Métodos em Ecologia Química

(1)

Métodos em Ecologia Química

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia – Brasilia, DF.

Maria Carolina Blassioli Moraes, Miguel Borges e Raúl Laumann

(2)

Interações Ecológicas

Ecologia Comportamental

Estuda as relações comportamentais entre o

organismo e o meio ambiente

Ecologia Química

Estuda as substâncias químicas (Semioquímicos)

envolvidas nas interações entre os organismos

(3)

Interações Ecológicas

Os seres vivos produzem substâncias químicas que os ajudam a sobreviver.

Qualquer substância química que liberada por um ser vivo que provoque uma mudança fisiológica e/ou comportamental é um SEMIOQUÍMICO

Semio = Semeon (do grego) = sinal Semio = Semeon (do grego) = sinal

(4)

Terminologia

Cairomônio Alomônio

• Semioquímico

– Um composto envolvido na

interação entre organismos

Aleloquímicos Interespecífica _{(- +)} (+ -) Feromônio Sinomônio Beneficia a planta e o parasitóide Feromônios Intraespecífica (+ +)

(5)

• A antena do inseto é o principal órgão de

percepção dos compostos químicos.

(6)

(7)

Linfa sensilar Poros Dendritos extrernos Complexo PLO-odorante PLO Cutícula Dendrit o Odorante no Poro Receptor C H 2 C H 3 C H 2

Percepção dos estímulos químicos

Linfa sensilar Cutícula Soma Axônio Sinal elétrico ar C H 3 C H 3 C H 2 C H 3 C H 3 C H 3 C H 2 Seletividade e sensibilidade

(8)

Química

Química dos

dos Semioquímicos

Semioquímicos

Foto em Túnel de Vento: Prof. Eraldo Lima

Induzem Modificações no Comportamento do Indivíduo Induzem Modificações no Comportamento do Indivíduo Induzem Modificações no Comportamento do Indivíduo Induzem Modificações no Comportamento do Indivíduo

(9)

Feromônio

Feromônio de

de insetos

insetos

O O O (E)-hex-2-enal (E)-oct-2-enal (E)-dec-2-enal O O (E)-tetradec-9-enyl acetate O O (Z)-tetradec-9-enyl acetate O O (9Z,12E)-tetradeca-9,12-dienyl acetate O Compostos defensivos Feromônio sexual de Feromônio sexual de mariposas tridecane (E)-dec-2-enal O O (E)-4-oxohex-2-enal O O (E)-4-oxooct-2-enal O O (E)-4-oxodec-2-enal O (Z)-dodec-7-enyl acetate (3Z,6Z,9Z)-nonadeca-1,3,6,9-tetraene O 2-nonyl-3-((2Z,5Z)-octa-2,5,7-trienyl)oxirane (R) (R) OH (S) (Z) H (R) H O O (S) (R) (S) O O (1R,4S,1’ S) Zingiberenol (7R) Sesquifelandreno

(2E,4Z,6Z) decatrienoato de metila (2S,6R,10S) trimetiltridecanoato de metila

Feromônio sexual de percevejos

(10)

Defesa de plantas contra insetos herbívoros

Constitutiva e induzida

Uma ferramenta alternativa para o controle biológico

Defesa direta:Compostos voláteis e não voláteis que agem diretamente sobre o herbívoro

Defesa indireta: Compostos voláteis que atraem o inimigo natural do herbívoro

(E,E)-α-farneseno Salicilato de metila

(11)

CO2 + H2O

hν _{Glicose e outros acúcares} Fotossíntese äcidos nucleiocs, plissacarídeos, glicosídeos O O OP Piruvato fosfoenol O OH O ácido pirúvico Compostos phenyl-C3

outrso compostos aromáticos, lignanas, taninos, flavooides CH₃COSCoA PO HO H OH H O H 4-fosfato eritrose HO OH OH OH O Ácido chiquímico +

Biossíntese de feromônios e metabolitos secundários

CH₃COSCoA acetyl coenzima A -_OOCCH 2COSCoA Malonil coenzima A + CO2 + CH₃COSCoA CH₃COCH₂COSCoA Acetoacetyl coenzima A + CH3COSCoA (R) OH OH O HO Aminoácidos aromáticos Aminoácidos alifáticos Peptídeos proteínas e alcalóides CO2 + H2O + Energia Policetídeos e ácidos gráxos Acetogeninas hidrocarboentos hormônios Eicosanóides ácido mavalônico Isoprenóides terpenos Esteróides Carotenos Ciclo do ácido cítrico

(12)

Introdução

nr

et

ta

ROTA DO MEVALONATO - MVA

3 Acetil CoA (C₂)

Piruvato

(C₃) Gliceraldeído-3-fosfato _{(C )}

ROTA DO METILERITRITOL FOSFATO - MEP

CERIVASTATIN CERIVASTATIN FOSMIDOMICINA FOSMIDOMICINA F ig . R eb ec ca H en re tta 3-hidróxi-3-metil-glutaril-coA redutase (HMGR) Ácido Mevalônico

Sesquiterpenos, homoterpenes e Triterpenos

(C₃) _(C 3) 1-deóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (DXR) Metileritritol fosfato Monoterpenos, Diterpenos e Tetraterpenos FOSMIDOMICINA FOSMIDOMICINA

(13)

(14)

Biossíntese de metabolitos secundários

Condensação de Claisen – novas ligações Carbono-Carbono

R O O R + _R O O R R O R O O R + R-OH NaOCH₂CH₃ H₃O+ H₃C O OR H₂C O OR H+ + _{Ka = 3x 10}-25 OR OR H+ + Ka = 1 x 10-13 H2C O OR O OR HC O OR O OR H+ + Ka = 1 x 10-13 H₂C O OR O OR HC O OR O SR + HS-R

(15)

Biossíntese de feromônios

H₃C C OH O + _H₃_C H₂ C C OH O COOH CH₃ +11 CH₃COOH -CO₂ H₂ C 3-methylpentacosane

(16)

Biossíntese de feromônios

H₃C C OH O + _H₃_C H₂ C C OH O 1 2 ₃ 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 2 1 1 2 (4R,6S,8S,10R,16S,18R)-4,6,8,10,16,18-hexamethyldocosane Prop-Prop-Prop-Prop-Prop-Ac-Ac-Prop-Prop-Ac-Ac

(17)

Biossíntese de feromônios

H _H H H O S - FeIII FeIV enzima O S - enzima H _H O S - enzima FeIII FeIII enzima + H₂O

