ROSANA MARY SARTOR CHONE
AÇÃO DO 24-EPIBRASSINOLÍDEO NA EMBRIOGÊNESE
SOMÁTICA DIRETA DE Coffea arabica L.
CAMPINAS 2015
' UNIVERSIDADE ESTADUAL DE
CAMPINAS
“INSTITUTO DE
BIOLOGIA
ROSANA
MARY
SARTOR CHONE
“AÇÃO
DO ZA-EPIBRASSINOLÍDEO NA
EMBRIOGÊNESE
SOMATICA DIRETA DE
Cofea
arabiea
L.”
Dissertação apresentada ao Instituto de
A Biologia da Universidade Estadual de ' Campinascomopartedosrequisitosexigidos
para obtenção do título de Mestra em BiologiaVegetal.
Orientadora: CLAUDIA REGINABAPTISTAHADDAD
ESTEEXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃODEFENDIDA PELA A L U N A
R O S A N AM A R YSARTOR CHONE E O R I E N TA D APELA PROFA. DRA. C L A U D I AR E G I N A B A P T I S TA H A D D A D
É/Íâoão/M
CAMPINAS, 2015
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Chone, Rosana Mary Sartor,
C455a ChoAção do 24-epibrassinolídeo na embriogênese somática direta de Coffea
arabica L. / Rosana Mary Sartor Chone. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
ChoOrientador: Claudia Regina Baptista Haddad.
ChoDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Cho1. Brassinosteróides. 2. Cafeeiro. 3. Micropropagação. 4. Citocininas. I. Haddad, Claudia Regina Baptista,1956-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Action of 24-epibrassinolide in the direct somatic embryogenesis of Coffea arabica L. Palavras-chave em inglês: Brassinosteroids Coffee plant Micropropagation Cytokinin
Área de concentração: Biologia Vegetal Titulação: Mestra em Biologia Vegetal Banca examinadora:
Claudia Regina Baptista Haddad [Orientador] Marcelo Carnier Dornelas
Paulo Hercílio Viegas Rodrigues
Data de defesa: 10-02-2015
Programa de Pós-Graduação: Biologia Vegetal
Campinas, 10defevereirode2015
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra.ClaudiaReginaBaptista Haddad (orientadora)
Prof. Dr.PauloHercílioViegasRodrigues
Prof.Dr.MarceloCarnierDornelas
Dra.JulietaAndréa
Silva
De AlmeidaProf. Dr. Marcos'Jose'Salvador
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“ m a t a m “ “màssdiatura .V i Ass1natura Assinatura AssinaturaRESUMO
O cultivo do cafeeiro é de grande importância econômica mundial. O consumo crescente de café arábica tem levado os pesquisadores a buscar variedades que produzam bebidas de melhor qualidade e com baixos teores de cafeína. Os programas de melhoramento genético concentram esforços na busca destas características com destaque para cultivares da espécie Coffea arabica, a mais cultivada no mundo. A embriogênese somática é importante para manter características selecionadas em programas de melhoramento genético e produzir os indivíduos selecionados em grande escala, além de contribuir para estudos fisiológicos e moleculares. A embriogênese somática direta apresenta vantagens pela redução de insumos e mão de obra, devido à eliminação da fase calogênica, porém, apresenta baixa eficiência, quando comparada com a via indireta, para a espécie C. arabica. Apesar da importância da embriogênese somática direta, nada se sabe sobre os fatores que controlam a sua ocorrência em genótipos de C. arabica e tampouco há estudos com utilização de brassinosteróides na fase de indução desse tipo de embriogênese in vitro. O brassinosteróide, 24-epibrassinolídeo, foi utilizado isoladamente e em conjunto com uma citocinina, N6-(2-isopentenyl) adenina
(2-iP), para avaliar seus efeitos sobre a embriogênese somática direta e verificar possíveis alterações endógenas no metabolismo desses hormônios durante a indução da embriogênese em explantes foliares da cultivar Mundo Novo de Coffea
arabica. Os explantes foram cultivados em meio de cultura MS modificado,
adicionado de 2-iP a 10 µM, acrescido ou não de 24-epibrassinolídeo. Foram utilizadas as seguintes concentrações do brassinosteróide: 0,01 µM, 0,10 µM e 1 µM, em dois experimentos realizados em diferentes épocas do ano. Análises de
microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura foram realizadas para compreensão dos eventos anatômicos e morfológicos da via de embriogênese relacionada às diferentes combinações hormonais praticadas. Avaliações de variáveis qualitativas e quantitativas dos explantes foliares dos dois experimentos foram realizadas in vitro durante 130 e 240 dias. Na tentativa de compreender melhor a participação dos brassinosteróides na via de embriogênese somática, explantes foliares induzidos apenas com a citocinina, 2-iP, foram submetidos a análises de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Os embriões somáticos obtidos tanto no tratamento com uso exclusivo de citocinina, como no tratamento com citocinina associada ao 24-epibrassinolídeo foram cultivados em meio de cultura para germinação e desenvolveram-se em plântulas. A aplicação do brassinosteróide levou à iniciação do processo de embriogênese somática direta, promovendo a formação de estruturas embriogênicas. Sua aplicação conjunta com citocinina aumentou o número de embriões, o número de explantes com embriões, levou à formação de embriões em condição na qual apenas a aplicação de citocinina foi insuficiente e acelerou a via embriogênica. Promoveu o desenvolvimento de embriões mais bem definidos, com características meristemáticas típicas. O aumento de picos na região do espectro de RMN, característico de moléculas esteroidais, coincidente com o período em que ocorre a embriogênese somática direta, pode ser indicativo da participação de brassinosteróides endógenos durante esse processo. Este trabalho abre perspectivas para a utilização de brassinosteróides em embriogênese somática direta em processos produtivos de C. arabica.
ABSTRACT
Coffee cultivation is of worldwide economic importance. The increasing consumption of coffee has led to search for varieties that produce better quality beverages with lower caffeine contents. Genetic improvement have concentrated their efforts on the search for these characteristics with emphasis on cultivars of the species Coffea arabica, the most cultivated in the world. Somatic embryogenesis is important to maintain selected characteristics in genetic improvement and produce selected individuals on a large scale, as well as contributing to physiological and molecular studies. Direct somatic embryogenesis shows the advantages of reduced consumables and less manual labor, due to elimination of the callus phase, but is inefficient with the species C. arabica when compared with the indirect pathway. Despite the importance of direct somatic embryogenesis, nothing is known about factors controlling its occurrence in C. arabica genotypes, nor are there any studies on use of brassinosteroids in the in vitro induction of this type of embryogenesis. The brassinosteroid 24-epibrassinolide was used alone and together with cytokinin N6 -(2-isopentenyl) adenine (2-iP) to evaluate its effects on direct somatic embryogenesis and verify endogenous alterations in metabolism of these hormones during induction of embryogenesis in foliar explants of cultivar Mundo Novo of species Coffea Arabica. The explants were cultivated in modified MS culture medium with the addition of 10 µM 2-iP, with or without 24-epibrassinolide. The following concentrations of brassinosteroid were used: 0.01 µM, 0.10 µM and 1 µM, in two experiments carried out at different times of the year. Light microscopy and scanning electronic microscopy analyses were carried out in order to understand anatomic and morphologic events of embryogenic pathway as related to different hormone
combinations applied. The qualitative and quantitative variables of the foliar explants were evaluated in the two experiments at points in time from 130 and 240 days. In an attempt to better understand the participation of the brassinosteroids in the somatic embryogenesis pathway, foliar explants induced only by the cytokinin 2-iP were submitted to nuclear magnetic resonance (RMN) analyses. The somatic embryos obtained both using the treatment with the exclusive use of cytokinin and in treatment with cytokinin associated with 24-epibrassinolide were cultivated in a culture medium for germination and developed into plant embryos. The application of brassinosteroid led to initiation of direct somatic embryogenesis process, promoting the formation of embryogenic structures. Its application together with cytokinin increased number of embryos, the number of explants with embryos, led to formation of embryos in a condition in which only application of cytokinin was insufficient and accelerated embryogenic pathway. It also promoted development of much better defined embryos with typically meristematic characteristics. The increase in peaks in the region of the RMN spectrum, characteristic of steroidal molecules, coinciding with the period in which direct somatic embryogenesis occurred, could be an indication of participation of endogenous brassinosteroids during the process. This work widens the perspectives for the use of brassinosteroids in direct somatic embryogenesis for productive processes with C. arabica.
