UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA

CARACTERIZAÇÃO POLIFÁSICA DE ISOLADOS BACTERIANOS OBTIDOS DE NÓDULOS DE FEIJOEIRO-COMUM

ALINE ASSIS CARDOSO

Orientador:

Prof. Enderson Petrônio de Brito Ferreira

Goiânia, GO – Brasil 2014

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ALINE ASSIS CARDOSO

CARACTERIZAÇÃO POLIFÁSICA DE ISOLADOS BACTERIANOS OBTIDOS DE NÓDULOS DE FEIJOEIRO-COMUM

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Agronomia, da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Agronomia, área de concentração: Solo e Água.

Orientador:

Dr. Enderson Petrônio de Brito Ferreira

Co-orientadoras:

Drª. Tereza Cristina de Oliveira Borba Profª Drª. Eliana Paula Fernandes Brasil

Goiânia, GO – Brasil 2014

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Aos meus pais Ademar Marques Cardoso e Maria Regina Chaves de Assis e Cardoso Ao meu amado marido Michel

E a minha filha, Maria Augusta

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AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Enderson Petrônio de Brito Ferreira (Orientador) por suas valiosas contribuições e sugestões.

A Drª Tereza Cristina de Oliveira Borba (Co-orientadora) pela paciência e colaboração no decorrer da pesquisa e a todos do laboratório de Biotecnologia da Embrapa Arroz e Feijão.

A Profª. Drª. Eliana Paula Fernandes Brasil (Co-orientadora) por todas as oportunidades oferecidas.

Aos analistas do Laboratório de Análises de Biologia e Bioquímica do solo da Embrapa Arroz e Feijão, Tatiana e Adriano Knupp pelo auxílio em vários momentos.

Ao laboratório de Bioquímica da Universidade Estadual de Goiás/Anápolis pela infraestrutura e em especial a Profª. Drª. Cláudia Cristina Garcia Martin Didonet pela dedicação e contribuições.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa de formação.

Ao meu marido Michel pelo carinho e incondicional apoio oferecido em todos os estágios da pesquisa, desde a parceria nos trabalhos em disciplinas, ajuda em análises laboratoriais até nos momentos da elaboração da dissertação. A minha filha Maria Augusta pelo carinho. Aos meus Pais Ademar e Regina, em especial à minha mãe a qual cuida da minha filha enquanto me dedico à formação profissional.

Também, a todos que de alguma forma contribuíram para que esse trabalho se tornasse uma realidade

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SUMÁRIO RESUMO... 7 ABSTRACT... 8 1 INTRODUÇÃO... 9 2 REVISÃO DE LITERATURA... 11 2.1 O FEIJOEIRO-COMUM... 11

2.2 A TAXONOMIA DOS RIZÓBIOS... 12

2.3 EFICIÊNCIA SIMBIÓTICA DE RIZÓBIOS... 13

2.4 TOLERÂNCIA DE RIZÓBIO À SALINIDADE E TEMPERATURA... 15

2.5 AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DOS RIZÓBIOS... 17

3 MATERIAIS E MÉTODOS... 20

3.1 ISOLADOS AVALIADOS E BACTÉRIAS AVALIADAS... 20

3.2 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA À SALINIDADE E TEMPERATURA... 20

3.2.1 Análise dos dados de tolerência à salinidade e temperatura... 21

3.3 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR... 22

3.3.1 Extração do DNA... 22

3.3.2 Caracterização molecular por análise da região BOX-PCR... 23

3.3.3 Caracterização molecular por análise da região REP-PCR... 23

3.3.4 Análise dos dados de marcadores moleculares... 24

3.4 AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA SIMBIÓTICA EM CASA DE VEGETAÇÃO 25 3.4.1 Análises estatísticas... 26

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 27

4.1 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA A SALINIDADE E TEMPERATURA... 27

4.2 AVALIAÇÕES MOLECULARES: BOX-PCR E REP-PCR... 36

4.3 AVALIAÇÃO DOS ISOLADOS EM CASA DE VEGETAÇÃO... 44

5 CONCLUSÃO... 50

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Estirpes padrão utilizadas como referência nos ensaios de caracterização de novos isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum... 20

Tabela 2 Avaliação de diferentes isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum a diferentes temperaturas e concentrações de NaCl... 28

Tabela 3 Número de nódulos, Massa seca de nódulos, Massa específica de nódulos, Massa seca da parte aérea, Massa seca de raíz, Relação raiz/parte aérea, N-Total e área foliar de plantas de feijoeiro-comum inoculadas com diferentes isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum... 45

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Avaliação da tolerância à salinidade e temperatura de isolados bacterianos obtidos de nódulos de feijoeiro-comum... 21

Figura 2 Visão geral do ensaio em casa-de-vegetação para avaliação da eficiência simbiótica dos isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum...

25

Figura 3 Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos resultados de salinidade e temperatura de 107 bactérias isoladas de nódulos de feijoeiro-comum... 35

Figura 4 Perfil eletroforético obtido por BOX-PCR para isolados de nódulos de feijoeiro-comum... 37

Figura 5 Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos fragmentos amplificados por BOX-PCR de bactérias isoladas de nódulos de feijoeiro-comum... 38

Figura 6 Perfil eletroforético de REP-PCR de isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum... 39

Figura 7 Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos fragmentos amplificados por REP-PCR de bactérias isoladas de feijoeiro-comum... 41

Figura 8 Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos fragmentos amplificados por REP-PCR e BOX-PCR de bactérias isoladas de feijoeiro-comum... 43

Figura 9 Análise de correlação correlação de Pearson entre a MSPA e MSN de feijoeiro-comum inoculado com novos isolados e com as estirpes padrão... 47

Figura 10 Análise de correlação correlação de Pearson entre a MSPA e MSN de feijoeiro-comum inoculado com novos isolados e com as estirpes padrão... 48

Figura 11 Análise de correlação correlação de Pearson entre a AF e MSN de feijoeiro-comum inoculado com novos isolados e com as estirpes padrão... 49

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RESUMO

CARDOSO, A. A. Caracterização polifásica de isolados bacterianos obtidos de

nódulos de feijoeiro-comum. 2014. 64 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia: Solo e

Água) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, 2014.1

A pesquisa sobre a fixação biológica de nitrogênio (FBN) no feijoeiro teve bastante progresso nos últimos anos, especialmente no conhecimento do microsimbionte e no estudo de novas abordagens buscando maior variabilidade no macrosimbionte para maior eficiência da FBN. Os estudos da diversidade e taxonomia bacteriana, especialmente aplicados aos simbiontes do feijoeiro-comum apresentou uma grande evolução devido às novas metodologias moleculares de avaliação e caracterização. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência à salinidade e temperatura, caracterizar molecularmente e avaliar a eficiência simbiótica de isolados de nódulos de feijoeiro-comum oriundos dos estados de GO, MG e PR. Os isolados foram avaliadas quanto à salinidade e temperatura em meio YMA com diferentes concentrações de NaCl (0%; 1%; 2%; 4% e 6%) em diferentes temperaturas (28ºC; 33ºC; 38ºC; 43ºC e 48ºC). Para a caracterização molecular os isolados foram crescidos em meio YMA líquido por 24 horas e logo em seguida foi realizada a extração do DNA. Foram avaliados perfis BOX-PCR e REP-PCR. A avaliação da eficiência simbiótica dos isolados foi conduzida em casa-de-vegetação com vasos tipo Leonard com a cultivar Pérola inoculada com diferentes isolados selecionados na análise anterior. Foi avaliado o número de nódulos (NN), massa seca de nódulos (MSN), massa específica de nódulos (MEN), massa seca de raiz (MSR), matéria seca da parte aérea (MSPA), relação raiz/parte aérea (R/PA), nitrogênio total (N) e área foliar (AF). Observou-se que 41,12% dos isolados cresceram em condições mais restritivas que as estirpes padrão SEMIA 4077, SEMIA 4080 e SEMIA 4088, e 29,90% dos isolados cresceram em condições menos restritivas que as SEMIAs. Os perfis BOX-PCR e REP-PCR apresentaram grande diversidade genética entre os isolados avaliados, demonstrando um alto grau de polimorfismo. Os isolados JPrG8A7 e JPrG8A6 apresentaram desempenho superior as estirpes padrão quando comparados o NN, MEN e MSN. Esta última apresentou correlação positiva com a MSPA, N-Total e AF. Foi observado que alguns isolados apresentaram características competitivas iguais ou superiores as estirpes-padrões comerciais, apresentando resultados que podem melhorar o processo de simbiose entre a planta e a bactéria, gerando assim uma maior produtividade para a cultura do feijoeiro-comum.

