úteis para o diagnóstico. Causas:

lt ã d t d í t d t í - alteração da taxa de síntese das proteínas - alteração na taxa de remoção das proteínas - alteração no volume de distribuição

A concentração das proteínas é afectada pela postura:

„aumento de 10 a 20% durante os 30 minutos após o levantar da cama,

devido a um aumento da difusão de fluídos do compartimento vascular para o intesticial.

Aumento num curto espaço de tempo (e não recebeu proteínas por via endovenosa) - devido a uma diminuição do volume de distribuição (desidratação)

Diminuição acelerada da concentração proteica - devida a um aumento do volume plasmático.

Proteínas plasmáticas

- Introdução

A determinação das proteínas plasmáticas fornece informações sobre o estado de hidratação do paciente.

Causas de alteração da concentração das proteínas plasmáticas totais

AUMENTO DIMINUIÇÃO −Hipergamaglobulinemia −Paraproteinemia Aumento da síntese proteica −Má nutrição e má absorção −Doença hepática −Imunodeficiência humoral Diminuição da síntese proteica Hemoconcentração

devido à estase do −Hiper-hidratação Aumento do - Artefacto devido à estase do _{sangue durante a}

punção −Aumento da permeabilidade capilar volume de distribuição - Desidratação Diminuição do volume de distribuição −Estado de perda de proteínas −Estado catabólico Aumento da excreção/ catabolismo

Proteínas plasmáticas

- Principais proteínas plasmáticas

Principais proteínas plasmáticas

CLASSE PROTEÍNA MASSA MOLECULAR (D) CONCENTRAÇÃO SÉRICA APROXIMADA (g/L) P é lb i 76000 0 25 Albumina „Préalbumina „Albumina 76000 66300 0,25 40 α1-globulina „α₁-antitripsina „α₁-glicoproteína ácida 53000 44000 2,9 1,0 α2-globulina „Haptoglobulina „α₂-macroglobulina „Ceruloplasmina 700000 725000 134000 2,0 2,6 0,35 „Transferrina 76000 3,0

β-globulina „Lipoproteínas de baixa densidade „Componentes do complemento (C₃) „Proteína C reactiva 3000000 180000 118000 1,0 1,0 0,01 γ-globulina „IgG „IgA „IgM „Ig D 150000 180000 900000 170000 14,0 3,5 1,5 0,03

Proteínas plasmáticas

- Albumina

ALBUMINA

ƒProteína mais abundante no plasma ƒProteína de fase aguda negativa ƒSintetizada no fígado

ƒContribui para o equilíbrio da pressão osmótica coloidal

ƒDetermina a distribuição do fluído extracelular entre os espaço vascular e extravascular

ƒTransporta: hormonas, medicamentos, ác. gordos livres, bilirrubina não conjugada e iões

A interpretação das variações patológicas têm que ser cuidadosas uma vez que são muitos os processos patológicos que causam alterações nas concentrações plasmáticas.

Causas de hipoalbuminemia

p

Diminuição da síntese: má nutrição, má absorção e doença hepática Aumento do volume de distribuição: hiperhidratação, aumento da

permeabilidade capilar (septicemia e hipoxemia)

Aumento da excreção/degradação: síndroma nefrótico, queimaduras,

hemorragia, estados catabólicos (febre, trauma, doença maligna)

Proteínas plasmáticas

-α1-globulinas

α

1

-GLOBULINAS

α

1

-ANTITRIPSINA

ƒInibidor as protease

ƒ É uma proteína de fase aguda. A sua concentração aumenta em estados de inflamação aguda.

ƒConstitui cerca de 90% dasα -globulinas ƒConstitui cerca de 90% das α1-globulinas

ƒForma activa: MM

ƒDeficiências hereditárias de α1-antitripsina podem originar:

ƒ hepatite neonatal que se pode transformar, no adulto, em cirrose (o defeito é devido na substituição de um aminoácido por outro que leva à proteína formar agregados que não podem ser secretados do fígado e causam danificação do tecido hepático)

ƒ e efisema (devido à falta do inibidor natural da enzima elastase, que resulta em mudanças destrutivas no pulmão) - risco aumentado em pessoas que fumam

Risco aumentado em deficiências Homozigóticos (ZZ)