SUMÁRIO BANCA EXAMINADORA...v RESUMO...vii ABSTRACT...ix SUMÁRIO...xi DEDICATÓRIA...xiii AGRADECIMENTOS...xv 1. INTRODUÇÃO...1 2. OBJETIVOS...12 2.1 Objetivo Geral...12 2.2 Objetivos Específicos...12 3. MATERIAL E MÉTODOS...13
3.1 Indução da embriogênese somática direta...13
3.1.1 Avaliação de variáveis da embriogênese somática direta...18
3.2 Preparação das amostras para análises microscópicas...19
3.2.1 Microscopia de Luz...20
3.2.2 Microscopia eletrônica de varredura...21
3.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)...22
3.4 Análise estatística...23
3.5 Desenvolvimento das plântulas in vitro...25
4. RESULTADOS...26
4.1 Embriogênese somática direta (experimento 1)...26
4.2 Embriogênese somática direta (experimento 2)...38
4.3 Microscopia de luz...49
4.4 Microscopia eletrônica de varredura...52
4.5 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)...56
4.6 Desenvolvimento das plântulas in vitro...61
5. DISCUSSÃO...63
DEDICATÓRIA
A Deus.
Ao meu esposo, Carlos Takahiro Chone. Aos meus pais, Adhemar e Lázara.
Aos meus filhos, Lucas, Rebecca, Laissa e Gabriel. Aos meus irmãos, Leni, Elizabeti, Marinalva e Alan.
“Ó Senhor, Deus dos Exércitos, quem é semelhante a ti?
És poderoso, Senhor, envolto em tua fidelidade.
Os céus são teus, e tua também é a terra; fundaste o mundo e tudo o que nele existe. Tu criaste o Norte e o Sul; o Tabor e o Hermom cantam de alegria pelo teu nome. O teu braço é poderoso; a tua mão é forte, exaltada é tua mão direita.
A retidão e a justiça são os alicerces do teu trono; o amor e a fidelidade vão à tua frente. Como é feliz o povo que aprendeu a aclamar-te, Senhor, e que anda na luz da tua presença!”
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual de Campinas pela oportunidade de realização do curso de mestrado em Biologia Vegetal.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pela concessão da bolsa de estudos.
À Profa. Dra. Claudia R.B. Haddad pela orientação, pelos inestimáveis ensinamentos, pela dedicação, profissionalismo, paciência e amizade. Acima de tudo por ter confiado em uma aluna e mãe de quatro filhos.
À Dra. Julieta Andrea Silva Almeida pela co-orientação, pelos inestimáveis ensinamentos, pela dedicação, confiança, profissionalismo e amizade. Sem a sua parceria este trabalho não seria realizado.
Ao Instituto Agronômico de Campinas e Centro de Análise e Pesquisa Tecnológica do Agronegócio do Café ‘Alcides Carvalho’ pela concessão da cultivar objeto do estudo.
À Profa. Dra. Hildete Prisco Pinheiro, Departamento de Estatística, do Instituto de Matemática, Estatística e Ciência da Computação da Unicamp, pela orientação com as análises estatísticas.
Ao CNPEM (Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais) e ao LNBio (Laboratório Nacional de Biociências) pelo acesso ao Laboratório de RMN.
À Dra. Ana Carolina de Mattos Zeri pela orientação nos estudos relacionados à RMN. Ao Dr. Giulio Cesare Stancato do Instituto Agronômico de Campinas, Centro de
Horticultura, pelo apoio e acesso ao laboratório de micropropagação.
Aos Professores que fizeram parte da pré-banca, Ladaslav Sodek, Marcelo Carnier Dornelas e Marcos José Salvador, pelas críticas e sugestões.
Aos Professores da banca de defesa, Claudia Regina Baptista Haddad, Paulo Hercílio Viegas Rodrigues, Marcelo Carnier Dornelas, Julieta Andréa Silva de Almeida e Marcos José Salvador.
Ao Prof. Dr. Lee Tseng Sheng Gerald pelos inestimáveis ensinamentos em Cultura de Tecidos Vegetais, pessoa que influenciou minha decisão em seguir esta carreira e que por motivos de força maior não pode estar presente na banca examinadora.
Ao Prof. Dr. Marcelo Carnier Dornelas pelo acesso ao Laboratório de Microscopia do Departamento de Biologia Vegetal - Fisiologia Vegetal.
Ao Prof. Dr. Fernando Martins pelo seu empenho e dedicação ao ensino de Biologia, ética e valores que deixarão marcas em nossa geração.
Aos demais professores do curso de Pós-graduação em Biologia Vegetal pelos ensinamentos.
Aos colegas Diego Ismael Rocha e Carolina Cassano Monte Bello pela ajuda com as análises de microscopia.
À amiga Lucila Helena Allan Leskow pela ajuda com as análises estatísticas. À amiga Carla Vaccari Vilalba Ferreira e seus filhos João Pedro e Morgana.
Aos colegas e funcionários do Departamento de Biologia Vegetal que colaboraram para realização deste trabalho.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para realização deste trabalho.
1. INTRODUÇÃO
O café é um dos produtos primários mais valiosos comercializados no mundo. É o segundo maior gerador de divisas, perdendo apenas para o mercado do petróleo (Mendes et al., 2002). Seu cultivo, processamento, comercialização e transporte proporcionam cerca de 26 milhões de empregos entre os 52 países produtores de café. É fundamental para a economia de países como Guatemala, Nicarágua, Uganda, Honduras, Ruanda, Etiopia e Burundi, cuja exportação de café representa entre 12 a 59%, respectivamente, de sua economia, segundo dados da Organização International do Café (ICO, 2013).
O Brasil é o maior produtor mundial, maior exportador mundial e o segundo maior consumidor mundial de café (Mendes et al., 2002). A safra de 2013, de acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), foi de 49,15 milhões de sacas de 60 kg de café beneficiado, dos quais 38,29 milhões da espécie
Coffea arabica e 10,86 milhões da espécie Coffea canephora. A área plantada
no país é de 2,311 milhões de hectares e 5,67 bilhões de pés de café, segundo informações do Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA, 2014). Exportamos 32,01 milhões de sacas em 2013, com faturamento de US 5,27 bilhões, o que representa aproximadamente 28% das exportações mundiais de café, conforme dados da Associação Brasileira da Indústria do Café (ABIC, 2013). A cadeia produtiva dessa cultura é a principal geradora de postos de trabalho na agropecuária nacional, o que corresponde a mais de oito milhões de empregos no país.
O Brasil tem condições climáticas que favorecem o cultivo do cafeeiro em 15 regiões produtoras. Diante de diversos climas, altitudes e tipos de solo, os produtores brasileiros obtêm variados padrões de qualidades e aromas, entre as duas espécies
cultivadas (C. arabica e C. canephora) (MAPA, 2014).
O cafeeiro pertence à Família Rubiaceae e o gênero Coffea conta com mais de 100 espécies conhecidas (Perosa e Abreu, 2009). Coffea arabica L. é a espécie mais plantada em todo o mundo (Mendes et al., 2002). No Brasil esta espécie é cultivada em todas as regiões produtoras e oferece bebida de excelente qualidade, além de apresentar baixo teor de cafeína (Nishijima et al., 2012). O café robusta ou conilon (C. canephora) é usado para a fabricação de cafés solúveis e apresenta um sabor único, menos acidez e maior teor de cafeína. Predomina nas lavouras do Espírito Santo, em Rondônia e em parte da Bahia e de Minas Gerais (MAPA, 2014).