Palavras-chave: Rhizobium, nodulação, BOX-PCR, REP-PCR, diversidade.

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Orientador: Dr. Enderson Petrônio de Brito Ferreira. Embrapa Arroz e Feijão. Co-orientadora: Drª. Tereza Cristina de Oliveira Borba. Embrapa Arroz e Feijão. Co-orientadora: Prfª Drª. Eliana Paula Fernandes Brasil. EA-UFG.

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ABSTRACT

CARDOSO, A. A. Polyphasic characterization of bacterial isolates obtained from

common bean nodules. 2014. 64 f. Dissertation (Master in Agronomy: Soil and water) –

Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, 2014.2

Research on biological nitrogen fixation (BNF) in common bean had a great progress in recent years, especially in the knowledge of microsimbiont and exploring new approaches seeking greater variability in macrosimbiont for efficiency of BNF. Studies of bacterial diversity and taxonomy, especially applied to common bean symbionts showed a great evolution due to new molecular methodologies for evaluation and characterization. This study aimed to evaluate the tolerance to salinity and temperature, to characterize based on molecular markers and to evaluate the symbiotic efficiency of bacterial isolates obtained from nodules of common bean cultivated on soil samples from the States of Goiás, Minas Gerais and Paraná. The isolates were evaluated for salinity and temperature on YMA medium with different NaCl concentrations (0%, 1%, 2%, 4% and 6%) at different temperatures (28ºC, 33ºC, 38ºC, 43ºC and 48ºC). For molecular characterization based on BOX-PCR and REP-PCR profiles the isolates were grown in liquid YMA for 24 hours and then DNA extraction was performed. Evaluation of symbiotic efficiency of the isolates was conducted under greenhouse conditions in Leonard jars. Seeds of common bean (var. Pérola) were inoculated with different isolates selected in the previous analysis. Nodule number (NN), dry mass of nodules (DMN), specific mass of nodules (SMN), root dry weight (RDW), dry matter of aerial part (DMAP), relation root/shoot (R/S), total nitrogen (N) and leaf area (LA) were evaluated. It was observed that 41.12% of the isolates grew in more restrictive conditions than standard strains SEMIA 4077, SEMIA 4080 and SEMIA 4088, and 29.90% of the isolates grew in less restrictive conditions than SEMIAs strains.BOX-PCR and REP-PCR profiles showed high genetic diversity among the evaluated isolates, demonstrating a high degree of polymorphism. JPrG8A7 and JPrG8A6 isolates exhibited superior performance compared to standard strains when compared the NN , SMN and DMN. The latter showed a positive correlation with the DMAP, Total-N and LA. It was observed that some isolates showed competitive features equal or superior than commercial standards strains, with results that can improve the process of symbiosis between plant and bacteria, thereby generating greater productivity for the common bean cultivation.

Key words: Rhizobium, nodulation, BOX-PCR, REP-PCR, diversity.

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Adviser: Dr. Enderson Petrônio de Brito Ferreira. Embrapa Arroz e Feijão. Co-adviser: Drª. Tereza Cristina de Oliveira Borba. Embrapa Arroz e Feijão. Co-adviser: Profª Drª Eliana Paula Fernandes Brasil. EA-UFG.

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1 INTRODUÇÃO

Oriunda da região Centro-americana a espécie Phaseolus vulgaris L. (feijoeiro-comum) é de grande importância econômica e social para diversas nações das regiões tropicais e subtropicais. Nestas regiões os grãos de feijão compõem a dieta básica de um segmento populacional expressivo, constituindo-se frequentemente na principal fonte básica de proteína e de carboidrato. No cenário agrícola internacional o Brasil destaca-se como o segundo maior produtor de feijoeiro-comum, sendo a Índia o primeiro (FAO, 2012). No contexto brasileiro, a cultura do feijoeiro-comum encontra-se inserida principalmente no sistema produtivo da agricultura familiar (65%), possuindo, portanto, importante apelo social e econômico.

A cultura do feijoeiro-comum possui grande importância econômica, para o Brasil, uma vez que a área cultivada, na safra 2012/2013, foi de cerca de 3,11 milhões hectares, o que correspondeu a uma produção de 2,83 milhões toneladas, com rendimento médio de 910 kg ha-1 (Conab, 2013). Juntos, os Estados do Paraná, Minas Gerais, São Paulo e Goiás respondem por quase 60% dessa produção, em 34% da área cultivada. A produtividade média desses Estados (1600 kg ha-1) supera em 71% a média nacional que é de 910 kg ha-1. Na década de 1980, a produtividade do feijão era pouco mais de 500 kg ha-1 (Ferreira et al., 2006). Portanto, verifica-se que houve grande aumento na produtividade da cultura. Grande parte desse aumento pode ser atribuída às novas cultivares obtidas.

A FBN é um processo essencial para transformar o N2, uma molécula estável e abundante na atmosfera, que não pode ser utilizada pela maioria dos microrganismos e pelas plantas, na forma inorgânica combinada NH3 e, a partir daí, em formas reativas orgânicas e inorgânicas vitais em sistemas biológicos. A reação de redução do N2 a NH3 é realizada por microrganismos que contêm a enzima nitrogenase e são conhecidos como fixadores de N2 ou diazotróficos (Novais et al., 2007).

A pesquisa sobre a fixação biológica de nitrogênio (FBN) no feijoeiro-comum vem progredindo nos últimos anos, especialmente no conhecimento do microsimbionte e no estudo de novas abordagens buscando maior variabilidade no macrosimbionte para maior eficiência da FBN (Nodari et al.,1993; Andriolo et al., 1994; Franco, 1998). Os

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estudos da diversidade e taxonomia bacteriana, especialmente aplicados aos simbiontes do feijoeiro-comum apresentou uma grande evolução nos últimos anos devido às novas metodologias moleculares de avaliação e caracterização.

O caso de maior sucesso da FBN no Brasil é a simbiose de Bradyrhizobium

japonicum com a soja. A principal leguminosa cultivada comercialmente no Brasil

dispensa totalmente a adubação nitrogenada, uma vez que, em condições normais de cultivo, a FBN é capaz de suprir as necessidades de N da cultura (Hungria et al., 2000). Por outro lado, a FBN com outras leguminosas importantes, tais como o feijoeiro-comum e o amendoim, não consegue, com a tecnologia atualmente disponível, suprir totalmente a demanda por N dessas culturas, mas permite reduzir as doses de N aplicadas como fertilizantes químicos (Novais et al., 2007).

