LUIZ ALBERTO BANDEIRA FERREIRA
“CITOTOXICIDADE, ENDOCITOSE E PROCESSAMENTO CELULAR DE NANOPARTÍCULAS BIOSSINTÉTICAS DE PRATA EM MACRÓFAGOS
PERITONEAIS”
CAMPINAS 2015
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Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Ferreira, Luiz Alberto Bandeira, 1984-
F413c Citotoxicidade, endocitose e processamento celular de
nanopartículasbiossintéticas de prata em macrófagos peritoneais / Luiz Alberto Bandeira Ferreira. – Campinas, SP: [s.n.], 2015.
Orientador: Marcelo Bispo de Jesus.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
1. Nanomedicina. 2. Nanopartículas de prata. 3.
Citotoxicidade. 4. Macrófagos peritoneais. I. Jesus, Marcelo Bispo de. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Cytotoxicity, endocytosis and cell processing of biogenic silver nanoparticles in peritoneal macrophages
Palavras-chave em Inglês: Nanomedicine
Silver nanoparticles Cytotoxicity
Macrophages, Peritoneal
Área de concentração: Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Titulação: Mestre em Ciências
Banca examinadora:
Marcelo Bispo de Jesus [Orientador] Paulo César Pires Rosa
Juliana Minardi Nascimento Data da defesa: 13-02-2015
vii RESUMO
A nanomedicina se tornou uma promessa de profundos impactos para a saúde humana através da utilização de nanopartículas, nanorobôs e outros nanomateriais para prevenir, diagnosticar ou curar doenças. Um dos exemplos de nanomateriais empregados na medicina são as nanopartículas de prata, que podem ser adquiridas por métodos químicos ou biossintéticos. As nanopartículas de prata apresentam alta atividade antimicrobiana, propriedade essa de grande interesse científico-industrial. Em vista disso, cresce também a preocupação em relação ao uso, manipulação e eliminação desse nanomaterial, visando uma aplicação mais segura. Diante dessas informações, o presente trabalho teve como objetivo investigar mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade e processamento das nanopartículas biossintéticas de prata em macrófagos peritoneais obtidos de camundongos C57BL/6. Inicialmemte, demonstrando que as nanopartículas atingiram o IC50 de 25 µM em 6h de tratamento por redução do MTT. A análise de microscopia de fluorescência revelou alterações na integridade de membrana a partir de 3 h, que foram agravadas após 6 h de tratamento. Esse mesmo perfil foi observado por microscopia eletrônica de varredura, no qual revelou que após 3 h de tratamento as células já apresentavam perda de projeções celulares, e após 6 h início de fragmentação celular. Além disso, as nanopartículas causaram aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio e demonstramos que este é um fator determinante para os efeitos citotóxicos. Com a inibição da fagocitose e endocitose mediada por caveolina evidenciamos a reversão parcial da citotoxicidade das nanopartículas. Por outro lado, o aumento do efeito citotóxico das nanopartículas também foi observado com a inibição da autofagia, o que sugere que esses processos estejam envolvidos no processamento das nanopartículas. Por fim, concluímos que as nanopartículas biossintéticas de prata apresentaram um efeito citotóxico semelhante aqueles descritos em literatura pelas nanopartículas de síntese química.
ix ABSTRACT
Nanomedicine became a promise of profound impacts on human health through the use of nanoparticles, nanorobots and other nanomaterials to prevent, diagnose or cure diseases. One example of nanomaterials used in medicine is silver nanoparticles, which can be produced by chemical or biosynthetic methods. Silver nanoparticles have high antimicrobial activity; this property is of great scientific and industrial interest. Consequently, there is growing concern about the use, handling and disposal of nanomaterials, aiming more secure application. Hence, the present study aimed to investigate the molecular mechanisms involved in cytotoxicity and intracellular processing of biogenic silver nanoparticles in peritoneal macrophages from C57BL/6 mice. We began showing that the nanoparticles have reached the IC50 of 25 µM after 6 hours of treatment determined by MTT reduction. Fluorescence microscopy analysis showed changes in membrane integrity after 3 h, which has been intensified after 6 h of treatment. A similar profile was observed by scanning electron microscopy, which showed loss of cellular projections after 3 h of treatment and after 6 h was observed cellular fragmentation. In addition, the nanoparticles treatment increased levels of reactive oxygen species and this response seems to be determining for the cytotoxic effects. The inhibition of phagocytosis and caveolin-mediated endocytosis led to a reduction in cytotoxicity of nanoparticles. On the other hand, an increase in the cytotoxic effect was observed upon inhibition of autophagy, suggesting that this response is part of the intracellular processing of the nanoparticles in peritoneal macrophage. Finally, we concluded that the biogenic of silver nanoparticles exhibited cytotoxic effects similar to that described for silver nanoparticles chemically synthesized.
xi SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Nanotecnologia e suas aplicações médicas ... 1
1.2 Química verde e a biossíntese de nanopartículas de prata ... 2
1.3 As nanopartículas de prata e seus aspectos toxicológicos ... 5
1.4 Surgimento da nanotoxicologia... 6
1.5 Endocitose de nanomateriais ... 8
1.6 Papel da autofagia no processamento de nanomateriais... 11
1.7 Avaliação da toxicidade de nanopartículas em macrófagos ... 13
2 OBJETIVOS ... 15
2.1 Objetivos gerais ... 15
2.2 Objetivos específicos ... 15
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 16
3.1 Obtenção das nanopartículas biossintéticas de prata ... 16
3.2 Caracterização das AgNP biossintéticas ... 16
3.3 Extração de macrófagos peritoneais elicitados ... 16
3.4 Caracterização de macrófagos Peritoneais ... 18
3.4.1 Caracterização por citometria de fluxo ... 18
3.4.2 Caracterização por microscopia confocal ... 18
3.5 Ensaios de viabilidade celular por MTT ... 19
3.6 Avaliação da integridade de membrana plasmática ... 20
3.6.1 Microscopia de Fluorescência ... 20
3.6.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 21
3.7 Avaliação do estresse oxidativo ... 21
3.8 Avaliação da citotoxicidade na presença de antioxidante ... 22
3.9 Determinação do mecanismo de internalização ... 22
3.10 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) ... 24
3.11 Avaliação da expressão de citocinas inflamatórias. ... 24
3.12 Forma de análise dos resultados ... 25
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 26
4.1 Caracterização físico-química das nanopartículas biossintéticas de prata ... 26
4.2 Pureza de extração de macrófagos peritoneais ... 27
4.3 Determinação do IC50 em macrófagos peritoneais por MTT ... 29
4.4 Viabilidade em função da variação do tempo ... 30
4.5 Avaliação da integridade da membrana em macrófagos peritoneais ... 32
4.6 Avaliação da geração de espécies reativas de oxigênio após tratamento com AgNP biossintéticas ... 36
4.7 Avaliação da endocitose na citotoxicidade das AgNP biossintéticas em macrófagos peritoneais ... 39
4.8 Avaliação de inibidores de fagocitose na citotoxicidade das AgNP ... 42
4.9 Estudo da pinocitose na citotoxicidade das AgNP ... 45
4.10 O papel da autofagia na citotoxicidade causada pelas AgNP ... 50
5 CONCLUSÃO ... 52
6 PERPECTIVAS ... 54
7 REFERÊNCIAS ... 55
8 ANEXO 1 - Avaliação do fluxo autofágico por MET em macrófagos tratados com as AgNP ... 65
9 ANEXO 2 - Avaliação in vivo da resposta imune inata em camundongos tratados com as AgNP ... 67
10 ANEXO 3 - Congresso Internacional ... 69
11 ANEXO 4 - Artigo de Revisão ... 70
xiii DEDICATÓRIA
“Agradeço а Deus, pois sеm ele еu nãо teria forças pаrа percorrer essa longa jornada. À minha amada mãe, meu maior exemplo de vida e superação que possuo”
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente, a Deus por me iluminar, me fortalecer nas horas mais difíceis e guiar minhas escolhas;
À minha família, principalmente minha mãe Marcia, por incentivar a minha profissão e dar todo o amparo nesta caminhada;
Ao meu orientador Dr. Marcelo Bispo de Jesus, por ter acreditado no meu potencial, pelos ensinamentos e paciência durante esses anos, e por ter me dado todo suporte possível nesta caminhada;
Ao Prof. Dr. Nelson Durán e Profa. Dra. Priscyla D. Marcato por terem cedido a matéria-prima, fonte para o desenvolvimento deste estudo e contribuído com seus conhecimentos.