Estas anomalias podem ser detectadas antes do nascimento por exame do sangue fetal - focagem isoeléctrica antecedida pela PCR (pollimerase chain reaction)

ƒValores elevados: - inflamações - gravidez

Proteínas plasmáticas

-α1-globulinas

α

1

-FETOPROTEÍNA

ƒSintetizada pelo fígado fetal

ƒDetectada no soro materno até ao 7 ou 8 mês de gravidez

ƒPensa-se que protege o feto do ataque imunológico materno (após o nascimento desaparece do soro. Está aumentado, por exemplo, em

i ) carcinomas)

ƒValores elevados: - alterações do tubo neural - espinha bífida

- sofrimento fetal, parto prematuro ou gémeos - tirosinose (aminoacidopatia)

- doença hemolítica do recém-nascido - hepato-carcinoma

- tumores das gonadas nos adultos

ƒValores baixos: - risco do síndrome de Down (alterações no cromossoma 21) ƒTeste de despite (“screening”): 15 a 20 semanas de gestação

Proteínas plasmáticas

-α1-globulinas

α

1

-GLICOPROTEÍNA ÁCIDA

ƒSintetizada pelo fígado (existe na membrana das plaquetas)

ƒHomologia com imunoglobulinas e haptoglobulina (podem ter resultado de uma proteína comum)

ƒFunção: - interfere no metabolismo das hormonas esteróides, na coagulação f ã d l é i

e formação de colagénio - transporta hormonas esteróides ƒValores elevados: - inflamação

- gravidez - cancro - pneumonia - artrite reumatóide ƒValores baixos: - problema hepático grave

Banda α1-globulinas:

Os seus níveis estão elevados nas doenças inflamatórias agudas e crónicas, neoplasias, após traumas ou cirurgias e durante a gravidez ou

estrogenioterapia. Nos hepatocarcinomas, a elevação pode acontecer pelo aumento da alfa-fetoproteína.

Proteínas plasmáticas

-α2-globulinas

α

2

-GLOBULINAS

HAPTOGLOBULINA

ƒSintetizada nos hepatócitos e nas células do sistema reticuloendotelial (pequena quantidade)

ƒÉ constituída por dois tipos de cadeias (duas α e duas β). A cadeia β contém o local de ligação para a hemoglobina (cadeia α)

ƒImpede a perda da hemoglobina e do ferro na urina ƒValores elevados: - estados inflamatórios

- doenças reumáticas - queimaduras - síndrome nefrótico

ƒValores baixos: doença hemolítica do recémnascido e após transfusões -serve para avaliar o grau de hemólise

CERULOPLASMINA

ƒSintetizada no fígado

ƒContém 6 a 8 átomos de cobre (ligados à apoceruloplasmina) ƒTem actividade enzimática: histaminase, cobre e ferro oxidase ƒAs mulheres apresentam valores mais elevados

ƒValores elevados: gravidez, estados inflamatórios, doenças malignas, contraceptivos

ƒValores baixos: doença de Wilson (defeito na incorporação de Cu na ceruloplasmina que fica menos estável diminuíndo a sua concentração), síndrome nefrótico, dieta pobre, síndrome de má absorção

Proteínas plasmáticas

-α2-globulinas

α

₂

-MACROGLOBULINA

ƒ

Sintetizada pelo fígado ƒInibidor de proteases

ƒTransportador de moléculas (IL-6, IL-2, insulina, factores de crescimento) ƒAs mulheres apresentam valores mais elevados

ƒAs mulheres apresentam valores mais elevados

ƒValores elevados: - contraceptivos, lesão hepática e diabetes

Níveis elevados de α2-macroglobulina associados à diminuição de albumina acontecem na síndrome nefrótica.

α2-globulinas

Incluem a haptoglobina, a alfa-2-macroglobulina e a ceruloplasmina. Raramente se encontram alterações nesta banda eletroforética, já que a diminuição de um componente é compensada pelos demais

diminuição de um componente é compensada pelos demais.

Níveis elevados de alfa-2-macroglobulina associados à diminuição da albumina acontecem na síndrome nefrótica.

Os níveis de haptoglobina e de ceruloplasmina podem apresentar-se elevados em numerosas situações que levam à reacção de fase aguda.