(18)

Biossíntese de feromônios

O OH oleic acid O OH ácido linolêico em plantas O OH ácido linolênico em animais O HO ácido araquidônico

(19)

Biossíntese do cis-jasmone através do ácido linolênico Linolenic acid CO2H CO2H HOO CO2H O O cis-jasmone 12-oxo-10,15-(Z)-phytodienoic acid (12-oxo-PDA) CO2H O CO2H O CO2H O CO2H O

(20)

Rota biossintetica de ‘acidos

hidroxamicos

NH _NH O N H O OH O OH O OH O OH O H Indole-3-glycerol phosphate BX1 _BX2 _BX3 BX4

Indole Indolin-3-one 3-Hydroxy- Indolin-2-one

HBOA BX5 DIBOA BX6 TRIBOA NH _NH O N H O OH O OH O OH O OH O H Indole-3-glycerol phosphate BX1 _BX2 _BX3 BX4

HBOA BX5 DIBOA BX6 TRIBOA N H O N O O H N O O H N O O OH O H O C H₃ _O N O O O OH O H OH OH OH N O O O O H O C H₃ HO O OH OH OH DIBOA-glucoside BX8 (BX9) BX8 /BX9 DIMBOA-glucoside BX7 DIMBOA N H O N O O H N O O H N O O OH O H O C H₃ _O N O O O OH O H OH OH OH N O O O O H O C H₃ HO O OH OH OH DIBOA-glucoside BX8 (BX9) BX8 /BX9 DIMBOA-glucoside BX7 DIMBOA

(21)

O O

H

P-coumaric acid. _{P-hydroxybenzoic acid}

MBOA HMBO

A

O O

Syringic acid Dimboa

Trigo- Principais compostos indentificados

O O N H C H₃ O OH O _O N H C H₃ O O O N C H₃ OH O OH O N H O HBOA OH O O H OH O O H OH O C H₃ Vanillic acid O O C H₃ CH₃ O OH O OH O H O CH₃ Ferullic acid

(22)

Feromônio sexual de percevejos

• Na ordem Heteroptera a diversidade dos

compostos pertencentes ao feromônio sexual é

muito maior do que nas mariposas

• Não há padrões estabelecidos para famílias ou

subfamílias.

(23)

Especificidade do Sinal Químico

• Os feromônios sexuais são únicos-cada espécie

possui o seu específico.

• A produção do feromônio sexual depende de

fatores bióticos e abióticos.

• O feromônio sexual de uma mesma espécie

pode variar devido a diferenças geográficas.

(24)

Isomeria

• Isômeros estruturais ou

constitucionais

C H₃ O CH₃ H3C _CH₂OH C H ₃ OAc C H ₃ OAc Acetato de (Z)-5-dodecenila Acetato de (Z)-7-dodecenila Z-5-C12OAC Z-7-C12OAC

(25)

Isomeria

OAc C H₃ Z-11-C14OAC OAc C H₃ E-11-C14OAC Estereoisômeros-Isômeros geométricos

(26)

Isomeria-Enantiomeria

Centro quiral H₂N O NH₂ (R) O Espelho H₂N O (S) H OH H₂N 2 O (R) H HO NH₂

(27)

Compostos defensivos

– Hidrocarbonetos-alcanos/alcenos – Aldeídos • Em particular (E)-2-alcenais C H₃ _CH₃ Tridecano 1-Trideceno C H₂ _CH₃ (E)-2-Hexenal (E)-2-Octenal 1 ₅ 4 3 6 O CH₃ O CH3 • Em particular (E)-2-alcenais – Ésteres – 4-Oxo-alcenais (E)-2-Decenal O CH₃ O C H₃ CH₃ O Acetato de (E)-2-hexenila O O CH₃ O O CH₃ 4-Oxo-(E)-2-hexenal _{4-Oxo-(E)-2-decenal}

(28)

O tridecane O O (E)-hex-2-enal (E)-oct-2-enal (E)-dec-2-enal

Compostos defensivos

Percevejos Pentatomidae _{Coleoptera Teneobrinidae}

O Coccinelideos (joaninhas) tridecane O O (E)-4-oxohex-2-enal O O (E)-4-oxooct-2-enal O O (E)-4-oxodec-2-enal NH O HO (S)-3-hydroxypiperidin-2-one (R) (Z) NH₂ H₂N (R,Z)-nonadec-10-ene-1,18-diamine N H H Propileina

(29)

Coleta de Feromônio por extração com solventes

• Em adultos:

– Dissecação de inseto, e extração dos conteúdos da glândula com uma capilar de vidro

• De ninfas:

– Exúvias frescas imersas em solvente

Quimica Nova, 2012

(30)

(E)-2-Hexenal 1% 4-Oxo-(E)-2-hexenal 47% (E)-2-Decenal 13% Tridecano 33% Chinavia impicticornis (E)-2-Hexenal 1% 4-Oxo-(E)-2-hexenal 44% (E)-2-Decenal 17% Tridecano 32% Chinavia ubica

Dichelops melacanthus _{Euschistus heros}

4-Oxo-(E)-2- hexenal 49% (E)-2-Hexenal 27% Tridecano 15% Tetradecanal 2% Piezodorus guildinii

Alarme

ee

4-Oxo-(E)-2-hexenal (E)-2-Hexenal 1% 55% Tridecano 21% (E)-2-Octenal 16% Tetradecanal 2%

Dichelops melacanthus _{Euschistus heros}

Tetradecanal 1% _{(E)-2-Hexenal} 4% 4-Oxo-(E)-2- hexenal 31% Tridecano 39% (E)-2-Octenyl acetate 7% (E)-2-Octenal 13% Pareja et al, 2008

ee

Defesa

(31)

E. heros

A

P. guildinii

(E)-2-Hexenal

C. impicticornis e C. ubica

Diversidade dos Compostos nos

Pentatomídeos

Alarme e Defesa D. melacanthus C V 2 (E)-2-Octenal (E)-2-Hexenal (E)-2-Octenyl acetate (E)-2-Octenal (E)-2-Decenal

(32)

Diversidade dos Compostos nos

Pentatomídeos

Alarme e Defesa Chinavia impicticornis (E)-2-Decenyl acetate Pentadecane (E)-2-Decenal 3 4 5 6 Females Chinavia ubica 4-Oxo-(E)-2-hexenal Pentadecane Tridecane 4-Hidroxy-4-methyl-2-pentanone* -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 Nymphs Females Males -4 -3 -2 -1 0 1 2 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 Nymphs Females Males E-(2)-Octenal