O estudo da biodiversidade do rizóbio tem aplicações agrícolas importantes, tanto em termos de manejo cultural, visando implementar a sobrevivência de populações mais eficientes e mesmo mais específicas, quanto da obtenção de germoplasma mais adaptado aos diferentes tipos de solos. Os dados levantados nos estudos de genética de populações dos diferentes gêneros de rizóbio indicam que há um alto grau de diversidade genética dentro desse grupo (Demezas et al., 1991, 1995; Eardly et al., 1990, 1995; Souza et al., 1992; Bottomley et al., 1994; Leung et al.,1994; Paffetti et al., 1996).

No entanto, a maioria dos estudos de biodiversidade tem sido conduzida em solos de clima temperado, sob condições completamente diferentes dos nossos solos tropicais. Na avaliação da biodiversidade do rizóbio, as modernas técnicas de DNA recombinante são uma ferramenta preciosa nas mãos dos pesquisadores das regiões tropicais, especialmente as técnicas baseadas em PCR, relativamente baratas e de fácil manuseio (Felice & Alshinawi, 1996).

Com base no exposto e no fato de que a eficiência da FBN depende de uma interação muito específica entre os simbiontes, é de fundamental importância estudar as diferentes estirpes de rizóbio. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos caracterizar isolados bacterianos de feijoeiro-comum quanto à tolerância a salinidade e temperatura e com base nos marcadores moleculares BOX-PCR e REP-PCR e a determinar a eficiência simbiótica desses isolados.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 O FEIJOEIRO-COMUM

O feijoeiro-comum é cultivado em diversos países em todo o mundo. Tem grande importância econômica principalmente em países em desenvolvimento, pois o seu cultivo é fonte de renda para muitas famílias, principalmente famílias de pequenos agricultores que dependem da produção da cultura. Seus grãos constituem uma das principais e mais acessíveis fontes de minerais, aminoácidos, calorias e fibras para os brasileiros, estando presente, diariamente, na dieta da população. A cultura do feijoeiro tem recebido destaque por organizações de combate à desnutrição por micronutrientes essenciais, tais como o programa Harvestplus, devido aos altos teores de Fe e Zn, apesar da alta variabilidade genética e ambiental presente nesses teores (Aidar, 2003).

A cultura do feijoeiro-comum possui grande importância econômica, para o Brasil, uma vez que a área cultivada, na safra 2012/2013, foi de cerca de 3,11 milhões hectares, o que correspondeu a uma produção de 2,83 milhões toneladas, com rendimento médio de 910 kg ha-1. Juntos, os Estados do Paraná, Minas Gerais, São Paulo e Goiás respondem por quase 60% dessa produção, em 34% da área cultivada. A produtividade média desses Estados (1600 kg ha-1) supera em 71% a média nacional que é de 910 kg ha-1 (Conab, 2013).

A inoculação do feijoeiro-comum em condição de campo no Brasil foi durante muito tempo feita com inoculante produzido utilizando-se estirpes de R. leguminosarum bv. phaseoli e R. etli, sendo que muitas das estirpes foram isoladas no exterior e testadas pelas instituições de pesquisa no Brasil. Com a evolução dos estudos taxonômicos, revelando os diferentes agrupamentos de isolados com características simbióticas e adaptação ecológica distinta, inclusive envolvendo isolados obtidos nas regiões de clima tropical, revelou-se a inequação das estirpes tradicionalmente recomendadas para as condições brasileiras de cultivo. Atualmente sabe-se que as estirpes de R. leguminosarum bv. phaseoli e R. etli estão sujeitas a um elevado grau de instabilidade genética (Soberón-Chaves et al., 1986; Flores et al., 1988), o que pode explicar, pelo menos parcialmente, a grande variabilidade na eficiência simbiótica verificada nestes experimentos.

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2.2 A TAXONOMIA DOS RIZÓBIOS

O agrupamento dos rizóbios foi, inicialmente, baseado em características fenotípicas, principalmente na habilidade de nodular algumas leguminosas, dando origem ao conceito de “grupos de inoculação cruzada”. A taxonomia do rizóbio baseada na especificidade hospedeira foi sendo substituída pela taxonomia numérica, que se apóia nas características bioquímicas, fisiológicas, sorológicas e moleculares (Hungria et al., 1997).

Primeiramente, a família Rhizobiaceae era representada apenas pelo gênero

Rhizobium, o qual era constituído por bactérias capazes de nodular e fixar nitrogênio em

relações simbióticas com plantas da família Leguminosae. A classificação das espécies tinha como base principalmente a leguminosa hospedeira com as quais fossem capazes de formar nódulos e fixar nitrogênio. Desse modo, Rhizobium phaseoli nodula feijoeiro-comum; R. japonicum, a soja; R. meliloti, a alfafa; R. lupini,o tremoço. e R. trifolii, o trevo (Coutinho, 2003).

Devido a sua ampla distribuição geográfica e a sua longa história evolutiva, existe uma enorme diversidade genética entre as bactérias da família Rhizobiaceae (Piñero et al., 1988). Uma amostra da diversidade e heterogeneidade deste agrupamento pode ser constatada quando uma mesma leguminosa atrai geneticamente vários simbiontes, ou quando um mesmo rizóbio é capaz de nodular diferentes leguminosas. Graças a essa diversidade a classificação destes organismos tem sido bastante dinâmica ao longo dos anos. Substituindo o conceito de inoculação cruzada, os rizóbios foram agrupados em dois grandes grupos: Rizóbios de crescimento rápido e lento, dando origem a dois grandes gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium, respectivamente (Jordan, 1984). Mais tarde quatro novos gêneros foram incluídos: Sinorhizobium (Lajudie et al, 1994; Chen et al., 1998),

Azorhizobium (Dreyfus et al., 1988), Mesorhizobium (Jarvis et al., 1982; Jordan, 1984;

Nour et al., 1994, Lindström et al.,1995) e Allorhizobium (Lajudie et al, 1998). Segundo Young & Haukka (1996), com a utilização de técnicas moleculares, os gêneros passaram a ser separados baseados em seqüências do gene 16S rDNA.

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Uma das características do feijoeiro-comum é a possibilidade de estabelecer relação simbiótica com um grupo de bactérias capazes de captar o nitrogênio atmosférico (N2). O N é um elemento essencial para a constituição da massa total dos sistemas vivos, sendo componente indispensável à biossíntese de moléculas fundamentais, tais como: ácidos nucléicos e aminoácidos, representando de 8 a 16% do total de massa orgânica. Como 78% da atmosfera terrestre é constituída por N2 ou dinitrogênio, esta é a fonte mais abundante deste elemento (Nelson & Cox, 2002). Entretanto, as formas solúveis e biologicamente assimiláveis desta molécula são escassas. Nenhum animal ou planta é capaz de utilizá-lo diretamente da atmosfera, devido à tripla ligação covalente que existe entre os átomos de nitrogênio (Manyani et al., 2001), por isso há uma dependência de microrganismos que realizem esta atividade.

Na natureza, somente um pequeno número de microrganismos, denominados diazotróficos ou fixadores de nitrogênio, é capaz de reduzir nitrogênio atmosférico à amônia. Esse processo, chamado de fixação biológica do nitrogênio (FBN), é realizado pela enzima nitrogenase, um complexo protéico que catalisa a reação (Eady & Postgate, 1974).