Nos países onde o café assume importância econômica, instituições de pesquisa têm concentrado esforços nos programas de melhoramento genético das espécies mais cultivadas. O Brasil é o país que soma maior número de contribuições ao melhoramento genético do cafeeiro, visando aumento da produção, desenvolvimento de resistência a pragas e doenças e tolerância à seca e à baixa fertilidade do solo (Mendes et al., 2002).
O melhoramento genético do cafeeiro demanda muito tempo e a obtenção de uma nova cultivar por melhoramento genético pode demorar até 30 anos (Carneiro, 1997), o que explica a tendência atual para o cultivo comercial de híbridos especiais de C. arabica, com genótipos intermediários, pois o uso destes híbridos intermediários leva à economia de tempo. Entretanto, a multiplicação de híbridos pelo método tradicional, via sementes, não é adequada, já que as plantas provenientes da germinação perdem as características diferenciadas do híbrido, devido à segregação genética. Dessa forma, os híbridos de C. arabica devem ser multiplicados pela via vegetativa, o que assegura a estabilidade genética. Apesar da
cultivar Mundo Novo, objeto desse estudo, não ser um híbrido, os resultados alcançados certamente abrirão possibilidade da sua aplicação também em híbridos de C. arabica.
A propagação de plantas in vitro tem contribuído para a compreensão da fisiologia e do desenvolvimento vegetal. Haberlandt em 1902, influenciado pela teoria celular da totipotência de Schleiden, 1838 e Schwann, 1839 (apud Vasil, 2008), foi o primeiro a cultivar células de tecidos somáticos de várias espécies de plantas em solução nutritiva. Apesar da falta de sucesso em suas culturas, provavelmente atribuída à falta de fornecimento de fitormônios (substâncias até então desconhecidas pela ciência) entre outros fatores nutricionais, trouxe uma contribuição visionária (Haberlandt, 1902 apud Krikorian e Berquam, 1969). Em 1904, Hannig cultivou embriões imaturos in vitro e observou a necessidade de suplementação do meio de cultivo com sacarose, e também demonstrou o efeito de diferentes fontes de nitrogênio sobre a morfologia dos embriões (Torres et al., 1998). Knudson (1922) cultivou embriões de orquídeas na ausência de micorrizas e comprovou a importância da sacarose no meio nutritivo. Em 1934, White elaborou um meio líquido capaz de manter o crescimento de ápices radiculares por um período ilimitado. Após 1934, com a descoberta da auxina, a cultura de tecidos começou a evoluir ainda mais e em 1939 Gautheret e Nobécourt ( apud Torres et al., 1998) estabeleceram cultura de calo de cenoura. Van Overbeek et al., 1941, 1942, (apud Torres et al., 1998), determinaram as exigências nutricionais para o cultivo de embriões nos diferentes estádios de desenvolvimento. A descoberta da citocinina na década de 1950, também agregou grande contribuição à cultura de tecidos e ao estudo da fisiologia do crescimento e desenvolvimento de plantas (Torres et al.,
1998). Morel e Martin (1952), recuperaram plantas de dália, livres de vírus do mosaico, por meio da cultura de ápices caulinares. Murashige e Skoog (1962) elaboraram o meio MS, o mais utilizado até o dia de hoje.
A cultura de tecidos vegetais, desde então, foi usada na tentativa de entender melhor a fisiologia das plantas, de reproduzir espécies naturalmente difíceis, espécies infectadas por viroses, de compreender as necessidades nutricionais dos vegetais, entre outras razões. A propagação in vitro tem agregado resultados fundamentais para compreensão dos efeitos dos hormônios vegetais e possibilita a manipulação de plantas, células, órgãos e embriões para os mais diversos objetivos.
A micropropagação também permite a multiplicação vegetativa de diferentes espécies em condição de laboratório (Gaj, 2004), com grande importância e aplicabilidade no agronegócio, tanto que nos dias atuais, empresas de grande porte deste segmento estabeleceram-se no Brasil para micropropagar em escala maciça diferentes culturas vegetais como as de banana, orquídeas, bromélias, eucaliptos, cana de açúcar, pinus, café, batata, diversos tipos de plantas ornamentais, etc. O agronegócio é parte importante da economia brasileira. A micropropagação também tem relevante importância na preservação de espécies, tanto pela multiplicação in
vitro de espécies ameaçadas, quanto pela preservação de espécies nativas, através
de programas específicos, mantidos por instituições de pesquisa.
A embriogênese somática, um dos tipos de propagação, é o processo pelo qual células somáticas desenvolvem-se em diferentes estádios embriogênicos, o que resulta na formação do embrião somático, sem que ocorra a fusão de gametas (von Arnold et al., 2002). O desenvolvimento do embrião somático é semelhante ao do
embrião zigótico, e apresenta os estádios: globular, codiforme, torpedo e cotiledonar (Zimmerman, 1993).
A embriogênese somática destaca-se entre as técnicas de cultura de tecidos, pois representa um eficiente método para regeneração de plantas elite in vitro, em larga escala, além de ser uma ferramenta em estudos básicos relacionados com a fisiologia do desenvolvimento do embrião e estudos moleculares (Guerra et al., 1999; Fehér et al., 2003).
A embriogênese somática pode ocorrer pela via indireta ou direta, e possibilita a formação de plantas com homogeneidade genética, em espaço reduzido, em menor tempo e em larga escala (Altman e Loberant, 1998; Vieira e Kobayashi, 2000; Kumar et al., 2006; Almeida et al., 2008). Na via indireta o processo inicia-se com a formação de massas calogênicas obtidas através da re-determinação de células somáticas de explantes vegetais (tecidos vegetais), enquanto que na embriogênese somática direta a indução de células embriogênicas ocorre sem passar pela fase de calogênese (Willians e Maheswaran, 1986).
A via de embriogênese indireta foi primeiramente relatada para C. arabica por Söndahl e Sharp (1977). Em Coffea a embriogênese somática pode ocorrer pelas duas vias, contudo como a via direta possibilita eliminação da fase calogênica há maior economia de insumos e mão de obra, quando comparada à via indireta (Altman e Loberant, 1998; Vieira e Kobayashi, 2000; Kumar et al., 2006; Almeida et al., 2008).
Assim como em outras espécies, na embriogênese somática direta de C.
arabica, os embriões somáticos iniciam-se diretamente de células da borda do
embriogênico, sem a necessidade da fase do calo (Dublin, 1981; Sharp et al., 1982; Williams e Maheswaran, 1986; Emons, 1994; Gaj, 2004; Motoike et al., 2007).
Nesses locais observa-se a formação de “estruturas embriogênicas”, que correspondem a formas arredondadas, com tamanho reduzido (cerca de 1 a 2 mm), com coloração hialina no início da formação e que se tornam oxidadas com o passar do tempo. A partir de células dessas estruturas embriogênicas ocorre a formação dos embriões somáticos (J.A.S. Almeida, comunicação pessoal). Portanto, células diferenciadas do explante passam pela indução, em seguida dividem-se intensamente dando origem aos embriões somáticos (Fehér et al. 2003; Jiménez, 2005), estruturas bipolares e sem conexão vascular com o tecido original (Carman, 1990; Dodeman et al., 1997; Quiroz-Figueroa et al., 2006; Almeida et al., 2008).