À Profa. Dra. Eneida de Paula, por todos ensinamentos, apoio e suporte junto ao programa de Pós-Graduação;
À Profa. Dra. Carmem Veríssima Ferreira, pela paciência e suporte estrutural para o desenvolvimento deste trabalho;
À Profa. Dra. Leonilda Maria Barbosa dos Santos e ao Dr. Alessandro dos Santos Farias, por me oferecer todo o suporte científico e estrutural possível para o desenvolvimento deste trabalho; Ao Prof. Dr. Marco Aurélio Ramirez Vinolo, pelos ensinamentos na extração de cultura primária de macrófagos;
Ao Me. Fernando Padrella, pelo suporte técnico para em algumas metodologias desenvolvidas neste trabalho;
Aos técnicos Daniel Razzo, Rosimeire Florença e Sílvio Roberto Consonni, que me auxiliaram na prática de técnicas de grande importante para realização deste estudo;
A todos os amigos do Instituto de Biologia, Departamento de Bioquímica e Imunologia;
À Fundação de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro;
Ao Programa de Pós-Graduação em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos pela oportunidade de desenvolver este trabalho científico.
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LISTA DE ABREVIATURAS
AgNP Nanopartícula de Prata
APC (Allophycocyanin) Aloficocianina
CLQ Cloroquina
CPZ Clorpromazina
DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol
DCF-DA 2',7'-diacetato de dicloro-fluoresceína
EIPA (5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride) Amilorida 5-(N-etil-N-isopropil) FSC-H (Forward scatter Height) Dispersão de Luz Frontal que mede a altura GSH Glutationa Reduzida
INFABIC Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fotônica aplicada a Biologia Celular
LC3- I/II (Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3) Forma I e II da cadeia leve 3 das proteínas associadas a microtúbulos
MβCD Metil Beta-Ciclodextrina
MΦ Macrófago
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura MET Microscopia Eletrônica de Transmissão
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio NAC N-Acetil-L-Cisteína
NTA (Nanoparticle Tracking Analysis)Análise de Rastreamento de Nanopartículas p62 Nucleoporina 62
PBS Tampão Fosfato-Salino PDI Polidispersividade
PI (Propidium Iodide) Iodeto de Propídio PFA Perfluoroalcoxi
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) Forbol 12-Miristato 13-Acetato ROS (Reactive Oxygen Species) Espécies Reativas de Oxigênio
RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Meio de cultura do Instituto Memorial Parque Roswell SMF Sistema Mononuclear Fagocitário
SFB Soro Fetal Bovino
xix LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Biossíntese das nanopartículas de prata. Ilustração do processo de biossíntese das
AgNP. ... 4
Figura 2 – Microscopia eletrônica de Transmissão das AgNP biossintéticas.. ... 4
Figura 3 – Número de periódicos com a palavra nanotoxicology de 2000 até 2014.. ... 7
Figura 4 – Principais vias de endocitose de nanopartículas em células eucarióticas.. ... 10
Figura 5 – Mecanismo de Autofagia. Ilustração do processo de autofagia.. ... 13
Figura 6 – Seletividade de extração de macrófagos peritoneais.. ... 28
Figura 7 – Marcação de glicoproteínas da família EGF-TM7 em macrófagos peritoneais elicitado ... 29
Figura 8 – Determinação do IC50 em macrófagos peritoneais ... 30
Figura 9 – Citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais em função do tempo.. ... 31
Figura 10 – Porcentagem de permeabilidade celular em macrófagos peritoneais ... 33
Figura 11 – Imagens representativas da avaliação da permeabilidade celular em macrófagos por microscopia de fluorescência ... 34
Figura 12 – Avaliação da morfologia de macrófagos peritoneais tratados com AgNP ... 35
Figura 13 – Avaliação dos níveis de ROS em macrófagos peritoneais. ... 37
Figura 14 – Avaliação da viabilidade celular na presença de N-Acetilcistena. ... 39
Figura 15 – Citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob variação da temperatura. 40 Figura 16 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de Dynasore ... 42
Figura 17 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de fagocitose Citocalasina D ... 44
Figura 18 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de fagocitose Nocodazol. ... 44
Figura 19 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de Macropinocitose EIPA ... 46
Figura 20 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de endocitose mediada por clatrina Clorpromazina ... 47
Figura 21 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de endocitose mediada por caveolina Metil-beta-ciclodextrina ... 49
xx
Figura 22 – Avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais sob ação do inibidor de endocitose mediada por caveolina Filipina ... 49 Figura 23 – Estudo da autofagia na avaliação da citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais ... 51 Figura 24 –Citotoxicidade e processamento celular de nanopartículas biossintéticas de prata em macrófagos peritoneais ... 53 Figura 25 – Indução da formação de vesículas típicas de autofagia por AgNP ... 66 Figura 26 – Avaliação in vivo da expressão de RNAm de citocinas pró e anti-inflamatórias em macrófagos extraídos de camundongos tratados com AgNP ... 68
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Determinação da concentração dos inibidores de endocitose e autofagia ... 23 Tabela 2 - Características físico-químicas das nanopartículas biossintéticas de prata ... 27
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1 INTRODUÇÃO
1.1 Nanotecnologia e suas aplicações médicas
A nanotecnologia consiste no desenvolvimento e controle da matéria em escala nanométrica, para aplicação em diversas áreas do conhecimento humano (ALBRECHT; EVANS; RASTON, 2006). No final do século XX, iniciativas ligadas à nanotecnologia receberam incentivos de várias agências de fomento em todo o mundo, tal que esta área da ciência logo se tornou uma promessa de rápidos avanços e profundos impactos na sociedade moderna (JONES, 2011). Uma das áreas da nanotecnologia das quais se espera grandes avanços é a nanomedicina (FORTINA et al., 2005; MCNEIL, 2005), que utiliza nanomateriais com o intuito de prevenir, diagnosticar ou curar doenças (FERNANDEZ-FERNANDEZ; MANCHANDA; MCGORON, 2011).
Atualmente, uma ampla gama de nanomateriais são utilizados na nanomedicina, alguns já em fase de testes clínicos, como os quantum dots, lipossomas, dendrímeros, nanopartículas poliméricas, nanopartículas de sílica, nanopartículas lipídicas, nanopartículas metálicas, entre outros (CHOU; MING; CHAN, 2010; FERNANDEZ-FERNANDEZ; MANCHANDA; MCGORON, 2011; PETROS; DESIMONE, 2010; RAJENDRAN; KNÖLKER; SIMONS, 2010; TORCHILIN, 2006). Esses nanomateriais podem apresentar atividades terapêuticas, ou então, serem utilizados como carreadores de fármacos, proteínas, DNA recombinante e diferentes tipos de RNAs, no qual apresentam um papel terapêutico coadjuvante (MARCHESAN; PRATO, 2012). Além disso, alguns nanomateriais funcionam como biosensores, auxiliando no diagnóstico de doenças (YAN et al., 2011).
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1.2 Química verde e a biossíntese de nanopartículas de prata
Dentre os tipos de nanomateriais supracitados encontram-se as nanopartículas metálicas, que podem ser originadas a partir de diversos metais, como por exemplo, óxido de ferro e prata (AgNP) (DURÁN et al., 2011). Entre as nanopartículas metálicas, destacamos as nanopartículas de prata que são muito conhecidas pela sua atividade antimicrobiana, e que têm sido utilizadas para uma variedade de aplicações e incorporados em diversos produtos de aplicações médicas (CHENG et al., 2013; GE et al., 2014; MANEEWATTANAPINYO et al., 2011).