(33)

(E)-2-Octenal

Tridecane 4

Dichelops melacanthus

Alarme e Defesa

Diversidade dos Compostos nos

Pentatomídeos

Euschistus heros 2 4 6 8 Females _Tetradecanal Dodecane Decane (E)-2-Octenal (E)-2-Octenal 4-Hidroxy-4-methyl-2-pentanone* Pentadecane -3 -2 -1 0 1 2 3 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 Nymphs Females Males Pentadecane 1-Pentadecene* 1-Tridecene* 7 25 -8 -6 -4 -2 0 2 -10 -5 0 5 10 15 Nymphs Males

(34)

Piezodorus guildinii

6 8

Tridecane

Alarme e Defesa

Diversidade dos Compostos nos

Pentatomídeos

36 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 -10 -5 0 5 10 15 20 Pentadecane 4-Oxo-(E)-2-hexenal _Tetradecanal Undecane Tetradecane Nymphs Females Males

(35)

Bombyx mori

O H

(36)

Classe de feromônio de insetos

• Não há uma classe específica para insetos.

• Lepidópteras: Tipo 1

Estrutura carbônica linear, variando de 10 a 18

carbonos, com grupos funcionais terminais,

álcool, acetato ou aldeído, e duplas ligações,

sendo a sua maioria dos compostos variando de

0 a 3 instaurações

(37)

Feromônio lepidópteras –Tipo 1

O O Elasmopalpus lignoselus (Z)-9-Tetradecenyl acetate O H (Z)-7-Tetradecen-1-ol O H (Z)-9-Tetradecen-1-ol O O Acetato de tetradecila O O (Z)-9-Acetato de hexadecenila O O (Z)-11-Acetato de hexadecenila O H O O Acetato de hexadecila (Z)-11-Hexadecen-1-ol

(38)

Feromônio de lepidópteras

• Os compostos do tipo II são hidrocarbonetos de

cadeias longas de C17 a C23 e seus epóxidos

(39)

Feromônio lepidópteras –Tipo 2

Anticarsia gematallis

(Z,Z,Z)-3.6.9-Eicosantriene

(40)

Percevejos

Liberação de Feromônio Sexual

Machos produzem o feromônio sexual

(41)

Feromônio sexual e de agregação

• Moléculas relativamente apolares

• Alta volatilidade

• Apresentam, no geral, quiralidade e/ou

insaturações

(42)

O O

Thyanta perditor

H

E2, Z4, Z6 Methyl decatrienoate

Piezodorus guildinii

Percevejos neotropicais

Piezodorus guildinii (7R)-(+)-

β

-Sesquiphellandrene OH Zingiberenol Tibraca limbativentris

(43)

Podisus maculiventris – 3-4 GAD machos

Atraiu machos e fêmeas

HO OH Linalool 0.83 α α α α-Terpineol 45.10 HO Terpinen-4-ol 0.93 O (E)-2-Hexenal 45.07 OH Ãlcool benzílico

(44)

Diversidade dos Compostos nos

Pentatomídeos

Acetatos Homoterpeno E.heros E.tristigmusE.servus E.politus E.obscurus E.conspercus C.ligata Chlorochroa ulheri T.perditor 0.5 1 1.5 n e n t 2 Feromônio Sexual Sesquiterpenos Sesquiterpeno oxigenado Terpeno Homoterpeno Lactona C.ubicaC.impicitcornis A.hilare_{A.pensylvanicum} N.viridula C.ligata C.sayi P.guildinii P.hybneri T.pallidovirens T.custator Tibraca limbativentris -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0.5 1 1.5 Component 1 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 C o m p o n e

(45)

“Dendograma Feromonal”

m ila ri ty Chlorochroa sayi C. ligarta C. ulheri T. limbativentris A. hilare A. pensylvanicum N. viridula C. ubica S im il C. ubica C. impicticornis T. pallidovirens T. custator E. heros E. obscurus E. conspercus P. guildinii P. hybneri E. tristigmus E. servus E. politus T. perditor Análise de Clusters Método Ward

(46)

60 80 100 E p o x i-b is a b o le n e

trans- Bisabolene epoxide cis-Bisabolene epoxide

Diversidade dos Compostos nos

Pentatomídeos

Feromônio Sexual A. marginatum A. pensnsylvanicum A. hilare C. ubica A. hilare C . M a rg in a tu m (F lór ida, E U A ) 0 20 40 C . P e n n s y lv a n ic u m (M ar yl an d, E U A ) C . U b ic a (D F , B R ) C .I m p ic it c o rn is (D F , B R ) C . H il a re (C al if ór n ia, E U A ) N . v ir id u la ( D F , B r) C . H il a re ( G eor gi a, E U A ) N . v ir id u la ( K yu sh u , JP ) N . v ir id u la ( M is is ipi , E U A ) N . v ir id u la ( M au i, H aw ai ) N . v ir id u la ( C al if ór in a, E U A ) % tr a n s & c isE

(Baker et al. 1987, Borges et al. 1987, Aldrich et al. 1992, Borges 1995, McBrien et al, 2000, Borges et al, unpublished)

C. ubica C. impicticornis N. viridula N. viridula N. viridula N. viridula N. viridula

(47)

Metodologia

Metodologia de Isolamento e Análise de

de Isolamento e Análise de

Feromônios

Fonte

(Insetos)

Extração/Concentração

Bioensaios

Separação/Fracionamento

(48)

…Coleta de material em campo…

Metodologia de Isolamento e Análise de

Semioquímicos

…e estabelecimento de colônia em

laboratório…

(49)

Mariposas

Liberação de Feromônio Sexual

(50)

Mariposas

Liberação de Feromônio Sexual

(51)

Coleta de Feromônios por Aeração

(52)

(53)

(54)

Esquema da câmera par coelta de

voláteis

(55)

Adsorventes Químicos

Materiais poliméricos

• PorapaK Q (co-polímero de

p-divinilbenzeno-vinilbenzeno)

• Tenax (polifenilenoxida na base de 2,6

difenilfenol)

• Carvão ativado

• Super Q

(56)

Hexano

Dessorção das amostras e

Pré-concentração das amostras sob fluxo de nitrogênio

(57)

Atividade Biológica de Feromônios

…fracionamento…

…isolamento…

(58)

Fracionamento da amostra

Sílica e alumina – cromatografia por adsorção.

