Diversos fatores interferem na eficiência da embriogênese somática direta em espécies de Coffea. Dentre esses destacam-se o genótipo da planta, a época do ano em que se procedeu à coleta do explante, temperatura e fatores diversos de estresse, que influenciam o estado fisiológico, nutricional e teores endógenos de hormônios vegetais da planta doadora de explantes, além dos tipos de nutrientes presentes no meio de cultura (Molina et al., 2002; Almeida et al., 2005; Almeida et al., 2007; Almeida et al., 2008; Almeida e Silvarolla, 2009). A dificuldade de controle desses diversos fatores pode implicar na baixa eficiência do processo. Neste estudo observou-se que o 24-epibrassinolídeo aumentou significativamente a eficiência da embriogênese somática direta em explantes foliares de C. arabica, em relação ao tratamento que recebeu apenas citocinina. É provável que esse aumento da eficiência possa ser explicado pelo fato dos brassinosteróides reduzirem efeitos adversos de diferentes tipos de estresses nas plantas (Kagale et al., 2007; Shahbaz et al. 2008; Xia et al.2009, Dalio et al., 2011), diminuindo dessa forma os efeitos de influências ambientais, provenientes da planta doadora de explantes, que poderiam resultar em alterações hormonais e nutricionais nos explantes, que por sua vez reduziriam a eficácia do processo embriogênico. Considerando ainda que a manipulação de plantas in vitro também pode representar uma condição de estresse, a ação do 24-epibrassinolídeo pode estar relacionada com a redução desse efeito na embriogênese somática.
A formação de estrutura embriogênicas nos explantes foliares tratados apenas com 24-epibrassinolídeo como agente indutor pode ser indicativa do envolvimento dos brassinosteróides no início do processo de embriogênese
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somática direta. Apesar da associação significativa entre as concentrações de 24- epibrassinolídeo e a formação de estruturas embriogênicas, na ausência da aplicação de citocinina esses explantes não produziram embriões somáticos até os 130 dias da condução do primeiro experimento, o que se repetiu no segundo experimento, até os 240 dias de observação. Como a aplicação exclusiva de 24- epibrassinolídeo não foi suficiente para a formação dos embriões, a presença de citocinina no meio de cultura mostrou-se indispensável para a continuidade do processo.
Nos tratamentos onde houve associação de 2-iP com diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo, a formação de estruturas embriogênicas correspondeu a 100% dos explantes (dados não apresentados), porém a porcentagem de explantes que efetivamente produziram embriões foi de 25% com uso exclusivo de 2-iP e de 75% com a associação da citocinina a 1,0 µM de 24- epibrassinolídeo (Tabela 3), para o primeiro experimento. No segundo experimento (Tabela 6) a atuação do brassinosteróide foi ainda mais evidenciada quanto à porcentagem de explantes com produção de embriões, pois o grupo controle não produziu embriões, enquanto que na associação entre os dois hormônios a porcentagem de explantes com formação de embriões variou entre 35,71% a 100%. O número total de embriões aumentou em 6,8 vezes quando comparamos o primeiro ao último tratamento, no primeiro experimento, e 16,7 vezes na comparação entre o pior e melhor resultado com relação ao segundo experimento. Brassinosteróides aumentaram a capacidade embriogênica de outras culturas e especificamente em
Coffea (Aydin et al., 2006; Núňez et al., 2004; Azpeitia et al., 2003; Garcia, 2000;
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resultados revelam o grande potencial do brassinosteróide para a embriogênese somática direta do cafeeiro, quando associado à citocinina. Além do aumento no número de embriões, consideramos que o incremento da porcentagem de explantes com embriões, provocado pelo brassinosteróide, também é uma caraterística importante por levar, na prática, à maior ocupação do espaço utilizado nas câmaras de crescimento com explantes produtivos. A utilização mais eficiente do espaço em câmaras de crescimento é um fator importante do ponto de vista econômico para a aplicação da técnica no setor produtivo.