As nanopartículas produzidas a partir da prata podem ser sintetizadas por processos químicos (DE LIMA; SEABRA; DURÁN, 2012) ou biológicos (DURÁN et al., 2011; JEYARAJ et al., 2013). A obtenção das AgNP por métodos químicos pode ser dispendiosa, cara e gerar resíduos tóxicos (ROSCHANGAR; SHELDON; SENANAYAKE, 2014). Desta forma, o desenvolvimento de métodos mais simples, seguros, que geram pouco ou nenhum resíduo tóxico, tem despertado maior interesse na síntese de nanopartículas inorgânicas, como as de prata (DURÁN et al., 2010). Para tentar minimizar os efeitos tóxicos que os nanomateriais podem ocasionar vem sendo desenvolvidos protocolos de síntese de nanopartículas com bases limpas, biocompatíveis e não tóxicos,utilizando princípios da “Química Verde” (Green Chemistry) (ALBRECHT; EVANS; RASTON, 2006).
Também conhecida como química sustentável, a Química verde visa desenvolver produtos e processos químicos mais seguros, procurando reduzir ou eliminar o uso e a geração de substâncias nocivas à saúde humana e ao ambiente (CLARK et al., 2013; ROSCHANGAR; SHELDON; SENANAYAKE, 2014). É uma filosofia que se aplica em diversas áreas da química, inclusive no desenvolvimento de produtos nanotecnológicos. Princípios da Química Verde têm sido aplicados à produção de AgNP com método biológico, utilizando, por exemplo, fungos
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(DURÁN et al., 2005; KOWSHIK et al., 2003), bactérias (SINTUBIN et al., 2009), ou até mesmo plantas (KRISHNARAJ et al., 2010), para a síntese de nanopartículas biossintéticas de prata. As principais vantagens da utilização desse método é que ele pode ser realizado em condições ambiente de temperatura, pressão e no pH fisiológico do organismo utilizado para a síntese (DHILLON et al., 2011).
A nanopartícula utilizada neste estudo foi desenvolvida por Durán e col., através da redução da prata por enzimas e substratos obtidos após a filtração da biomassa do fungo Fusarium oxysporum (DURÁN et al., 2005). Nesse método, o nitrato de prata é adicionado numa solução de extrato fúngico contendo redutases e outros substratos, onde os íons prata (Ag+) são reduzidos à prata metálica (Ag0) (fig. 1) (DURÁN et al., 2005; ERENO; MARCATO; RODRIGUES, 2013). Este método de biossíntese possibilita obter AgNP esféricas (fig. 2), com alto potencial antimicrobiano, faixa estreita de raio hidrodinâmico (i.e. monodispersas), já estabilizadas por proteínas do próprio microrganismo, não sendo necessário a adição de surfactantes (DURÁN et al., 2007; MOHANPURIA; RANA; YADAV, 2008). Além disso, essas AgNP biossintéticas apresentam muitas vantagens, como: alta biodisponibilidade, baixo custo de produção, baixa tendência de auto agregação (DURÁN et al., 2011).
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Figura 1 – Biossíntese das nanopartículas de prata. Ilustração do processo de biossíntese das AgNP. 1- Preparação
do extrato fúngico: após o Fusarium oxysporum crescer ele é solubilizado em água e filtrado, assim formando uma solução contendo componentes extracelulares do fungo. 2- Produção das AgNP biossintéticas: Nitrato de prata é adicionado ao extrato fúngico, no qual os íons prata (Ag+) serão reduzidos por redutases contidas no filtrado fúngico,
assim dando origem a prata metálica (Ag0) que precipita na forma de nanopartículas revestidas por proteínas fúngicas.
Adaptado: ERENO; MARCATO; RODRIGUES, 2013.
Figura 2 – Microscopia eletrônica de Transmissão das AgNP biossintéticas. Nanopartículas de prata biossintetizadas pelo fungo Fusarium oxysporum apresentado o formato esférico de tamanho médio 40.3 nm ±3.5 nm (escala de 200 nm) (LIMA et al., 2013).
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1.3 As nanopartículas de prata e seus aspectos toxicológicos
A prata é conhecida por sua potente ação antimicrobiana, na qual seus efeitos biológicos são descritos tanto na forma nanoparticulada, quanto na forma livre (Ag+) (RAI et al., 2012). Devido a essa propriedade, produtos utilizando AgNP são amplamente utilizados em equipamentos eletrônicos, roupas, alimentos, tintas, bloqueadores solares, cosméticos (AHAMED; ALSALHI; SIDDIQUI, 2010). Na área médica, as AgNP têm sido usadas no tratamento e diagnóstico de doenças, bem como no revestimento de dispositivos médicos, curativos, têxteis médicos e contraceptivos (CHEN; SCHLUESENER, 2008; GALIANO et al., 2008; GE et al., 2014; MOORE, 2006; ZHOU et al., 2011). Portanto, toda essa exposição aos produtos contendo AgNP leva a uma concomitantemente crescente na preocupação sobre os efeitos adversos que esses materiais podem proporcionar, por isso uma avaliação mais detalhada dos efeitos tóxicos desses nanomateriais e suas implicações em seres vivos e meio ambiente se faz necessária.
As AgNP têm atraído muita atenção por parte de pesquisadores para uma avaliação mais criteriosa sobre seus efeitos danosos. Muitos estudos em diversas linhagem celulares relatam que as AgNP podem induzir uma série de eventos citotóxicos, incluindo o comprometimento da membrana celular (ZHORNIK et al., 2014), resposta inflamatória (YANG et al., 2012), danos ao DNA, causando genotoxicidade e aberrações cromossômicas (ASHARANI et al., 2009; EOM; CHOI, 2010), indução de morte celular por apoptose ou necrose (FOLDBJERG et al., 2009; HSIN et al., 2008). Muitos desses danos celulares citados também são descritos por decorrência da produção de espécies reativas de oxigênio induzidas pelas AgNP (ARORA et al., 2008; MANKE; WANG; ROJANASAKUL, 2013).
Os mecanismos de toxicidade das AgNP estão ligados aos íons de prata liberados, que podem intercalar com bases nitrogenadas de ácidos nucleicos, interagir com o grupamento tiol de
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proteínas, tais como glutationa (GSH), tioredoxina, superóxido dismutase e tiorredoxina peroxidase, que são conhecidos por regular de modo inibitório o estresse oxidativo (ARORA et al., 2008; RAI et al., 2012; ZHANG et al., 2014). Existem muitas moléculas que contêm os tióis no citoplasma, membrana celular e membrana interna de mitocôndrias, que servem como alvos de íons de prata ou AgNP (ALMOFTI et al., 2003).
A incorporação de produtos com AgNP é cada vez mais frequente, aliado a isso cresce o número de trabalhos descrevendo os efeitos citotóxicos das AgNP. Existem muitos estudos sobre os efeitos tóxicos causados por AgNP adquiridas por métodos químicos ou biossintéticos (ZHANG et al., 2014). Entretanto, estudos da citotoxicidade de nanopartículas biossintéticas pode trazer particularidades. Um exemplo disso é a obtenção de AgNP pelo fungo Fusarium oxysporum, que leva a formação de nanopartículas com características únicas (corona de proteínas fúngicas) (DURÁN et al., 2005, 2007). Desta forma, as AgNP biossintéticas apresentam-se como uma alternativa promissora e pouco explorada em literatura, o que garante a originalidade do presente trabalho. Ainda há poucos relatos sobre o seu efeito citotóxico, principalmente sobre os estudos do processamento celular e efeitos no metabolismo dessas partículas.
1.4 Surgimento da nanotoxicologia
Nos dias atuais é crescente uso de nanopartículas nas mais variadas aplicações, em paralelo cresce também a preocupação sobre possíveis efeitos colaterais desses materiais, fazendo necessária uma avaliação mais rigorosa dos seus potenciais efeitos tóxicos e critérios de controle associados (OBERDÖRSTER; OBERDÖRSTER; OBERDÖRSTER, 2005; SOENEN et al., 2012). Nos últimos anos, essa preocupação ganhou dimensões globais e uma nova área do conhecimento foi estabelecida e denominada nanotoxicologia, que se propõe em avaliar os efeitos
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toxicológicos de nanomateriais. Alguns eventos foram fundamentais para o estabelecimento dessa nova área, como por exemplo a publicação do artigo intitulado “Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles” de Oberdörster e colaboradores em 2005 e o lançamento da revista científica internacional e indexada Nanotoxicology, em 2007 pela editora Informa Healthcare. Depois disso, mais atenção vem sendo dada a essa área, além da criação de novas revistas científicas sobre o tema e até o presente momento totalizam-se 1251 artigos no portal PubMed e 941 artigos no portal Web of Science sobre o tema (fig. 3).
