EFEITOS RENOPROTETORES DA PENTOXIFILINA EM RELAÇÃO A CLORPROMAZINA E LOVASTATINA EM ISQUEMIA E REPERFUSÃO
RENAL DE RATOS WINSTAR (Rattusnovergicus). MOREIRA, Brunna Silva (Medicina Veterinária, Correspondência:
brunna_moreira@hotmail.com)
PEREIRA, Daniel Peixoto (daniel.peixoto.udi@gmail.com)
RESUMO
O rim possui diversas funções no organismo, dentre as quais, a manutenção da homeostasia, produção de hormônios, filtração sanguínea e eliminação de dejetos metabólicos. Devido às inúmeras consequências fisiológicas e metabólicas no qual indivíduo está exposto quando a função renal apresenta-se comprometida, a necessidade da utilização métodos terapêuticos com afinalidade de evitar danos irreversíveis torna-se imprescindível. A isquemia renal está presente em diferentes circunstâncias como em cirurgias renais, vasculares e no transplante renal. A síndrome de isquemia e reperfusãosão reconhecidas como asprincipais causas de danos e consequências deletérias para órgãos. O objetivo deste presente trabalho é de avaliar a integridade e a função renal de ratos Winstar, submetidos à isquemia e reperfusão com ou sem aplicação de pentoxifilina, clorpromazina e lovastatina. Com qual serão utilizados 36 animais, machos, adultos, distribuídos aleatoriamente em quatro grupos de nove indivíduos, todos submetidos à isquemia e reperfusão: grupo CT sem tratamento, grupo PTX tratados previamente com pentoxifilina, grupo CPZ tratados com clorpormazina, e grupo LVT com lovastatina.Avaliações da integridade e funçãorenalsão realizadas por exame físico, concentração sérica de uréia e creatinina, e análise histopatológica. O trabalho está em andamento, com as cirurgias do grupo CT concluídas.
INTRODUÇÃO
O rim possui diversas funções na manutenção da homeostase. Ambos os rins filtram o sangue e, eliminam os dejetos metabólicos enquanto, retém as substâncias filtradas essenciais ao organismo, como proteínas de baixo peso molecular, água e eletrólitos (Cunninghan, 2008). Outras incumbências são as secreções de hormônios e as hidrólises de pequenos peptídeos (Reece, 2008).
No rim, a lesão induzida por isquemia e reperfusão é o principal fator etiológico da insuficiência renal aguda (IRA), que se caracteriza, entre outros achados, por uma elevação transitória nas taxas séricas de creatinina. (Leal, et al, 2001; Rhoden, et al, 1998; Rhoden et al, 1997). A geração de injúria renal após isquemia e reperfusão, por sua vez, envolve três principais rotas metabólicas: via da xantinaoxidase, via do óxido nítrico e a via do ácido araquidônico. (Silva, 2002; Rhoden, et al 1998).
Isquemia é a falta de fluxo sanguíneo para um tecido devido à obstrução do fluxo arterial, em que há decréscimo da oferta de substratos metabólicos, inclusive a glicose (Cotran, 2000). A lesão decorrente da isquemia é um fenômeno complexo que não envolve apenas processos intracelulares, mas também desencadeiam resposta inflamatória que são interconectados (Grootet al. 2007).
Segundo Molitoris (1993) e Goes (1995), a isquemia causa uma queda na presença de oxigenação no órgão, promovendo mudanças no metabolismo dos nucleotídeos, com redução de ATP, que provoca expressão de moléculas de adesão epitelial, produção de citocinas e fator de necrose tumoral (TNF), devido os leucócitos atacarem o epitélio do parênquima renal.
A síndrome de isquemia e reperfusãotem sido amplamente reconhecida como uma fonte importante de danos e consequências deletérias para órgãos, (Silva et al, 2002).Reperfusão é a designação para caracterizar o restabelecimento do fluxo arterial após um período de isquemia (Evoraet al.1996).