Em C. arabica a obtenção de embriões somáticos pela via direta é viabilizada principalmente, pela presença de citocininas no meio de cultura (Ramos et al., 1993; Santos-Briones e Hernández-Sotomayor, 2006, Almeida et al., 2007). Em estudos pioneiros, com explantes foliares de Coffea, foram obtidos embriões pela via direta, em resposta ao 6BA, um dos tipos de citocinina (Dublin, 1981; Yasuda et al., 1985). Contudo, a ação das citocininas na via direta ainda é pouco explorada para C.
arabica, como se verifica em alguns estudos recentes (Molina et al., 2002; Ayub e
Gebieluca, 2003; Cid et al., 2004; Almeida e Silvarolla, 2009; Vasconcellos et al., 2009; Santos et al., 2010).
A aquisição de competência celular para o desenvolvimento da embriogênese somática pode ser afetada por diversos fatores: estádio fisiológico do explante (“condição na qual as células responsivas do explante conteriam um grande número de receptores para aqueles reguladores de crescimento presentes no meio de
cultura”), composição do meio nutritivo (sais minerais, carboidratos, reguladores de crescimento, concentração do agente gelificante, pH, etc.), concentração osmótica do meio nutritivo, temperatura e luz (Guerra et al., 1999). Alguns genótipos apresentam maior capacidade de embriogênese somática do que outros. A utilização de explantes jovens ou mesmo regenerados de tecidos embrionários, aumenta a capacidade de embriogênese somática (Ramos et al., 1993; von Arnold et al., 2002).
Embora a embriogênese somática direta seja mais vantajosa, os explantes de genótipos de C. arabica, submetidos a essa via, normalmente apresentam baixa eficiência quanto ao número de embriões formados e o processo demanda longo período de tempo in vitro, (J.A.S. Almeida, comunicação pessoal). Apesar da importância dessa via, nada se sabe sobre os fatores que controlam a sua ocorrência em genótipos de C. arabica e nem tampouco há estudos com utilização de brassinosteróides na fase de indução da embriogênese somática direta in vitro.
Os brassinosteróides são hormônios esteroidais vegetais de importância fundamental em ampla variedade de fenômenos do desenvolvimento vegetal. Participam de diferentes eventos do desenvolvimento das plantas: divisão celular, alongamento celular, regulação da fotomorfogênese, desenvolvimento reprodutivo, senescência foliar, indução da biossíntese de etileno, síntese de ácido nucléico e proteínas, regulação da assimilação e alocação de carboidratos, ativação da fotossíntese e resposta a estresses bióticos e abióticos (Clouse e Sasse, 1998; Szekeres e Koncz, 1998; Yamamoto et al., 2001; Zullo e Adam, 2002; Hu et al. 2006; Hartwig et al., 2011). Como a condição de cultivo in vitro pode representar estresse para o material manipulado, devido aos diversos fatores como baixa intensidade de luz, elevada umidade relativa, ferimentos decorrentes da manipulação que favorecem
a oxidação fenólica e acumulo de etileno, hiper-hidricidade, entre outros, é possível que a aplicação de brassinosteróides na micropropagação possa contribuir para a redução dessa condição de estresse.
Encontrados naturalmente em baixas concentrações, os brassinosteróides estão amplamente distribuídos no reino vegetal. Podem ser detectados em diferentes órgãos das plantas como em grãos de pólen, anteras, sementes, caule, folhas, raízes e flores. Tecidos jovens apresentam teores mais elevados de brassinosteróides quando comparados a tecidos maduros. Desde a descoberta desses hormônios em 1979, diferentes brassinosteróides foram isolados dentre 64 espécies vegetais incluindo 53 angiospermas, seis gimnospermas, uma pteridófita, uma briófita e três algas. (Fujioka, 1999; Bajguz e Tretyn, 2003).
Desde o isolamento do primeiro brassinosteróide (Brassinolide), vários outros brassinosteróides foram isolados de diferentes fontes vegetais, identificados e classificados em mais de 60 tipos de acordo com suas estruturas químicas (Bajguz e Tretyn, 2003). Brassinosteróides análogos são moléculas que apresentam alguma similaridade estrutural e ou de atividade similar com brassinosteróides naturais (Zullo e Adam, 2002).
Quanto ao papel desses hormônios na organogênese, embora a aplicação de brassinolídeo (um tipo de brassinosteróide) em concentração baixa (10-10 M) não tenha induzido a formação de caules em discos de folhas de tabaco e, sob concentrações altas, o hormônio tenha inibido a formação desses órgãos, na presença de citocinina (Kim et al., 2008), em revisão recente sobre o papel de hormônios na regulação do meristema apical caulinar foi sugerido que os brassinosteróides desempenham um papel no ajuste e coordenação da organogênese do meristema apical (Veit, 2009).
Já que a divisão e o alongamento celular são eventos associados à ocorrência da embriogênese somática, é bastante provável que os brassinosteróides também participem do controle da indução, iniciação ou desenvolvimento do embrião somático a partir de explantes vegetais. Em estudo sobre embriogênese somática indireta em hipocótilos de algodoeiro, foi verificado que aplicação de brassinolídeo estimulou o amadurecimento dos embriões (Aydin et al., 2006) e aplicação de análogos espirostânicos de brassinosteróides aumentou a formação de calos e regeneração de caules a partir de cotilédones de alface (Núňez et al., 2004). Aplicação de homobrassinolídeo também estimulou a formação inicial de calos, de calos embriogênicos e de embriões somáticos em explantes de plúmulas de coqueiro (Azpeitia et al., 2003). Em estudos sobre embriogênese somática indireta com o gênero Coffea, foi verificado que aplicação de MH5, um análogo de brassinosteróide,
levou a aumentos nas massas secas e frescas de calos em folhas de C. canephora, (Garcia, 2000) e aplicação de 24-epibrassinolídeo, um brassinosteróide, aumentou muito o crescimento de calos de C. stenophylla (Zullo e Adam, 2002). Análogos de brassinosteróides (BB-6 e MH-5) quando combinados com auxina (IAA) e citocinina (Cinetina) favoreceram a regeneração de brotações in vitro, em Ipomoea batatas L. (González et al., 2003). Brassinolideo em associação com citocininas aumentou significativamente a formação de brotações adventícias em culturas de Brassica
oleraceae (Sasaki, 2002) e ainda em estudos de embriogênese somática em pinheiro
houve estimulação de embriogênese somática em três genótipos de Pinus
wallichiana (Malabadi e Nataraja, 2007) e em cinco genótipos de Pinus caribea
(Malabadi et al., 2010). Contudo, nada se conhece sobre o papel desses hormônios na embriogênese somática direta de C. arabica.
Possíveis alterações no metabolismo de brassinosteróides durante a embriogênese somática direta em explantes foliares de C. arabica podem ser caracterizadas pelo perfil metabólico (metabolômica) dos diversos intermediários que compõem sua rota de síntese. Brassinosteróides têm sido analisados por ressonância magnética nuclear (RMN) (Porzel et al., 1992; Drosihn et al., 2001; Baranovskii et al., 2007). A RMN visa identificar e quantificar os metabólitos presentes numa amostra biológica, num evento bioquímico selecionado, sob condições definidas (Bhalla e Narasimhan, 2005; Schripsema, 2009), possibilitando a identificação do conjunto de metabólitos existentes de interesse (Scarminio e Soares, 2002).
Neste estudo, a caracterização do perfil metabólico dos explantes submetidos à embriogênese somática direta através da RMN foi realizada na tentativa de trazer informações quanto ao envolvimento dos brassinosteróides endógenos no controle bioquímico desse processo, indicando, por exemplo, se há alteração no perfil desses hormônios no período de indução e expressão da embriogênese somática em explantes foliares do cafeeiro.