Quanto à observação da coloração dos explantes e estruturas embriogênicas, aparentemente a oxidação, que é característica da espécie e está relacionada ao metabolismo de fenóis (Almeida et al., 2008), não interferiu no surgimento dos embriões somáticos, já que aos 90 dias todos os explantes encontraram-se oxidados e verificamos surgimento de embriões após esse período.
Não foi verificada correlação entre o número de lados do explante foliar contendo estruturas embriogênicas, bem como do tamanho das estruturas embriogênicas com o número total de embriões. Dessa forma, essas variáveis não se mostraram adequadas como indicadoras de produtividade do explante. Contudo, a formação de estruturas embriogênicas pode ser usada como indicativa da viabilidade do explante e da indução do processo de embriogênese, que é longo.
As análises de microscopia foram esclarecedoras e de grande importância na compreensão do trabalho realizado. Primeiramente evidenciaram a formação das estruturas embriogênicas seguidas dos embriões somáticos, provenientes dos explantes foliares, cujas células do mesofilo após 7 dias de cultivo dos explantes iniciaram proliferação celular na região da incisão do explante. A proliferação celular
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intensificou-se aos 30 dias com início do surgimento de células com citoplasma denso, coloração intensa e organização celular dos primeiros embriões somáticos, porém isto só foi observado nos tratamentos com presença de 2-iP associado ou não ao brassinosteróide. Esta observação em microscopia de luz reforça as observações de que a via de embriogênese somática direta em C. arabica seja citocinina dependente (Hatanaka et al., 1991; Ayub e Gebieluca, 2003 e Nunez et al., 2004). Porém, embora a aplicação exclusiva do brassinosteróide não tenha sido suficiente para a conclusão do processo de embriogênese somática direta, o fornecimento desse hormônio conjuntamente com a citocinina teve um efeito importante na morfologia dos embriões produzidos. O fornecimento concomitante dos dois hormônios não apenas aumentou quantitativamente o número de embriões, com resultados estatísticos significativos, como promoveu ganhos qualitativos, pois as análises de microscopia de luz mostraram embriões somáticos bem delimitados, com células pequenas, citoplasma denso e núcleos evidentes.
As análises de microscopia eletrônica de varredura confirmaram os dados obtidos em microscopia de luz. Os explantes analisados apresentaram aos 7 dias, intensificação da proliferação celular e surgimento dos primeiros embriões somáticos já aos 30 dias, processo que evoluiu gradativamente, com presença de vários embriões somáticos observados aos 90 dias, resultados observados apenas nos tratamentos com presença de citocinina associada ou não ao brassinosteróide. Nas análises macroscópicas, o tratamento com uso exclusivo do brassinosteróide não apresentou embriões somáticos, fato também comprovado pelas análises de microscopia eletrônica de varredura. Nas análises macroscópicas, os primeiros embriões somáticos só foram visualizados aos 45 e 60 dias (Experimentos 1 e 2). As
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análises de microscopia eletrônica de varredura também mostraram que os explantes foliares submetidos ao tratamento com citocinina associada ao brassinosteróide apresentaram embriões em três diferentes estádios de desenvolvimento aos 90 dias (globular, codiforme e torpedo), enquanto que no tratamento com uso exclusivo de citocinina, os explantes foliares apresentaram embriões apenas em estádio inicial de desenvolvimento, ou seja, pré-embrionário a globular. Portanto, com base nessas observações é possível afirmar que a presença do brassinosteróide acelerou a via de embriogênese somática. As análises de microscopia de varredura também evidenciaram que a superfície celular dos embriões obtidos nos dois tratamentos apresentou diferença, pois os embriões do tratamento com associação dos dois hormônios apresentaram superfície mais lisa, ou seja, presença de epiderme, enquanto que os embriões do tratamento com uso exclusivo de citocinina apresentaram superfície mais rugosa devido a ausência de epiderme aos 90 dias e células maiores e mais alongadas.