Tanto o solvente como o soluto são atraídos para a fase estacionária. Hexano + éter mistura de Fase estacionária Adsorvent e mistura de Voláteis em hexano Voláteis separados

(59)

Fracionamento argentometria

• Compostos orgânicos insaturados complexam

com metais de transição- Prata

(60)

Microextração em fase sólida - SPME

Tipos de Fibras:

Apolares: Polidimetilsiloxano (PDMS)

Polares: Polietileno glicol, poliacrilato

(61)

(62)

(63)

Extração de semioquímicos em fase aquosa usando Extração de semioquímicos em fase aquosa usando barra magnéticas de PDMS (SBSE)

barra magnéticas de PDMS (SBSE)

Barras magnéticas cobertas com polidimetilsiloxano

Diferentes tamanhos de barras e diferentes espessuras do PDMS.

Adsorção dos analitos na barra

Barra de ferro

Lâmina de

Dessorção dos analitos da barra Pré-concentração da amostra

Lâmina de vidro PDMS Análise Química GC, HPLC, GC-MS

(64)

Análise de Feromônios

Cromatografia gasosa é um método instrumental para

separação e identificação de compostos químicos

1 1 1

1 ---- Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2

2 2

2 ---- Injetor (Vaporizador) de Amostra. Injetor (Vaporizador) de Amostra. Injetor (Vaporizador) de Amostra. Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3

3 3

3 ---- Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4

4 4

4 ---- Detector. Detector. Detector. Detector. 5

5 5

5 ---- Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6

6 6

(65)

(66)

Coluna capilar: Diametro: 0.53 a 0.10 um Comprimento: 30 a 90 m.

Coluna Capilares

poliimida

Suporte sólido vidro Fase estacionário

líquida

Absorção líquida

(67)

Coluna Capilares-Fases estacionárias

POLIGLICÓIS Muito polares; sensíveis a umidade e oxidação; ainda muito importantes. Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais: Carbowax, DB-Wax, Supelcowax, HP-Wax, etc.)

CH₂ CH₂ O

H OH

Estrutura Química:

n

SILICONES (polisiloxanas) As FE mais em-pregadas em CG. Cobrem ampla faixa de pola-ridades e propriedades químicas diversas.

Si CH3 H3C CH3 O Si R1 R2 O Si CH3 CH3 CH3 n R₁, R₂ = qualquer radical orgânico

(68)

Coluna Capilares-Fases estacionárias

Fase estacionária Fases de polisiloxanas Dimetil -polisiloxana Nomes comerciais DB1, SPB-1, AT1, HP1, RTX-1, CPSIL 5CB 5% Fenil-Metil polisiloxana

5% Fenil-Metil polisiloxana DB5, SPB-5, AT5, HP5, RTX-5, CPSIL 8CB

50% Fenil-Metil polisiloxana DB17, SPB-50, AT50, HP17, RTX-50, CPSIL 19CB

(69)

Detector de Ionização de chama

COLETOR

FLAME TIP

AR

SELETIVIDADE Seletivo para

substâncias que contém ligações C-H em sua estrutura química.

BLOCO

H₂

COLUNA

(70)

Gases nobres H₂, O₂, N₂ CO, CO₂, CS₂ CCl₄, peralogenados NH₃, N_xO_y SiX₄ (X = halogênio) H₂O HCOOH, HCHO *

Compostos que NÃO produzem resposta no DIC:

DIC

DCT N2

CH₄ CO₂ O₂

(71)

ANÁLISE QUALITATIVA

Índice de Retenção de Kovàts

5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 6. 02 1 8. 56 9 11.3 78 14 .2 10 16 .9 63 19 .5 72 22 .0 07 23.8 98 25 .4 25 26 .7 33 ₂₇.8 95 28 .9 53 29 .9 36 C20 C18 C13 C14 _C15 C16 C17 C19 C21 C12 C11 C10 C9 Um gráfico de log(t’_R) em função do número de átomos de carbono do analito n_C é LINEAR Interpolação logarítmica dos t’_R

(72)

ANÁLISE QUALITATIVA

Índice de Retenção de Kovàts

TR =8.890 TR_n=8.603 TR_N=9.580 C12 _C13       − − + = n N n A TR TR TR TR * 100 n * 100 KI 7.50 7.75 8.00 8.25 8.50 8.75 9.00 9.25 9.50 9.75 10.00 TR_A=8.890 Min     − − + = 603 . 8 9.580 603 . 8 8.890 * 100 12 * 100 KI KI=1229 Decanal

(73)

Análise Quantitativa

• Padrao interno

AMOSTRA + Padrão PADRÃO

(74)

Padrão interno

ka é uma constante de

proporcionalidade que depende do

analito, do detector e das condições de analito, do detector e das condições de operação do equipamento

Ca é a concentração do analito v é o volume injetado de amostra.

v

C

k

A

_a

=

_a

v

C

k

A

_pi

(75)

Como as duas substâncias são injetadas simultaneamente, o volume é o mesmo nas duas equações

Padrão interno

a a a pi pi pi

C

k

A

C

k

A

=

v

C

k

A

_a

=

_a

A

_pi

=

k

_pi

C

_pi

v

a pi pi a pi a

C

A

C

A

k

´

=

equações pi a pi a pi a C C k k A A ⋅ = A_a/A_pi C_a/C_pi α A inclinação da reta é K pi a pi s a a k A C A C , = pi pi a a

A

C

A

C =

(76)

Fator de Reposta do analito em

relação ao Padrão interno

pi a pi s a a k A C A C , = A_a A_pi A_a/A_s C_a/C_s α A inclinação da reta é K a pi pi a pi a

C

A

C

A

K

_,

=

(77)

Padrão Externo

• Curva analítica- padrão injetado em diferentes

concentrações. O detector FID é proporcional a

concentração.