A caracterização das alterações celulares que ocorrem durante a embriogênese somática é essencial para a compreensão dos fatores envolvidos na aquisição de competência embriogênica e determinação das células e tecidos envolvidos. (Rocha et al., 2012). O estudo do desenvolvimento de sistemas de regeneração, sob aspecto citológico, pode contribuir para a otimização dos mesmos (Almeida et al., 2006). Diferentes culturas e sistemas de regeneração foram submetidos a estudos citológicos, demonstrando a importância destas análises (Rocha et al., 2002; Correia e Canhoto 2010; Moura et al., 2010; Almeida et al., 2012; Avilés-Viñas et al., 2013; Etienne et al., 2013 e Delporte et al., 2014). Em estudos
histológicos apresentados por Quiroz-Figueroa et al. (2002), foram demonstrados os diferentes estádios de formação dos embriões somáticos e a origem unicelular destes, tanto para embriogênese somática direta quanto para embriogênese somática indireta em C. arabica. As células embriogênicas, independentemente do padrão de regeneração, direto ou indireto, apresentam um conjunto de características citológicas comuns como: tamanho pequeno (100 – 200 µm), conteúdo citoplasmático denso, núcleos grandes com nucléolos proeminentes, vacúolos pequenos e presença de grãos de amido. Estudos histoquímicos dessas células sugerem intensa atividade metabólica e de síntese de RNA (Tisserat et al., 1979; Sharp et al., 1980; Vasil, 1982; Carvalho et al., 2013; Rocha et al., 2014).
2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos de brassinosteróide sobre a embriogênese somática direta e verificar possíveis alterações no metabolismo desses hormônios durante a indução da embriogênese em explantes foliares da cultivar Mundo Novo de Coffea arabica.
2.2 Objetivos Específicos
Investigar se aplicação de 24-epibrassinolídeo aumenta a eficiência da embriogênese somática direta em explantes foliares da cultivar Mundo Novo de C.
arabica e avaliar o efeito de diferentes concentrações desse brassinosteróide em
variáveis de indução de embriogênese e na formação dos embriões.
Avaliar alterações histológicas durante a embriogênese somática em explantes foliares de C. arabica através de análises de microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura.
Analisar por RMN, em explantes foliares, possíveis alterações em constituintes endógenos das vias de biossíntese de brassinosteróides, durante o período de indução de embriões somáticos, pela via direta.
3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Indução da embriogênese somática direta
Foram utilizadas folhas jovens de C. arabica, da cultivar Mundo Novo, IAC 376-4, coletadas até o terceiro par a partir do ápice, de ramos de plantas adultas cultivadas em condição de campo, no Germoplasma do Cafeeiro, Centro de Análise e Pesquisa Tecnológica do Agronegócio do Café ‘Alcides Carvalho’, do Instituto Agronômico de Campinas, São Paulo, Brasil. A desinfestação das folhas foi realizada em duas etapas, a primeira após a coleta e a segunda no dia seguinte. No primeiro dia as folhas foram lavadas com água e detergente neutro para a remoção de poeira e enxaguadas três vezes em água corrente. Em seguida as folhas foram submetidas à desinfestação com hipoclorito de sódio a 2%, por 25 minutos, seguida de tríplice enxágue em água destilada esterilizada em autoclave. No dia seguinte, o material foi desinfestado em fluxo laminar com dióxido de cloro a 0,147 %, durante 25 minutos (Chone et al., 2011). A partir dessas folhas foram obtidos os explantes retangulares (1,0 X 2,0 cm), com exclusão da nervura principal, das margens e das porções apical e basal (Figura 1). Dois explantes foliares foram inoculados por frasco de cultura (unidade experimental), com a face adaxial em contato com a superfície do meio de cultura. Foram utilizados frascos de vidro (100 mL) contendo 30 mL de meio de cultura. Os explantes foram mantidos em ausência de luz, sob 27+ 2 oC por 130 dias e 240 dias (Almeida et al., 2007).
O meio de cultura utilizado para indução da embriogênese somática direta foi o MS preparado com metade da concentração dos sais (Murashige e Skoog, 1962), modificado conforme Sondhal e Sharp (1977) acrescido de 20 g.L-1 de sacarose. As
concentrações de citocinina, N6-(2-isopentenyl) adenina (2-iP) utilizadas foram: 0 e 10 µM, conforme Almeida et al. (2007). O meio de cultura teve pH ajustado para 5,8,
foi gelificado com Phitagel a 2 gL-1 e autoclavado a 121 oC e 1,5 atm por 20 minutos. Também se utilizou um brassinosteróide, 24-epibrassinolídeo (Sigma-E1641) dissolvido em etanol absoluto (1mg mL-1) (Dalio et al., 2011) e em água destilada
estéril. A solução de 24-epibrassinolídeo foi esterilizada por filtração em membrana Millipore (0,2 µm) e adicionada ao meio de cultura previamente autoclavado e resfriado a 50 °C em fluxo laminar (Malabadi e Nataraja, 2007). Os tratamentos consistiram das seguintes concentrações de 24-epibrassinolídeo: 0 µM, 0,01 µM, 0,10 µM e 1 µM, com e sem adição de 2-iP.
Figura 1. Obtenção dos explantes retangulares (1,0 X 2,0 cm) a partir de folhas jovens de C.arabica, após exclusão da nervura principal, das margens e das porções apical e basal. (Barra = 1 cm).
A indução da embriogênese somática direta em C. arabica foi realizada em duas diferentes épocas do ano, a primeira em Dezembro de 2012 (experimento 1), primavera-verão, e a segunda em Abril de 2013 (experimento 2), outono-inverno. O número inicial de unidades experimentais por experimento foi de 35 frascos por tratamento. Foram realizados oito tratamentos em cada experimento, conforme tabela (1). Após sete dias da indução da embriogênese somática direta, foram eliminados os frascos com contaminação microbiológica (bactérias e fungos) e padronizado o número de frascos restantes por tratamento.
Tabela 1. Concentrações de 2-iP e 24-epibrassinolídeo (24-epiBr) usadas em tratamentos hormonais para indução da embriogênese somática direta em explantes foliares de Coffea arabica L., cultivar Mundo Novo, cultivados em meio MS modificado conforme Sondhal e Sharp (1977), a 27 +2 ºC, na ausência de luz.
Tratamento 2-iP (µM) 24-epiBr (µM)
1 0,00 0,00 2 0,00 0,01 3 0,00 0,10 4 0,00 1,00 5 10,00 0,00 6 10,00 0,01 7 10,00 0,10 8 10,00 1,00
3.1.1 Avaliação de variáveis da embriogênese somática direta
As avaliações foram realizadas in vitro e de forma não destrutiva. Utilizou-se uma luminária e lupa manual, com amplificação de 5 vezes, para as medições. No primeiro experimento, as avaliações foram realizadas após 30, 45, 60, 90 e 130 dias. No segundo experimento, as avaliações foram realizadas após 15, 30, 45, 60, 90, 130 e 240 dias. Os explantes de todos os tratamentos foram avaliados quanto à capacidade de embriogênese somática direta com relação às variáveis:
A. Porcentagem de explantes com formação de estrutura embriogênica B. Porcentagem de explantes que formaram embriões somáticos;
C. Número total de embriões somáticos formados por explante.
Também foram avaliadas seguintes variáveis, a fim de monitorar a viabilidade dos explantes e verificar se haveria alguma relação entre elas e o número de embriões formados:
D. Número de lados do explante com formação de estrutura embriogênica, para o qual se atribuiu notas de 0 a 4 (lados), a fim de se verificar se um maior número de lados com indução da embriogênese levaria à formação de um maior número de embriões;
E. Estimativa do tamanho da estrutura embriogênica, em mm;
F. Coloração dos explantes, classificados como: verde, amarelo ou oxidado; G. Coloração das estruturas embriogênicas, classificadas como: clara ou oxidada.
