AVALIAÇÕES MOLECULARES: BOX-PCR E REP-PCR

Os 64 isolados e as 4 estirpes padrão (SEMIAs 4077, 4080, 4088 e CFN42) amplificaram para o BOX-PCR, sendo possível visualização em gel de agarose (Figura 4). No perfil de amplificação dos fragmentos foi possível observar no máximo 14 bandas e no mínimo uma, com diferentes tamanhos e perfis entre as amostras, demonstrando assim um alto grau de polimorfismo entre os isolados, o que também foi observado por Leite (2011) avaliando 50 isolados de rizóbio de feijão-caupi caracterizados com o primer BOX A1R.

Os isolados JPrG1A1, UnPaG3A2 e JPrG8A6 apresentam perfis de bandeamento semelhante ao da SEMIA 4077. O JPrG10A10 apresenta semelhança com a SEMIA 4088. Os isolados PCG7A1 e JPrG6A8 apresentam perfis de bandeamentos similares e o isolado PCG10A7 com UbALG3A4.

Figura 4. Perfil eletroforético obtido por BOX-PCR para isolados de nódulos de feijoeiro-

comum. Linhas: 1 e 26- Marcador ladder 1 kb, 2- UnPaG1A2, 3- JPrG1A1, 5- UnPaG3A2, 6- UnPaG4A9, 7- UnPaG8A8, 8- UbALG4A6, 9- JPrG10A10, 10- NVSG2A4, 11- JPrG8A6, 12-PCG10A7, 13- UbALG3A4, 14- NVSG3A3, 16- SEMIA 4077, 17- SEMIA4088, 18- PCG7A1, 19- JPrG6A8, 20- NVSG8A2, 21- NVSG2A2, 22- JPrG7A5, 23- UnPaG8A2, 24- UnPaG11A5, 25- UnPaG2A4

Diversos estudos de determinação das relações genéticas entre estirpes de rizóbio têm empregado a amplificação do DNA pela técnica de PCR com oligonucleotídeos específicos, como as sequências REP e BOX, que codificam regiões altamente conservadas, normalmente no espaço intergênico (Santos et al., 1999; Mostasso et al., 2002).

Pelo dendrograma de similaridade gerado a partir do padrão de bandeamento dos fragmentos amplificadas por BOX-PCR (Figura 5), pode-se inferir que a maioria dos isolados apresentou perfil único de DNA, o que resultou na separação dos grupos em valores de similaridade muito baixos, a partir de 3% de similaridade, sendo observada similaridade de 100% somente entre dois isolados (NVSG11A3 e UnPaG7A3). Pelo resultado desse dendrograma, observa-se número elevado de grupos, concordando com Chueire et al., (2000) quando afirma que o uso desse oligonucleotídeo específico permite a detecção de um polimorfismo suficientemente elevado para análise genética de bactérias.

Com aproximadamente 30% de similaridade são formados 14 grupos. Dentre os grupos que apresentaram maior número de isolados está o G4, formado pela SEMIA 4077 e SEMIA 4088 e mais oito isolados, que representam 14,7% do total de isolados avaliados. O G6 apresentou o maior número de isolados (23), representando 33,8% do total avaliado. O G8 foi formado pela SEMIA 4080 e mais quatro isolados, representando 5,88% do total. O G9 é composto por 2 isolados e a estirpe-padrão CFN 42.

38

Figura 5. Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o

coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos fragmentos amplificados por BOX-PCR de bactérias isoladas de nódulos de feijoeiro-comum

30% G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 G13 G14

No dendrograma gerado com os dados de BOX-PCR observa-se que 20,6% dos isolados apresentam perfil para o marcador molecular BOX semelhante às estirpes padrão de R. tropici. Três por cento dos isolados agruparam com a estirpe padrão CFN 42 de R.

etli. Além disso, o isolado PCG10A7 apresenta 100% de similaridade com a estirpe padrão

SEMIA 4088 e o isolado UnPaG4A9 apresenta 100% de similaridade com a estirpe padrão SEMIA 4077.

O BOX-PCR tem sido freqüentemente utilizado para genotipagem de bactérias a fim de revelar diferenças entre estirpes em estudos de diversidade (Lu et al., 2009; Koedoeboecz et al., 2009) e também empregado na identificação de estirpes utilizadas em inoculantes no Brasil, como ferramenta de controle de qualidade (MAPA, 2010). No caso de rizóbio, bactérias que nodulam leguminosas, esta ferramenta tem sido muito empregada para fins da caracterização da diversidade deste grupo de bactérias assim como na descrição de novas espécies (Han et al., 2008).

Na Figura 6 observa-se o perfil de bandeamento dos isolados gerado pelo marcador molecular REP-PCR, em que é verificado um alto grau de polimorfismo, representado pela predominância de perfis únicos de DNA. Dentre os perfis visualizados observamos no mínimo uma banda e no máximo 10 bandas para o marcador molecular REP-PCR. O perfil de bandeamento da SEMIA 4077 apresentou-se de forma semelhante ao da SEMIA 4088. A SEMIA 4080 apresentou um perfil semelhante ao isolado UnPaG8A12. O isolado UbALG3A apresentou-se semelhante ao isolado JPrG6A8.