A participação da FBN no ciclo biogeoquímico do nitrogênio é, sobretudo importante na medida em que a atividade das bactérias diazotróficas representa cerca de 60% do nitrogênio anualmente fixado na Terra (Kim & Rees, 1994). Além disso, a FBN é o processo primário através do qual o nitrogênio, quimicamente indisponível para a maioria dos organismos, se torna fisiológica e metabolicamente disponível, inicialmente sob a forma de amônia e, posteriormente, na ciclagem do nitrogênio, podendo formar outros compostos nitrogenados, como: nitritos, nitratos e óxido nítrico. Em todas as leguminosas a fixação de N2 não é iniciada até que a planta possa sustentar esta atividade, ou seja, ceder energia para que a bactéria possa entrar em atividade e fornecer o nitrogênio necessário, ou até que se esgote o nitrogênio presente na semente, e a planta, portanto, venha a sentir a falta deste elemento (Mercante et al., 1992).

Quando o solo contém suficiente quantidade de N para suprir a demanda da planta, a quantidade de N2 fixada será pequena, evidenciando que a nitrogenase é um processo flexível que ajusta a demanda da planta por N (Mengel, 1994). Dentre as associações entre bactérias fixadoras e plantas, a que ocorre entre bactérias comumente chamadas de rizóbio e leguminosas é a mais conhecida.

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Uma associação rizóbio x leguminosa eficiente, na qual a necessidade da planta por nitrogênio seja suprida, é o alvo de muitas pesquisas que são desenvolvidas no mundo, principalmente nos trópicos, uma vez que o nitrogênio é um dos elementos do solo mais limitantes da produção nestas áreas (Franco & Balieiro, 1999). Existem aproximadamente 18000 espécies de plantas leguminosas, entretanto sabe-se que somente em 8% ocorre a formação de nódulos (Sprent, 1995).

A formação dos nódulos é um processo complexo que ocorre em várias etapas e envolve mudanças fisiológicas e morfológicas, tanto na célula hospedeira, como na bactéria. As mudanças na bactéria visam, principalmente, o recebimento de fontes de carbono da planta hospedeira, para prover o ATP e poder redutor, necessários para o processo de FBN, enquanto que as mudanças na planta hospedeira visam assimilar a amônia produzida pelas bactérias (Hungria & Campo, 2005).

Espécies de leguminosas tropicais, normalmente são capazes de nodular com uma ampla faixa de rizóbios, contribuindo, desta forma, para a FBN nessas regiões. Por outro lado, a introdução de inoculantes contendo rizóbios eficientes, é dificultada, pois as estirpes nativas, em geral, são muito competitivas (Santos et al., 2007). Frente a esta situação, torna-se interessante estudar estratégias para avaliar a composição e a contribuição de estirpes de rizóbios nativos do solo onde se pretende introduzir o inoculante visando realizar uma eficiente FBN (Zilli et al., 2006).

O reconhecimento das características estruturais do genoma rizobiano foi facilitado pela observação de que ferramentas disponíveis aos estudos com Escherichia

coli poderiam ser aplicadas ao rizóbio. Isso levou à identificação dos genes nif, bem como

a sua localização aproximada no cromossomo (Hungria et al., 1997). Hoje, estão descritos diversos genes, que são classificados em três categorias: genes de nodulação (nod, nol e

noe), responsáveis pelos passos iniciais da nodulação; genes nif (nitrogen fixation), ligados

à síntese e regulação da nitrogenase, todos homólogos a genes encontrados em Klebsiella pneumoniae e os genes fix, com a mesma função dos nif, mas sem homologia com os genes de K. pneumoniae (Hungria et al., 1994). Existem, ainda, outras categorias de genes, envolvidos com a superfície das bactérias e que afetam a nodulação, exo (exopolysaccharides), lps (lipopolysaccharides) e ndv (1,2−β−glucans, nodule

development), além dos genes hem (heme), relacionados com síntese de hemoglobina, dct (dicarboxylic transport), gln (glutamine synthetase) e hup (hydrogenase uptake) (Hungria et al., 1997).

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2.4 TOLERÂNCIA DE RIZÓBIO À SALINIDADE E TEMPERATURA.

A salinização do solo constitui uma das mais sérias formas de degradação dos recursos edáficos e, em áreas secas, caracteriza-se como um fenômeno complexo causado pela interação entre fatores biofísicos e sócio-econômicos. No Brasil, esses efeitos são mais intensos no meio rural da região semi-árida do Nordeste, em virtude das características de clima, relevo, geologia, entre outros fatores, serem condições favoráveis à ocorrência de solos afetados por excesso de sais (Mota & Oliveira, 1999).

O excesso de sais solúveis provoca uma redução do potencial hídrico do solo, resultando em menor capacidade de absorção de água pelas plantas. Essa redução, associada com os efeitos tóxicos dos sais, interfere inicialmente no processo de absorção de água pelas sementes, influindo também no desenvolvimento normal das plantas (Rebouças et al., 1989) e sobre alguns processos biológicos, como a FBN, pois prejudica a eficiência da simbiose (Shereen et al., 1998).

Assim como as plantas, as bactérias diazotróficas simbióticas apresentam grande variação na tolerância à salinidade. Essa tolerância ao estresse salino pode ser atribuída a variações de pH, temperatura, fonte de carbono solúvel e à presença de solutos osmoprotetores (Graham, 1992). Para bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium, os efeitos prejudiciais dos sais são mais evidentes, particularmente em relação aos efeitos da concentração do íon específico do que ao efeito osmótico (Elsheikh, 1998), variando de acordo com a forma iônica presente e a tolerância da estirpe. Nesse contexto, o NaCl tem sido considerado bom indicador da tolerância de bactérias a sais (Abdelmoumen et al., 1999).

O desenvolvimento de tecnologias e conhecimentos que favoreçam a atividade agrícola em solos salinos ou afetados pela salinização decorrente de ações antrópicas é um dos desafios à segurança alimentar de grandes contingentes populacionais em escala planetária, em especial nas zonas áridas e semi-áridas. Nas áreas irrigadas do semi-árido brasileiro, equivalente a 300 mil há, o problema está presente em 25% da área (Goes, 1977). Considfderando toda a região semi-árida, a salinidade alcança cerca de 20% dos 95 milhões de hectares (Melo et al., 2006). Caracterizado por baixa precipitação pluviométrica, estiagens prolongadas, altas temperaturas e, muitas vezes, baixa fertilidade do solo, o Semi-árido do Brasil concentra a população com menor Índice de Desenvolvimento Humano (IDH) do país.

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Alguns trabalhos realizados principalmente com leguminosas de clima temperado relatam o efeito prejudicial da salinidade na nodulação. A maioria desses trabalhos considera que o efeito é mais acentuado no sistema radicular, prejudicando o desenvolvimento do rizóbio (Tu, 1981). Alguns pesquisadores observaram variações na tolerância de diferentes estirpes quanto a concentrações crescentes de NaCl (Rai, 1983; Rai et al., 1985), enquanto outros consideram que a tendência e magnitude das reduções por efeito da salinidade dependem também das variedades apresentadas pelas plantas (Ahmad et al., 1981).

Acredita-se que, quando os estresses são de curta duração, predominem os efeitos osmóticos dos sais, fazendo com que o potencial hídrico do ambiente radicular diminua e restrinja a absorção de água; em estresses de longa duração, todavia, os íons se acumulam e provocam toxidez, induzindo distúrbios nutricionais e metabólicos (Munns, 2002). Nesse contexto, o NaCl tem sido considerado bom indicador da tolerância de bactérias à sais (Abdelmoumen et al., 1999).