Proteínas plasmáticas

-β-globulinas

β-GLOBULINAS

TRANSFERRINA

ƒ

Sintetizada pelo fígado, sistema reticuloendotelial (em pequena quantidade), contém dois iões férricos

ƒProteínas de fase aguda negativa ƒTempo de semi-vida de 7 dias

ƒFunções: - transporte de ferro - para os locais que armazenam ferro (apoferritina-ferritina) e para a medula óssea (hemoglobina) - impede a perda do ferro pelo rim

- impede a deposição de ferro nos tecidos

ƒDiagnóstico diferencial das anemias e monitorização do tratamento ƒUm aumento de ferro ligado à transferrina – hemocromatose

ƒValores baixos: inflamação, doenças malignas ƒValores elevados: anemia por deficiência em ferro

Proteínas plasmáticas

-β-globulinas

PROTEÍNA C REACTIVA

ƒSintetizada pelo fígado ƒProteínas de fase aguda

ƒNão é detectável em indivíduos saudáveis

ƒNa electroforese aparece entre a região da γ lenta e a βp g γ β

ƒPode iniciar a opsonização, fagocitose e lise celular como resposta à reacção inflamatória

ƒValores elevados: - febre reumática - infecções bacterianas

COMPLEMENTO

ƒConjunto de proteínas que participam na reacção imune ƒCirculam na forma de precursores não funcionaisCirculam na forma de precursores não funcionais ƒValores elevados: estados inflamatórios ƒValores baixos: - má nutrição

- lupus eritomatoso

- coagulopatias intravasculares disseminadas

Proteínas plasmáticas

-β-globulinas

B-globulinas

Composta pelas beta-lipoproteínas (LDL), transferrina, C3 e outros componentes do complemento, beta-2-microglobulina e antitrombina III.

A redução dessa banda não é frequente A redução dessa banda não é frequente.

Está frequentemente elevada nos casos de icterícia obstrutiva e menos frequentemente em alguns casos de hepatite. Quase sempre, está elevada nos casos de cirrose hepática. Nesses casos, pode aparecer junto com

sobreposição ou fusão das bandas beta e gama pelo aumento de IgA, que ocorre nas cirroses hepáticas, infecções de pele ou trato respiratório e na artrite reumatóide.

Elevações causadas provavelmente pelo aumento dos componentes do ç p p p

complemento podem ocorrer em hipertensão maligna, doença de Cushing,

poliarterite nodosa e carcinomas.

A anemia por deficiência de ferro leva ao aumento da transferrina.

O hipotireoidismo, a cirrose biliar, as nefroses e alguns casos de diabetes mellitus podem se evidenciar pelo aumento de colesterol e consequente aumento das beta-lipoproteínas (LDL).

Proteínas plasmáticas

-γ-globulinas

γ-GLOBULINA

IMUNOGLOBULINAS

ƒIg A, Ig G, Ig E, Ig M, Ig D

Características das imunoglobulinas

Classe _pesadaCadeia Conc. sérica _{média (g/L)} Função

IgG γ 14,0 anticorpo que existe em maior quantidade na resposta _{imune secundária}

IgA α 3,5

„secretado como um dímero

„anticorpo que existe em maior quantidade nas

secreções mucosas (ex.:saliva, muco bronquial)

„secretado como um pentamero

IgM µ 1,5

„secretado como um pentamero

„anticorpo que existe em maior quantidade na resposta

imune primária

IgD δ 0,03 „presente na superfície dos linf. B

„anticorpo envolvido no reconhecimento antigénico?

IgE ε Vestígios

„presente na superfície dos mastócitos e basófilos „provável papel na imunidade contra helmintas e

Proteínas plasmáticas

-γ-globulinas

IMUNOGLOBULINAS

(cont.)

As imunoglobulinas são constituídas por duas cadeias H (pesadas) e duas L (leves) ligadas por pontes dissulfureto.

p p

Diferenças na cadeia H - IgA, IgG, IgE, IgM e IGD As cadeias leve são só de dois tipos: K, λ

ƒo recém-nascido não sintetiza IgG, mas esta atravessa a placenta

ƒIgA é mais elevada nos homens

ƒIgM e IgG são mais elevadas nas mulheres

ƒIgE depende da condição alérgica do indivíduo

ƒIgE depende da condição alérgica do indivíduo

As imunoglobulinas derivadas da proliferação de um único clone designa-se por imunoglobulina monoclonal

Proteínas plasmáticas

-γ-globulinas IMUNOGLOBULINAS (cont.)