Figura 6. Perfil eletroforético de REP-PCR de isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-

comum. Linhas: 1 e 26- Marcador ladder 1 kb, 2- ALSG7A7, 3- PCG7A1, 4- NVSG2A2, 5- PCG4A6, 6- UnPaG3A5, 8- SEMIA 4080, 11-NVSG7A11, 12- UnPaG2A5, 14- UbALG3A5, 15- JPrG6A8, 19- UnPaG8A1, 21-UnPaG8A12, 24- SEMIA 4077, 25- SEMIA 4088

40

Pela análise de agrupamento realizada por dendrograma de similaridade construído a partir dos perfis de bandeamento do marcador REP-PCR pode-se observar que a escala de similaridade varia de 5 a 100%, indicando uma grande diversidade entre os isolados avaliados (Figura 7). Com aproximadamente 30% de similaridade são formados 19 grupos. Grange (2001) constatou um grau elevado de polimorfismo entre as bactérias investigadas de rizóbio de feijão na região do cerrado, com a presença perfis distintos, formando uma grande quantidade de grupos com baixa similaridade.

O G1 é composto por três isolados. O G2 formado pela SEMIA 4077, SEMIA 4088 e CFN 42 além de oito isolados, representando 16,2% do total de isolados avaliados. O G4 apresentou um maior número de isolados com sete isolados e a estirpe padrão SEMIA 4080, representando 11,8% do total avaliado. O G5 formado por sete isolados, representando 10,3% do total. Os demais grupos foram formados por 42 isolados, representando 61,8%.

No dendrograma para REP-PCR apresentados pelos isolados e pelas estirpes padrão, observa-se que 28% dos isolados apresentam bandeamento para o marcador molecular REP semelhante às estirpes padrão de R. tropici. Além disso, o isolado PCG2A2, apresenta 100% de similaridade com a estirpe padrão SEMIA 4088, indicando que este isolado tem grande probabilidade de ser R. tropici. Grange (2001) observou resultado semelhante a este, em seu trabalho com rizóbios de feijão de regiões do Cerrado a presença de 2 isolados que apresentaram 100% de similaridade com a SEMIA 4088.

Figura 7. Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o

coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos fragmentos amplificados por REP-PCR de bactérias isoladas de feijoeiro-comum

Os resultados deste estudo demonstram que a análise de REP-PCR foi eficiente para discriminá-las, embora nem sempre sejam adequadas nas avaliações filogenéticas (Chueire et al., 2000; Fernandes et al., 2003).

G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 G13 G14 G15 G16 G17 G18 G19

42

A análise de similaridade realizada usando as matrizes de similaridade obtidas com os dados de BOX e REP-PCR revelou, também, uma alta diversidade entre os isolados avaliados, com a escala de similaridade variando de 8% a 100% (Figura 8). Com aproximadamente 30% de similaridade são formados 23 grupos. O G4 representado pela SEMIA 4077, e um isolado, representando 3% do total de isolados avaliados. O G5 apresentou cinco isolados e a estirpe padrão SEMIA 4080, representando 7,4% do total avaliado. O G6 formado por sete isolados e a SEMIA 4088 e CFN 42 representando 10,3% do total. Os demais grupos foram formados por 54 isolados, representando 79,4%.

No dendrograma para BOX e REP-PCR apresentados pelos isolados e pelas estirpes padrão, observa-se que 20,6% dos isolados apresentam bandeamento para o marcador molecular REP semelhante às estirpes padrão de R. tropici e 7,35% para R etli. Além disso, o isolado PCG2A2 apresenta 100% de similaridade com a estirpe padrão SEMIA 4088 e o isolado JPrG7A2 100% de similaridade com a estirpe padrão SEMIA 4077. Os resultados deste trabalho corroboraram os obtidos por Vandamme et al. (1996), que colocam que o conhecimento polifásico deve ser aplicado à taxonomia e diversidade bacteriana já que um consenso de resultados combinados resultará em análises bem mais consistentes. Bala et al. (2003), estudando 414 isolados rizobianos de três leguminosas arbóreas tropicais, identificaram 23 espécies e também observaram a importância de uma análise polifásica.

Esses resultados conclui que os marcadores BOX e REP-PCR são importante para avaliar a diversidade de populações bacterianas, mas pouco viável para diferenciar espécies, sendo necessário um sequenciamento para verificar essa diversidade genética. Pela análise de BOX e REP foram selecionados 28 isolados escolhidos pela proximidade com as estirpes padrões para a avaliação da eficiência simbiótica em casa-de-vegetação.

Figura 8. Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o

coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos fragmentos amplificados por REP-PCR e BOX-PCR de bactérias isoladas de feijoeiro-comum

G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 G13 G14 G15 G16 G17 G18 G19 G20 G21 G22 G23

44