Por outro lado, temperaturas elevadas são outro fator também limitante para o rizóbio, onde o tamanho do nódulo parece ser o parâmetro mais sensível a altas temperaturas do que o número de nódulos em estudos com a cultura da soja realizados por Castro et al. (1993). Esta sensibilidade a temperaturas elevadas pode ser exemplificada pelas simbioses do feijoeiro-comum, a qual também apresenta sensibilidade.

No caso do feijoeiro-comum, tanto a planta como o rizóbio são afetados quando em temperaturas superiores à 34 oC (Moreira & Siqueira, 2002), sendo que no caso do rizóbio, os plasmídeos que carregam os genes simbióticos podem ser perdidos. Estirpes isoladas de leguminosas florestais tolerantes a altas temperaturas e eficientes na nodulação do feijoeiro-comum têm sido apontadas como uma valiosa fonte de recursos genéticos para aumentar o potencial da FBN nesta cultura nos trópicos como as encontradas por Hungria et al. (1993). Em feijão-caupi, Dart & Mercer (1965) encontraram que nódulos foram reduzidos em número, tamanho e conteúdo de leghemoglobina quando submetidas a altas temperaturas embora outros fatores, além da temperatura, estivessem também envolvidos.

A literatura é bem diversificada quanto a informações sobre as diferentes capacidades de bactérias diazotróficas, tanto associativas quanto simbióticas, em tolerar salinidade (Shereen et al., 1998; Rasa et al., 2001; Tamimi, 2001; Nóbrega et al., 2004), e as faixas de tolerância das espécies diazotróficas simbióticas observadas variaram de 0 a 60 g L-1 de NaCl. Segundo Xavier et al. (2007), as concentrações máximas toleradas de

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NaCl pelas estirpes, em meio de cultura YMA (Yeast Mannitol Agar), variaram de 2 até 30 g L-1. Não houve nenhuma estirpe que cresceu na concentração de 50 g L-1 de NaCl. Os padrões de crescimento de todas as estirpes foram reduzidos com o aumento da concentração de NaCl no meio de cultura. Estudos com essa finalidade objetivam não só identificar estirpes potenciais para usos diversos, mas também auxiliar na caracterização das espécies bacterianas (Frioni et al., 2001; Nóbrega, et al., 2004).

Em geral, espécies de rizóbio de crescimento rápido são mais tolerantes a altas concentrações salinas em meio de cultura, quando comparadas a espécies de crescimento lento, pois produzem mais polissacarídeos extracelulares, que envolvem as células bacterianas, diminuindo o contato da superfície celular com o meio salino, proporcionando maior resistência da célula bacteriana ao efeito osmótico (Elsheikh, 1998).

2.5 AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DOS RIZÓBIOS

Além da contribuição de todo o conhecimento da biodiversidade do solo e da utilização de coleções de rizóbios, ensaios sobre sua diversidade genética desempenham importante papel no desenvolvimento a longo prazo de estratégias que aumentem a contribuição da FBN na agricultura mundial.

Impressionantes progressos têm sido alcançados para o entendimento da diversidade genética dos rizóbios, com a aplicação de várias técnicas de análise do DNA. Alguns exemplos são amplificações de DNA de rizóbio pela PCR (Polymerase Chain Reaction) com primers específicos como REP (Repetitive Extragenic Palindromic), ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus), BOX (Box Element) (De Bruijin, 1992; Versalovic et al., 1994; Kaschuk et al., 2006), análise de genes ribosomais (rRNA 16S e 23S) e regiões intergênicas através de RFLP (“Restriction Fragment Length Polimorphism”) e seqüência de DNA (Laguerre et al., 1996; Vinuesa et al., 1998).

A análise genética por meio de PCR utilizando primers específicos na rizobiologia tem desempenhado importante papel nos estudos de diversidade genética. Sequências repetitivas intergênicas, de consenso, dispersas no genoma bacteriano, conhecidas como ERIC, REP e BOX, geram padrões altamente característicos quando separados em gel de agarose (De Bruijn, 1992; Versalovic et al., 1994). As seqüências REP consistem de regiões do DNA com repetições invertidas de 35-40 pb e são encontradas em clusters, onde cópias sucessivas são organizadas em orientação alternada.

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As seqüências ERIC têm o tamanho de 124-127 pares de bases. Tanto as seqüências ERIC quanto os elementos REP estão localizados em regiões não codificadoras, mas que provavelmente são transcritas e possuem potencial para formar estruturas secundárias. As seqüências BOX assemelham-se mais a ERIC quanto ao tamanho, parecendo estar envolvidas na duplicação do DNA. Sua ação seria com a DNA girase e terminação da transcrição (Mehta, 2000). Os padrões de amplificação são menos complexos que os obtidos com REP, mas permitem uma boa discriminação em nível de estirpe (Olive & Bean, 1999).

Os estudos de diversidade normalmente são realizados a partir de simples amostragens de bactérias do solo. Na maioria deles, os rizóbios são obtidos a partir de amostras de plantas inoculadas (Mercante et al., 1998; Straliotto et al., 1999; Ferreira et al., 2000) ou de nódulos de plantas cultivadas no campo (Mostasso et al., 2002). Menos comuns são os métodos de cultivo de plantas em vasos com solo pela presença de rizóbios nativos do solo (Palmer & Young, 2000) ou em tubos contendo solução isenta de nitrogênio (Frémont et al., 1999). Ainda podem ser isolados do solo sem a planta hospedeira, usando placa de Petri, contendo meio sólido semi-seletivo (Bromfield et al., 1994; Louvrier et al., 1996).

Atualmente os critérios de agrupamento e/ou classificação taxonômica têm-se baseado em análises filogenéticas moleculares. Seqüências de nucleotídeos altamente conservadas em bactérias têm sido o fundamento para a revisão das reais inter-relações entre espécies, gêneros ou mesmo famílias (Olson et al., 1994). O uso da seqüência de nucleotídeos do gene que codifica o 16S rRNA (subunidade menor do ribossomo) foi estabelecido como método padrão de análise em procariontes.

Para fins de determinação da diversidade genética e agrupamento por similaridade, a técnica de PCR parece demonstrar bons resultados. Fernandes et al. (2003) analisaram rizóbios isolados dos tabuleiros costeiros de Sergipe empregando três técnicas: PCR com o oligonucleotídeo específico BOX; PCR-RPFL da região do DNA que codifica para o gene 16S rRNA e da região intergênica entre 16S e 23S rRNA, com cinco enzimas de restrição; e seqüenciamento parcial da região 16S rRNA. Os resultados obtidos neste estudo revelaram diversidade genética elevada entre as estirpes nativas e confirmam que a análise por BOX-PCR é eficiente para discriminá-las, mas como já relatado por outros autores (Laguerre et al., 1997; Chueire et al., 2000) nem sempre foi adequada nas avaliações filogenéticas, onde houve coerência entre as análises envolvendo a região do

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16S rRNA, mas o agrupamento com uma das estirpes diferiu pela análise do espaço intergênico.