Sabe-se que o dano celular na síndrome isquêmico-reperfusional é decorrente de alterações da estrutura das membranas lipídicas da célula e de suas organelas, que são consequência de processos iniciados já na fase de isquemia, porém intensificados durante a reperfusão tecidual. (Silva, 2002; Rhoden, et al, 1998; Rhoden et al, 1997)
De acordo com Land (1996) e Gill (2005), a lesão por isquemia e reperfusão é uma das principais causas de insuficiência renal aguda que ocorre após choque hemorrágico ou cirurgia cardiovascular maior, e a causa mais comum da função retardada do enxerto ou falha do órgão.
Em transplantes, a perfusão com solução adequada é parcialmente efetiva, novas pesquisas são indispensáveis para impedir a perda da função do órgão doado devido a danos isquêmicos. O intermédio do uso de fármacos nesses processos potencializa as condições de melhora nas condições clínicas em cirurgias que incluam isquemia e reperfusão (Jaeschkeet, 2003).
A Síndrome da Isquemia e Reperfusão (SIR) é um fenômeno complexo, que contribui para a mortalidade e morbidade dos transplantes clínicos de órgãos sólidos. Embora a introdução de melhores soluções de preservação na prática clínica tenha reduzido a severidade das lesões isquêmicas, a injúria da isquemia-reperfusão ainda permanece como um dos maiores problemas dos transplantes (Torras, et al, 1999).
Várias estratégias e recursos são utilizados pelas células para prevenir ou diminuir a injúria celular causada pelo estresse oxidativo. Esses mecanismos de defesa antioxidantes celulares têm por finalidade prevenir a formação de radicais livres, converter espécies oxidantes tóxicas em menos tóxicas, preservar a compartimentalização celular - que é vital para as estruturas celulares - ou promover o reparo do dano causado pelos radicais livres (Shah, 1995).
De acordo com Araújo (2002) e Netto (2001), a clorpromazina tem-se a capacidade de preservação confirmada, cuja ação protetora ainda não foi totalmente esclarecida. Segundo Chien (1997), a proteção contra lesão isquêmica só ocorre quando ministrada antecipadamente ao momento da parada de aporte sanguíneo ao tecido. O efeito protetor pode estar associado à
alteração do metabolismo de cálcio, recuperação de ATP e perda de fosfolipídeos.
A lovastatina apresenta efeito benéfico na circulação renal, caracterizando-se pelo aumento do fluxo sanguíneo renal, mesmo em animais anormais (Harris et al. 1990; Jiang et al. 1997).
A isquemia do rim pode ocorrer em cirurgias urológicas e vasculares, o que justifica o interesse na procura de drogas protetoras da função renal que possam ser utilizadas por via intravenosa como a Lovastatina, permitindo maior amplitude clínica na prevenção da lesão renal isquêmica(Leal,2001).
A pentoxifilina atua classicamente como agente redutor da viscosidade sangüínea. O mecanismo de ação desta droga ainda não foi totalmente esclarecido, porém sabe-se que ocorre uma diminuição da viscosidade sangüínea, melhorando o fluxo de sangue através da alteração das células vermelhas. Capaz de inibir a produção de TNF-α por monócitos e linfócitos T in vitro (Loprinzi, 2004).
De acordo com Cooper (2004) e Sliwa (1998), esta droga tem sido utilizada em outros estudos, baseada na hipótese de que a mesma é capaz de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias.
O objetivo geral do presente experimento é avaliar a capacidade de proteção renal da Pentoxifilina no episódio da Síndrome da Isquemia e Reperfusão (SIR) comparada a Lovastatina e a Clorpromazina.
O objetivo específico baseia-se em avaliar a capacidade renoprotetora da Clorpromazina, Lovastatina, Pentoxifilina, e seus efeitos histopatológicos sobre o rim pós-SIR medicado ou não com a Pentoxifilina, comparando-as qualitativamente a sua capacidade renoprotetora.