3.2 Preparação das amostras para análises microscópicas
Para caracterização anatômica, em microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura, do processo de embriogênese somática de C. arabica, explantes foliares, submetidos ao processo de indução da embriogênese somática direta foram cultivados no mesmo meio e nas mesmas condições descritos em Indução da embriogênese somática com três diferentes combinações de 2-iP / 24- epibrassinolídeo (a, b e c, abaixo). Amostras foram coletadas após 7, 30 e 90 dias de cultura. As amostras coletadas foram fixadas em solução tampão de fixação, paraformoldeído (4%), sendo:
a) 0,0 µM de 2-iP/ 1,0 µM de 24 epi-Br b) 10,0 µM de 2-iP/ 0,0 µM de 24 epi-Br c) 10,0 µM de 2-iP/ 1,0 µM de 24 epi-Br
3.2.1 Microscopia de luz
Para os estudos anatômicos, as amostras foliares fixadas aos 7, 30 e 90 dias após indução da embriogênese somática direta foram desidratadas em série de concentração crescente de etanol e incluídas em resina acrílica (Historesin, Leica Instruments, Alemanha). Secções transversais com 5 µm de espessura foram obtidas em micrótomo rotativo de avanço automático, montadas em lâminas de vidro e coradas com azul de toluidina (O’Brien e McCully, 1981) para caracterização estrutural. A captura de imagens foi realizada em microscópio de luz e fluorescência ZEISS, modelo AXIOVERT 35, com câmera digital (AxioCam HRc ZEISS) acoplada, no laboratório de microscopia, na área de Fisiologia Vegetal, do Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, UNICAMP.
3.2.2 Microscopia eletrônica de varredura
As amostras fixadas aos 7, 30 e 90 dias após indução da embriogênese somática direta foram desidratadas em série de concentração crescente de etanol, secas ao ponto crítico (CPD030, Balzers, Alemanha) e metalizadas com ouro (SCD050, Balzers, Alemanha). As análises foram realizadas em microscópio eletrônico de varredura, modelo JSM 5800LV, fabricação JEOL, E.U.A., com utilização de software de captura de imagem ARC58 do Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia – UNICAMP.
3.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
A fim de se verificar se haveria alteração endógena de brassinosteróides nos explantes durante a formação dos embriões somáticos, foi feita a determinação desses hormônios por RMN 1H, no Laboratório Nacional de Biociências - LNBio, em Campinas, conforme Vázquez e Rodríguez (2000) com modificações. Explantes foliares foram cultivados em meio para embriogênese somática direta com uso exclusivo da citocinina 2-iP a 10 µM e coletados aos 0, 7, 15, 30, 60 e 90 dias, congelados em nitrogênio líquido e armazenados em Freezer – 80 ºC. A unidade experimental foi semelhante à descrita em Indução da embriogênese somática direta (dois explantes por frasco). Para cada data foram coletadas amostras em triplicata. Os explantes foram triturados em almofariz em presença de nitrogênio líquido e em seguida transferidos para tubos de vidro e macerados com adição de 1 mL de clorofórmio. Ao longo do processo de maceração as amostras foram submetidas ao sonicador por 4 minutos seguidos por intervalos de 30 segundos. A operação com o sonicador foi repetida por três vezes. O extrato vegetal descansou sob refrigeração para decantação por 1 hora. O sobrenadante foi coletado e eliminado o solvente (clorofórmio), sob ventilação, com nitrogênio gasoso. As amostras permaneceram a -20º C durante o tempo de estocagem. Para realização das análises em equipamento de RMN de prótons, Agilent DDR2 500MHz, as amostras foram solubilizadas em 500 µL de clorofórmio deuterado e adicionado TMS (Tetramethylsilane, Cambridge Isotopes) como indicador de referência. A seguir, foram centrifugadas em centrífuga manual, com posterior análise por RMN 1H. Para comparação dos espectros uma amostra pura de 24-epibrassinolídeo também foi analisada. Os dados foram analisados com o programa Chenomx (Chenomx Inc.).
3.4 Análise estatística
Como os dados não se enquadraram dentro de uma distribuição normal e se ajustaram muito bem dentro de um Modelo Linear Generalizado, Binomial Negativa, esse foi o modelo adotado (McCullagh e Nelder 1989). Quando o modelo está bem ajustado, a razão entre a Deviance e os graus de liberdade (g.l) do modelo devem ser próximos de 1. O modelo com distribuição binomial negativa aplicado apresentou um ajuste muito bom (Deviance/g.l = 1,00). A equação do modelo é dada por:
Log (E(Y)) = α + β1 X1 + β2 X2 + β3 X3, Onde E(Y) é o número médio de embriões;
α representa o número médio de embriões para o grupo controle (0 µM de 24-epibrassinolídeo e 10 µM de 2-iP);
βk representa o incremento no número médio de embriões para os grupos com concentrações k de 24- epibrassinolídeo, k = 1,2,3, i.e., 0.01, 0.1 e 1, ou seja, o efeito das concentrações de 24-epibrassinolídeo no número de embriões. Assim, se βk for negativo há um decréscimo no número de embriões comparado com o grupo de referência e se βk for positivo há um aumento no número de embriões em relação ao grupo de referência. Quanto maior for βk, maior o número médio de embriões. Para o modelo estimado, foram feitas todas as comparações múltiplas entre os quatro grupos ao nível de significância de 5%. Como há quatro grupos, há seis possíveis comparações em pares e utilizando-se a correção de Bonferroni, chega-se a um nível de significância de 0,08% (0,05/6=0,0083) para cada comparação.
Tendo em vista que a correlação de Pearson mede a relação linear entre duas variáveis e, no nosso caso essa relação não é linear, o coeficiente de correlação de
Spearman (Woolson, 1987) foi aplicado para avaliar possíveis correlações entre as variáveis: número de lados do explante com estrutura embriogênica, tamanho da estrutura embriogênica e o número de embriões.
O teste exato de Fisher (Fleiss, 1981) foi realizado para verificar a associação entre a variável: presença de estrutura embriogênica nos explantes e as diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo na ausência de 2-iP. O mesmo teste estatístico foi usado para verificar associação entre a variável: número de explantes que produziram embriões e as diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo na presença de 2-iP. Para realização dos testes de Fisher, foi utilizado o software R, versão 3.0.2. Para o modelo binomial negativa foi utilizado o software SAS, através do procedimento FREQ.
Os resultados da estatística descritiva das variáveis: coloração dos explantes, tamanho da estrutura embriogênica e número de lados do explante com estrutura embriogênica, de acordo com os diferentes tratamentos estão apresentados nas figuras 2, 3, 4, 6 e 7.
3.5 Desenvolvimento das plântulas in vitro
Os embriões obtidos com uso exclusivo de citocinina, 2-iP a 10 µM, e com citocinina associada a 1 µM de 24-epibrassinolídeo foram transferidos a partir do estádio de torpedo para meio de cultura MS (sais e vitaminas) com metade da concentração de sais, isento de reguladores de crescimento, acrescido de 20 g.L-1 de
sacarose, 5 g.L-1 de agar e mantidos sob fotoperíodo de 16 horas de luz a 25 +2 ºC por 90 dias, a fim de se observar se haveria germinação e desenvolvimento dos embriões somáticos ao estádio de plântulas.
4. RESULTADOS 4.1 Embriogênese somática direta (experimento 1)
No primeiro experimento de embriogênese somática direta de C.arabica que foi realizado no período de primavera-verão, dentre as 35 unidades experimentais de cada tratamento, sete foram excluídas devido à contaminação microbiológica, portanto 28 unidades foram avaliadas ao longo de 130 dias. Houve formação de embriões nos explantes do tratamento controle (10 µM 2-iP / 0 µM de 24- epibrassinolídeo) e nos demais tratamentos com aplicação do brassinosteróide associado à citocinina. Não houve formação de embriões nos explantes cultivados em ausência total de hormônios vegetais, assim como nos tratados apenas com 24- epibrassinolídeo.
A via de embriogênese somática direta de C. arabica ao longo dos 130 dias está ilustrada na figura 2. Células da borda do explante em meio de cultura sofreram indução e originaram as estruturas embriogênicas (Fig. 2B). Foram necessários cerca de 60 dias para formação dos primeiros embriões somáticos. Entre 60 e 130 dias um número crescente de embriões foi produzido pelos explantes in vitro. Na figura 2C são observados embriões somáticos em diferentes estádios de desenvolvimento num mesmo explante foliar.