Nos estudos conduzidos para avaliar a qualidade dos inoculantes, Chueire et al (2000) estudaram a variabilidade das estirpes de Bradyrhizobium sp. e Rhizobium sp. (coleção SEMIA – Seção de Microbiologia Agrícola) recomendadas respectivamente para soja e feijoeiro. Desde 1992, variantes naturais destas estirpes foram incluídas na coleção SEMIA. Não foi possível, no entanto, diferenciar entre as estirpes parentais e as variantes, dentro de cada par de estirpes de Bradyrhizobium pela análise sorológica de aglutinação com anticorpos de células totais, ou com anticorpos de lipopolissacarídeos celulares. Contudo, no estudo foi possível distinguir as quatro estirpes pela reação de amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD). Os autores observaram que as estirpes SEMIA 5079, SEMIA 5080 e as duas outras recomendadas para o uso em inoculantes comerciais, SEMIA 587 e SEMIA 5019 (= 29w), mostraram perfis diferenciados pela técnica de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores REP e ERIC, no entanto, o REP e ERIC-PCR produziram perfis idênticos para os pares de estirpes SEMIA 566 X SEMIA 5079 e SEMIA 586 X SEMIA 5080. Tanto o RAPD como o REP e ERIC-PCR mostraram perfis distintos para as duas estirpes de Rhizobium, SEMIA 4077 (=CIAT 899) e SEMIA 4080 (=PRF 81), demostrando alta diversidade entre as estirpes.

Marcadores moleculares de diferentes classes, como aqueles baseados na PCR têm contribuído para a determinação da variabilidade de rizóbios, tanto entre estirpes de uma mesma espécie, quanto de estirpes de diferentes espécies. Com estes estudos podem gerar melhoria no processo da FBN e garantir assim uma maior produtividade do feijoeiro-comum.

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3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 ISOLADOS AVALIADOS E BACTÉRIAS UTILIZADAS

Os 107 isolados avaliados neste trabalho (Anexo A) foram obtidos a partir de amostras de solo oriundas dos estados de GO, MG e PR, cultivadas com 11 diferentes genótipos de feijoeiro-comum, utilizandos como plantas-isca. Os nódulos foram coletados e isolados em placas de Petri contendo meio Yeast Mannitol Agar (YMA) (Sampaio, 2012). As estirpes utilizadas como referência foram as SEMIA 4077, SEMIA 4080, SEMIA 4088 e a CFN42 (Tabela 1).

Tabela 1. Estirpes padrão utilizadas como referência nos ensaios de caracterização de

novos isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum

Espécie Estirpe Sinonímia Origem do solo

para isolamento Referência

R. etli bv. Phaseoli* CFN 42 ATCC 51251,

USDA 9032 México Segovia et al., 1993

R. tropici CIAT 899 SEMIA 4077 Colombia Martínez-Romero et al., 1991

R. tropici PRF 81 SEMIA 4080 Paraná, Brasil Hungria et al., 2000

R. tropici H12 SEMIA 4088 D. Federal, Brasil Mostasso et al., 2002

* Usada somente nas analises de BOX e REP.

3.2 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA A SALINIDADE E TEMPERATURA

Os 107 isolados e as três estirpes padrão de Rhizobium tropici (SEMIA 4077, SEMIA 4080 e SEMIA 4088), foram usados nas avaliações para a determinação da tolerância dos isolados a diferentes salinidades e diferentes temperaturas.

Os isolados foram transferidos para vidros de penicilina contendo 5 mL de meio YMA (Yeast Manitol Agar) líquido e colocados para crescer (28ºC;120 RPM) por 48 horas. Da suspensão de cada isolado foram transferidos, em triplicata, 200 µL para uma microplaca de 96 poços. Com o auxílio de um carimbo replicador os isolados foram inoculados em placas de Petri contendo meio YMA sólido com diferentes concentrações de NaCl (0%; 1%; 2%; 4% e 6%), as quais foram adicionadas no momento do preparo do meio YMA sólido. As placas de Petri inoculadas com os isolados em meio YMA sólido

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com diferentes concentrações de NaCl foram incubadas em incubadora B.O.D por 48 horas em diferentes temperaturas (28ºC; 33ºC; 38ºC; 43ºC e 48ºC). Após as 48 horas de incubação as placas de Petri foram retiradas da BOD para as avaliações do crescimento (Figura 1).

Figura 1. Avaliação da tolerância à salinidade e temperatura de isolados bacterianos

obtidos de nódulos de feijoeiro-comum

3.2.1 Análise dos dados de tolerância a salinidade e temperatura

Para a discriminação dos resultados foi utilizado o símbolo “+” para os isolados que apresentaram crescimento e o símbolo “-” para os que não cresceram. Com esses resultados foi gerada uma tabela agrupando as bactérias que apresentaram crescimentos similares, gerando diferentes grupos, através dos quais foram selecionados, para as análises de BOX-PCR e REP-PCR, 68 isolados que apresentaram desempenho melhor ou semelhante ao das SEMIAS, crescendo em condições mais restritivas ou próximas. A partir dessa tabela também foi gerada uma matriz binária atribuindo os valores 1 ou 0, indicando presença ou ausência de crescimento, respectivamente. A matriz binária foi submetida a uma análise de similaridade usando o coeficiente de Jaccard utilizando a fórmula J = a/(n-d), sendo “a” o número de combinações com a presença dos crescimentos, menos as combinações de ausência dos crescimentos, “d” é o número de combinações de ausência de crescimentos e “n” é o número de combinações possíveis. A partir dessa análise resultou uma matriz de similaridade entre todas as bactérias estudadas, a qual foi utilizada para o agrupamento das mesmas utilizando o método da média aritmética das

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distâncias entre os elementos dos dois grupos (UPGMA - Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean). Para estas análises foi utilizado o software NTSYSpc® (versão 2.02i ,1986-1998 Applied Biostatistcs) que gerou um dendrograma de similaridade entre as bactérias analisadas, permitindo avaliar a similaridade entre os isolados e selecionar 68 isolados para análise de BOX-PCR e REP-PCR.

3.3 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR

3.3.1- Extração do DNA

O DNA genômico dos 107 isolados e das três estirpes padrão foi extraído como descrito por Ausebel et al. (1999), com modificações. Os isolados foram cultivados em tubos de 10,0 mL contendo 8,0 mL de meio líquido YMA sem azul de bromotimol e mantidos sob agitação (120 rpm 48 h;. Foram utilizados três mL de cultura bacteriana para a extração de DNA, sendo centrifugados (13.000 rpm; 2 min) e então adicionados 600 μL de solução de lise (50 μM Tris pH 7,6; 20 mM de EDTA; 400 mM de NaCl; 1% SDS) e incubados (10 min; 80 °C). Após esta etapa as amostras foram transferidas para o banho de gelo por 5 minutos e adicionados 3 μL de solução RNAse (25 μg mL-1), seguido de incubação (37ºC; 15 min). Foram acrescentados 200 μL de NaCl 5M na mistura que foi homogeneizada por inversão sendo acondicionada em banho de gelo por 5 minutos. A mistura então foi centrifugada (13.000 rpm; 3 min) e o sobrenadante transferido para um novo tubo já contendo 600 μL de isopropanol (P.A.) à temperatura ambiente e levada ao banho de gelo por 10 minutos. A mistura foi centrifugada (13.000 rpm; 15 min) e o sobrenandante descartado. Em seguida foram utilizados 600 μL de etanol 70% para ressupensão, seguida de centrifuação (13.000 rpm; 2 min) e descarte do sobrenadante. O precipitado foi seco à temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas e ressuspendido em 30 μL de água ultrapura estéril e estocado a -20 °C. O DNA foi quantificado em equipamento digital para que todas as amostras fossem padronizadas com a concentração de DNA de 50 ng µL-1.

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3.3.2 Caracterização molecular por análise da região BOX-PCR.