METODOLOGIA
O protocolo experimental foi submetido ao Comitê de Ética no Uso Animal, CEUA-UNITRI e aprovado pelo protocolo 849855, cuja pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes do código Brasileiro de legislação para o uso científico de animais (Lei 11.794 / 08).
Foram utilizados36 ratos Wistar machos fornecidos pelo Biotério do Centro Universitário do Triângulo (UNITRI) de Uberlândia MG, com peso corporal variando entre 200 a 250g.
Todos os animais ficaram por 15 dias no biotério climatizado sendo manipulados pela equipe pesquisadora a fim de se adaptarem e reduzir o estresse pela mudança ambiental. É fornecido água clorada e ração própria ad libitum.Cada animal passa por exame clínico a fim de verificar o estado de saúde. Os animais clinicamente saudáveis são utilizados na pesquisa divididos em grupos. Os grupos foram definidos como grupo Controle (CT); grupo Clorpromazina (CPZ); grupo Lovastatina (LVT) e grupo Pentoxifilina (PTX).
Cada grupo foi dividido em três subgrupos de três animais e cada subgrupo está alocado em uma gaiola separada, sendo marcados como 24h (24 horas), 72h (72 horas) e 5d (cinco dias).
Antes dos procedimentos anestésicos os animais passam por jejum alimentar de 6 horas. Após a cirurgia, a ferida cirúrgica é limpa diariamente com água sabão e PVPI tópico.
Para o grupo (CT): No momento zero, os animais foram anestesiados com inalação de isoflurano puro vaporizado em oxigênio a 100%, foi realizada uma laparotomia mediana, onde foi induzida uma isquemia normotérmica pelo clampeamento da artéria renal esquerda utilizando pinça bulldogdieffenbach.
A incisão da laparotomiafoi suturada, os animais receberam uma dose de fentanila na dose de 0,025 mg/kg por via intramuscular e foram colocados em caixas individuais pelo período de 60 minutos. A seguir, foram novamente anestesiados, a cavidade abdominal reaberta e restabelecido o fluxo sanguíneo renal pela retirada da pinça vascular mantida na artéria renal.
Em continuidade, realizou-se a nefrectomia contralateral ao órgão previamente isquêmico. A cavidade abdominal foi suturada com pontos simples separados com fio mononylon 4-0 (Figura 1), e após a recuperação anestésica, os animais foram mantidos em suas próprias gaiolas e realizada analgesia com cloridrato de tramadol na dose de 5mg/kg por via intramuscular a cada 12 horas.
Figura 1 – Animal suturado após indução de isquemia e reperfusão esquerda e nefrectomia direita. Anestesia realizada com Isoflurano em oxigênio a 100%
O subgrupo 24h foi anestesiado com o mesmo protocolo após 24 horas da indução isquêmica e reaberto. Foi coletado três microlitros de sangue intra-cardiaco.Seria coletado urina por cistocentese.E o rim testado foi coletado por nefrectomia padrão. Ainda em plano anestésico os animais forameutanasiados com aplicação de cloreto de potássio 19,1% por via intra-cardíaca.
O subgrupo 72h foi anestesiado com o mesmo protocolo após 72 horas da indução isquêmica e reaberto. Foi coletado três microlitros de sangue intracardíaco, seria coletado o maior volume de urina possível da vesícula urinária por cistocentese e o rim testado foi retirado por nefrectomia padrão. Ainda em plano anestésico os animais forameutanasiados com aplicação de cloreto de potássio 19,1% por via intracardíaca.
O subgrupo 5dfoi anestesiado com o mesmo protocolo após cinco dias da indução isquêmica e reaberto. Foram coletados três microlitros de sangue intracardíaco, seria coletado o maior volume de urina possível da vesícula urinária por cistocentese e o rim testado foi coletado por nefrectomia padrão. Ainda em plano anestésico os animais forameutanasiados com aplicação de Cloreto de Potássio19,1% por via intracardíaca.