Figura 3 – Número de periódicos com a palavra nanotoxicology de 2000 até 2014. Pesquisa de artigos científicos
contendo a palavra nanotoxicology na base de dados dos portais Pubmed e Web of Science, pelo período entre 2000 à 2014. Pesquisa realizada em 17/12/2014.
Através dos avanços na área de nanotoxicologia será possível compreender mecanismos ainda inexplorados causados pelas nanopartículas. Para estudarmos as bases moleculares da toxicidade de nanomateriais é necessário entender como o nanomaterial é internalizado,
0 50 100 150 200 250 300 350 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 N ú m e ro d e A rtig o s Ci e n tíf ic o s
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metabolizado, eliminado e as consequências desses processos para o microambiente celular (DE JESUS; KAPILA, 2014; SOENEN et al., 2012). Estudos sobre a degradação intracelular de nanopartículas e a correlação entre localização intracelular, concentração local de nanopartículas e o seu efeito citotóxico podem fornecer pistas importantes sobre os efeitos das nanopartículas em células animais (BRANDENBERGER et al., 2010; LEHMANN et al., 2010; SOENEN et al., 2010). Composição química, forma, estrutura de superfície, carga de superfície, agregação e solubilidade também podem influenciar na toxicidade de nanomateriais (SHINDE et al., 2012). Essas propriedades têm forte influência na biodistribuição, opsonização e endocitose desses nanomateriais e, por consequência, podem modular seus efeitos biológicos. As propriedades físico-químicas podem influenciar também a toxicidade de nanomateriais, cujos mecanismos moleculares podem, por exemplo, resultar do aumento de estresse oxidativo, da produção de citocinas inflamatórias, ou até mesmo levar à morte celular (GARNETT, 2006; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010; SHINDE et al., 2012; ZHAO et al., 2011).
O comportamento de nanopartículas no interior das células ainda é um enigma e algumas respostas metabólicas e imunológicas induzidas por estas nanopartículas até hoje não são compreendidas. Neste cenário, a nanotoxicologia assume o desafio de decifrar os eventos moleculares que regulam a bio-acumulação e toxicidade das nanopartículas (CANTON; BATTAGLIA, 2012; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010; ZHAO et al., 2011).
1.5 Endocitose de nanomateriais
O principal mecanismo responsável pela internalização de nanomateriais em células eucarióticas é a endocitose, que fisiologicamente está envolvida com diversos processos biológicos, como: absorção de nutrientes extracelulares, regulação dos receptores de superfície
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celular, manutenção homeostática do colesterol e apresentação de antígenos (CANTON; BATTAGLIA, 2012; DE JESUS; KAPILA, 2014; DOHERTY; MCMAHON, 2009). A endocitose (fig. 4) pode ser dividida em fagocitose e pinocitose, na qual a fagocitose é desempenhada por células do sistema imunológico, principalmente por fagócitos profissionais, como os monócitos, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas (DOHERTY; MCMAHON, 2009; ZHAO et al., 2011). Nesse processo, as células prolongam a membrana celular para internalizar materiais exógenos e formar o fagossomo, que será processado no interior da célula, com objetivo de degradar o material endocitado no lisossomo (fig. 4) (CANTON; BATTAGLIA, 2012; ZHAO et al., 2011). A pinocitose (fig. 4) é responsável pela internalização de materiais menores que aqueles endocitados pela fagocitose. A pinocitose pode ser classificada em macropinocitose, endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por caveolina e endocitose clatrina-caveolina independentes, representadas por Flotilina e GLIC/GEEC (fig. 4) (FERREIRA et al., 2014; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010).
Vários aspectos são importantes para a internalização de um nanomaterial, como o tipo de interação que ele estabelece com a membrana plasmática, sua forma e composição, além de seu tamanho e revestimento (CANTON; BATTAGLIA, 2012; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010; ZHAO et al., 2011). O processo de endocitose de nanomateriais, simplificadamente, inicia-se com a projeção ou invaginação de uma porção da membrana plasmática, envolvendo o nanomaterial; em seguida, a fração de membrana é liberada no interior da célula formando uma vesícula, denominada de fagossomo (na fagocitose) ou endossomo (na pinocitose). Posteriormente, a vesícula contendo o nanomaterial é processada pela célula, sendo direcionada para os lisossomos, onde o conteúdo intravesicular é degradado com o objetivo de fornecer nutrientes para síntese de proteínas ou geração de energia para a célula (fig. 4) (CANTON;
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BATTAGLIA, 2012; SAHAY; ALAKHOVA; KABANOV, 2010). O ambiente hostil gerado para a degradação dos nanomateriais nos lisossomos pode ter desdobramentos para a célula, com geração de espécies reativas de oxigênio, ou até mesmo uma resposta biológica como a autofagia, muitas vezes esses processos estão relacionados com as bases moleculares da toxicidade de nanomateriais (STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012). De modo geral, o estudo da endocitose de nanomateriais é uma importante ferramenta para se começar a entender os efeitos citotóxicos intracelulares de nanomateriais (DE JESUS; KAPILA, 2014; ZHAO et al., 2011).
Figura 4 – Principais vias de endocitose de nanopartículas em células eucarióticas. A etapa inicial representa
principais vias de endocitose usadas para o estudo da internalização de partículas, que tem como consequência a formação de vesículas intracelulares - fagocitose, macropinocitose, endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por caveolina e endocitose clatrina e caveolina independentes (flotilina e CLIC/GEEC). A segunda etapa representa a via clássica de tráfego intracelular que envolve o processamento das nanopartículas a partir do amadurecimento do endossomo precoce, com destino à degradação lisossomal do material endocitado (FERREIRA et al., 2014).
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1.6 Papel da autofagia no processamento de nanomateriais
A autofagia é um mecanismo fisiológico que contribui para a sobrevivência temporária da célula, uma vez que a reciclagem de componentes celulares serve como fonte de energia diante de uma condição de estresse, como inanição (privação de aminoácidos e outros nutrientes), hipóxia e estresse metabólico (STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012). Sendo assim, este processo é
evolutivamente conservado e altamente regulado que envolve a degradação lisossomal de macromoléculas, ribossomos e organelas (por exemplo, retículo endoplasmático, aparelho de Golgi e mitocôndrias) (ESKELINEN; SAFTIG, 2009). Resumidamente, a autofagia inicia-se através da formação de uma membrana de camada dupla denominada autofagossomo, no qual irão envolver proteínas e organelas danificadas destinados à degradação. Posteriormente, o autofagossomo se funde com o lisossomo, onde enzimas hidrolíticas irão degradar o conteúdo, dando a origem ao autofagolisossomo (fig. 5). Durante a autofagia, uma proteína citosólica denominada LC3-I é conjugada com fosfatidiletanolamina, para formar LC3-fosfatidiletanolamina (LC3-II), que é recrutada na membrana de autofagossomos e posteriormente degradada por hidrolases lisossômicas após a fusão de autofagossomos com lisossomos (DJAVAHERI-MERGNY; BOTTI; CODOGNO, 2007).
Outra proteína citosólica que participa desse processo é a p62, que tem fundamental importância na degradação autofágica seletiva de muitas proteínas e organelas disfuncionais. Esta proteína adaptadora atua como seletor de substratos, sendo uma proteína reguladora da entrega de organelas disfuncionais, proteínas agregadas e proteínas ubiquitinadas, para a eliminação através da autofagia (ITAKURA; MIZUSHIMA, 2011). No final deste processo, a p62 é degradada no lisossomo juntamente com os substratos de autofagia, o que promove a diminuição do nível intracelular desta proteína livre (FILOMENI; DE ZIO; CECCONI, 2014; RUSTEN;
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STENMARK, 2010). Sendo assim, o aumento dos níveis de LC3 II e a diminuição da p62 livre são muito utilizadas como marcadores celulares para determinação de fluxo autofágico (TASDEMIR et al., 2008).