C (g/ml) Área 2,8 117 y = 8.4941x + 91.309 250 2,8 117 5,7 135 8,4 162 11,2 194 14,1 207 y = 8.4941x + 91.309 R² = 0.9827 0 50 100 150 200 250 0 5 10 15 Á re a do p ic o Concentração g/mL

(78)

Padrão Externo

y = 8.4941x + 91.309 R² = 0.9827 0 50 100 150 200 250 Á re a do p ic o 0 0 5 10 15 Concentração g/mL A=8.5*C+ 91.3 A=184 184=8.5*C+91.3 C=(184-91.4)/8.5 C=10.8g/mL

(79)

Confiabilidade dos dados ( e da curva Analítica)

C (g/mL) Área 1 Área 2 Área 3 Média

0,3 462 416 462 447 0,6 929 924 924 926 0,9 1386 1525 1340 1417 1,2 1834 1848 1827 1839 1,5 2079 2310 2305 2231 y = 414.3x + 85.1 R² = 0.9907 0 500 1000 1500 2000 2500 0 1 2 3 4 5 6 Concentração g/mL Á re a y = 448.1x + 27.7 R² = 0.9977 0 500 1000 1500 2000 2500 0 1 2 3 4 5 6 Concentração g/mL Á re a

(80)

GC-MS

Cromatógrafo a gás Fonte de íons

e -e -e -e -e -e -e -+ + + + + + + + + + + + ₊ ₊ + + + + ₊ + Analisador de massas Multiplicador De elétrons e 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 0.0e6 5.0e6 10.0e6 15.0e6 50 75 100 125 150 175 200 225 0e3 50e3 100e3 150e3 200e3 250e3 300e3 350e3 400e3 43 93 109 67 82 55 131 121 159 146 177 187 207 220

(81)

Espectro de massas

10.0e6 15.0e6 50 75 100 125 150 0e3 100e3 200e3 300e3 400e3 43 70 55 83 98 110 121 ₁₃₆ 153 0e3 50 75 100 125 150 175 50e3 100e3 150e3 200e3 250e3 300e3 350e3 ₅₇ 43 71 85 99 113 127 141 155 184 50 75 100 125 150 175 200 225 0e3 50e3 100e3 150e3 200e3 250e3 300e3 350e3 400e3 43 93 109 67 82 55 131 121 159 146 177 187 207 220 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 0.0e6 5.0e6 10.0e6 50 75 100 125 150 175 0e3 250e3 500e3 750e3 1000e3 57 43 71 85 99 ₁₁₃ 127 141 170

(82)

Interpretação de espectro de massas

H

IE

CH

+

H

12_{C 100} 13_{C 1.1}

(83)

Bibliotecas de banco de espectros

NIST

(84)

Interpretação de espectro de massas

Perda de C_nH_2n+1+ C_nH_2n-1 Isótopos 13C 1.1 2H 0.015

Tridecano C

₁₃

H

₂₈ M+ m/z A bu nd ân ci a re la ti va 218432 31702 (32502/218432)*100= 14,51

(85)

Espectro de massas

Rearranjo de McLafferty

Rearranjo do Hγ e quebra da ligação β a carbonila

R H O rH R O H α R O H + + O m/z=58: R=CH3. 40% retenção da carga m/z=58: R=CH3. 40% (IE=8.7 eV) R=C6H5, 5% R O H R O H + R=CH3(IE=9.7eV), 5% R=C6H5 (IE=8.4), 100% migração da carga

(86)

100 43

Interpretação de espectro de massas

H O _rH _α O H m/z=72 O+ O+ H C H (w8n08) 2-Pentanone, 3-methyl-20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 0 50 26 27 28 29 30 32 38 39 40 41 42 44₄₆ ₅₀ _{53 55} 56 57 58 ₆₂ _{65 67 69 71} 72 73 83 85 87 100 O C H₃ m/z=43 m/z=57 C H₃ M+

(87)

100 43

Interpretação de espectro de massas

H

O _rH _α

O H

m/z=58

(w8n08) Methyl Isobutyl Ketone

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 0 50 26 27 28 29 30 38 39 40 41 42 44 50 53 55 57 58 59_{61 63 65 67 69 71 73} _{81 83} 85 86 98 100 O M+

(88)

Interpretação de espectro de massas

Ácidos carboxílicos e seus derivados

C H₃ O O H 45 60 73 C H₂ + O O R + γ McL α O R C H₂ O H+ O R + COOR

Substituinte R Clivagem γγγγ McLafferty Clivagem α

R=H m/z 73 m/z 60 m/z 45

R=CH₃ m/z 87 m/z 74 m/z 59

(89)

Interpretação de espectro de massas

M+

(90)

Interpretação de espectro de massas

M+

(91)

Interpretação de espectro de massas

(92)

Interpretação de espectro de massas

M+

(mainlib) Methyl 2,6,10-trimethyltridecanoate

80 120 160 200 240 280 0 50 100 55 69 88 101 129 157 ₁₈₀ 213 239 270 O O M+

(93)

Interpretação de espectro de massas

C H₃ CH₃ O O CH3 129 133 88 methyl 2-methylhexanoate M+

(94)

Interpretação de espectro de massas

Compostos terpenóides C H₃ CH₃ CH₃ CH₃ C H₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ C H₃ 3 2,6-dimethyloctane OH

(95)

Interpretação de espectro de massas

Compostos terpenóides -e -R _R α R R α R + Retenção de carga m/z =68 R α R + Migração de carga m/z =68

(96)

RDA +

Interpretação de espectro de massas

RDA

56 u m/z 68

RDA

+

(97)

Limoneno

(98)

(99)

Linalol

(100)

Thyanta perditor

O O 1 0 8 2E,4Z,6Z-Decatrienoato de metila 6 8 1 0 1 2 1 4 1 1 1 2 9 7 8 5 4 6 3 2 1 R e t e n t io n T im e / m in . Moraes et al, JCE 2005

(101)

Elucidação estrutural

O O Estratégias 2 5 % 5 0 % 7 5 % 1 0 0 % 3 9 5 5 6 5 7 9 9 1 1 0 5 1 2 0 1 4 9 M - 3 2 / 3 1 7 4 M + . M - 3 2 / 3 1 7 4 M + . A 1 8 0 7 4 A (2E,4Z,6Z)-Decatrienoato de metila M+-32, perda de CH3OH, M+-31, perda de CH3O. 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 0 % 2 5 % _{6 5} 1 3 3 1 4 9 1 6 5 7 4 7 4 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 7 4 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 0 % 2 5 % 5 0 % 7 5 % 1 0 0 % 3 9 5 5 6 5 7 9 9 1 1 0 5 1 2 0 1 3 3 1 4 9 1 6 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 1 8 0 M/z=74 O O R H CH₃ R CH₂ + O + C H₂ O H CH₃

(102)

Elucidação estrutural

• Hidrogenação

• Atmosfera com H

₂

e catalizador 10% de Pd (1h com

agitação em vial cônico)

100 74 O 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 0 50 18 29 43 ₅₅ 69 87 101 115 129 143 155 186 O