Os grupos (CPZ), (LVT) e (PTX) passarão pelo mesmo tipo de procedimento que o grupo (CT), mas antes da indução de isquemia e reperfusão, receberão o tratamento com os fármacos em teste. O grupo (CPZ)
receberá uma dose de 3mg/Kg de clorpromazina administrada por via intravenosa (Veia Jugular externa), 15 minutos antes. O grupo (LVT) receberá a Lovastatina na dose de 15mg/Kg/dia administrados por via oral no período de 10 dias que antecederão a realização da isquemia. O grupo (PTX) receberá a Pentoxifilina na dose de 40mg/Kg/dia administrados por via intraperitoneal no período de 10 dias que antecederão a realização da isquemia.
A análise sanguínea será realizada para aferição dos níveis de uréia e creatinina séricas.
Os resultados obtidos com as análises serão submetidos a análise estatística pelo teste U de Mann-Whitney considerando o índice de significância de 5%.
Posteriormente os rins serão incluídos em formoldeído e cortes micrométricos serão realizados para análise em microscopia ótica.Tanto para os rins do grupo controle quanto os do grupo teste serão avaliados conforme estrutura tecidual.
Serão avaliados quantidade de glomérulos normais por campo, densidade do tecido cortical e medular. Além das características vasculares parenquimais, espessura da capsula renal, presença de fibrina, fibrose e necrose tecidual, além de presença ou não de infiltrado inflamatório.
Os resultados obtidos serão posteriormente submetidos a análise estatística pelo testeKolmogorov-Smirnov para efeito comparativo entre os grupos.
RESULTADOS
Até o presente momento foram realizados os procedimentos cirúrgicos apenas no grupo controle (CT). Os subgrupos (24h, 72h, e 5d) comportaram-se de maneira semelhante após 1 hora de isquemia,onde o rim apresentava-se congesto e cianótico (Figura 2).Houve um grande incremento dos níveis séricos de creatinina e ureia. Tanto as dosagens realizadas 24, 75 horas e cinco dias apresentaram-se próximas (Tabela 1).
Figura 2 - Retirada da pinça vascular, e o início da reperfusão renal. Nota-se a aparência macroscópica de coloração enegrecida em decorrência de congestão e cianose.
Após o procedimento experimental, os animais mantiveram-se bem e clinicamente estáveis, no entanto houve redução do consumo alimentar e perca de peso corporal em alguns animais. Apesar da impossibilidade técnica de coleta urinária, observou-se translucidez urinária no fundo das caixas em todos os subgrupos.
Tabela 1 – Níveis de ureia e creatinina pré e pós isquemia e reperfusão renal RESULTADOS ANÁLISE BIOQUÍMICA GRUPO CONTROLE
Animais Sub-grupo Pré Pós UREIA CT1 24h 40.7mg/dl 282mg/dl CT2 24h 44.1mg/dl 277mg/dl CT3 24h 35.3mg/dl 270mg/dl CT4 72h 58.3 mg/dl 302 mg/dl CT5 72h 50.7 mg/dl 198 mg/dl CT6 72h 38.4 mg/dl 308 mg/dl CT7 5d 93.8 mg/dl 269 mg/dl CT8 5d 40.6 mg/dl 285 mg/dl
CT9 5d 36.0 mg/dl 292 mg/dl CT1 24h 0.48 mg/dl 5.32mg/dl CREATININA CT2 24h 0.45 mg/dl 5.54mg/dl CT3 24h 0.38 mg/dl 5.81mg/dl CT4 72h 0.32 mg/dl 12,0mg/dl CT5 72h 0.47 mg/dl 1.85 mg/dl CT6 72h 0.39 mg/dl 4.86 mg/dl CT7 5d 0.42 mg/dl 5.42 mg/dl CT8 5d 0.36 mg/dl 5.04 mg/dl CT9 5d 0.41 mg/dl 4.92 mg/dl
Os rins esquerdos dos nove animais foram conservados em formaldeído para envio a análise histopatológica.