Como citado anteriormente, a autofagia é um mecanismo fisiológico para a sobrevivência da célula, porém a indução da autofagia tem sido descrita quando um estímulo contínuo ou potente de estresse é dado, por exemplo, por ação de xenobióticos. Nanomateriais também são descritos como indutores de autofagia (STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012), por exemplo, alguns nanomateriais podem ativar autofagia através da produção de espécies reativas de oxigênio, tal como a acumulação de proteínas oxidadas não funcionais e subsequente estresse do retículo endoplasmático, ou ainda por dano mitocondrial (HE; KLIONSKY, 2009; STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012). Portanto, o estudo da autofagia é uma ferramenta importante para elucidar mecanismo citotóxicos causados pelos nanomateriais, onde é possível visualizar o crescente número de publicações evidenciando o envolvimento deste fenômeno nas bases moleculares da toxicidade de nanomateriais (STERN; ADISESHAIAH; CRIST, 2012; ZABIRNYK; YEZHELYEV; SELEVERSTOV, 2007).
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Figura 5 – Mecanismo de Autofagia. Ilustração do processo de autofagia. 1- Início da formação do Autofagossomo.
2 - O Autofagossomo funde com o lisossomo, dando origem ao Autofagolisossomo, 3- Degradação de organelas e macromoléculas no Autofagolisossomo. As proteínas LC3-II estão envolvidas no processo autofágico, respectivamente auxiliando na formação do autofagossomo e no recrutamento de substratos para degradação (p62 - agregação com ubiquitinas e substratos autofágicos).
1.7 Avaliação da toxicidade de nanopartículas em macrófagos
Os macrófagos pertencem ao Sistema Mononuclear Fagocitário (SMF) e são oriundos de células precursoras do sistema hematopoiético (VAN FURTH et al., 1972). Essas células podem ser encontradas em diversos tipos de tecidos devido a sua grande diversidade funcional. Dessa forma, papéis importantes são atribuídos para essas células em vários aspectos biológicos de um organismo, como por exemplo desenvolvimento, homeostase, reparação e resposta imunológica a patógenos (WYNN; CHAWLA; POLLARD, 2013).
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Os macrófagos são equipados com uma ampla variedade de receptores que permitem a célula reconhecer objetos desconhecidos (não opsnisados) de um organismo, e muitas vezes constituem a primeira linha de defesa, sendo capazes de fagocitar e processar detritos celulares e agentes invasores, como vírus, bactérias e partículas (BUZEA; PACHECO; ROBBIE, 2007; GORDON, 2002). Por essas características, são considerados “fagócitos profissionais” devido a sua alta capacidade de realizar fagocitose (WYNN; CHAWLA; POLLARD, 2013). Sendo assim, são muito utilizados para avaliar os efeitos de patógenos como bactérias (TAYABALI; SELIGY, 2000) ou efeitos citotóxicos de nanopartículas, como exemplo as AgNP (LOCHT et al., 2011; PRATSINIS et al., 2013; SHAVANDI; GHAZANFARI; MOGHADDAM, 2011; WANG; WU; REINHARD, 2012).
Muitas linhagens de macrófagos são comumente utilizadas como modelos para estudos de vários aspectos de captação de nanomateriais e seus potenciais efeitos tóxicos relacionados (CANNON; SWANSON, 1992; WANG; WU; REINHARD, 2012). No presente trabalho, utilizamos macrófagos peritoneais extraídos de camundongos C57BL6 como modelo celular para estudos dos efeitos citotóxicos e processamento celular de AgNP biossintéticas. Como dito anteriormente, os macrófagos constituem a primeira linha de defesa contra nanomateriais em seres humanos e outros mamíferos (PRATSINIS et al., 2013), fato esse relevante para escolha do modelo celular. Além disso, o uso do modelo com cultura de células primárias se aproxima mais da realidade in vivo, pois esses nanomateriais também podem ser eliminados pela circulação sistémica via sistema fagócito mononuclear (BERTRAND; LEROUX, 2012).
15 2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Avaliar os mecanismos moleculares desencadeados por AgNP biossintéticas em macrófagos peritoneais elicitados de camundongos C57BL/6, através de ensaios ex vivo estabelecendo relação entre (i) as vias de internalização das AgNP e seu efeito citotóxico e a (ii) determinação da resposta biológica (e.g. autofagia e estresse oxidativo).
2.2 Objetivos específicos
Para alcançar os objetivos gerais supracitados estabelecemos os seguintes objetivos específicos:
a. Determinar a citotoxicidade das AgNP biossintéticas em macrófagos peritoneais em função de concentração e de tempo.
b. Avaliar a integridade de membrana celular de macrófagos tratados com AgNP biossintética em função do tempo.
c. Verificar a contribuição da endocitose (i.e. fagocitose e pinocitose) para a citotoxicidade das AgNP biossintéticas em macrófagos peritoneais.
d. Investigar os mecanismos moleculares em resposta ao tratamento com as AgNP biossintéticas, através da avaliação da:
produção de espécies reativas de oxigênio; indução do processo autofágico.
16 3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Obtenção das nanopartículas biossintéticas de prata
As AgNP biossintéticas utilizadas nesse projeto foram obtidas através da colaboração com os grupos de pesquisas da Dra. Priscyla D. Marcato (FCFRP/USP) e Dr. Nelson Durán (IQ/UNICAMP). A biossíntese das nanopartículas ocorre a partir da reação do AgNO3 com solução de filtração da biomassa do fungo Fusarium oxysporum, doado pelo laboratório de Genética e Biologia Molecular de Piracicaba (ESALQ-USP), SP, Brasil, na qual a formação da prata metálica ocorre através a redução da prata por enzimas e outros substratos contidos no filtrado fúngico. As nanopartículas foram sintetizadas na concentração de 10 mM (1,4 mg/mL de Ag) apresentando formato esférico, com diâmetro de ±100 nm e carga superficial negativa (ζ = - 29 mV) (DURÁN et al., 2005, 2007).
3.2 Caracterização das AgNP biossintéticas
O raio hidrodinâmico médio, potencial zeta e o índice de polidispersividade das suspensões coloidais foram determinados utilizando um Zetasizer Nano Series (Malvern Instruments, Worcestershire, UK). As medidas foram realizadas a 25 ºC, após diluição de 1:100 da solução estoque em água destilada.
3.3 Extração de macrófagos peritoneais elicitados
Para a obtenção de macrófagos peritoneais elicitados administrou-se, por via intraperitoneal em camundongos C57BL/6 machos (6 a 8 semanas de vida), 1 mL de tioglicolato 4%. Após 72 horas, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e a pele da região abdominal foi removida e pulverizada com álcool 70% para diminuir as chances de contaminação por
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organismos. Após este procedimento, 4 mL de meio RPMI sem soro foram injetados por via intraperitoneal no camundongo e as células da parede interna na cavidade peritoneal foram removidas por massageamento do abdômen do animal por aproximadamente 30 s. Em seguida, o volume injetado foi coletado com a mesma seringa utilizada para injetar o meio de cultura. Para finalizar o procedimento de extração, a cavidade abdominal foi aberta para extração do excesso de fluido contendo as células com uma pipeta Pasteur. Todo fluido peritoneal foi transferido para tubo falcon e centrifugado em 1200 RPM por 10 minutos, no qual o sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em meio de cultura RPMI (Roswell Park Memorial Institute – 1640) (Biomol, Brasil), suplementado com 10% de soro fetal bovino inativo (Biomol, Brasil), 100 U/mL de penicilina (Biomol, Brasil), 100 μg/mL de estreptomicina (Biomol, Brasil) e 1% glutamina. Em todos os ensaios utilizando cultura de macrófagos, as células foram plaqueadas em densidade celular e placas de cultura apropriadas para cada procedimento, e depois incubadas por 24 h a 37 ºC, em atmosfera de 5% de CO2 em incubadora REVCO Ultima II (Biomol, Brasil), para a adesão dos macrófagos em placas de culturas.
Este procedimento de extração de macrófagos peritoneais elicitados possui a aprovação do comitê de ética (protocolo CEUA 3004-1A) e foi feito em colaboração com o Dr. Alessandro dos Santos Farias (jovem pesquisador do Instituto de Biologia/UNICAMP - Proc. FAPESP_nº JP#2011/18728-5), que vem estudando o efeito de nanomateriais nesse modelo animal (GRECCO et al., 2011; MORAES et al., 2013).