Análise por HPLC gerou um pico com absorbância máxima em 330nm

(103)

Elucidação estrutural

Configuração absoluta-isomeria

Comparamos com diferentes isômeros- GC-MS

• (2E,4E,6E) -10:COOMe

• (2E,4Z,6E) -10:COOMe

• (2E,4E,6Z) -10:COOMe

• (2E,4Z,6Z)- 10:COOMe

2E,4Z,6Z -10:COOMe T. Perditor

(104)

Elucidação estrutural

Configuração absoluta-centro estereogênicos

Feromônio sexual do percevejo Tibraca limbativentris e Oebalus poecilus 1,10-bisaboladien-3-ols OH H OH H OH H OH OH 1 4 1' 7 ( 1'R)-zingiberenol H H OH ( 1'S)-zingiberenol H OH H OH H OH H OH H 1 4 1' 7

(105)

Elucidação estrutural

Configuração absoluta-centro estereogênicos

Coluna cromatográfica quiral

(106)

Elucidação estrutural

(107)

Piezodorus

Piezodorus guildinii

guildinii

(7R)-β-Sesquiphellandrene C H₂ H3C CH₃ H C H₃ 7 1 2 3 4 5 6 8 9 7

Borges et al., JCE 2007

3

4 6 8 10 12 14

1111, (E)-2-hexenal; 2222, ocimene isomer; 3333, 2-ethylhexanol; 4444, undecane; 5555, nonanal; 6666, tridecene; 7777, tridecane; 8888, α-farnesene; 9999, β-sesquiphellandrene

(108)

GC-MS

91 ₁₆₁ Macho de P. guildinii C H₂ H3C CH₃ H C H₃ 7 Sesquiphellandrene 30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 0 50 100 41 55 69 77 91 105 120 133 147 161 204 30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 0 50 100 ₃₉ 56 69 77 91 105 120 133 147 161 204 Padrão Sintético

(109)

H H

(7R)-β-Sesquiphellandrene (7S)-β-Sesquiphellandrene

Piezodorus

Piezodorus guildinii

guildinii

Borges et al., JCE 2007

+ O O Cl Cl Cl Cl 2 80 OC (7R)-β-Sesquifelandreno 7 Tetraclorobenzoquinona _{(7R)-α-Curcumeno} 7

(110)

Determinação da Esterioquímica do

Coluna quiral Cyclodex β

Extrato natural R C H2 C H3 CH₃ H C H₃ 7

α-curcumeno sintético Isômeros R e S

S R

(111)

* e s n-Hexane (R)-Sesquiphellandrene C H₂ H3C CH₃ H C H₃ 7

Piezodorus guildinii

30 20 10 0 10 20 30 (S)-Sesquiphellandrene (R)-Sesquiphellandrene ns ns ns M a le s ---F e m a le s n-Hexane n-Hexane n-Hexane (S)-Sesquiphellandrene

Response (Number of Insects)

(112)

Oebalus

(113)

Oebalus

Oebalus poecilus

poecilus

OH H 1 4 1' 7 Extrato natural Padrão sintético

(114)

Derivatização com N-methyl-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide (MSTFA) HO H MSTFA O H Si m/z 222 m/z=294 Extrato natural Sintético

(115)

Análise por cromatografia gasosa

Extrato de macho

Coluna apolar DB-5

O Si

Extrato de macho derivatizado com MSFTA

Zingiberenol sintético

H

(116)

CH₃CN DEATMS O _O O O

Síntese do Zingiberenol

O H THF, Et₂O KOH, TBAOH Et₂O MeLi OH H 1’ 4 1

(117)

1 2

3 4

1 2

3 4

Coluna quiral Zingiberenol sintético

Elucidação estrutural

Configuração absoluta-centro estereogênicos

42.51

1 2

42.51

(118)

(R) OH 7 1 4 H2SO4 1 4 _(R) 1 4

Elucidação estrutural

Configuração absoluta-centro estereogênicos

(R) (S) 4 H 1' MeOH H₂SO₄ (R) (S) 4 H 1' (R) (S) H 1'

(119)

Elucidação estrutural

Configuração absoluta-centro estereogênicos

Zingibereno gerado do1’ R-zingiberenol 4R,1´R zingiberenol e 4S,1’R zingiberenol

Natural zingibereno do óleo de zingibre 4R,1’S zingiberene

Zingibereno gerado do 1’S-zingiberenol 4R,1´S zingiberenol e 4S,1’S zingiberenol

Zingibereno gerado do extrato natural

HO

(120)

HO

H

Elucidação estrutural

Configuração absoluta-centro estereogênicos

4R 1RS 1’S (R) (R) OH (S) 7 1 4 (R) (R) OH 7 1 4 H (1R, 4R) -Quercivorol H 1' (1R, 4R, 1'S) -Zingiberenol 1'

(121)

Elucidação estrutural

Configuração absoluta-centro estereogênicos

(R) (R) OH 7 1 4 (R) (R) OH 7 1 4 H H 1' (S) H (1R, 4R) -Quercivorol H 1' (1R, 4R, 1'S) -Zingiberenol 1'

(122)

CH₃ O CH CH₃ O C H₃ CH₃ CH₃

trans- 1,2 epoxi-(z)- αααα-bisabolene

Nezara

Nezara and

and Chinavia Species

Chinavia Species

40 60 80 100 c is E p o x i-b is a b o le n e

trans -bisabolene epoxide cis -Bisabolene epoxide

C

H3 CH3

CH₃

cis- 1,2 epoxi-(z)- αααα-bisabolene

CH₃

C

H₃ CH3

CH3

(z)- α-bisabolene

(Baker et al. 1987, Borges et al. 1987, Aldrich et al. 1992, Borges 1995, McBrien et al, 2000, Borges et al, unpublished) C . M a rg in a tu m (F ló ri da , E U A ) 0 20 C . P e n n s y lv a n ic u m (M ar yl an d, E U A ) C . U b ic a (D F, B R ) C .I m p ic it c o rn is (D F, B R ) C . H ila re (C al if ór ni a, E U A ) N . v ir id u la ( D F, B r) C . H ila re ( G eo rg ia , E U A ) N . v ir id u la ( K yu sh u, J P ) N . v ir id u la ( M is is ip i, E U A ) N . v ir id u la ( M au i, H aw ai ) N . v ir id u la ( C al if ór in a, E U A ) % tr a n s &c

(123)