A formação de estrutura embriogênica, que antecede a formação dos embriões (Figura 2B) nas bordas do explante foliar foi uma das variáveis que avaliamos na embriogênese somática direta de C. arabica, sob diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo. Verificamos que a porcentagem de explantes que formaram estrutura embriogênica, aos 130 dias, foi nula no tratamento sem nenhum dos dois hormônios, enquanto que nos tratamentos com diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo e sem a presença de 2-iP essa porcentagem
variou entre 21,43% e 67,86% (Tabela 2). O teste exato de Fisher foi aplicado para os tratamentos com adição de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo e ausência de 2-iP. De acordo com o p-valor obtido nesse teste houve diferença significativa, ao nível de 5%, entre as porcentagens de explantes que formaram estruturas embriogênicas sob as diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo. A comparação entre os tratamentos nos permitiu verificar diferença significativa entre os tratamentos 0 µM e 0,01 µM, 0 µM e 1,00 µM e 0,1 µM e 1,00 µM de 24-epibrassinolídeo. Para os tratamentos com aplicação dos dois hormônios, o teste exato de Fisher não foi realizado, já que não houve diferença entre os resultados, sendo que todos apresentaram 100% de estruturas embriogênicas (dados não apresentados).
Figura 2. (A) Embriões somáticos (setas) de C. arábica, cultivar Mundo Novo, em diferentes estádios de desenvolvimento após 90 dias, formados a partir de células da borda de explante oxidado, característico da embriogênese somática direta; (B) Explante foliar (oxidado) submetido à embriogênese somática direta com embriões somáticos (es) e estruturas embriogênicas (ee) (C) Explante foliar com embriões somáticos nos quatro lados; (D) Embriões somáticos em estádios: globular (g), codiforme (c), torpedo (t) e cotiledonar (e). (Barras = 1mm).
Tabela 2. Número ( porcentagem) de explantes que formaram (Sim) ou não formaram (Não) estrutura embriogênica aos 130 dias, sob efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolideo (24-epiBr) e ausência de 2-iP, calculados entre as 28 unidades experimentais de cada tratamento. O p-valor foi igual a 0,0066. Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos ao nível de 5% pelo teste exato de Fisher.
24-epiBr (µM) Sim Não
0,00 0 (0,00%) a 28 (100,00%) 0,01 12 (42,86%) b 16 (57,14%) 0,10 6 (21,43%) ab 22 (78,57%) 1,00 19 (67,86%) c 9 (32,14%)
As médias do número de lados dos explantes foliares com estruturas embriogênicas são apresentadas na figura 3. No tratamento sem aplicação de citocinina e brassinosteróide nenhum dos lados dos explantes apresentou formação de estruturas embriogênicas, enquanto que nos tratamentos com diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo e ausência de aplicação da citocinina, ao menos um lado do explante formou essas estruturas. Nos tratamentos com aplicação de 2-iP associado a diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo, no mínimo três lados do explante foliar formaram estruturas embriogênicas. Embora a aplicação do brassinosteróide em associação com a citocinia tenha aumentado o número de lados do explante com estruturas embriogênicas, não houve correlação entre o número de lados do explante foliar contendo essas estruturas e o número total de embriões.
Figura 3. Efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr) no número médio de lados dos explantes foliares com formação de estruturas embriogênicas, quando cultivados em meio de cultura para indução de embriogênese somática direta, com e sem adição de 2-iP.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 30 45 60 90 130 0,00"-"0,00" 0,00"-"0,01" 0,00"-"0,10" 0,00"-"1,00" 10,00"-"0,00" 10,00"-"0,01" 10,00"-"0,10" 10,00"-"1,00" 2-iP / 24-epiBR (µM) Tempo (d) N úm ero de la dos dos e xpl ant es c om e st rut ura s e m bri ogê ni ca s
Com relação ao tamanho médio das estruturas embriogênicas formadas nos explantes, não houve aparecimento das mesmas no tratamento sem adição dos dois hormônios. A aplicação isolada de 24-epibrassinolídeo no meio de cultura foi suficiente para promover o aparecimento dessas estruturas, que apresentaram tamanho médio máximo de 0,26 mm. Quando o brassinosteróide foi fornecido em associação com 2-iP o tamanho dessas estruturas, no mínimo, dobrou (0,5 a 1,0 mm, aproximadamente) (Figura 4). Contudo, não houve correlação entre o tamanho das estruturas embriogênicas e o número total de embriões.
Quanto à coloração dos explantes e estruturas embriogênicas, após aproximadamente 90 dias todos apresentaram coloração oxidada (Figura 2B).
Figura 4. Efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr) na estimativa do tamanho das estruturas embriogênicas formadas em explantes foliares, cultivados em meio de cultura para indução de embriogênese somática direta, com e sem adição de 2-iP.
0,0" 0,5" 1,0" 1,5" 30" 45" 60" 90" 130" 0,00"-"0,00" 0,00"-"0,01" 0,00"-"0,10" 0,00"-"1,00" 10,00"-"0,00" 10,00"-"0,01" 10,00"-"0,10" 10,00"-"1,00" Tempo (d) T am anho da s e st rut ura s e m bri ogê ni ca s (m m )
O número total de embriões somáticos, estimado em contagem visual ao longo dos 130 dias, é apresentado na figura 5. Nessa figura são apresentados apenas os dados obtidos nos tratamentos onde havia presença de 2-iP associado ou não a diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo, já que nos tratamentos sem aplicação da citocinina não houve formação de embriões. Verificou-se que o número total de embriões variou entre 80 para o tratamento que recebeu apenas citocinina e 541 no tratamento com 2-iP e 1,0 µM de 24-epibrassinolídeo. O resultado do tratamento com 1,0 µM do brassinosteróide associado à citocinina diferiu significativamente dos demais aos 130 dias. A partir de 90 dias os dados apresentaram respostas significativas, sendo que dados com letras minúsculas distintas diferem entre si com relação ao número de dias do surgimento dos embriões. Dados representados por letras maiúsculas distintas apresentam diferenças, aos 130 dias, entre as concentrações de 24-epibrassinolídeo. Embora se observe diferença significativa apenas entre o tratamento com a maior concentração do brassinosteróide, com relação aos demais, é perceptível a tendência de aumento do número de embriões nos tratamentos com concentrações intermediárias do hormônio à medida que seu o teor aumenta.
Figura 5. Efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr) no número total de embriões somáticos formados em explantes foliares cultivados em meio de cultura para indução de embriogênese somática direta, com adição de 2-iP. Valores com letras distintas diferem entre si ao nível de 5%. Letras minúsculas referem-se aos valores ao longo do tempo, enquanto que letras maiúsculas representam a diferença entre as concentrações de 24-epibrassinolídeo, aos 130 dias.
A porcentagem de explantes que efetivamente produziram embriões (tabela 3) foi diferente da observada na indução das estruturas embriogênicas (tabela 2), já que não foram produzidos embriões na ausência de citocinina, mas houve formação de estruturas embriogênicas nessa situação. O aumento das concentrações de 24-epibrassinolídeo promoveu a porcentagem de explantes com embriões e no melhor resultado (1µM) houve produção três vezes maior que no tratamento que recebeu apenas a citocinina. Aplicamos o teste exato de Fisher que indicou diferença significativa, ao nível de 5%. Na comparação entre os tratamentos um a um, foi encontrada diferença significativa entre o tratamento com 0 µM e 1,00 µM de 24-epibrassinolídeo. Os explantes que receberam aplicação exclusiva do brassinosteróide não formaram embriões somáticos, portanto não foram submetidos ao teste estatístico, (dados não apresentados).