18 3.4 Caracterização de macrófagos Peritoneais 3.4.1 Caracterização por citometria de fluxo
Para caracterização dos macrófagos peritoneais as células foram plaqueadas em placas de 12 poços na concentração de 6,0 x 105 células/poço, de acordo com o item 3.3. Após este procedimento, as células foram desprendidas das placas de cultura por raspagem com o espalhador de células e ressuspendidas na concentração de 1,0 x 106 células em 100 µL de PBS, e transferidas para tubos de citometria de fluxo. A seguir, as amostras foram marcadas com 3 µL da solução de anticorpo monoclonal APC anti-mouse F4/80 (BioLegend, San Diego, CA, USA) de concentração 0,2 mg/mL por 30 minutos, em temperatura ambiente e protegidas da luz. Após o processo de marcação, foram adicionados mais 200 μL de PBS e as amostras foram analisadas (10.000 eventos por amostra) em citômetro de fluxo FACSCalibur (Beckton Dickinson), usando-se o programa CellQuest 2.8. A análise da porcentagem das diferentes populações marcadas foi feita utilizando-se o programa FlowJo V10 (Copyright FlowJo, LCC).
3.4.2 Caracterização por microscopia confocal
Os Macrófagos peritoneais foram plaqueados em placas de 12 poços contendo lamínula de 18 mm na concentração de 6,0 x 105 células/poço, de acordo com o item 3.3. Após a incubação por 24 h e a adesão dos macrófagos peritoneais nas lamínulas, as células foram lavadas com PBS, fixadas por 20 minutos com paraformaldeído (PFA) 4% em PBS à temperatura ambiente, após a fixação as células foram lavadas por 3 vezes com PBS. Em seguida, as células foram incubadas com glicina 0,1 M em PBS por 20 minutos, permeabilizadas com triton X-100 0,2% por 2 minutos e bloqueadas com solução de SFB 10% por cinco minutos. Subsequentemente, as amostras foram marcadas com 0,6 µg/lâmina de anticorpo monoclonal APC anti-mouse F4/80 (BioLegend, San
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Diego, CA, USA) por 30 minutos a 37°C e para marcação dos núcleos utilizou-se DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (Enzo Life Sciences), que é marcador de DNA. Após três lavagens com PBS, as lamínulas foram montadas em lâminas de vidro, utilizando meio de montagem líquido Faramount (DAKO). As lâminas foram feitas no Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fotônica aplicada a Biologia Celular (INFABIC), na Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP. As amostras foram analisadas usando um confocal Zeiss LSM 780-NLO em um microscópio Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Alemanha) equipado com lentes de imersão 60X. As imagens foram adquiridas sob airy-unity 1, garantindo a confocalidade. Foram adquiridos 1024 por 1024 pixels e os arquivos foram salvos em formato próprio (lsm) sem perda de qualidade, sendo posteriormente analisadas utilizando o software ImageJ (NIH).
3.5 Ensaios de viabilidade celular por MTT
Para a avaliação da viabilidade celular utilizou-se o ensaio de redução do MTT (3-(4,5-dimetiltiazol2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina), no qual o princípio consiste na captação deste corante e sua redução à formazan (um composto de cor púrpura) pelas desidrogenases mitocondriais, resultando em acúmulo desse composto em células viáveis. A lise das células possibilita a liberação do formazan, que pode ser, então, quantificado em 570 nm (MOSMANN, 1983). Os macrófagos peritoneais foram plaqueados na densidade celular de 1,0 x 104 células/poço em placas de 96 poços, de acordo com o item 3.3. Posteriormente, as células foram submetidas ao tratamento com as AgNP biossintéticas diluídas em meio RPMI sem soro e incubadas à 37 °C, na qual as medições dose e tempo dependentes do tratamento com as AgNP biossintéticas foram obtidas através dos resultados definidos através deste ensaio. Após o tratamento, os poços foram lavados com PBS e adicionados a solução de MTT (0,5 mg/mL) (Sigma-Aldrich, EUA) diluída
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em meio RPMI sem soro, na qual as células foram incubadas por mais 2 horas à 37 °C. No final do procedimento, o meio foi removido cuidadosamente e foram adicionados 100 μL de etanol absoluto para solubilização do formazan. As placas foram agitadas por 10 minutos e a absorbância correspondente a cada poço foi lida no leitor de placas (ELx 800 BIO-TEK) em λ = 570 nm. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao controle.
3.6 Avaliação da integridade de membrana plasmática 3.6.1 Microscopia de Fluorescência
Para avaliar a permeabilidade da membrana plasmática os macrófagos peritoneais foram extraídos e plaqueados em placas de 12 poços na densidade celular de 6,0 x 105 células/poço, de acordo com o item 3.1. Posteriormente, as células foram submetidas ao tratamento com as AgNP biossintéticas ou saponina 0,25% (controle positivo) por 1, 3 e 6 horas (tempo determinado de conforme item 5.4). Após o tratamento, os macrófagos foram lavados 3 vezes com PBS e incubados com Iodeto de Propídio (PI) + Hoechst 33342 (PI 1:1000 e Hoechst 33342 1:1000) (500 µL/poço) em meio RPMI sem soro e incubadas por 10 min a 37°C. Em seguida, as células foram lavadas 1 vez com PBS e fixadas com 500 µL de PFA 4% por 20 min. Finalizando esta etapa, as células foram lavadas 3 vezes com PBS e mantidas em 1 mL da própria solução de lavagem. Para quantificação das amostras, as imagens foram adquiridas em 6 campos diferentes por poço, pelo microscópio Zeiss Cell Observer Z1, acoplado a uma câmara Axio Cam MRm, para posteriormente serem analisadas através do software ImageJ (NIH).
21 3.6.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Para avaliação morfológica da integridade da membrana plasmática por microscopia eletrônica de varredura, os macrófagos peritoneais foram plaqueados em placas de 12 poços contendo lamínula de 18 mm na densidade celular de 6,0 x 105 células/poço de acordo com o item 3.1. Após as células serem submetidas ao tratamento com as AgNP biossintéticas e saponina 0,25% (controle positivo) por 1, 3 e 6 horas as células foram fixadas com glutaraldeído 2.5% (500 µL/poço) em PBS e incubadas por 2 h a 4 °C. Posteriormente, as células foram lavadas com PBS e desidratadas gradualmente com etanol (25%, 50%, 75%, 90% e 100%). Em seguida, o ponto crítico foi realizado de acordo com os protocolos experimentais e as lamínulas aderidas com fitas de carbono nos stubs previamente limpos para que sejam cobertas com ouro. Por final, as lâminas foram observadas e as imagens adquiridas no microscópio de Varredura JEOL JSM 6360-LV no laboratório de microscopia eletrônica – Instituto de Química – UNICAMP.
3.7 Avaliação do estresse oxidativo
Os macrófagos peritoneais foram plaqueados em placas pretas de 96 poços na concentração de 1,0 x 104 células/poço, de acordo com o item 3.1. A geração de espécies reativas de oxigênio foi monitorada empregando-se a sonda 2',7'-diacetato de dicloro-fluoresceína (DCF-DA, Sigma Aldrich, cod. D6883), que é desacetilada por estearases intracelulares gerando o produto 2, 7-diclorofluoresceina (DCF), e na presenta de algumas espécies, tais como •H2O2, •NO2, •HO-, •ROO
(GOMES; FERNANDES; LIMA, 2005; KALYANARAMAN et al., 2012), se torna um composto altamente fluorescente e pode ser detectado por espectroscopia de fluorescência, com um comprimento máximo de excitação de 495 nm e um comprimento máximo de emissão de 529 nm. Neste ensaio, utilizamos como controle positivo de ROS 20 nM de Forbol 12-Miristato 13-Acetato
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(PMA) (Sigma Aldrich), e como controle negativo utilizamos 10 mM de N-acetilcisteina (NAC) (Sigma Aldrich). As células foram tratadas com as 25 µM de AgNP biossintéticas e s geração de espécies reativas de oxigênio foi analisada a cada minuto, pelo tempo total de 60 min, no leitor de placas Synergy HT Biotec utilizando uma excitação em 490 nm e emissão em comprimentos de onda de 530 nm.
3.8 Avaliação da citotoxicidade na presença de antioxidante
Para a determinação da citotoxicidade na presença de antioxidantes, os macrófagos peritoneais foram extraídos e plaqueados em placas de 96 poços na densidade celular de 1,0 x 104 celulas/poço, de acordo com o item 3.3. Antes das células serem submetidas aos protocolos de tratamento com as AgNP, os macrófagos peritoneais foram previamente incubados com 10 mM de N-Acetilcisteína (NAC) por 30 min diluídos em meio RPMI sem soro. Logo em seguida, as células foram tratadas com as AgNP biossintéticas e incubadas por 6 h. A viabilidade celular foi medida conforme descrita no item 3.5.