ƒHIPOGAMAGLOBULINEMIA

- causas fisiológicos: à nascença a concentração de IgA e IgM é baixa e a IgG diminui (IgG maternos)

- causas patológicas: deficiências congénitas (doença de Bruton); deficiências adquiridas (doenças hematológicas, ex.: leucemias

linfática crónica; estados de perda de proteínas, ex.: síndroma nefrótico)

ƒHIPERGAMAGLOBULINEMIA

- causas fisiológicos: infecção aguda ou crónica

- causas patológicas: doenças autoimunes (doença reumatóide e lupus eritomatoso sistémico) e doenças hepáticas graves (algumas tendo por base uma doença autoimune)

tendo por base uma doença autoimune)

ƒPARAPROTEÍNAS

É uma imunoglobulina produzida por um único clone de células da série dos linfócitos (normalmente plasmócitos). São moléculas idênticas (aparece um pico discreto na electroforese)

Proteínas plasmáticas

-γ-globulinas IMUNOGLOBULINAS (cont.)

ƒPARAPROTEÍNAS (cont.) Aparece, por exemplo:

- Mieloma múltiplo - proliferação maligna disseminada de células plasmáticas (IgG e IgA)

- Leucemia linfática crónica (IgM) - Fisiológico - aumenta com a idade PESQUISA LABORATORIAL

- Electroforese de proteínas: essencial para a detecção de paraproteínas - Pesquisa na urina: 20% dos mielomas, o tumor produz apenas as

cadeias leves que são rapidamente excretadas para a urina (não detectadas no soro) - proteínas de Bence Jones

- As proteínas de Bence Jones precipitam a 45-60ºC, mas redissolvem-se pela ebulição

Proteínas plasmáticas

- Análise quantitativa e semiquantitativa

Muito complicado e complicado e

demorado

Proteínas plasmáticas

- Análise quantitativa e semiquantitativa

Valores de referência para as proteínas sérica: 60-80 g/L

Proteínas plasmáticas

- Análise quantitativa e semiquantitativa

Técnicas de separação de proteínas

ƒELECTROFORESE

Há separação das proteínas num suporte sólido (normalmente acetato de celulose e agarose), de acordo com as suas características de carga eléctrica.

No final temos 5 fracções:

Proteínas plasmáticas

- Técnicas de separação de proteínas

No final temos 5 fracções:

Albumina (fracção mais negativa), α1-globina, α2-globina, β-globina e γ-globina

(fracção menos negativa)

preparação da tira de acetato de celulose

Colocar uma tira num recipiente com tampão (pH=9). Deve-se deixar embeber lentamente a tira e depois mergulha-la no tampão durante, no mínimo, 10 minutos.

preparação da tina de electroforese preparação da tina de electroforese

Colocar em cada recipiente da tina (marcados com + e -) cerca de 150 ml de tampão.

preparação do aplicador e aplicação

Numerar, em primeiro lugar, de 1 a 8 as referências de trabalho.

Encher os poços base do aplicador da direita para a esquerda, fazendo coincidir a sua numeração com a numeração da lista de trabalho. O soro 1 é então colocado no 1º poço do lado direito.

Encher cada um dos 8 poços da base do aplicador com cerca de 18µl de soro, de cada um dos pacientes.

ƒELECTROFORESE (cont.)

Retirar a tira do tampão e coloca-la suavemente entre duas folhas de papel de filtro de forma a retirar o excesso de tampão. Depois, colocar a tira, bem estirada, na ponte.

aplicação e migração

Proteínas plasmáticas

- Técnicas de separação de proteínas

ap cação e g ação

Colocar a ponte com a tira na Tina de electroforese (migração: -→ +).