Para a amplificação por PCR da região BOX foi utilizado o primer BOX A1R (5’-CTACGGCAAGGCGACG-3’), sintetizado pela Invitrogen® (Life Technologies) (Versalovic et al., 1994).

O sistema de reação de amplificação utilizado foi: 2,9 μL de água milli-Q estéril; 7,5 μL de 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (3mM Mg2+_{); 1,6 μL de primer} BOX A1R (50 pmolμL-1) e 3 μL de DNA (10 ng. μL-1), em um volume final de 15 μL.

A amplificação foi realizada usando os seguintes ciclos: 1 ciclo de desnaturação inicial (95 °C; 7 min); 35 ciclos contendo as etapas de desnaturação (94 °C; 1 min), anelamento (55 °C; 1 min) e extensão (65 °C; 8 min); 1 ciclo de extensão final (65 °C; 15 min) em termociclador Biocycler® (Applied Biosystens) de acordo com Kaschuk et al. (2006).

Às amostras amplificadas foram adicionados tampão de corrida Agarose (azul de bromofenol 0,25%, SDS 0,1%, Ficoll® 20% em T10E1) e Syber na proporção de 3:3:6 (Agarose: SYBR®: DNA). Conduziu-se a eletroforese em gel de agarose 1%, durante 7 horas a 50 V, em tampão TAE 0,75X (Sambrook et al., 1989) para a visualização dos fragmentos amplificados.

Os fragmentos foram visualizadas em transiluminador UV acoplado a um sistema de fotodocumentação MultiDoc-it® (UVP). O marcador de tamanho molecular utilizado foi 1kb DNA Ladder® (Norgen).

3.3.3 Caracterização molecular por análise da região REP-PCR.

Para a amplificação por PCR da região REP presente nas bactérias foi utilizado os primers REP-1 (5’- IIIICGICGICATCIGGC -3’) e REP-2 (5’-ICGICTATCIGGCCTAC -3’), sintetizados pela Invitrogen® (Life Technologies)(Versalovic et al., 1994).

O sistema de reação de amplificação utilizado foi: 2,0 μL água milli-Q estéril; 7,5 μL 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (3mM Mg2+

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pmol μL-1); 1,25 μL primer REP 2 (10 pmol μL-1); 3 μL DNA (10 ng μL-1),em um volume final de 15 μL.

A amplificação foi realizada usando os seguintes ciclos: 1 ciclo de desnaturação inicial (95 °C; 7 min); 35 ciclos contendo as etapas de desnaturação (94 °C; 1 min), anelamento (40 °C; 1 min) e extensão (65 °C; 8 min); 1 ciclo de extensão final (65 °C; 15 min) em termociclador Biocycler® de acordo com Kaschuk et al (2006).

Às amostras amplificadas foram adicionados tampão de corrida Agarose (azul de bromofenol 0,25%, SDS 0,1%, Ficoll® 20% em T10E1) e Syber na proporção de 3:3:6 (Agarose: SYBR®: DNA). Conduziu-se a eletroforese em gel de agarose 1%, durante 7 horas a 50 V, em tampão TAE 0,75X (Sambrook et al., 1989) para a visualização dos fragmentos amplificados.

Os fragmentos foram visualizadas em transiluminador UV acoplado a um sistema de fotodocumentação MultiDoc-it® (UVP). O marcador de tamanho molecular utilizado foi 1kb DNA Ladder® (Norgen).

3.3.4 Análise dos dados de marcadores moleculares

Foi construída uma matriz binária, com os dados obtidos da análise dos fragmentos amplificados para as regiões BOX e REP. Para cada posição de migração dos fragmentos foram atribuídos os valores 1 ou 0, indicando presença ou ausência, do fragmento, respectivamente. A matriz binária foi submetida a uma análise de similaridade usando o coeficiente de Jaccard utilizando a fórmula J = a/(n-d), sendo “a” o número de combinações com a presença dos crescimentos menos as combinações de ausência dos crescimentos, “d” é o número de combinações de ausência de crescimentos e “n”, o número de combinações possíveis. A matriz de similaridade foi utilizada para o desenho de um dendrograma utilizando o método da média aritmética das distâncias entre os elementos dos dois grupos (UPGMA - Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) através do software NTSYSpc® (versão 2.02i ,1986-1998 Applied Biostatistcs). Através da análise desse dendrograma foram selecionados 28 isolados para avaliação da eficiência simbiótica em casa-de-vegetação pela similaridade do grupo com as estirpes padrões e agrupamentos próximos.

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3.4 AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA SIMBIÓTICA EM CASA-DE-VEGETAÇÃO

O experimento foi realizado em casa-de-vegetação da Embrapa Arroz e Feijão no Município de Santo Antônio de Goiás. As sementes de feijoeiro-comum cv. Pérola foram levadas para ambiente controlado onde recebeu 35 tratamentos (Figura 2), sendo 32 tratamentos com inoculação 29 isolados (Tabela 3) e as três estirpes-padrão (SEMIA 4077, SEMIA 4080 e SEMIA 4088), um tratamento sem inoculação e dois tratamentos nitrogenados recebendo durante o período de condução do experimento doses de N equivalentes a 60 Kg ha-1 e 120 Kg ha-1.

Figura 2. Visão geral do ensaio em casa-de-vegetação para avaliação da eficiência

simbiótica dos isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum

Para o plantio foram utilizados vasos de 1000 mL tipo Leonard, preenchidos com areia e vermiculita autoclavadas na proporção 2:1 (v/v). Os vasos Leonard foram colocados sobre uma mesa cuja superfície foi desinfestada com álcool (70%) e mantidos dentro de casa-de-vegetação em blocos casualizados com três repetições. As sementes foram selecionadas, eliminando aquelas que apresentavam má formação e danos físicos, desinfestadas superficialmente com álcool utilizando-se um erlenmayer com a parte superior fechada com uma malha plástica trançada. Acrescentou-se um volume de álcool (70%) de modo que todas as sementes ficassem imersas. As sementes foram agitadas suavemente por 30 segundos e em seguida o álcool foi descartado. Acrescentou-se hipoclorito de sódio (2%), seguida de agitação por 3 minutos e descarte do hipoclorito de sódio. Em seguida as sementes foram lavadas sucessivamente por 10 vezes utilizando-se

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água destilada autoclavada. Após a desinfestação das sementes, com auxílio de um bastão de vidro, foram feitos dois orifícios nos vasos Leonard nos quais foram colocadas a sementes com o auxílio de uma pinça, cobrindo-se as sementes com areia autoclavada.

Aos cinco dias após a emergência (DAE) foi realizado o desbaste, deixando apenas uma plântula por vaso e aos oito DAE foi realizada a inoculação das plântulas com um mL de uma suspensão crescida em meio líquido (YMA), contendo cerca de 1 X 109 células por mL para cada um dos tratamentos com isolados e estirpes padrão. Após a inoculação foi adicionada uma camada de areia autoclavada na superfície dos vasos para evitar possíveis contaminações. Uma vez por semana foram adicionados 200 mL de uma solução nutritiva isenta de nitrogênio (Franco & Dobereiner, 1967).

A coleta foi realizada aos 35 DAE das plantas, onde estas foram cortadas na altura do nó cotiledonar e retiradas as raízes dos vasos. As raízes foram lavadas cuidadosamente em água corrente, secas em papel toalha e os nódulos destacados e contados para avaliar o número de nódulos (NN). A parte aérea foi separada em sacos identificados e as folhas levadas para aferir a área foliar (AF) em medidor de área foliar LI-COR modelo 3100 (LI-LI-COR, 1996). Em seguida a parte aérea, raiz e nódulos foram colocados para secar em estufa (65ºC; 72 h) e pesados para determinar a massa seca da parte aérea (MSPA), massa seca de raiz (MSR) e massa seca de nódulos (MSN).