3.9 Determinação do mecanismo de internalização
Os macrófagos peritoneais foram plaqueados na concentração de 1,0 104 células/poço em placas de 96 poços, conforme descrito no item 3.3. Antes das células serem submetidas aos protocolos de tratamento com as AgNP biossintéticas, os macrófagos peritoneais foram previamente incubados com inibidores diluídos por 30 min em meio RPMI sem soro. Todas as concentrações dos inibidores foram otimizadas de acordo com os testes de citotoxicidade por MTT, descritos no item 3.5. Uma vez que as concentrações utilizadas não poderiam apresentar
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efeitos tóxico, foi determinado que concentrações de inibidores que reduziam a viabilidade em mais de 20% não seriam utilizadas, como demonstrado na tabela abaixo:
Tabela 1 - Determinação da concentração dos inibidores de endocitose e autofagia. As concentrações dos
inibidores foram avaliadas através dos ensaios de viabilidade celular por redução de MTT.
Via de ação Inibidores Mecanismo de inibição testada Conc. Viabilidade Conc. * Viabilidade celular (%) Fagocitose
Nocodazol Inibe polimerização de microtúbulos 1 5 - 20 µM 20 µM 97,7 Citocalasina D Despolimerização de F-Actina 2 3,75 - 15 µM 15 µM 100,0
Macropinocitos
e EIPA Inibidor de bomba de sódio/próton 3
6,25 - 25
µM 6,25 µM 86,2 Clatrina Clopromazina Perda de clatrina e do complexo adaptor AP2 da membrana plasmática 4 2,5 - 10 µg/mL 2,5 µg/mL 86,0
Caveolina
Metil-β-Ciclodextrina
Solubilização de dominios ricos em
colesterol 5
2,5 - 10
µM 10 µM 91,8
Filipina II Sequestro de colesterol da membrana 6 5 - 20 µM 20 µM 91,0 Dinamina
dependentes Dynasore
Inibição de dinamina-1, dinamina-2 e
Drp17
25 - 100
µM 100 µM 93,6
Autofagia Cloroquina Inibição da acidificação lisossomal 8 12,5 - 50 µM 50 µM 100,0
* Concentração viabilidade- é a concetração que, neste trabalho, apresentou efeito mais relevante de inibição de endocitose com menor citotoxicidade.
Referências da tabela: 1(CANNON; SWANSON, 1992; DELOID et al., 2009), 2 (DELOID et al., 2009; ELLIOTT;
WINN, 1986), 3 (HASHIMOTO et al., 2014; WEST; BRETSCHER; WATTS, 1989), 4(MARINA-GARCÍA et al.,
2009; WANG; WU; REINHARD, 2012; YUMOTO et al., 2006), 5 (RODAL et al., 1999; AURIAC; WILLEMETZ;
CANONNE-HERGAUX, 2010), 6(AURIAC; WILLEMETZ; CANONNE-HERGAUX, 2010; SCHNITZER et al.,
1994), 7 (MACIA et al., 2006; MARINA-GARCÍA et al., 2009), 8(EGGER et al., 2013).
A inibição das vias de endocitose utilizadas neste trabalho foram baseadas de acordo com publicações referentes a este efeito em macrófagos (vide referências Tabela 1). Além disso, também utilizamos como inibidor de endocitose a incubação de macrófagos peritoneais em temperatura de 10 °C, pois reduz a produção de ATP a níveis basais, que impossibilita a formação deste evento dependente de energia.
24 3.10 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Os macrófagos peritoneais foram plaqueados em placas de 12 poços contendo lamínula de 18 mm na densidade celular de 6,0 105 células/poço de acordo com o item 3.1. Após as células serem submetidas ao tratamento com as AgNP biossintéticas e saponina 0,25% (controle positivo) por 1, 3 e 6 horas, os macrófagos foram lavados duas vezes com PBS e fixadas com glutaraldeído 2.5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M e CaCl2 3 mM por 5 minutos no banho de gelo. Após a fixação, as células foram lavadas em tampão cacodilato 0.1 M pH 7,2 e CaCl2 3 mM por 2 minuto no gelo, e pós-fixadas com ósmio 1% em tampão cacodilato 0,1M e CaCl2 3mM e 0,8% de ferrocianeto de potássio por 30 minutos no banho de gelo. Em seguida, foram realizadas as desidratações seriadas das amostras em gradiente crescente de etanol (20%, 50%, 70%, 80%, 90% e 2 vezes 100%). Em seguida, as amostras foram embebidas em resina Epon e etanol 1:1 à temperatura ambiente por 30 min sob agitação e depois 4 a 5 trocas completas (1 hora cada, sendo uma delas overnight, pelo menos) de resina Epon pura à temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram polimerizadas à 60 ºC em estufa controlada por 60-72 horas. Os cortes ultrafinos foram obtidos em um ultramicrótomo e coletados em grades de cobre com 200 mesh, as amostras foram contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo e as imagens foram obtidas em microscópio eletrônico de transmissão JEOL JM 1400 pertencente ao Instituto de Biologia da UNICAMP.
3.11 Avaliação da expressão de citocinas inflamatórias.
Os macrófagos peritoneais foram extraídos de acordo com o item 3.1, entretanto, 24 horas que precedem a extração das células, as AgNP foram administradas por via intraperitoneal em camundongos C57BL/6 para avaliação da resposta imune inata, na qual as concentrações de AgNP
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foram relativamente estimadas a partir dos resultados obtidos pelos ensaios de citotoxicidade por MTT. Sendo assim, após a extração, os macrófagos peritoneais foram colocados em tampão de lise do kit RNAeasy (Qiagen, USA) adicionado de 1% de β-mercaptoetanol, para a extração do mRNA. O mRNA extraído de todas as amostras foi convertido a cDNA usando-se o kit de conversão High Capacity cDNA (APPLIED BIOSYSTEMS), de acordo com as instruções do fabricante. Os cDNAs foram colocados junto a conjuntos de primers e sonda marcada com FAM- MGB (IL-6, IL-12, IL-10, TNFα) SYBR Green (APPLIED BIOSYSTEMS). Foram utilizados como house keeping GAPDH (IL-12, IL-6, TNFα) e B2M (IL-10). As análises foram feitas usando Real-time PCR system 7500 fast (APPLIED BIOSYSTEMS). Os ciclos e as temperaturas, já determinadas pelo fabricante, são os seguintes: 2 minutos a 50ºC, 10 minutos a 95ºC, e 45 ciclos de 15 segundos a 95ºC/1 minuto a 60ºC.
3.12 Forma de análise dos resultados
Os resultados apresentados foram analisados pelo software Graphpad Prism 6.0 (GraphPad Softwares, EUA), cujos resultados foram expressos como média ± desvio padrão da média de três experimentos independentes realizados em triplicata. A análise estatística foi realizada utilizando um nível de significância foi de 5% (P < 0,05) para o teste “t” de Student, para análises com dois grupos, ou ANOVA, para análises com três ou mais grupos, seguida do pós teste de Tukey.
26 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização físico-química das nanopartículas biossintéticas de prata
Para iniciarmos os nossos estudos ex vivo dos efeitos citotóxicos causados pelas AgNP biossintetizadas, avaliamos algumas características físico-químicas das nanopartículas para confirmar se suas propriedades estavam semelhantes com aquelas descritas em literatura (DURÁN et al., 2005, 2007; MARCATO; DURÁN, 2008). Durante este estudo foram utilizados 3 lotes de sínteses distintas que foram avaliados quanto a suas propriedades físico-químicas e efeito biológico, no qual, analisamos o raio hidrodinâmico, índice de polidispersão e potencial zeta das AgNP biossintéticas pela técnica de espalhamento de luz dinâmico e análise de rastreamento de nanopartículas (Tabela 2).