No segundo experimento os explantes submetidos ao tratamento com aplicação exclusiva de citocinina não produziram embriões. A alta contaminação fúngica relatada nas culturas levou a uma diminuição no número de frascos do experimento. A infestação por fungos é fator de estresse para plantas e aumento endógeno de etileno é reportado em diversas espécies de plantas em resposta aos estresses bióticos e abióticos (Wang et al., 2002). Doenças fúngicas também estão relacionadas com aumento endógeno de etileno (Garcia et al., 2013). Giridhar et al., (2004), demonstraram que o uso de nitrato de prata, um inibidor do etileno, favoreceu a embriogênese somática em C. arabica, mas o mesmo não ocorreu com
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embriogênicos de Prunus persica apresentaram menor teor endógeno de 1- aminociclopropano-1-carboxilico ácido (ACC), precursor de etileno, quando comparados a cotilédones não embriogênicos. Dessa forma é possível que, no presente trabalho, os explantes tratados apenas com citocinina (tratamento controle) não tenham produzido embriões, devido a um aumento endógeno de etileno, causado por um possível contato da planta doadora com fungos. É possível que a presença apenas da citocinina, como indutor de embriogênese, não tenha sido suficiente para deslocar o balanço citocinina/etileno, no sentido de promover a formação dos embriões. O fornecimento do brassinosteróide em associação a citocinina foi capaz de promover a embriogênese somática direta em explantes foliares de C. arabica provenientes das mesmas plantas doadoras, o que sugere uma provável ação antagônica do brassinosteróide ao possível aumento de etileno
in vitro. Contudo, são necessários estudos mais aprofundados sobre o papel do
etileno nesse processo.
Com relação às análises de RMN 1H, os espectros obtidos nas análises dos
extratos apolares de explantes foliares de C. arabica cultivados apenas com acréscimo de citocinina e coletados aos 0, 7, 15, 30, 60 e 90 dias, apresentaram sinais na região das metilas (1 a 0,7 ppm) e foram melhor definidos entre 15 e 60 dias (figura 15), o que coincide com o período de atividade embriogênica conforme as análises de microscopia. Embora esses espectros não coincidam exatamente com o padrão utilizado (24- epibrassinolídeo), como os brassinosteróides apresentam diversas moléculas com os mesmos grupamentos químicos, os sinais obtidos nos espectros podem eventualmente estar relacionados a outros tipos de brassinosteróides naturais, que podem estar presentes no explante durante o
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processo de embriogênese direta e não exatamente ao 24-epibrassinolídeo, utilizado como padrão. Outro fator limitante nas análises realizadas por RMN deveu-se às baixíssimas concentrações dos hormônios esteroidais naturalmente encontradas nos vegetais, o que limitou a sua quantificação. Portanto, com base nos experimentos de RMN realizados nas amostras dos explantes foliares em que sinais de moléculas apolares como os esteroides aparecem, e aumentam no mesmo período da fase ativa da embriogênese somática direta analisada anteriormente por estudos de microscopia, é possível sugerir que brassinosteróides endógenos estejam envolvidos na promoção do processo de embriogênese somática direta. Estudos posteriores com emprego de técnicas como espectrometria de massas poderiam ser realizados na tentativa de elucidar o papel e envolvimento dos brassinosteróides endógenos na embriogênese somática direta.
Os embriões somáticos obtidos tanto do tratamento com citocinina como do tratamento com 24-epibrassinolídeo associado à citocinina desenvolveram-se plântulas após transferência para meio de germinação e desenvolvimento dos embriões. Estudos futuros são necessários para que seja determinado se há diferenças entre as plântulas dos dois tratamentos.
Resumindo: a aplicação de 24-epibrassinolídeo levou à iniciação do processo de embriogênese somática direta, promovendo a formação de estruturas
embriogênicas. Sua aplicação conjunta com citocinina aumentou o número de embriões, o número de explantes com embriões, levou à formação de embriões em condição na qual apenas a aplicação de citocinina foi insuficiente e acelerou a via embriogênica. Acelerou o desenvolvimento de embriões, que apresentaram-se mais bem definidos, com características meristemáticas típicas. O aumento de picos na
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região do espectro de RMN 1H, característico de moléculas esteroidais, coincidente com o período em que ocorre a embriogênese somática direta, pode ser indicativo da participação de brassinosteróides endógenos durante esse processo.
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