Colocar o aplicador na base que tem os soros. Premir o botão suave e lentamente para que os pentes mergulhem nas amostras. Esperar durante 10-15 segundos. Levantar lentamente o botão para permitir que o soro em excesso caia dos pentes. Fazer a aplicação na tira premindo o botão durante 10 a 15 segundos, levantando-o lentamente ao fim desse tempo. Fazer esta aplicação 2 vezes. Atenção: a aplicação é feita no lado negativo.

Colocar a tampa da Tina e ligar a fonte de alimentação regulando-a para 225 V d t 20 i t V i i ã ã d t í

durante 20 minutos. Vai ocorrer a migração e a separação das proteínas. Lavar de imediato o aplicador (para o soro não secar nos pentes) mergulhando os pentes na água do recipiente de lavagem e fazendo 5 a 10 aplicações em papel absorvente ou lavar os pentes com água corrente e depois com água destilada.

Deixar secar à temperatura ambiente. Lavar a base com os soros com água destilada e secar com uma toalha.

ƒELECTROFORESE (cont.) coloração e transparentização

Após 20 minutos de separação, desligar a fonte de alimentação e seguir os seguintes passos:

· Coloração: colocar a tira num recipiente com corante, deixando embebe-la

Proteínas plasmáticas

- Técnicas de separação de proteínas

Coloração: colocar a tira num recipiente com corante, deixando embebe la

primeiro na superfície e depois mergulha-la durante 10 minutos. · Lavagem: efectuar 3 lavagens sucessivas da tira com solução de lavagem.

Deixar ficar cerca de 2 minutos + 2 minutos + 3 minutos em cada recipiente de lavagem.

· Transparentização: colocar a tira num recipiente com o transparentizador durante 3 minutos.

· Secagem: colocar a tira sobre uma lâmina de vidro, usando as mãos protegidas com umas luvas Com outra lâmina de vidro passar sobre protegidas com umas luvas. Com outra lâmina de vidro passar sobre a primeira para retirar bolhas de ar e fixar melhor à lâmina, usando-a também para cortar o excesso de tira. Levar à estufa a 80ºC durante 5-10 minutos.

Depois de retirar a lâmina da estufa, deixar arrefecer à temperatura ambiente. Não por os dedos nem encostar nada às zonas de migração. Qualquer mancha provoca erros de leitura.

Proteínas plasmáticas

- Técnicas de separação de proteínas

Valores de referência:

Percentagem (%): Valor absoluto (g/L): Albumina: 52 – 65 32 – 56

Alfa-1: 2,5 – 5,0 1 – 4 Alfa-2: 7,0 – 13,0 4 – 12 Beta: 8,0 – 14,0 5 – 11 Gama: 12,0 – 22,0 5 – 16

Proteínas plasmáticas

- Técnicas de separação de proteínas Electroforese das proteínas no soro e correlação patológica

E:

- diminuição da capacidade de sintetizar albumina e aumento da excreção - compensação dada pelo

aumento da gamaglobulinas (manter a pressão oncótica)

( p )

- continuidade entre β e γ dada pela IgA

F:

- secreção feita pela proliferação monoclonal de plasmócitos

- normalmente sem estar presente a quantidade normal de Ac policlonais normal de Ac. policlonais (células normais são substituídas por um clone maligno)

Proteínas plasmáticas

- Técnicas de separação de proteínas Electroforese das proteínas no soro e correlação patológica (cont.)

D:

- existe uma quase completa ausência da fracção gama Ex.: - ocorre normalmente em neonatais antes da neonatais antes da maturação do sistema imune

- após quimioterapia para erradicação de alguma malignidade

H:

- diminuição da maioria das fracções (diminuição da síntese e aumento da excreção das proteínas de excreção das proteínas de baixo peso molecular) - contudo a fracção α2pode

estar relativamente aumentada devido à coexistência de uma resposta de fase aguda (haptoglobulina) ou preferencialmente uma retenção de moléculas grandes (α

Outras técnicas de separação de proteínas

ƒELECTROFORESE E IMUNOFIXAÇÃO

Proteínas plasmáticas

- Técnicas de separação de proteínas

Outras técnicas de separação de proteínas

ƒELECTROFORESE EM DUAS DIMENSÕES

ƒFOCAGEM ISOELÉCTRICA

Proteínas plasmáticas

- Técnicas de separação de proteínas

FOCAGEM ISOELÉCTRICA

ƒPRECIPITAÇÃO