A técnica de espalhamento de luz (Tabela 2) demonstrou-se que as AgNP biossintéticas possuem um raio hidrodinâmico médio de 103,1 nm 3,7 e um PDI de 0,250 0,003, índice que mede a variação do tamanho da população de partículas (varia de 0, como suspensão totalmente homogênea, até 1 em suspensão totalmente heterogênea, ISO 13321:1996 e ISO 22412:200), resultado esse que garante as distribuições de faixa estreita de tamanho (baixa polidispersão). Além disso, o resultado da média do potencial Zeta de -29,1 mV ±0,9 mV sugere uma baixa tendência para agregação, pois em módulo, a presença de fortes cargas elétricas na superfície das partículas impedem a aglomeração de partículas devido diferença eletroestática. (HEBEISH et al., 2013), o que é de grande importância tanto para possíveis aplicações biológicas, quanto para prosseguir com os estudos dos efeitos citotóxicos causados por essas nanopartículas em macrófagos peritoneais. Os lotes testados apresentaram uma reprodutibilidade precisa, demonstrado pelo baixo desvio padrão inter-amostra, o que possibilitou o intercâmbio entre as amostras de AgNP biossintéticas. Além disso, os lotes eram validados quanto a sua atividade biológica, utilizando-se
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testes de MTT e comparando os valores de IC50. Em um outro ensaio complementar utilizamos a Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA), no qual obtivemos a média de partículas com tamanho de 97 34 nm e concentração de 4,88 x 108 partículas/mL. Este resultado nos confirma o raio hidrodinâmico obtido no primeiro ensaio, além de estimar a concentração de nanopartículas.
Tabela 2 - Características físico-químicas das nanopartículas biossintéticas de prata. Análise
do raio hidrodinâmico, polidispersão e potencial zeta pelo equipamento ZetaSizer (Malvern). Resultados apresentados em forma de média e desvio padrão de 3 experimentos independente. .
Lote 1 Lote 2 Lote 3 Média Desv. Pad.
Tamanho (nm) 107,6 98,6 103,2 103,1 3,7
PDI 0,250 0,254 0,246 0,250 0,003
Zeta (mV) -29,9 -29,5 -27,8 -29,1 0,9
4.2 Pureza de extração de macrófagos peritoneais
Para iniciar os ensaios ex vivo, avaliamos a pureza de extração de macrófagos peritoneais utilizando a marcação com o anticorpo monoclonal APC anti-mouse F4/80, que reconhece glicoproteínas da família EGF-TM7 presentes na membrana de macrófagos (AUSTYN; GORDON, 1981; MCKNIGHT et al., 1996; MCKNIGHT; GORDON, 1998). A análise por citometria de fluxo determinou que 98,5% das células extraídas eram positivas para a marcação do anticorpo, demonstrando que o método de extração foi significativamente seletivo para macrófagos (fig. 6).
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Figura 6 – Seletividade de extração de macrófagos peritoneais. As células extraídas do peritônio de camundongos da
linhagem C57BL/6 elicitadas com tioglicolato, marcadas com o anticorpo APC anti-mouse F4/80 e depois analisadas por citometria de fluxo (GATE: /FL4-H: MΦ APC). A avaliação das porcentagens das diferentes populações foi obtida pelo programa FlowJo V. 10 (Copyright FlowJo, LCC), no qual obteve-se 98,5% da população de macrófagos peritoneais. A Gráfico de granulosidade do Controle (SSC-H x FSC-H); B Histograma do controle (Número de eventos x FL4-H: MΦ APC); C Gráfico de granulosidade das células marcadas com anti-F4/80 (SSC-H x FSC-H); D Histograma das células marcadas com anti-F4/80 (Número de eventos x FL4-H: MΦ APC).
Os resultados obtidos a partir da técnica de citometria foram confirmados pela microscopia confocal, no qual os macrófagos peritoneais foram marcados com APC anti-mouse F4/80 e DAPI para marcação dos núcleos. A marcação em vermelho (fig. 7) demonstra a interação entre o anticorpo F4/80 e as glicoproteínas da família EGF-TM7 presentes na membrana de macrófagos, onde virtualmente não foram observados outros tipos celulares. Portanto, confirmamos através de duas metodologias que o processo é seletivo para extração de macrófagos peritoneais elicitados, a partir daí estabelecemos a utilização desse modelo celular para estudos ex vivo sobre a interação com as AgNP biossintéticas.
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Figura 7 – Marcação de glicoproteínas da família EGF-TM7 em macrófagos peritoneais elicitado. As lâminas para
a microscopia confocal foram preparadas utilizando lamínulas em placas de 12 poços onde 6,0 x 105 células foram
plaqueadas por poço, após 6 h o material foi fixado e, subsequentemente, marcado com anticorpo monoclonal anti-mouse F4/80 acoplado ao fluoróforo APC (vermelho) e DAPI (azul) (Barra de escala: 20 µm).
4.3 Determinação do IC50 em macrófagos peritoneais por MTT
Com a caracterização das AgNP biossintéticas e do modelo celular de macrófagos peritoneais elicitados, iniciamos a avaliação dos efeitos citotóxicos causados pelas AgNP biossintéticas, para isso utilizamos o ensaio de viabilidade por redução de MTT. Após a extração dos macrófagos peritoneais, as células foram incubadas por 24 h com crescentes concentrações de AgNP biossintéticas para a determinação da dose responsável pela redução em 50% da viabilidade celular (IC50). A regressão sigmoidal dos dados resultou em um alto coeficiente de determinação (R2 = 0,9935, Graphpad Prism 6.0), determinando a faixa de IC50 entre 23,65 µM – 26,81 µM de
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AgNP (fig. 8). A determinação do IC50 é uma ferramenta importante de citotoxicidade aguda, pois nos permite trabalhar com uma concentração inicial para seguir com os demais experimentos em macrófagos peritoneais, desta forma, fixamos a concentração de 25 µM de AgNP para representar o valor de IC50.
Figura 8 – Determinação do IC50 em macrófagos peritoneais. As células foram tratadas com concentrações
crescentes de AgNP (0 – 100 μM) por um período de 24 h e a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. A viabilidade de células não tratadas foi considerada como 100%. Cada valor representa a média ± S.D. de três experimentos independentes (n = 4).
4.4 Viabilidade em função da variação do tempo
Após determinarmos o valor de IC50 pelo período de 24 h, avaliamos o perfil de citotoxicidade das AgNP biossintéticas em menores intervalos de tempo. A citotoxicidade de AgNP biossintéticas em tempos menores (fig. 9) mostrou que nos tratamentos de 30 min e 1, 2 e 4 h não foram observados efeitos citotóxicos para todas as concentrações testadas (10, 25 e 50 μM). Contudo, após 6 h de tratamento, o perfil de citotoxicidade é bastante similar àquele observado após 24 h de tratamento. Outra observação é que, mesmo com a utilização de uma concentração superior de AgNP (50 μM) em 4 h de tratamento, não foi obtido o mesmo perfil de
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citotoxicidade em 6 h e 24 h de incubação na concentração de 25 μM de AgNP. Portanto, demonstrando que a citotoxicidade das AgNP é dose dependende (fig. 8) e tempo dependente (fig.9) nas condições testadas de incubação e de tipo celular. Desta forma, decidimos realizar as análises subsequentes em tempos de até 6 h, pois acreditamos que ensaios dentro desse intervalo de tempo são fundamentais para a determinação de detalhes moleculares da interação entre AgNP biossintetizadas e macrófagos peritoneais. Somado a isso, como não observamos alteração na viabilidade após 6 h, provavelmente o macrófago inicia um processo de recuperação ao tratamento. Portanto, análises em 24 h ou tempos maiores trariam detalhes sobre o processo de recuperação e não sobre os efeitos citotóxicos das nanopartículas.
Figura 9 – Citotoxicidade das AgNP em macrófagos peritoneais em função do tempo. As células foram tratadas com
10, 25 e 50 M de AgNP durante 30 min, 1 h, 2h, 4h, 6h e 24 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. A viabilidade de células não tratadas foi considerada como 100%. Cada valor representa a média ± S.D. de três experiências independentes (n = 4). Foram encontradas diferenças significativas entre os valores de IC50 para 30 min, 1, 2 e 4 h quando comparado com 24 h, somente o tratamento de 6 h não apresentou diferença estatística (p < 0,05). ANOVA seguida por teste de Tukey (24h vs 30 min, 1h, 2h,4h e 6h).