DISCUSSÂO
Pode-se constatar que todos os animais foram induzidos a uma insuficiência renal aguda (IRA), cujo grau de destruição glomerular será comprovado e avaliado com o laudo histopatológico, com qual se aguarda os resultados.
De acordo com os estudos realizado por Feitosa et al. (2005), evidenciou-se alterações tubulares após 30 minutos de isquemia, que foram agravadas após 30 minutos de reperfusão.
As alterações evidenciadas neste experimento foram gradativas de acordo com o avanço da lesão, acentuando-se no período de reperfusão.Este fato pode ser explicado porque a reperfusão, ainda que seja essencial para prevenir a irreversibilidade da lesão celular, pode agravar as lesões produzidas na fase isquêmica isolada.
Os níveis de ureia se tornaram aumentados em todos os tempos avaliados (Tabela 1), no entanto não houve diferença significativa entre as médias nos momentos 24 horas, 72 horas e 5 dias (Gráfico 1).O que pode ter sido justificado por um estado de compensação realizada por uma função renal mínima após as primeiras horas pós isquêmica.
Gráfico 1 – Níveis séricos de ureia (mg/dl) entre os tempos testados
No entanto os níveis de creatinina subiram até nas primeiras 72 horas pós-teste e no quinto dia, houve uma redução significativa (Gráfico 2). A compensação renal pode ter sido a principal causa dessa redução após cinco dias, já que uma parcela dos néfrons podem ter sido recuperados. O que será confrontado com exames histopatológicos
Gráfico 2 – Níveis séricos de creatinina (mg/dl) entre os tempos testados
Conforme Jablonski et al. (1983) e Williams et al. (1997), rins submetidos a isquemia durante 60 minutos, resultam em déficit funcional e em uremia estrita. O estudo experimental com o uso clorpromazina, como um protetor
0 50 100 150 200 250 300
Pré 24 horas 72 horas 5 dias
Média dos níveis de ureia (mg/dl) 0 1 2 3 4 5 6 7
Pré 24 horas 72 horas 5 dias
Média dos níveis de creatinina (mg/dl)
contra a isquemia renal, foram realizados por Junior et al. (2008), cujo grupo controle apresentou os níveis de uréia e creatinina mantidos elevados até 7dia pós-operatório, embora apresentando uma tendência a diminuição e estabilização dos valores séricos, como ocorrido neste projeto.
Öztürket al. (2001) estudaram o efeito renoprotetor da molsidomina em ratos submetidos ao processo de isquemia/reperfusão renal. O molsidomina é um potente vasodilatador que é amplamente utilizado como antianginoso, relaxando a musculatura lisa, estimulando guanilatociclase, aumentando os níveis de guanosina cíclico monofosfato (cGMP). Os animais sofreram nefrectomização direita e isquemia do rim esquerdo, permanecendo isquêmico durante 1 hora.
De acordo com a medição diária de uréia e creatinina por sete dias, e do laudo do exame histopatológico, observaram-se que os ratos do grupo molsidominaobtiveram um melhor índice de ureia e creatinina, melhor sobrevida e menor grau de lesão renal, quando comparado ao grupo controle (Ozturket al. 2001). A metodologia deste projeto experimental foi similar ao que está sendo utilizado neste trabalho.
Com isso é possível ressaltar que a duração da isquemia/reperfusão foi indicadora da presença de lesão renal, levado em consideração o modelo experimental empregado. Além dos métodos de avaliação da função renal, torna-se imprescindível à necessidade da avaliação do efeito protetor conferido pelas medicações impostas neste presente trabalho.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Foi clara a indução da insuficiência renal aguda no grupo controle o que permitirá uma plena avaliação dos efeitos renoprotetores dos fármacos testados.
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