Tabela 3 . Número (porcentagem) de explantes que produziram (Sim) ou não produziram (Não) embriões aos 130 dias, sob efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr) com a presença de 2-iP (10µM), calculados entre as 28 unidades experimentais de cada tratamento. O p-valor foi de 0,004. Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos ao nível de 5% pelo teste exato de Fisher.
24-epiBr (µM) Sim Não
0,00 7 (25,00%) a 21 (75,00%) 0,01 14 (50,00%) ab 14 (50,00%) 0,10 17 (60,71%) ab 11 (39,29%) 1,00 21 (75,00%) b 7 (25,00%)
4.2 Embriogênese somática direta (experimento 2)
No segundo experimento de embriogênese somática direta, realizado no período de outono-inverno, houve alta contaminação das culturas por fungo, o que levou à perda de 21 unidades experimentais, dentre as 35 unidades iniciais de cada tratamento. Portanto, apenas 14 unidades foram avaliadas ao longo de 240 dias. O aumento no tempo de observação de 130 dias para 240 dias deveu-se à ausência de formação de embriões nos explantes do tratamento controle (10 µM 2-iP / 0 µM de 24- epibrassinolídeo). Assim, o tempo foi prorrogado para que tivéssemos certeza quanto aos resultados nulos obtidos nesse tratamento. Nos demais tratamentos, com aplicação do brassinosteróide associado à citocinina, houve formação de embriões a partir de 45 dias. Novamente, não houve formação de embriões nos explantes tratados apenas com 24- epibrassinolídeo, assim como no tratamento com ausência total de hormônios vegetais.
Quanto à formação de estrutura embriogênica, a porcentagem de explantes que formaram essas estruturas, aos 240 dias, foi nula no tratamento sem nenhum dos dois hormônios, enquanto que nos demais tratamentos essa porcentagem variou entre 35,71% e 100%, sendo que o valor de 100% foi obtido para todos os tratamentos com 2-iP associado ao brassinosteóide (Tabelas 4 e 5). Na ausência de 2-iP (Tabela 4) verificou-se associação significativa entre as concentrações de 24-epibrassinolídeo e a presença de estruturas embriogênicas. Na presença de 2-iP (Tabela 5), não houve associação significativa entre a presença de estruturas embriogênicas e as concentrações de 24-epibrassinolídeo.
Tabela 4. Número (porcentagem) de explantes que formaram (Sim) ou não formaram (Não) estrutura embriogênica aos 240 dias, sob efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolideo (24-epiBr) em ausência de 2-iP, calculados entre as 14 unidades experimentais de cada tratamento. O p-valor foi menor que 0,0001. Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos ao nível de 5% pelo teste exato de Fisher.
24-epiBr (µM) Sim Não
0,00 0 (0,00%) a 14 (100,00%) 0,01 5 (35,71%) b 9 (64,29%) 0,10 10 (71,43%) c 4 (28,57%) 1,00 11 (78,57%) c 3 (21,43%)
Tabela 5. Número (porcentagem) de explantes que formaram (Sim) ou não formaram (Não) estrutura embriogênica aos 240 dias, sob efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolideo (24-epiBr) em presença de 2-iP (10 µM), calculados entre as 14 unidades experimentais de cada tratamento. O p-valor foi igual a 0,0109. Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos ao nível de 5% pelo teste exato de Fisher.
24-epiBr (µM) Sim Não
0,00 11 (78,60%) a 3 (21,40%) 0,01 14 (100,00%) a 0 (0,00%) 0,10 14 (100,00%) a 0 (0,00%) 1,00 14 (100,00%) a 0 (0,00%)
As médias do número de lados dos explantes foliares com estruturas embriogênicas são apresentadas na figura 6. No tratamento sem aplicação de citocinina e brassinosteróide nenhum dos lados dos explantes apresentou formação de estruturas embriogênicas, enquanto que nos tratamentos com diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo e ausência de aplicação da citocinina os valores variam de menos que 0,5 a mais que 1,0. Houve aumento crescente dos valores com o aumento da concentração do brassinosteróide. Nos tratamentos com aplicação de 2-iP associado a diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo, todos os lados dos explantes foliares formaram estruturas embriogênicas, enquanto que o tratamento controle (só com citocinina) apresentou em média dois lados do explante com estrutura embriogênica. Embora a aplicação do brassinosteróide em associação com a citocinia tenha aumentado o número de lados do explante com estruturas embriogênicas, novamente não houve correlação entre o número de lados do explante foliar contendo essas estruturas e o número total de embriões.
Figura 6. Efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr) no número médio de lados dos explantes foliares com formação de estruturas embriogênicas, quando cultivados em meio de cultura para indução de embriogênese somática direta, com e sem adição de 2-iP.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 15 30 45 60 90 130 240 0,00 - 0,00 0,00 - 0,01 0,00 - 0,10 0,00 - 1,00 10,00 - 0,00 10,00 - 0,01 10,00 - 0,10 10,00 - 1,00 Tempo (d)
Com relação ao tamanho médio das estruturas embriogênicas formadas nos explantes não houve aparecimento das mesmas no tratamento sem adição dos dois hormônios (Figura 7). Os resultados da aplicação isolada de 24-epibrassinolídeo no meio de cultura reforçam os resultados obtidos no primeiro experimento, já que o brassinosteróide, isoladamente, foi suficiente para promover o aparecimento dessas estruturas, que apresentaram tamanho médio máximo de 0,20 mm. Quando o brassinosteróide foi fornecido em associação com 2-iP o tamanho dessas estruturas, no mínimo, triplicou (0,77 a 1,27 mm, aproximadamente). Contudo, não houve correlação entre o tamanho das estruturas embriogênicas e o número total de embriões.
Quanto à coloração dos explantes e estruturas embriogênicas, após aproximadamente 90 dias todos apresentaram coloração oxidada, sendo esse mesmo resultado obtido no primeiro experimento.
Figura 7. Efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr) na estimativa do tamanho das estruturas embriogênicas formadas em explantes foliares, cultivados em meio de cultura para indução de embriogênese somática direta, com e sem adição de 2-iP.
0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 15 30 45 60 90 130 240 0,00 - 0,00 0,00 - 0,01 0,00 - 0,10 0,00 - 1,00 10,00 - 0,00 10,00 - 0,01 10,00 - 0,10 10,00 - 1,00 Tempo (d)
O número total de embriões somáticos, estimado em contagem visual ao longo dos 240 dias, é apresentado na figura 8. Nessa figura são apresentados apenas os dados obtidos nos tratamentos onde havia presença de 2-iP associado ou não a diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo, já que nos tratamentos sem aplicação da citocinina não houve formação de embriões. Verificou-se que o número total de embriões variou entre 0 para o tratamento que recebeu apenas citocinina e 435 embriões no tratamento com 2-iP e 1,0 µM de 24-epibrassinolídeo. Os resultados dos tratamentos com 0,1 e 1,0 µM do brassinosteróide associado à citocinina diferiram significativamente dos demais aos 240 dias. A partir de 60 dias os dados já apresentavam respostas significativas, sendo que resultados com letras minúsculas distintas diferem entre si com relação ao número de dias do surgimento dos embriões. Dados representados por letras maiúsculas apresentam diferenças, aos 240 dias, entre as concentrações do brassinosteróide. Novamente, o aumento da concentração de 24-epibrassinolídeo tendeu a aumentar o número de embriões, embora tenham sido detectadas diferenças significativas apenas entre os tratamentos com os dois maiores teores do brassinosteróide, em relação aos demais.
Figura 8. Efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr) no número total de embriões somáticos formados em explantes foliares cultivados em meio de cultura para indução de embriogênese somática direta, com adição de 2-iP. Valores com letras distintas diferem entre si ao nível de 5%. Letras minúsculas referem-se aos valores ao longo do tempo, enquanto que letras maiúsculas representam a diferença entre as concentrações de 24-epibrassinolídeo, aos 240 dias.