Tibraca limbativentris

12 3 4 5 7 6 9 8 10 11 10 12 13 13 14 15 16 ♂ ♀ 1 11 12 14 9 8 2 3 6 5 4 69 119 93 204 41 121 91 77 105 55 ₈₂ 161 109 67 71 79 133 57 94 162 189 4345 53 59 65 75 86 9596 111113 123127132 137138147148153157 165 193 207209 222 Peak 16 119 93 69 91 204 161 41 77 120 5557 67 79 9495 105109 133 134 81 82 53 70 132 138147 162 189 4351 65 117 123 14815 202 205 9 208 86 96103 145 169173 193 222 4445 75 152 180 187 200 69 Peak 15 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 m/z 119 4 1 93 94 109 43 55 67 7779 91 95 ₁₀₅ 123 137 161 204207 138 133 81 5357 65 7071 8384 9697 111 147148151 162 179 189 208 222 45 51 58 72 112 124 139 152 165 175 180 190193 221223229 Zingiberenol 2 69 119 93 204 41 121 91 77 105 55 ₈₂ 161 109 67 71 79 133 57 94 162 189 4345 53 59 65 75 86 9596 111113 123127132 137138147148153157 165 193 207209 222 Peak 16 119 93 69 91 204 161 41 77 120 5557 67 79 9495 105109 133 134 81 82 53 70 132 138147 162 189 4351 65 117 123 14815 202 205 9 208 86 96103 145 169173 193 222 4445 75 152 180 187 200 69 Peak 15 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 m/z 119 4 1 93 94 109 43 55 67 7779 91 95 ₁₀₅ 123 137 161 204207 138 133 81 5357 65 7071 8384 9697 111 147148151 162 179 189 208 222 45 51 58 72 112 124 139 152 165 175 180 190193 221223229 Zingiberenol 2 OH Zingiberenol

(124)

Tibraca limbativentris

Ionização química com amônia

2 34 A 2 34 A 42.51 39.5 40.0 40.5 41.0 41.5 42.0 42.5 43.0 43.5 44.0 44.5 45.0 Time (min) 1 1 2 2 3 B 42.51 39.5 40.0 40.5 41.0 41.5 42.0 42.5 43.0 43.5 44.0 44.5 45.0 Time (min) 1 1 2 2 3 B Coluna quiral Padrão de Zingiberenol Extrato de macho m/z 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 75 73 69 41 279 55 57 43 209 119 81 93 95 67 44 61 99 111 121 137 143 156 161 181183 195 204 210 223224 237 251252267 280 294 295 313 341 B – peak 2 73 279 75 69 209 119 41 93 ₁₈₃ 280 156 195 55 67 79 91 95105 121 133 143 181 204 210 294 45 161 223 237 251 261 265 282 295 312 341 A– peak 2 O Si C H3 CH3 CH3 m/z 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 75 73 69 41 279 55 57 43 209 119 81 93 95 67 44 61 99 111 121 137 143 156 161 181183 195 204 210 223224 237 251252267 280 294 295 313 341 B – peak 2 75 73 69 41 279 55 57 43 209 119 81 93 95 67 44 61 99 111 121 137 143 156 161 181183 195 204 210 223224 237 251252267 280 294 295 313 341 B – peak 2 73 279 75 69 209 119 41 93 ₁₈₃ 280 156 195 55 67 79 91 95105 121 133 143 181 204 210 294 45 161 223 237 251 261 265 282 295 312 341 A– peak 2 73 279 75 69 209 119 41 93 ₁₈₃ 280 73 279 75 69 209 119 41 93 ₁₈₃ 280 156 195 55 67 79 91 95105 121 133 143 181 204 210 294 45 161 223 237 251 261 265 282 295 312 341 A– peak 2 O Si C H3 CH3 CH3 Sililação

(125)

1 2 Zingiberenol 2 1 2 Zingiberenol 2 1 2 Zingiberenol 2 11 2 Zingiberenol 2 1

Colunas cromatográficas com diferentes polaridades

Coluna polar Coluna apolar

Tibraca limbativentris

min 20 22.5 25 27.5 30 32.5 35 37.5 min 17.5 20 22.5 25 27.5 30 32.5 35 37.5 1 2 ♂T. limbativentris min 20 22.5 25 27.5 30 32.5 35 37.5 min 17.5 20 22.5 25 27.5 30 32.5 35 37.5 1 2 ♂T. limbativentris 1 min 24 26 28 30 32 34 min 24 26 28 30 32 34 1 2 ♂– T. limbativentris 11 min 24 26 28 30 32 34 min 24 26 28 30 32 34 1 2 ♂– T. limbativentris 1

(126)

Tibraca limbativentris

OH Zingiberenol 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 No response No response No response Z I Z II Hexane Hexane Z I Z II ns ** ns OH OH OH OH OH OH OH OH Borges et al. 2006 Borges et al. 2006Borges et al. 2006 Borges et al. 2006 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50

(127)

Mosca do gado

Hydrotea irritans Hydrotea irritans Musca autumnalis Musca autumnalis Haematobia irritans Haematobia irritans Stomoxys calcitrans Stomoxys calcitrans

(128)

Atratividade diferencial

Se o gado fosse igualmente atraente as moscas Se o gado fosse igualmente atraente as moscas esperaríamos ter uma distribuição normal das esperaríamos ter uma distribuição normal das moscas…

moscas…

(129)

Captura dos voláteis

(130)

Teste de campo com, 6

Teste de campo com, 6--Metil

Metil--55--Hepten

Hepten--22--ona

ona

50 O 0 10 20 30 40 1 3 5 7 9 11 13 15 Counting session P er ce n ta g e o f fl ie s A B C D E F

(131)

Aedes aegypti

América do Sul, Asia, Africa e Australia América do Sul, Asia, Africa e Australia Àreas rurais e urbanas

Àreas rurais e urbanas Febre amarela e dengue Febre amarela e dengue

(132)

Coleta de voláteis

-Air temperature and RH -Body temperature -Questionnaire

(133)

min 5 10 15 20 25 30 35 pA 0 100 200 300 400 500 600 700

Results

Results -- GC Traces

GC Traces

Blank control min 5 10 15 20 25 30 35 min 5 10 15 20 25 30 35 pA 0 100 200 300 400 500 600 700 FID1 A, (R:\JAMES\T011202B.D) Human being

(134)