Após pesagem da parte aérea esse material foi moído em moinho tipo Willey para a análise de Nitrogênio total (N-Total) da parte aérea pelo método de Kjedahl, a partir do extrato obtido de 100 mg de massa seca com solução digestora de ácido sulfúrico (H2SO4) e posterior destilação com hidróxido de sódio (NaOH), titulando com H2SO4 como descrito por Silva & Queiroz (2006).

3.4.1 Análises estatísticas

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e, quando observada significância do “F”, as médias foram comparadas pelo teste de Skott-Knott a 5% de probabilidade usando o software SISVAR (Ferreira, 2011). Foi realiza análise de correlação de Pearson entre o NN e MSPA, N-Total e AF, usando o software R (Wessa, 2014).

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA A SALINIDADE E TEMPERATURA

Em função dos resultados de tolerância à salinidade e temperatura, os isolados foram divididos em 28 grupos utilizando como critério para a separação o crescimento em condições mais restritivas para as menos restritivas (Tabela 2). Nessa avaliação observou-se isolados que apreobservou-sentaram crescimento até 38ºC em todas as concentrações de NaCl e até 48ºC a 4% de NaCl (JPrG11A7 e UnPaG6A2), formando o grupo um (G1). Dos isolados de rizóbio avaliados por Leite (2011) em meio YMA a diferentes temperaturas, 154 apresentaram crescimento positivo a 41 °C. Este número foi reduzido para 100 quando a temperatura era de 43 °C. Com acréscimo da temperatura para 45 °C ocorreu uma redução de 59% dos isolados tolerantes a este estresse. No presente trabalho, nas temperaturas de 43ºC e 48ºC, 57 isolados dos 107 avaliados apresentaram crescimento.

A partir dos resultados verificou-se para as temperaturas de 43ºC e 48ºC que nenhum dos isolados e estirpes padrão cresceu em concentração de NaCl de 6%, independente da temperatura. Por esse motivo, para essa concentração não foram apresentados resultados. Segundo Xavier et al. (2007), as concentrações máximas toleradas de NaCl pelas estirpes, em meio de cultura YMA, variaram de 2 até 30 g L-1. Não houve nenhuma estirpe que cresceu na concentração de 50 g L-1 de NaCl. Após a triagem de 189 isolados de rizóbio de feijão-caupi avaliados por Leite (2011), onde foi verificado crescimento em meio YMA e diferentes temperaturas, foi verificado que houve uma queda no percentual de bactérias tolerantes à medida que ocorreu aumento do estresse e que esta redução foi mais pronunciada para o estresse induzido pelo NaCl, mostrando ser este fator mais limitante ao crescimento dos isolados do que o estresse de temperatura.

Os testes de tolerância à salinidade, usando cloreto de sódio (NaCl) e temperatura são importantes fatores para caracterização e descrição de bactérias isoladas de nódulos de leguminosas, pois podem inibir seu crescimento e multiplicação (Peter et al., 2009; Elboutahiri et al., 2010).

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Tabela 2. Avaliação de diferentes isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum a diferentes temperaturas e concentrações de NaCl

Grupos Bactérias

Temperatura 28ºC Temperatura 33ºC Temperatura 38ºC Temperatura 43ºC Temperatura 48ºC Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 0 1 2 4 G1 JPrG11A7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G1 UnPaG6A2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G2 JPrG5A7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G3 JPrG1A1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 JPrG10A6 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 ALSG2A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 UbALG7A7 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 UnPaG8A1 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 UnPaG8A2 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 UbALG3A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 UnPaG8A7 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 UnPaG3A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 JPrG9A9 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 UnPaG8A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 UbALG3A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 UnPaG8A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 UnPaG7A3 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 JPrG6A8 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 PCGG5A8 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ G4 ALSG6A1 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ + +++ +++ +++ + G4 NVSG2A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ + +++ +++ +++ + G5 UnPaG2A9 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G5 NVSG1A1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - Continua... 28

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Tabela 2. Continuação

Temperatura 28ºC Temperatura 33ºC Temperatura 38ºC Temperatura 43ºC Temperatura 48ºC Grupos Bactérias Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl)

0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 0 1 2 4 G5 UnPaG7A6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G5 ALSG5A6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G6 UnPaG3A2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G6 NVSG2A6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G6 NVSG11A3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G6 NVSG3A3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 JPrG10A10 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 UnPaG3A6 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 ALSG5A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 NVSG3A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 NVSG5A3 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 UnPaG3A17 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 UnPaG4A6 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 NVSG4A1 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 NVSG2A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 UnPaG8A8 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 UbALG8A9 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 NVSG7A11 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G7 NVSG2A1 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G8 ALSG2A10 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G9 ALSG10A8 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G9 JPrG1A9 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G9 SEMIA 4080 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - Continua... 29

(31)

0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 0 1 2 4 G9 NVSG8A2 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - G10 UnPaG3A6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - G11 UnPaG11A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ - - +++ +++ - - G11 NVSG8A9 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ - - +++ +++ - - G11 UnPaG6A3 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ + - - +++ + - - G12 PCG4A2 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - - G12 NVSG7A7 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - - G12 PCG8A2 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - - G12 JPrG6A2 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - - G12 UnPaG8A12 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - - G12 UbALG6A3 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - - G12 JPrG7A2 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - - G12 JPrG3A7 +++ +++ - - - +++ +++ - - - + + - - - + + - - + + - - G13 UbALG4A6 +++ - - - - +++ - - - - +++ - - - - +++ - - - +++ - - - G14 NVSG4A6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - - - G14 UnPaG1A2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - - - G15 NVSG6A2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - G16 NVSG7A9 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - G16 UnPaG1A9 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - G16 UnPaG6A7 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - G16 UbALG8A1 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - G16 ALSG3A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - G16 NVSG4A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - Continua... 30

(32)

0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 0 1 2 4 G16 UnPaG3A19 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - G16 JPRG9A3 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - G16 UnPaG1A10 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - G17 NVSG2A2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - G18 NVSG7A11 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - G18 UnPaG6A12 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - G18 UnPaG6A7 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - G18 SEMIA 4077 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - G18 SEMIA 4088 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - G19 JPrG8A6 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - - - G19 ALSG2A9 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - - - G19 UnPaG1A12 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - - - G19 UnPaG4A13 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ + - - - - G20 JPrG7A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ - - - - G21 PCG1A6 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - G21 PCG2A2 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - G21 PCG4A6 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - G22 JPrG4A9 +++ +++ + + - +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G23 UnPaG4A9 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G24 PCG5A6 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ - - - - G25 UnPaG2A5 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ - - - - G25 JPrG4A4 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ - - - - G25 PCG2A5 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ - - - - Continua... 31

(33)

0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 0 1 2 4 G26 UnPaG11A9 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G27 JPrG9A9 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - G27 JPrG2A5 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - G27 PCG10A7 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - G28 PCG3A3 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 ALSG11A2 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 ALSG9A8 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 PCG7A8 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 JPrG5A1 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 ALSG5A1 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 PCGG7A1 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 UnPaG6A5 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 JPrG4A10 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 ALSG7A7 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 JPrG8A7 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 PCG1A3 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 JPrG3A7 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - G28 UnPaG1A1 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - 3 2