Avaliar a influência de fitohormônios da defesa direta de plantas

Cis-jasmone

Voláteis

Compostos não voláteis

O Compostos não voláteis

Ácidos hidroxâmicos e Fenólicos;

(135)

Rotas biossintéticas de metabólitos secundários em plantas Carbon Dioxide Glucose Erythrose-phosphate Acetyl Co-enzyme A Glyceral-3-P+Pyruvate

Isopentenyl pyrophosphate _Homortepenes Green leaf volatiles Calvin cycle glycolysis pentose phosphate or glycolysis shikimic acid/ fatty acid/ lipoxygenase pathway melavonate pathway alt. IPP pathway CH₃ CH₃ Jasmonic acid Cis-jasmone Indole-3-glycerol-P _Monoterpenes Sesquiterpenes shikimic acid/ tryptophan pathway tryptophan or non tryptophan pathway N H CH₂ CH₃ C H₃ CH₃ Ocimene OH C H₃ CH₃ CH₂ C H₃ linalool CH₃ C H₃ CH₃ CH₃ CH₂ farnesene C H₃ _CH₃ CH₃ CH₃ CH₂ Indole TMTT Hydroxamic acids

(136)

Rota metabólica ácido hidroxâmico em milho. NH _NH O N H O OH N O O OH N O O OH N O O OH O H Indole-3-glycerol phosphate BX1 _BX2 _BX3 BX4

HBOA BX5 DIBOA BX6 TRIBOA NH _NH O N H O OH N O O OH N O O OH N O O OH O H Indole-3-glycerol phosphate BX1 _BX2 _BX3 BX4

HBOA BX5 DIBOA BX6 TRIBOA N H O N O O H N O O H N O O OH O H O C H₃ _O N O O O OH O H OH OH OH N O O O O H O C H₃ O O H OH OH OH DIBOA-glucoside BX8 (BX9) BX8 /BX9 DIMBOA-glucoside BX7 DIMBOA N H O N O O H N O O H N O O OH O H O C H₃ _O N O O O OH O H OH OH OH N O O O O H O C H₃ O O H OH OH OH DIBOA-glucoside BX8 (BX9) BX8 /BX9 DIMBOA-glucoside BX7 DIMBOA

(137)

Extração na fase líquida

1. Pesar100 mg do tecido em frasco de 10mL 3. Adicionar 3 ml of 0.001 M HCl e macerar 4. Sonicar por 10 min.

5. Extrair com érte etílico (3x10 ml)

Metodologias de etxração

5. Extrair com érte etílico (3x10 ml)

6. Adicionar 3 µl of padrão interno(Tetracosane 5 µg/ml) 7. Evaporar sobre N₂

8. Adicionar 0.1 ml de MSFTA (N-metil-N- trimetilsili(trifluoroacetamida) 9. Heat at 60o_{C for 1 hour}

(138)

1 2 ₃ 4 co-eluted 5 6 7 8 9 co-eluted 10 11 12 Leaves

Perfil cromatográfico do extrato de plantas de trigo obtidos através de extração na fase líquida.

1 2 2 3 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 12 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 Time (min) Root

(139)

Perfil cromatográfico do extrato de trigo obtido de folhas de trigo tratadas com cis-jasmone B. Espectro de massas do composto Dimboa (18.41 min) confirmando a presença do composto trimetilsilil (TMS)-derivatizad oDIMBOA.

Dimboa 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 14.49 17.57 14.58 18.41 8.26 17.68 6.61 15.89 8.37 19.52 13.02 24.95 10.41 22.27 O O N C H₃ OH O OH Pm= 211.17 g/mol m/z H O O N C H₃ O O O Si C H₃ CH₃ CH₃ Si C H₃ C H₃ CH₃ 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Time (min) 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 73.0 238.0 355.1 340.1 194.0 147.0 _191.0 75.0 _239.0 _356.1 195.0 44.8 _136.0 _149.0 _251.0 _357.1 103.0 296.0 327.1 _383.0 _433.1 _{449.1 461.1} _507.2 _551.1

(140)

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Time (min) 18.36 15.10 19.51 15.88 10.42 22.21 24.95 10.82 9.11 11.97 25.48 MBOA O _O N H C H₃ O Pm= 165.15g/mol Time (min) 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 m/z 0 20 40 60 80 100 R e la ti v e A b u n d a n c e 194.0 237.0 195.0 238.0 222.0 _281.0 164.0 147.0 _179.0 _196.0 136.0 _151.0 _208.0 _223.0 239.0 120.0 133.0 166.0 193.0 221.0 236.1 249.0 254.0 265.0 273.0 Si CH3 CH₃ C H₃ O N O O MBOA

(141)

O O

H

P-coumaric acid. _{P-hydroxybenzoic acid}

MBOA HMBOA

O O

Syringic acid Dimboa

Main compounds identified in extraction solutions of Wheat using LPE and VPE

O O N H C H₃ O OH O _O N H C H₃ O O O N C H₃ OH O OH O N H O HBOA O H O O H OH O O H OH O C H₃ Vanillic acid O O C H₃ CH₃ O OH O OH O H O CH₃ Ferullic acid

(142)

Quantidade média (±SE) de ácidos hidroxâmicos extraídos de raízes e folhas usando EFL.

Cis-jasmone/EBV Untreated EBV Cis-jasmone/EBV Untreated EBV DIMBOA 400 600 800 1000 400 600 800 1000 a b _b 2 3 4 5 6 7 a a a 2 3 4 5 6 7 a a a HBOA ra ti o n m g /K g ( fr e s h w e ig h t) MBOA DIMBOA O _O N H C H₃ O O O N C H₃ OH O OH Cis-jasmone/EBV Untreated EBV C o n c e n tr a ti o n m g /K g ( fr e s h w e ig h t) 0 3 6 9 12 15 Leaves Roots Cis-jasmone/EBV Untreated EBV Cis-jasmone/EBV Untreated EBV C o n c e n tr a ti o n m g /K g ( fr e s h w e ig h t) 0 3 6 9 12 15 Leaves Roots a a a a a a 0 200 Root Leaves 0 200 Root Leaves a b b b _b 0 1 2 Leaves Root 0 1 2 Leaves Root C o n c e n tr a t HMBOA O O N H C H₃ O OH

(143)

Extração em fase vapor

Vacuum pump

N flow

Flow meter _N₂ _flow

Flow meter Hot plates 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 10 2 3 4 5 6 7 8 9 11 200 o_C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 10 2 3 4 5 6 7 8 9 11 70 o_C